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https://repositorio.ufrn.br/handle/123456789/19512| Título: | Expressão heteróloga de biossurfactantes identificados em bibliotecas metagenômicas |
| Autor(es): | Araújo, Sinara Carla da Silva |
| Orientador: | Agnez, Lucymara Fassarella |
| Palavras-chave: | Metagenômica;Biossurfactantes;Proteína hipotética;Degradação de hidrocarbonetos. |
| Data do documento: | 22-Ago-2014 |
| Editor: | Universidade Federal do Rio Grande do Norte |
| Referência: | ARAÚJO, Sinara Carla da Silva. Expressão heteróloga de biossurfactantes identificados em bibliotecas metagenômicas. 2014. 65f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2014. |
| Resumo: | Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e estão presentes em toda biosfera, no entanto cerca de 1% das espécies pode ser cultivada por técnicas laboratoriais padrão. A metagenômica tornou possível o acesso direto ao genoma microbiano derivado de amostras ambientais, utilizando técnicas independentes de cultivo. A metodologia permite obter informação funcional de proteínas, assim como a identificação de potenciais produtos com interesse biotecnológico e de novos recursos biológicos industrialmente exploráveis, a exemplo novas soluções para impactos ambientais. Áreas contaminadas com petróleo são caracterizadas por um grande acúmulo de hidrocarbonetos e surfactantes são utilizados para sua biorremediação. Sendo assim, a abordagem metagenônima foi utilizada para selecionar genes envolvidos no processo de degradação e biossurfactação de hidrocarbonetos. Em um trabalho anterior, o DNA ambiental (eDNA) foi extraído de amostras de solo coletadas em duas diferentes áreas (Caatinga e rio salino) do Rio Grande do Norte (Brasil), as bibliotecas metagenômicas foram construídas e analisadas funcionalmente. Os clones capazes de degradar o óleo foram avaliados quanto à capacidade de sintetizar biossurfactante. O clone foi sequenciado e análise da sequencia revelou uma ORF com 897 pb, 298 aminoácidos e proteína de peso molecular próximo a 34 kDa. A busca por homologia no GenBank revelou similaridade com a sequência que codifica uma proteína hipotética de representantes da família Halobacteriaceae, que foram mostradas recentemente como produtoras de biossurfactantes. A presença da sequência codificante inserida e do fenótipo adquirido foram confirmadas. Primers foram desenhados e suas ORFs amplificadas por PCR. Em seguida, foram subclonadas em vetor de expressão pETDuet-1, contendo uma cauda de histidina, para expressão e posterior purificação da proteína de interesse. Os testes foram realizados para confirmação da atividade de biossurfactante e degradação de hidrocarbonetos e apresentaram resultados positivos. O ensaio de imunodetecção (western blot) com a utilização do anticorpo monoclonal Anti-His® confirmou a presença da proteína ambiental. Esse estudo foi o primeiro a relatar uma possível proteína com atividade biossurfactante obtida a partir de uma abordagem metagenômica. |
| Abstract: | The microorganisms have a vast genetic diversity and they are present throughout the biosphere, however, only about 1% of the species can be cultivated by traditional cultivation techniques. Within this diversity there is a huge pool genetic and biological being explored. The metagenomics has enabled direct access to microbial genome derived from environmental samples using independent methods of cultivation. The methodology enables to obtain functional information about the proteins, as well as identify potential products with biotechnological interest and new industrially exploitable biological resources, such as new solutions to environmental impacts. Oil-contaminated areas are characterized by a large accumulation of hydrocarbons and surfactants may be used for bioremediation. Thus, the metagenomic approach was used in this study in order to select genes involved in the degradation and hydrocarbon emulsification. In a previous work, the environmental DNA (eDNA) was extracted from soil samples collected from two different areas (Caatinga and Saline River) of Rio Grande do Norte (Brazil), the metagenomic libraries were constructed and functionally analyzed. The clone able to degrade the oil was evaluated for the ability to synthesize biosurfactants. The sequence analysis revealed an ORF with 897 bp, 298 amino acids and a protein with around 34 kDa. The search for homology in GenBank revealed sequence similarity with a hypothetical protein of representatives Halobacteriaceae family, who were recently shown as strains producing biosurfactants. The presence of the inserted coding sequence and the acquired phenotype was confirmed. Primers were designed and the ORF amplified by PCR. The ORF was subcloned into pETDuet-1 expression vector for subsequent purification of the protein of interest containing a histidine tail. The tests performed to confirm the biosurfactant activity and the ability of hydrocarbon degradation showed positive results. The immunodetection test (western blot) using the monoclonal AntiHis® confirmed the presence of the environmental protein. This study was the first to report a possible protein with biosurfactant activity obtained from a metagenomic approach |
| URI: | https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/19512 |
| Aparece nas coleções: | PPGB - Mestrado em Bioquímica |
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