Universidade Federal do Rio Grande Norte Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Laboratório de Biologia Molecular e Genômica Identificação de genes em Chromobacterium violaceum relacionados à Resposta ao Estresse Delanne Cristina Souza de Sena Fontinele Natal Março 2012 Delanne Cristina Souza de Sena Fontinele Identificação de genes em Chromobacterium violaceum relacionados à Resposta ao Estresse Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande Norte / Universidade Estadual do Ceará, como requisito para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientadora: Dra. Lucymara Fassarella Agnez Lima Natal Março 2012 iii Dedico este trabalho à DEUS. Hoje e sempre. Dedico também aos meus pais, Luciano e Lurdinha, Aos meus irmãos Danielle, Dianne, Dominique, Luciano Ricardo e Díllia e ao meu esposo Maurício por todo amor e compreensão. À vocês todo o meu amor! iv AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Luciano e Lourdinha, pelo apoio incondicional. Agradeço eternamente por todo amor e carinho. À todos os meus irmãos, Danielle, Dianne, Dominique, Luciano Ricardo e Díllia, obrigada pelas palavras de incentivo. E ao meu sobrinho Henrique por me fazer sorrir sempre. Ao meu esposo Maurício Fontinele pela caminhada lado a lado, desculpe pela ausência. Agradeço à Professora Lucymara Fassarella Agnez Lima, pela orientação, pela “construção e desconstrução” de conhecimentos, pela oportunidade de ingressar numa área tão apaixonante e pelas tão sábias sugestões. Aos órgãos de fomento CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e CAPES pelo investimento. Ao Programa RENORBIO (Rede Nordeste de Biotecnologia) e todos que fazem parte desta Pós-Graduação. À Coordenadora do Ponto Focal UFRN Profa. Gorete Ribeiro por toda sua compreensão e atenção. Ao Prof. Dr. Robert P. Fuchs, ao CNRS (Centre national de la recherche scientifique) e ao pessoal do IGC (Instabilité du Génome et Cancérogenèse) pelo importantes contribuições. À Dra. Rita Napolitano e Dr. Mauro Modesti pela amizade e acolhida na França. v À Profa. Dra. Adriana Uchoa, ao Prof. Dr. Hugo de Oliveira, à Dra. Keronninn Bessa e Dra. Tirzah Petta pelas importantes contribuições como membros da banca. À Profa. Dra. Marinalva Pinheiro e Profa. Dra. Cristiane de Assis pela leitura da Tese. À Professora Katia Castanho Scortecci, agradeço pela paciência, pela bancada, pela amizade e por todo conhecimento transmitido. À Rita Barreto pelo companheirismo, pela incansável ajuda na realização deste trabalho e, principalmente, pela amizade. Agradecimento especial aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular e Gênomica (LBMG) e Laboratório de Mutagênese Ambiental (LAMA), Anna Helena, Abinadabe, Thayse, Leonam, André, Fabrícia (Fafa), Jana Dara, Gizélia (Gi), Maria Beatriz (Bia), Juliane, Danielle, Acarizia, Sinara, Naldo, Adilson, Déborah Afonso, Thiago, Marcos Felipe, Joana e a todos que de alguma forma contribuíram para que este trabalho fosse realizado. Sempre lembrarei de vocês com muito carinho. Aos metagenômicos Larissa, Uaska, Ralfo pelo árduo trabalho e confidências. Aos amigos especiais da “Chromo” Fabio Duarte (Fabinho), Viviane, Daniel Chaves pela disponibilidade. A ajuda de vocês foi essencial. Às “Docs” Valéria, Fabíola (Fafa),Tatiana, Fernanda. Agradeço imensamente. Ao trio de “manas” Ana Rafaela (Lelinha), Angélica (Geka) e Amanda pelo carinho. A toda a família Souza e Sena (tios e primos) pela descontração, em especial a Vovó Diva pelo exemplo de fortaleza. Aos meus queridos cunhados Emanuel, Márcio e Eloiza pelo companheirismo. Amigos Judney, Agnus, Fabiana, Gilliane, Olavo, Patrícia, Luciana, Débora e Érika pelo incentivo. Em especial a Heloísa (Hêlo) pela alegria. vi RESUMO O seqüenciamento do genoma da espécie Chromobacterium violaceum identificou um cromossomo simples circular de 4.8 Mb, no qual aproximadamente 40% das ORFs encontradas são classificadas como hipotéticas conservadas ou hipotéticas. Algumas regiões gênicas de interesse biotecnológico e biológico vêm sendo caracterizadas, como por exemplo, genes de detoxificação ambiental e genes de reparo de DNA, respectivamente. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi identificar genes de C. violaceum envolvidos com a resposta ao estresse, como por exemplo, mecanismos de reparo de DNA e/ou manutenção da integridade genômica. Para tanto, foi construída uma biblioteca genômica de C. violaceum na cepa DH10B de Escherichia coli (RecA-), a qual foi testada para clones resistentes a UVC, resultando na seleção de cinco clones candidatos. Foram identificadas quatro ORFs (CV_3721 a 3724) no clone PLH6A. Das quais, as ORFs CV_3722 e CV_3724, foram subclonadas e uma atividade sinérgica de complementação foi observada. A ocorrência de um operon foi confirmada usando cDNA de C. violaceum em ensaio de RT-PCR. Adicionalmente, foi observada a indução do operon após tratamento com UVC, dessa forma, esse operon foi relacionado à resposta ao estresse em C. violaceum. Ensaios de mutagênese com rifampicina após tratamento com luz UVC mostraram alta freqüência de mutagenicidade para a ORF CV_3722, subunidade δ’ da Polimerase III. Assim, propomos que esta subunidade de C. violaceum pode agir em DH10B na síntese translesão utilizando Pol IV em uma via RecA independente. Em ensaios de viabilidade outros quatro clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B e PLE12H) foram capazes de complementar a função na dose de 5 J/m2. E em ensaios de mutagenicidade PLE7B, PLE10B e PLE12H apresentaram freqüências de mutação com diferenças significativas em relação ao controle (DH10B), demonstrando que de alguma forma eles estão envolvidos na resposta ao estresse em C. violaceum. Estes clones parecem estar inter-relacionados, provavelmente, regulados por molécula mensageira (como o nucleotídeo c-di-GMP) e/ou molécula regulatória global (como a subunidade σS da RNA Polimerase). Os resultados obtidos contribuem para um melhor conhecimento da genética desta espécie e de seus mecanismos de resposta ao estresse ambiental. Palavras-chave: HolB; Operon; Mutagênese; Resposta ao Estresse; β-Proteobacteria vii ABSTRACT The sequencing of the genome of Chromobacterium violaceum identified one single circular chromosome of 4.8 Mb, in which approximately 40% of the founded ORFs are classified as hypothetical conserved or hypothetical. Some genic regions of biotechnological and biological interest had been characterized, e. g., environmental detoxification and DNA repair genes, respectively. Given this fact, the aim of this work was to identify genes of C. violaceum related to stress response, as the ones involved with mechanisms of DNA repair and/or genomic integrity maintenance. For this, a genomic library of C. violaceum was built in Escherichia coli strain DH10B (RecA-), in which clones were tested to UVC resistance, resulting in five candidates clones. In the PLH6A clone were identified four ORFs (CV_3721 to 3724). Two ORFs, CV_3722 and CV_3724, were subcloned and a synergic complementation activity was observed. The occurrence of an operon was confirmed using cDNA from C. violaceum in a RT-PCR assay. Further, it was observed the induction of the operon after the treatment with UVC. Thus, this operon was related to the stress response in C. violaceum. The mutagenesis assay with rifampicin after the treatment with UVC light showed high frequency of mutagenicity for the ORF CV_3722 (Pol III δ’ subunit). In this way, we propose that the C. violaceum δ’ subunit can act in DH10B in the translesion synthesis using Pol IV in a RecA independent-manner pathway. In growth curve assays other four clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B and PLE12H) were able to complement the function at the dose 5 J/m2 and in mutagenicity assays PLE7B, PLE10B and PLE12H showed frequencies of mutation with significant differences upon the control (DH10B), demonstrating that in some way they are involved with the stress response in C. violaceum. These clones appear to be interrelated, probably regulated by a messenger molecule (eg., nucleotide c-di-GMP) and/or global regulatory molecule (eg., σS subunit of RNA polymerase).The results obtained contribute for a better genetic knowledge of this specie and its response mechanisms to environmental stress. Keywords: HolB; Operon; Mutagenesis; Stress Response; β-Proteobacteria viii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Mapa funcional das ORFs de C. violaceum. 03 Figura 2. Principais tipos de agentes mutagênicos, lesões e sistemas de reparo. 08 Figura 3. Esquema de NER bacteriano. 10 Figura 4. Estrutura da forquilha de replicação em E. coli. 17 Figura 5. Fluxograma das atividades realizadas para obtenção de clones candidatos. 22 Figura 6. Mapa e sítios de clonagem do plasmídeo pBC-SK. 23 Figura 7. Fluxograma das atividades realizadas a partir de clones candidatos. 26 Figura 8. Figura ilustrativa da seleção de clones em placa após ensaio UVC. 38 Figura 9. Mapa de localização das ORFs dos clones candidatos no genoma de C. violaceum. 39 Figura 10. Alinhamento das proteínas HolB de C. violaceum (CV), N. meningitidis (NM), R. solanacearum (RT), E. coli (EC) e S. flexneri (SF) pelo programa CLUSTALW2. 43 Figura 11. Estrutura molecular das proteínas HolB mostrando os prováveis sítios de ligação fornecida pelo I-Tasser. 46 Figura 12. Alinhamento das proteínas PilZ de C. violaceum (CV), N. meningitidis (NM), Lutiella nitroferrum (LN), Thiobacillus denitrificans (TD), Dechloromonas aromática (DA) e Pseudomonas aeruginosa (PA) pelo programa CLUSTALW2. 46 Figura 13. Alinhamento das proteínas Timidilato quinase (TMK – ORF 3723) de C. violaceum (CV), L. nitroferrum (LN), Laribacter hongkongensis (LH), Neisseria mucosa (NM) e Neisseria meningitidis (NM) pelo programa CLUSTALW2. 47 ix Figura 14. Alinhamento da seqüência protéica da ORF CV_3724 de C. violaceum (CV3724Y) com proteínas fornecidas pelo Blastp de Lutiella nitroferrum (LNAlyas), Ralstonia pickettii (RPAlyas), Herminiimonas arsenicoxydans (HAPspep), Neisseria meningitidis (NMPalys), Burkholderia cenocepacia (BCPlipo) e Oxalobacteraceae bacterium (OBYceGl) pelo programa CLUSTALW2. 48 Figura 15. Alinhamento da seqüência protéica da ORF CV_1667 de C. violaceum (CV1667Hyp) com proteínas apresentando domínio diguanilato ciclase/fosfodiesterase (GGDEF) de L. nitroferrum (LNDCyclpp), P. aeruginosa (PAWspRpro), E. coli (ECDcyclas) e R. solanacearum (RSDcyclas) pelo programa CLUSTALW2. 50 Figura 16. Alinhamento da seqüência protéica da ORF CV_0390 de C. violaceum (CV0390H) com proteínas apresentando domínio isocitrato liase e fosfoenolpiruvato mutase (ICL/PEPM) de Pectobacterium carotovorum (PCHypot), Sphingobacterium spiritivorum (SSPepmu), Bacillus cereus (BCCpepm), Listeria monocytogenes (LMTrans), Rhizobium leguminosarum (RLLyase) e E. coli (ECPrpBl) pelo programa CLUSTALW2. 51 Figura 17. Alinhamento das proteínas ADA de C. violaceum (CV), E. coli (EC), Klebsiella variicola (KV), Marinomonas posidonica (MP), Spirochaeta smaragdinae (SS) e P. carotovorum (PC) pelo programa CLUSTALW2. 52 Figura 18. Alinhamento da seqüência protéica da ORF CV_1311 de C. violaceum (CV1311H) com proteínas fornecidas pelo Blastp de Plesiocystis pacifica (PPHypot), Streptosporangium roseum (SRHypot), Saccoglossus kowalevskii (SKHypot), Aspergillus clavatus (ACAller) e Cupriavidus taiwanensis (CTDgbet) pelo programa CLUSTALW2. 54 Figura 19. Alinhamento da seqüência protéica da ORF CV_1312 de C. violaceum (CV1312H) com proteínas fornecidas pelo Blastp de B. multivorans CGD1 (BM1Hypo), B. multivorans ATCC 17616 (BM2Hypo), B. sp. TJI49 (BSHypot), Desulfotomaculum kuznetsovii (DKIstBd) e B. cenocepacia PC184 (BCHypot) pelo programa CLUSTALW2. 55 x Figura 20. Alinhamento da seqüência protéica da ORF CV_1313 de C. violaceum (CV1313f) com proteínas apresentando domínio da família ThiJ/PfpI de R. sp (RSIhydr), P. putida (PPIhydr), R. pickettii (RPThPff e RPAraCf), C. crescentus (CCThPff), C. violaceum (CV1314A) e Photorhabdus asymbiotica (PAAraCf) pelo programa CLUSTALW2. 56 Figura 21. Alinhamento das proteínas RpoA de C. violaceum (CV), E. coli (EC), L. nitroferrum (LN), Laribacter hongkongensis (LH), N. meningitidis (NM) e N. gonorrhoeae (NG) pelo programa CLUSTALW2. 57 Figura 22. A) Ensaio de complementação funcional a UVC do clone PLH6A. 59 Figura 22. B) Ensaio de complementação funcional a UVC dos clones PLE1G e PLE7B. 60 Figura 22. C) Ensaio de complementação funcional a UVC dos clones PLE10B e PLE12H. 61 Figura 23. Curva de Sobrevivência do clone PLH6A, ORFs CV_3722 e CV_3724 e pBC-SK. 63 Figura 24. Freqüência de indução relativa do operon (ORFS CV_3721 a CV_3724) por RT-PCR. 64 Figura 25. Ensaio de mutagênese (Rifampicina) com a ORF CV_3722, ORF CV_3724, DH10B (pBC-SK), C. violaceum e AB1157 a partir de Luz UVC. 66 Figura 26. Ensaio de mutagênese (Rifampicina) com os clones PLE1G, PLE7B, PLE12H e PLE10B, DH10B (pBC-SK), C. violaceum e AB1157 a partir de Luz UVC. 67 Figura 27. Reconstrução de árvore filogenética com proteínas apresentando domínio da família ThiJ/PfpI. 69 xi LISTA DE TABELAS Tabela 1. Proteínas que participam da forquilha de replicação em E. coli. 16 Tabela 2. Cepas e plasmídeo utilizados. 20 Tabela 3. Clones resistentes a ensaio UVC após análise com ferramentas do BLAST. 40 xii LISTA DE ABREVIATURAS AB1157 Cepa selvagem de Escherichia coli Água DEPC Água tratada com dietilpirocarbonato ATCC American Type Culture Collection BER Reparo por excisão de base BLAST Basic Local Alignment Search Tool c-di-GMP Nucleotídeo diguanilato cíclico ou bis-(3›,5›)-di-guanosina monofosfato cíclico - 2º mensageiro celular CIAP fosfatase alcalina intestinal de bezerro (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) CPD Dímeros de pirimidinas do tipo ciclobutano Cv Chromobacterium violaceum ATCC 12472 DH10B Linhagem de Escherichia coli recA- DO Densidade Óptica EDTA Ácido etileno diamina tetra acético GGDEF Domínio 1 das enzimas Diguanilato ciclase / fosfodiesterase GGR Reparo genômico global H2O2 Peróxido de Hidrogênio HolB Proteína da subunidade delta’ da DNA Polimerase III ICL Enzima Isocitrato liase IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo Kb Kilobases KOAc Acetato de potássio LB Luria-Bertani (meio de cultivo) mfd Gene mutation frequency decline MgSO4 Sulfato de magnésio MMR Reparo por mau pareamento - Mismatch Repair MSC Múltiplo Sítio de Clonagem xiii NaOAc Acetato de sódio NaOH Hidróxido de Sódio NEB New England Biolabs NER Reparo por excisão de nucleotídeo ORF Opened Reading Frame (quadro aberto de leitura) pb Pares de base pBC-SK Vetor de expressão pBluescript PCR Reação em Cadeia da Polimerase PEPM Enzima fosfoenolpiruvato mutase PilZ Proteína de biogênese fimbrial tipo 4 pMol picoMol RecA Enzima Recombinase A rpm Rotação por minuto RR Reparo por Recombinação RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction - Reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa SDS Dodecil Sulfato de Sódio SOS Mecanismo de Resposta SOS SSB Proteínas de ligação ao DNA fita simples TAE Tris - base, Ácido Acético e EDTA - Tampão TCR Reparo acoplado à transcrição TCRF Fator acoplado ao reparo transcricional TE Tris e EDTA - Tampão TLS Translesion Synthesis – Síntese Translesão TMK Enzima Timidilato quinase X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-tiogalactopiranosideo SUMÁRIO 1 Introdução 01 1.1 Chromobacterium violaceum 01 1.2 Genoma de C. violaceum 02 1.3 Mecanismos de Proteção e Resposta ao Estresse 06 1.3.1 Mecanismos de Reparo e Tolerância ao Dano no DNA 07 1.3.2 Síntese Translesão e DNA Polimerases 12 1.3.2.1 Holoenzima DNA Polimerase III 14 2 Objetivos 19 2.1 Geral 19 2.2 Específicos 19 3 Material e Métodos 20 3.1 Cepas bacterianas e plasmídeo 20 3.2 Construção da biblioteca genômica de C. violaceum 21 3.2.1 Extração de DNA genômico de C. violaceum 21 3.2.2 Fragmentação do DNA por Sonicação e Endonucleases de Restrição 22 3.2.3 Vetor de Expressão 23 3.2.4 Obtenção das Construções 25 3.2.5 Seleção de clones por coloração azul-branco 25 3.3 Ensaio de Seleção Funcional 27 3.4 Seqüenciamento de clones resistentes a radiação UVC 28 3.5 Bioinformática para análise das seqüências 28 3.6 Ensaios de Complementação Funcional 29 3.6.1 Curvas de Sobrevivência 30 3.6.2 Curvas de Crescimento 30 3.7 Amplificação e isolamento de ORFs específicas 31 3.8 Níveis de expressão por RT-PCR (Reverse transcriptase- polymerase chain reaction) 32 3.8.1 Extração de RNA de C. violaceum 33 3.8.2 Obtenção de cDNA de C. violaceum 34 3.8.3 Níveis de expressão por RT-PCR a partir de primers ORF- específicos e de regiões intergênicas 34 3.9 Ensaio de Mutagênese Direta (Rifampicina) (Miller, 1992) 36 3.10 Reconstrução Filogenética para a ORF CV_1313 37 4 Resultados 38 4.1 Biblioteca genômica de Chromobacterium violaceum e Seleção Funcional 38 4.2 Análise das seqüências in silico 39 4.2.1 Análise das seqüências por ferramentas do pacote BLAST e mapas genômicos das ORFs 39 4.2.2 Alinhamento de seqüências das ORFs do clone PLH6A 42 4.2.3 Alinhamento de seqüências das ORFs dos clones PLE1G, PLE7B, PLE10B e PLE12H 49 4.3 Ensaios de complementação funcional para os clones selecionados 58 4.4 Ensaios de Complementação Funcional para o clone PLH6A e ORFs subclonadas 62 4.5 Nível de Expressão por RT-PCR a partir de Primers ORF- Específicos e de regiões intergênicas 63 4.6 Ensaio de Mutagênese Direta (Rifampicina) 65 4.6.1 Mutagênese do clone PLH6A (ORFs CV_3722 e CV_3724) 65 4.6.2 Mutagênese dos clones PLE1G, PLE7B, PLE12H e PLE10B 65 4.7 Reconstrução Filogenética para a ORF CV_1313 68 5 Discussão 70 6 Conclusões 84 Referências Bibliográficas 86 1 1 Introdução 1.1 Chromobacterium violaceum A -proteobactéria C. violaceum pertence à família Neisseriaceae, sendo classificada como um organismo de vida livre, saprófito, geralmente não-patogênico, gram-negativo e aeróbico facultativo. Apresenta distribuição circuntropical, podendo ser encontrada em amostras de solo e água de regiões tropicais e subtropicais de diversos continentes (Boone e Castenholz, 2001; Byamukama et al., 2005). Ocorre em abundância no Rio Negro (Região Amazônica do Brasil), tanto em corpos de água, como sobre bancos de areia (Dias Jr. et al., 2002). C. violaceum raramente causa infecções em animais e homens, mas quando isto ocorre, resulta em alta taxa de mortalidade. Assim, esta bactéria pode atuar como um patógeno oportunista causando septicemia fatal a partir de lesões na pele com abscessos no fígado e pulmão (Liu et al., 1989; Ray et al., 2004; Dias et al., 2005; Kim et al., 2005). Comumente, atinge crianças ou indivíduos que apresentam baixa imunidade, mas há casos reportados em pessoas consideradas saudáveis (Siqueira et al., 2005; Ma et al., 2006; Slesak et al., 2009). A espécie C. violaceum é caracterizada pela produção de violaceína, um pigmento roxo, insolúvel em água e clorofórmio e solúvel em etanol. A este pigmento têm sido atribuídas importantes atividades, como por exemplo: 1) ação antimicrobiana contra determinados patógenos tropicais como os agentes causadores da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis), doença de Chagas (Trypanosoma cruzi) e leishmaniose (Leishmania sp.) (Durán et al., 1994; Souza et al., 1999; Leon et al., 2001; Andrighetti-Frohner et al., 2003); 2) ação antivirótica (Durán e Menck, 2001); 3) atuação como um composto terapêutico para finalidades dermatológicas; e 4) capacidade de induzir a apoptose e a diferenciação de células leucêmicas humanas (Melo et al., 2003). Em função deste último, novas metodologias de associação da violaceína a outros compostos, como o ácido ascórbico, vem sendo desenvolvidas objetivando sua utilização como agente antitumoral (Martins et al., 2010). Para a síntese da violaceína, a C. violaceum necessita de oxigênio molecular e de L-triptofano. Segundo Caris e colaboradores (2003), a produção da violaceína é dependente da fonte de carbono utilizada, sendo 2 desfavorecida em presença de glicose e frutose, porém estimulada em glicerol, mais especificamente em meio contendo ágar. A C. violaceum apresenta outras características que ampliam seu potencial biotecnológico, como por exemplo, no controle de pragas agrícolas como insetos, fungos e nematóides (Durán e Menck, 2001; Vasconcelos et al., 2003), apresentar capacidade de produzir polímeros com propriedades semelhantes ao polipropileno e peptídeos com atividade antitumoral (Melo et al., 2000), além da sua possível utilização no processo de concentração de minério de ouro e na recuperação de metais pesados, uma vez que possui genes relacionados à produção de cianeto (radical). Esse produto enzimático pode se complexar a metais pesados e vir a ser aplicado no desenvolvimento de estratégias de biorremediação de áreas contaminadas pelo garimpo, método importante para conservação e recuperação ambiental, já que possibilitaria a não contaminação pelo mercúrio (Lawson et al., 1999; Campbell et al., 2001). 1.2 Genoma de C. violaceum Devido ao potencial biotecnológico C. violaceum teve seu genoma seqüenciado pela Rede Nacional de Seqüenciamento Nucleotídico (Projeto Genoma Brasileiro – CNPq), da qual o Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal-RN) fez parte. Os resultados mostraram um genoma de 4.751.080 pb, com uma média de 64,83 % de conteúdo GC. Foram identificadas 4.431 ORFs, que correspondem a cerca de 89 % do genoma com um comprimento médio de 954 pb (Vasconcelos et al., 2003). biotecnológico vêm sendo caracterizadas, podendo responsáveis pela detoxificação am conferem resistência à drogas, como o antibiótico cloranfenicol (Fantinatti Garboggini antitumoral (Cheng influenciando o desenvolvimento de características em resposta a situações de estresse (formação de celulose, flagelo e fímbrias) que, por sua vez, são regulados por moléculas celular que atuam nessa resposta % das ORFs encontradas em conservadas ou hipotéticas, ou seja, as funções bioquímicas e papéis biológicos de 2,7 % 3,7 % 6,1 % 3,2 % 5 % 5,8 % 3 % 3,6 % Figura 1. Mapa funcional das ORFs de A partir deste seqüenciamento et al. mensageiras (Recouvreux No entanto, como em genomas de outros organismos, aproximadamente 40 4,6 % 3,4 % 2,9 % 6,4 % , 2004); grupos et al., 2007) et al., 2008) (Duarte 0,9 % 7,5 % 1,8 % gênicos responsáveis pela biossíntese de agente ; que atuam na patogênese bacteriana e desenvolviment ; e mais especificamente et al. C. violaceum 21,6 % 17,1 % 4,6 % C. violaceum , algumas regiões gênicas de interesse biental (Carepo genes envolvidos na form , 2004) (Figura 1) fora HIPOTÉTICAS CONSERVADAS HIPOTÉTICAS PRODUÇÃO E CONVERSÃO DE ENERGIA CONTROLE DO CICLO CELULAR E MITOSE METABOLISMO E TRANSPORTE DE AMINOÁCIDO METABOLISMO E TRANSPORTE DE NUCLEOTÍDEO METABOLISMO E TRANSPORTE DE CARBOIDRATO METABOLISMO DE COENZIMA METABOLISMO DE LIPÍDIO TRADUÇÃO, ESTRUTURA RIBOSSOMAL E BIOGÊNESE TRANSCRIÇÃO REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO BIOGÊNESE DA PAREDE/MEMBRANA/ENVELOPE CELULAR MOTILIDADE CELULAR E SECREÇÃO MODIFICAÇÃO PÓS PROTEÍNA, FUNÇÕES DE CHAPERONAS METABOLISMO E TRANSPORTE DE ÍONS INORGÂNICOS BIOSSÍNTESE, TRANSPORTE E CATABOLISMO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS TRANSDUÇÃO DE SINAL -se destacar os genes et al. , genes . m classificadas como hipotéticas ARBOIDRATO . , 2004); genes que ação de biofilme de reparo de DNA -TRADUCIONAL, TURNOVER DE 3 - o 4 40 % do patrimônio genético desta espécie ainda permanecem desconhecidos (Figura 1). A comparação das ORFs de C. violaceum com as de outros organismos revelou similaridades com Ralstonia solanacearum, Neisseria meningitidis e Pseudomonas aeruginosa (Parkhill et al., 2000; Salanoubat et al., 2000; Stover et al., 2000). A similaridade encontrada com a R. solanacearum é na maior parte relacionada com a motilidade celular, modificações pós-traducionais, transporte de íons inorgânicos e biossíntese de metabólitos secundários (Vasconcelos et al., 2003). Grande parte das ORFs identificadas apresenta-se especificamente relacionada à habilidade da C. violaceum em interagir e responder ao ambiente, o que garante grande adaptabilidade e versatilidade a este organismo (Vasconcelos et al., 2003). É possível que as ORFs hipotéticas conservadas ou hipotéticas presentes em C. violaceum possam fornecer genes novos relacionados à resposta ao estresse com igual ou superior potencial biotecnológico aos identificados até o momento. Por exemplo, em análise comparativa entre os genomas de C. violaceum e Escherichia coli foram encontradas 59 e 72 ORFs relacionadas a reparo de DNA, respectivamente, onde todas as vias de reparo de DNA foram representadas (Duarte et al., 2004). Esta diferença pode estar relacionada ao fato de E. coli ser o modelo bacteriano melhor estudado quanto aos mecanismos de reparo de DNA. De fato, em E. coli são encontrados genes de reparo que não foram localizados em outras bactérias, o que nos leva a questionar a uniformidade funcional de alguns genes de reparo de DNA, e até de mecanismos de reparo conhecidos. Considerando que C. violaceum é uma bactéria de vida livre, estando exposta a uma série de agentes mutagênicos ambientais como a luz ultravioleta (UV), é possível supor que exista um número maior de genes envolvidos com a proteção do material genético do que o inicialmente estimado. Corroborando com essa hipótese, dados recentes de nosso laboratório indicam que C. violaceum apresenta resistência significativamente superior que E. coli a agentes como luz UV, peróxido de hidrogênio (H2O2) e alguns metais pesados (Vieira et al., em preparação), sugerindo que C. violaceum apresente sistemas mais eficientes de proteção contra estresse oxidativo. A finalização de projetos genomas de eucariotos e procariotos vem fornecendo uma base de informações que tem possibilitado o desenvolvimento de trabalhos de grande interesse biotecnológico. Porém, sabe-se que o seqüenciamento dos genes permite identificar funções por homologia com genes já 5 descritos, ou seja, como citado anteriormente, apenas parte das seqüências identificadas possui função conhecida. Entre 20 a 40 % desses genomas têm sido anotados como ORFs (Open Read Frames) hipotéticas ou hipotéticas conservadas, ou seja, deve existir uma série de novos genes que permitam ao organismo responder às adversidades ambientais (Pagani et al., 2012; Windsor e Mitchell-Olds, 2006), a exemplo do que é esperado para C. violaceum. O conhecimento de genes novos ou novas funções continuam sendo um grande desafio a ser vencido, uma vez que, se não é observada homologia com seqüências já descritas, em geral não tem sido possível inferir funções. Além disso, alguns genes são identificados com funções já descritas, mas com baixa similaridade (< 30 %), sendo, portanto, de fundamental importância investir no desenvolvimento de métodos para prospecção de novos genes ou de novas funções para genes com potencial biotecnológico. A construção de uma biblioteca genômica proporciona a realização de ensaios funcionais que permitem identificar genes de interesse. Cepas de E. coli proficientes e/ou deficientes em funções específicas vem sendo utilizadas para construção de bibliotecas genômicas permitindo conhecer os diferentes genes, proteínas e sistemas relacionados a resposta ao estresse. A exemplo disso, algumas cepas proficientes e/ou deficientes em vias de reparo de DNA que visam à seleção de genes relacionados à resistência a agentes mutagênicos, vem permitindo conhecer os diferentes sistemas de reparo, bem como, as moléculas envolvidas nesses processos (Doudney e Rinaldi, 1985; Sambrook e Russell, 2001; Clauß M e Grotjohann, 2009). Dessa forma, a construção de biblioteca genômica de C. violaceum em cepa de E. coli deficiente em reparo de DNA nos permite a seleção de genes candidatos cujas funções estejam relacionadas à resposta ao estresse e a manutenção da integridade genômica. Assim, utilizando uma abordagem genômica é possível explorar mecanismos de resposta e defesa em diferentes bactérias, não se restringindo somente ao modelo clássico normalmente utilizado (E. coli). A busca de novos modelos bacterianos, principalmente a identificação de genes novos relacionados à resposta ao estresse pode ampliar nosso conhecimento a cerca dos mecanismos celulares de defesa desses organismos. 6 1.3 Mecanismos de Proteção e Resposta ao Estresse A sobrevivência de um organismo depende em parte de sua habilidade de sentir e responder às mudanças ambientais. A proteção adequada a diferentes situações de estresse ambiental é uma das características básicas inerente a qualquer organismo. Uma vez que essas situações podem afetar estruturas, processos celulares e moleculares, desse modo, mecanismos de proteção são necessários para neutralizar os potenciais danos causados por essa condição de estresse, tanto em procariotos como em eucariotos. A regulação de genes induzidos por estresse pode ocorrer ao nível da transcrição ou tradução ou por modificações pós-traducionais. Sob condições de estresse, alterações metabólicas, moleculares e estruturais, como modificações na dupla fita de DNA podem atuar induzindo ou reprimindo genes. Em bactérias, proteínas induzidas em resposta ao estresse têm seu papel tanto na sobrevivência como também estão implicadas na manifestação de sua patogenicidade (Chowdhury et al., 1996; Forsberg et al., 2001; Boor, 2006; Skoneczna et al., 2007). Bactérias desenvolveram respostas regulatórias rigorosas frente a situações de estresse como a privação de aminoácidos, carbono, nitrogênio e limitação de fosfato. Em E. coli os produtos dos genes relA e spoT regulam o acúmulo de moléculas efetoras em resposta à estas privações, como as moléculas guanosina tetrafosfato e pentafosfato (ppGpp e pppGpp, respectivamente). Estes nucleotídeos hiperfosforilados se ligam diretamente à RNA polimerase bacteriana alterando a atividade transcricional de alguns genes, como, por exemplo, aqueles que codificam enzimas metabólicas, especialmente aquelas envolvidas na biossíntese de aminoácidos e na hidrólise de proteína, bem como, o gene do fator sigma S. Este fator se liga ao núcleo da RNA polimerase bacteriana e induz a expressão de genes específicos da fase estacionária e de resposta ao estresse (Dabrowska et al., 2006). A produção de biofilme é outro exemplo importante de reprogramação da expressão gênica e síntese proteica que ocorrem nas células e contribui para sua defesa e seu desenvolvimento. A regulação da expressão gênica para formação do biofilme requer uma combinação de diferentes sinais ambientais que podem modular a atividade de redes reguladoras complexas. Atualmente, se conhece pouco a respeito dessas redes reguladoras da formação de biofilme. Assim, muitos 7 reguladores globais, incluindo reguladores de resposta ao estresse celular e ambiental, e sistemas quorum sensing, podem afetar tanto a formação, como manutenção e até mesmo a dispersão do biofilme, tanto em bactérias gram-positivas quanto em gram-negativas (Landini, 2009). Logo, a sobrevivência do organismo depende da estabilidade do seu genoma, que resulta da ação de diferentes mecanismos, como a replicação e os mecanismos que reparam os danos que ocorrem continuadamente no DNA. Assim, dentre os mecanismos de resposta ao estresse, as vias de reparo de DNA são constituídos de moléculas e sistemas bastante conservados em todos os seres vivos, como será enfatizado adiante. Estudar os mecanismos envolvidos na proteção ao estresse celular tem importantes implicações, uma vez que, muitas doenças humanas se desenvolvem como conseqüência de uma resposta deficiente ao estresse. O conhecimento da biologia dos organismos envolvidos, de suas relações ambientais e de patogênese, poderá refletir em avanços nas áreas das ciências da saúde e economia. 1.3.1 Mecanismos de Reparo e Tolerância ao Dano no DNA Alterações na seqüência de bases do DNA ocorrem espontaneamente e podem ser intensificadas por agentes mutagênicos biológicos, químicos ou físicos. Interações com esses agentes endógenos ou exógenos à célula podem gerar uma variedade de alterações (lesões) na estrutura do DNA. Assim, as lesões podem ser classificadas como espontâneas ou induzidas, resultantes da ação de agentes exógenos ou endógenos. Estas lesões podem afetar processos celulares primordiais, como replicação e transcrição, e ainda resultar em mutações no material genético (Friedberg et al., 1995, Friedberg et al., 2004). Desse modo, as células necessitam remover tais lesões do DNA para garantir que suas funções aconteçam normalmente e que sua integridade genômica seja mantida. Essa remoção é feita através de uma série de mecanismos de reparo de DNA, os quais são tão importantes biologicamente que se mantêm conservados em todos os seres vivos conhecidos até o momento (Eisen e Hanawalt, 1999; Grogan, 2000; Wood et al., 2001). 8 Células deficientes em reparo de DNA são mais susceptíveis à mutagênese e, conseqüentemente, a predisposição dos organismos a doenças, como o câncer e processos degenerativos (por exemplo, envelhecimento celular) e/ou morte. As vias associadas ao reparo do DNA podem ser divididas em três grandes grupos, sendo eles: 1) reparo direto (fotorreativação e alquil transferência); 2) reparo por excisão (excisão de base – BER; excisão de nucleotídeos – NER; e reparo por mau pareamento - Mismatch Repair - MMR) e 3) reparo por recombinação (RR) (Friedberg e Fischhaber, 2003; Sancar et al., 2004). A Figura 2 mostra os tipos de sistemas de reparo que atuam sobre as principais lesões no DNA produzidas por uma ampla variedade de agentes (Morita et al., 2010). Sistemas de reparo de DNA de alguns organismos representantes de grandes grupos têm sido detalhadamente estudados (E. coli, Homo sapiens e fungos) (Eisen e Hanawalt, 1999; Zeibell et al., 2007), embora outras espécies, como a Caulobacter crescentus, estejam sendo também exploradas (Galhardo et al., 2005; Martins- Pinheiro et al., 2007). Figura 2. Principais tipos de agentes mutagênicos, lesões e sistemas de reparo (Modificado de Morita et al., 2010). 9 O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) é o principal sistema de remoção de danos causados por luz UV e por agentes químicos que destorcem a dupla hélice. É o sistema de reparo mais flexível e pode agir sobre uma ampla variedade de adutos de DNA reconhecendo distorções na molécula. Como também descrito anteriormente, os substratos do NER incluem dímeros de pirimidinas do tipo ciclobutano (CPDs; dímeros de pirimidina = T-T, C-C, C-T) ou (6-4) fotoprodutos, adutos químicos, DNA cross-links e alguns tipos de danos oxidativos (Batty e Wood, 2000; Nakano et al., 2009; Morita et al., 2010). O sistema NER já foi descrito em espécies representantes de todos os reinos dos seres vivos (Morita et al., 2010). O sistema NER tem duas sub-vias de reparo, o reparo genômico global (global genomic repair - GGR) e o reparo acoplado à transcrição (transcription- coupled repair - TCR) (Crowley e Hanawalt, 1998; Svejstrup, 2002; Gillet e Schärer, 2006; Maddukuri et al., 2007; Farnell, 2011). O GGR realiza remoção de lesões em todo o genoma, enquanto o TCR remove preferencialmente e mais rapidamente lesões na fita que está sendo transcrita. No GGR, em procariotos também denominado sistema de reparo UvrABC, há a participação de quatro proteínas, UvrA, UvrB, UvrC e UvrD que realizam a retirada da lesão que está impedindo a replicação. A DNA polimerase replicativa interrompe sua atividade quando encontra algum uma lesão (por exemplo, os dímeros gerados pela luz UV), levando a interrupção da replicação. A atuação do sistema UvrABC inicia com o reconhecimento e excisão da lesão. A UvrA forma dímeros que interagem com UvrB (complexo UvrA2B); o complexo formado reconhece e se liga a lesão (UvrA2B - DNA), resultando em mudança conformacional do complexo seguido de liberação das moléculas de UvrA. A UvrC logo é recrutada ao complexo UvrB-DNA e excisa a lesão do DNA através dos dois sítios catalíticos, um no N-terminal e o outro no C- terminal, onde atuam no lado 3’ e 5’, respectivamente. A UvrD Helicase atua retirando a seqüência excisada (12-13 nucleotídeos). Posteriormente, a DNA polimerase I preenche a lacuna formada, que é unida pela DNA ligase restaurando a molécula (Figura 3) (Grossman et al. 1986; Nakano et al., 2009; Jaciuk et al., 2011). O TCR requer a participação das mesmas quatro proteínas e, adicionalmente, da RNA polimerase e pelo menos um fator acoplado ao reparo transcricional, como o TRCF (transcription-repair coupling factor) em E. coli que é transcrito a partir do gene mfd (mutation frequency decline). No TCR, o bloqueio da atividade da RNA polimerase é responsável pelo início do reparo - ela interrompe a transcrição quando 10 encontra um aduto. Após a paralisação da transcrição o TRCF libera a RNA polimerase do DNA e em seguida recruta UvrA que se liga ao DNA. As reações subseqüentes procedem da mesma forma como no GGR (Mellon e Hanawalt, 1989; Selby e Sancar, 1993; Svejstrup, 2002; Truglio et al., 2006; Farnell, 2011). Figura 3. Esquema de NER bacteriano. Inicialmente há o reconhecimento e excisão da lesão pela UvrA2B e UvrC, seguida da atuação da Helicase (UvrD); logo após a DNA polimerase I preenche a lacuna que é unida pela DNA ligase (Nakano et al., 2009). 11 Algumas proteínas como a RecA são peças-chaves em determinados sistemas e a caracterização de sua(s) função(ões) permite conhecer diferentes mecanismos. Em E. coli a proteína RecA atua de duas formas: como fator essencial em sistemas de recombinação pelas vias recBCD ou recF e como regulador (positivo) do sistema SOS (Goerlich et al., 1989; Konola et al., 2000; Bichara et al., 2006). O reparo por recombinação é uma estratégia livre de erro (error-free) já que se utiliza da recombinação homóloga, assim, a informação contida na fita complementar serve de molde para replicação, havendo a troca entre seqüências idênticas ou quase idênticas do DNA. Como citado anteriormente, o reparo por recombinação mediado pela proteína RecA em E. coli atua por duas possíveis vias independentes, via RecF e via RecBC (Bichara et al., 2006). Alguns mecanismos fogem ao padrão dos sistemas de reparo já que não retiram a lesão. Estes são denominados mecanismos de tolerância, como por exemplo, a Síntese Translesão (TLS; síntese de DNA sujeito a erro ou error-prone) em função da Resposta SOS. No Sistema SOS a presença da lesão no DNA regula mais de 40 genes envolvidos na expressão de proteínas de reparo de DNA, replicação e recombinação sob o controle do repressor LexA, que atua regulando as seqüências promotoras presentes nestes genes (Schlacher et al., 2006). A RecA pode auxiliar a resposta de tolerância celular de duas maneiras, por reparo por recombinação (RR) e/ou síntese translesão (TLS); ela cliva o repressor transcricional LexA, levando a ativação do sistema SOS, resultando no aumento dos níveis de algumas proteínas do sistema de recombinação genética (RecA, RecN, RecQ e RecD), do NER (UvrABC), de síntese translesão (síntese de DNA sujeito a erro, error-prone) [DNA Pol II (polB), Pol IV (dinB) e Pol V (UmuDC)] e SfiA. Assim, RecA age aumentando a capacidade de reparo de DNA das células, como também, a tolerância ao dano, replicação do DNA e mutagênese (Wagner et al., 2002; Asad et al., 2004). Entretanto, dependendo da natureza e contexto da lesão, Pol II e Pol IV podem estar envolvidas em síntese translesão livre de erro (error-free) (Napolitano et al., 2000). Os mecanismos de tolerância já foram descritos em diversos organismos (bactérias, eucariotos, etc.) (Friedberg et al., 1995; Cox, 2001; Pham et al., 2001). Em C. violaceum foram identificadas algumas das proteínas que participam da resposta SOS, mas o repressor transcricional da resposta SOS, o LexA, está ausente neste organismo (Duarte et al., 2004), além da DNA Polimerase II e da 12 subunidade da DNA Pol III. Por outro lado, há quatro prováveis genes dnaQ (subunidade ) distribuídos no genoma. Embora seja comum a conservação das funções de enzimas de reparo entre as diversas espécies, muitas vezes não ocorre a conservação da seqüência protéica (Grogan, 2000). Assim, as enzimas de reparo são caracterizadas através da identificação dos substratos que atuam e de como atuam (mecanismo), podendo esta caracterização ser obtida por meio de diferentes metodologias, entre elas ensaios in vivo utilizando cepas mutantes. Em estudos recentes, foram identificadas novas enzimas atuando em alguns sistemas de reparo, podendo as mesmas se sobrepor as funções de enzimas já conhecidas. Possivelmente essas novas enzimas podem funcionar como alternativas a ausência ou quantidade de outras, podendo ainda participar de diferentes vias de reparo (Alseth et al., 2006; Morita et al., 2008). 1.3.2 Síntese Translesão e DNA Polimerases A Síntese Translesão (TLS) é mediada por DNA polimerases especializadas. Em resumo, existem três grupos de DNA Polimerase em E. coli, em cada um desses grupos participam uma ou mais dessas enzimas com funções relacionadas, embora específicas, como anteriormente citado e mostrado abaixo: - Grupo I: DNA Pol I (Família A): Replicação (enzimática) e Exonuclease 5’–3’ (remoção de Primer); - Grupo II: DNA Pol II (Família B), IV e V (Família Y): Reparo de DNA; - Grupo III: DNA Pol III (Família C): Replicação = Replicase (maior fidelidade e processividade). Assim, a DNA Polimerase I é uma enzima replicativa, mas sua principal função é de exonuclease 5’–3’ que permite que sejam removidos os primers de RNA formados pela primase e sua substituição por desoxinucleotídeos (DNA) tanto em filamentos contínuos (leading) como tardios (lagging). As DNA Polimerases II, IV e V estão envolvidas nos sistemas de reparo de DNA e têm um papel importante no resgate de forquilhas de replicação paradas, embora algumas (II e IV) possam ultrapassar alguns tipos de danos ao DNA (bypass) (Napolitano et al., 2000; Wagner et al., 2002). 13 Diferentes DNA Polimerases auxiliam a Holoenzima DNA Polimerase III (Pol III, replicativa) a passar pelo dano (bypass), seja por uma forma livre de erro (error- free), em que o desoxinucleotídeo certo é inserido frente à lesão, ou por uma forma suscetível ao erro (error-prone), onde qualquer desoxinucleotídeo (certo ou errado) pode ser inserido frente ao dano (Wagner et al., 2002). No entanto, se o desoxinucleotídeo errado for inserido podem surgir mutações no DNA lesionado (Zhang et al., 2000). Segundo Wang (2001) a justificativa que se tem a respeito desse comportamento “errado” da TLS é atribuída a importância biológica de se manter vivo, principalmente para procariotos, já que são unicelulares, ou seja, o importante é sobreviver mesmo que para isso ocorra mutação. Além disso, a TLS pode promover o aumento de mutações, processo essencial a todas as espécies, seja ela um procarioto ou um eucarioto, visto que as mutações permitem a evolução. Pol II e Pol IV estão envolvidas em síntese translesão e mutagênese (in vivo) e podem ter sua síntese aumentada quando necessário, enquanto a DNA Polimerase V (Pol V) ocorre apenas nas células SOS-induzidas (Wagner et al., 2002). Sabe-se que essas enzimas podem atuar sozinhas ou combinadas com outras polimerases e podem competir entre elas devido à especificidade, frente a uma ampla variedade de lesões (Fuchs et al., 2001; Wagner et al., 2002). A mutagênese SOS é em grande parte resultado da ação da DNA Pol V devido a sua baixa fidelidade durante a síntese tornando-a susceptível a erro (error-prone). Esta polimerase é composta do polipeptídeo UmuD'2C que é composto por proteínas codificadas pelo operon umuDC. Além da função em TLS de UmuD'2C, foi observada que os produtos gênicos de umuDC participam de checkpoint no DNA (DNA damage checkpoint), isso ocorre devido a formação de diferentes produtos gênicos a partir de alelos variantes de umuC, em que cada um destes produtos podem atuar em funções distintas (Beuning et al., 2009). Pol V é estritamente regulada na célula a fim de evitar sobrecarga de mutação genômica, embora possa ter alguma atividade na presença unicamente de DNA fita simples (Schlacher et al., 2006). Por outro lado, filamentos da nucleoproteína RecA (RecA*), formados por ligação da RecA ao DNA fita simples (single-stranded DNA) com ATP, são essenciais para TLS catalisada por Pol V tanto in vivo como in vitro (Patel et al., 2010). A proteína de ligação ao DNA fita simples (SSB; single-strand DNA-binding protein) também é requerida para a ação da Pol V além de RecA (Maor-Shoshani e Livneh, 2002; Arad et al., 2008). 14 Evidências sugerem que a DNA Pol III pode participar do processo de reparo a lesão na quebra da dupla fita de DNA (DSB - double-strand-break) após estresse, inclusive competindo com outras DNA polimerases. Além disso, as cinco polimerases tem capacidade de ligação ao ß clamp (“grampo”) e mais de uma poderia ou não estar presente ao mesmo tempo, embora somente uma torna-se funcional (Indiani et al., 2005; Hastings et al., 2010). Desse modo, embora o clamp faça parte da holoenzima DNA Pol III há a interação com outras proteínas ou subunidades protéicas, esse processo tem sido estudado para a compreensão da maquinaria de ação de replissomas, já bastante caracterizados, contudo, há muito a ser investigado para compreender completamente a ação de seus constituintes. 1.3.2.1 Holoenzima DNA Polimerase III Replissomas são maquinarias multiprotéicas dinâmicas capazes de reproduzir as duas fitas do DNA simultaneamente. A análise da estrutura e função do replissoma da Holoenzima DNA Polimerase de E. coli possibilita generalizar essas informações para outras bactérias e células eucarióticas. Como por exemplo, em um estudo proposto há mais de 30 anos por Sinha e colaboradores (1980) em que se permitiu a compreensão do funcionamento básico do replissoma em bacteriófago T4, mostrando haver a utilização de clamps de fixação ao DNA e carreadores desses clamps (clamp loaders) para coordenar as ações necessárias ao modelo de síntese incluindo a fita descontínua (lagging). Esse modelo foi bastante esclarecedor, já que todas as células apresentam clamps e sliding clamps, o que permitiu fazer inferências a outros organismos, como por exemplo, E. coli (Yao e O’Donnell, 2008). Estudos recentes revelam mecanismos relacionados ao replissoma que lhe permite contornar as lesões em qualquer uma das fitas de DNA (Yao e O’Donnell, 2008). Durante estes processos as polimerases têm funções específicas no replissoma, embora as mesmas possam realizar outras funções, como citado anteriormente (Hastings et al., 2010). Os mecanismos que estão por trás dessas ações podem envolver giros no DNA, facilitando a síntese dos fragmentos de Okazaki que surgem a partir da fita descontínua (lagging) (Yao e O’Donnell, 2008). 15 Todos os replissomas celulares contêm algumas atividades enzimáticas em comum. Estas incluem enzimas como: 1) DNA helicase – desnatura a dupla-hélice de DNA; 2) DNA primase – produz os curtos RNA iniciadores (RNA primers) para iniciar a síntese de DNA e 3) DNA polimerases – polimerizam fitas novas a partir das fitas moldes contínuas (leading) e descontínuas (lagging). As proteínas de ligação ao DNA fita simples (SSBs) evitam a renaturação do DNA e a ação de nucleases. Para a replicação das células de todos os grupos de seres vivos (archea, eubactéria e eucariotos) são utilizados “grampos deslizantes” (sliding clamps) circulares, que são constituídos por proteínas que envolvem a dupla fita de DNA e mantém a DNA polimerase de alta processividade ligada à molécula (Jeruzalmi et al., 2002; O’Donnell, 2006; Reyes - Lamothe et al., 2010). Os clamp loaders são espirais pentaméricos que se ligam ao DNA de uma forma estrutural específica, este complexo abre o clamp que está sendo carreado, localiza e o abre em torno da molécula de DNA, usando energia a partir de hidrólise de ATP para esta reação. A estrutura do clamp em E. coli ligado ao DNA tem algumas implicações, por exemplo, como diferentes polimerases funcionam sobre os sliding clamps e como ocorre a troca entre elas (Yao e O’Donnell, 2008). O núcleo ativo da pol III (core) consiste de três subunidades, (DNA polimerase), (3’-5’ exonuclease) e . Em cada uma das fitas contínua e descontínua um núcleo da Pol III associa-se ao clamp para em seguida processar a síntese de DNA (O’Donnell, 2006). Na Tabela 1 estão identificadas as proteínas que participam da forquilha de replicação em E. coli e um resumo de suas funções. Na Figura 4 pode-se observar a estrutura da forquilha de replicação em E. coli, em que há presença das moléculas envolvidas, como a Helicase DNA B; a Primase DNA G; a Holoenzima DNA Polimerase III com o núcleo (core) das fitas contínua e descontínua, mais o clamp loader e o sliding clamp; e a proteína de ligação ao DNA fita simples. 16 Tabela 1. Proteínas que participam da forquilha de replicação em E. coli (Lamothe et al., 2010). Subunidade No Gene Função Núcleo Polimerase III 2 dnaE DNA Polimerase (Replicativa) / Interação com o clamp 2 dnaQ Exonuclease 3’ – 5’ (Revisora) 2 holE Liga e estimula a subunidade ß Clamp ß 4 dnaN Sliding clamp Clamp loader (complexo ) / 3 dnaX ATPase, Liga o clamp ao DNA e a DNAB 1 holA ATPase, Liga-se ao clamp e o abre ’ 1 holB ATPase, Auxilia na montagem e estabilização do clamp loader 1 holC Liga SSB 1 holD Liga a , estabiliza o clamp loader Primase DNA G 1 dnaG Síntese de Iniciador de RNA Helicase DNA B 6 dnaB Abre/desenrola a fita de DNA Ligação ao ssDNA SSB 4 ssb Liga ssDNA, evita a formação de pontes de hidrogênio 17 Figura 4. Estrutura da forquilha de replicação em E. coli. Os sliding clamps são montados (ß clamp) em volta do DNA pela maquinaria multiprotéica do clamp loader (complexo ); este complexo carrega o clamp, localiza e o abre em torno da molécula de DNA, usando energia a partir de hidrólise de ATP para esta reação. Somado a essas moléculas, o núcleo da DNA Polimerase III (Pol III Core) é o sítio catalítico da Holoenzima. Na maquinaria de replicação temos o envolvimento ainda de outras moléculas: Helicase DNA B; Primase DNA G; e proteína SSB (Modificado de Yao e O’Donnell, 2008). 18 Como citado anteriormente, os sistemas de reparo são bem conservados desde bactérias mais simples até eucariontes mais complexos. A ausência da proteína LexA em C. violaceum pode indicar uma resposta SOS constitutiva ou a regulação por alguma outra proteína ainda desconhecida (Duarte et al., 2004). Em outras ß-proteobacteria a proteína LexA também não está presente, com exceção na espécie Ralstonia solanacearum, sugerindo uma perda deste gene em um evento evolutivamente recente para essas ß-proteobacterias (C. violaceum, Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis). Curiosamente, a DNA Polimerase II e a subunidade da DNA Pol III também não estão presentes em C. violaceum, entretanto, há quatro prováveis genes dnaQ (subunidade ) presentes no genoma deste organismo. Dados relevantes obtidos a partir de estudos com esse microorganismo podem ser extrapolados para outros organismos, incluindo a espécie humana. A ampla relação entre deficiência em sistema de reparo de DNA e propensão a formação de tumores e envelhecimento (Eisen e Hanawalt, 1999; Costa et al., 2003; Maddukuri et al., 2007; Fousteri e Mullenders, 2008; Shuck et al., 2008) indica que novas informações podem abrir diversas perspectivas na área de saúde humana. Deste modo, pelo seu potencial biotecnológico C. violaceum mostra-se um organismo interessante ao conhecimento de seus genes e enzimas relacionadas às vias de reparo / replicação, bem como, aos diferentes mecanismos de defesas, já que se trata de um organismo de vida livre. Além disso, C. violaceum pode ser considerado um modelo para estudo de ß- proteobacterias, e bactérias de vida livre, cuja genética tem sido pouco explorada em relação ao que tem sido feito com bactérias classicamente patogênicas. Neste contexto, o presente trabalho visa contribuir para melhorar o conhecimento genético de C. violaceum, principalmente, com a identificação de genes associados a processos celulares em resposta ao estresse (p. ex.: estratégias de defesa / replicação / reparo de DNA). Com esse propósito, foi realizada a construção da biblioteca genômica de C. violaceum, a partir desta foi feita a seleção e isolamento de clones de interesse, com posterior caracterização funcional. As análises destes clones em um perfil funcional e genômico possibilitaram fazer inferências a respeito da interação entre esses genes e, pelo menos em parte, do comportamento de C. violaceum em resposta à luz ultravioleta. 19 2 Objetivos 2.1 Geral O principal objetivo deste trabalho foi identificar genes de C. violaceum (linhagem ATCC 12472) envolvidos com a resposta ao estresse, mais especificamente, mecanismos de reparo de DNA e/ou manutenção da integridade genômica. 2.2 Específicos Para tanto, foram definidos os seguintes objetivos específicos: - Selecionar clones de C. violaceum que expressem genes relacionados à tolerância e/ou resistência a luz ultravioleta (UVC); - Seqüenciar clones selecionados e analisar as seqüências in silico para identificação de genes e predição de possíveis funções; - Analisar os clones de interesse por ensaios de complementação funcional e mutagenicidade; - Identificar por RT-PCR (Transcriptase Reversa) as possíveis ORFs em operon, bem como, analisar sua expressão a partir de variações e análise relativa. 84 6 Conclusões - Neste trabalho um operon em C. Violaceum indutível em resposta ao tratamento foi identificado envolvido com resposta ao estresse. Apesar deste operon ser encontrado em outros organismos, sua ativação sob estresse não havia sido relatada anteriormente; - O sinergismo observado em relação ao aumento da sobrevivência de DH10B na presença das ORFs CV_3722 e CV_3724 após tratamento com UV sugere que as proteínas codificadas por estes genes atuam em resposta ao estresse em vias independentes; - A ORF CV_3724 é homologa a uma proteína hipotética conservada e nossos dados abrem perspectivas para a caracterização de sua função em relação à resposta ao estresse; - Podemos destacar uma possível contribuição das ORFs CV_3721 (PilZ) e CV_3723 (TMK), uma vez que estas podem estar envolvidas em processos que podem favorecer o crescimento sob estresse, como a produção de biofilme e síntese de desoxinucleotídeos, respectivamente; - A ORF CV_3722 (HolB) devido a sua contribuição a mutagênese pode complementar a deficiência de RecA por sua atividade sobre a ativação do clamp ter um efeito estimulante na atividade da Pol IV; - Os clones PLE1G, PLE7B, PLE10B e PLE12H complementam a cepa DH10B por desempenharem funções à resposta celular frente ao estresse; - A ORF CV_1667 (PLE1G) que apresenta domínio GGDEF com função relacionada a biossíntese do nucleotídeo c-di-GMP (2º mensageiro) deve favorecer a sobrevivência do organismo devido a função regulatória deste mensageiro, o que permite uma resposta inter-relacionada com outras proteínas, como a PilZ (ORF CV_3721) na formação de biofilme; - A ORF CV_0391 que codifica uma proteína hipotética com domínios ICL/PEMP) (PLE7B) pode estar atuando no aumento de mutagenicidade no clone devido à atividade desta proteína no fornecimento de energia, evento primordial aos processos celulares de defesa e sobrevivência; 85 - A capacidade de complementação e mutagenicidade do clone PLE10B na da cepa DH10B não pode ser indicado devido a não identificação das ORFs hipotéticas (CV_1311 e 1312 sem domínios conservados), bem como, da não associação de função específica da Isonitrila Hidratase (ORF CV_1313) relacionada a estas atividades; - Mesmo de forma redundante, a ORF CV_4160 (subunidade a da RNA Pol de C. violaceum) deve ter contribuído na complementação (viabilidade) da cepa DH10B, já que atua na transcrição, processo essencial na resposta celular a agentes estressores; - Os dados obtidos neste trabalho são relevantes uma vez que a resposta ao estresse em bactérias de vida livre é mal compreendido. 86 Referências Bibliográficas Abdallah J, Caldas T, Kthiri F, Kern R and Richarme G. 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