MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE EFEITOS DA ÁGUA DE COCO HIPERTÔNICA E SINVASTATINA NO TRATAMENTO DA SEPSE E CHOQUE HIPOVOLÊMICO EM RATOS VANESSA DE FÁTIMA LIMA DE PAIVA MEDEIROS NATAL/RN JULHO DE 2017 VANESSA DE FÁTIMA LIMA DE PAIVA MEDEIROS EFEITOS DA ÁGUA DE COCO HIPERTÔNICA E SINVASTATINA NO TRATAMENTO DA SEPSE E CHOQUE HIPOVOLÊMICO EM RATOS Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros NATAL/RN 2017 Medeiros, Vanessa de Fátima Lima de Paiva. Efeitos da água de coco hipertônica e sinvastatina no tratamento da sepse e choque hipovolêmico em ratos / Vanessa de Fátima Lima de Paiva Medeiros. - Natal, 2017. 54f.: il. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientador: Aldo da Cunha Medeiros. 1. Sepse - Tese. 2. Choque hipovolêmico - Tese. 3. Sinvastatina - Tese. 4. Água de coco - Tese. 5. Tratamento - Tese. I. Medeiros, Aldo da Cunha. II. Título. RN/UF/BS-CCS CDU 616.94 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito iii VANESSA DE FÁTIMA LIMA DE PAIVA MEDEIROS EFEITOS DA ÁGUA DE COCO HIPERTÔNICA E SINVASTATINA NO TRATAMENTO DA SEPSE E CHOQUE HIPOVOLÊMICO EM RATOS Aprovada em 28 / 07 / 2017 Banca examinadora Presidente da Banca: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros Membros da Banca: Profa. Dra. Rejane Andrade de Carvalho - UFRN Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior – UFRN Dr. Robson de Macedo Filho – Membro externo – IRN Profa. Dra. Deborah de Melo Magalhães Padilha Membro externo – UnP iv DEDICATÓRIA a Fernanda Luíza, meu amor maior, minha continuidade. v AGRADECIMENTOS A Deus, por me permitir continuar a enfrentar desafios e realizar sonhos; À minha família, por todo apoio e amor incondicional; À minha filha, Fernanda Luíza, que sem saber, é a minha maior incentivadora; Ao Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros, meu orientador e amigo. Muito obrigada por tudo. Eternamente grata; Ao amigo Italo Medeiros pela parceria; À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela oportunidade e aprendizado; A todos os colegas e colaboradores que direta ou indiretamente contribuíram para a conclusão deste trabalho. vi RESUMO Reanimação e tratamento de choque e sepse são controversos e desafiadores. O objetivo deste estudo foi examinar os efeitos da água de coco + NaCl 3% + sinvastatina na reanimação em modelo murino de sepse abdominal e choque hemorrágico. Ratos Wistar machos adultos foram submetidos a sepse por ligadura e punção do ceco e choque hemorrágico, e divididos em quatro grupos de reposição hidroeletrolítica. 1. solução salina 0,9%; 2. água de coco + NaCl 3%; 3. água de coco + NaCl 3% + sinvastatina (microemulsão) 10 mg / Kg i.v; 4. Água de coco não modificada. Escore clínico, histologia e fluorescência do pulmão foram avaliados neste estudo. Dosagem sérica das citocinas TNF-α, IL-1β e contagem de leucócitos foram determinados. O tratamento com água de coco + NaCl 3% + sinvastatina resultou em resultados significativamente melhores de sobrevivência, análises bioquímicas e histopatologia quando comparando com os animais submetidos aos tratamentos água de coco + NaCl 3% e água de coco não modificada. Em conclusão, a ressuscitação com água de coco com Nacl 3% + sinvastatina teve efeito benéfico significativo sobre a redução dos níveis de citocinas e na atenuação de lesões pulmonares em modelo de sepse abdominal e choque hemorrágico. Também foi demonstrado que o tratamento com água de coco com Nacl 3% + simvastatina atuou positivamente na função do fígado e dos rins, e no escore clínico. Palavras-chave: Choque hemorrágico. Sepse. Ressuscitação. Sinvastatina. Água de coco. Ratos. vii ABSTRACT Resuscitation and treatment of shock and sepsis are controversial and challenging. The aim of this study was to examine the effects of coconut water + Nacl 3%+ simvastatin in resuscitation in a murine model of sepsis and hemorrhagic shock. In methods, adult male Wistar rats were subjected to sepsis by cecal ligation and puncture and hemorrhagic shock assigned to four fluid replenishment groups. Animals received 1. saline 0,9%; 2. coconut water (CW) + NaCl 3%; 3. coconut water + NaCl 3% + simvastatin (microemulsion)10 mg/Kg i.v; 4. Coconut water. Clinical score was determined and lung tissue was assessed for inflammation. Serum cytokines TNF-α, IL-1 β and leucocytes were measured. The results of this study indicated that coconut water+NaCl 3%+ simvastatin decreased significantly serum cytokines, survival, biochemical analysis and lung histopathological testing when compared to saline, water+NaCl 3% and coconut water. In conclusion, resuscitation with coconut water with Nacl 3%+simvastatin had a significant beneficial effect on downregulating cytokines and decreasing lung injury in a rat model of abdominal sepsis and hemorrhagic shock. We also demonstrated that coconut water with Nacl 3%+simvastatin administration clearly made liver and kidney function better and improved clinical score. Key words: Shock, Hemorrhagic. Sepsis. Resuscitation. Simvastatin. Foods Containing Coconut. Rats. viii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS FMOS .....................................................Falência múltipla de órgãos e sistemas HMG-CoA .............................................. 3-Hidroxi-3-metil-glutaril-CoenzimaA redutase PAM .............................................................................................Pressão arterial média CEUA ...................................................................Comissão de ética no uso de animais TNF-α ............................................................................. Fator de Necrose tumoral alfa IL-1β ..................................................................................................Interleucina-1 beta ELISA ................................................................ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay PCR ……………………………………......................................………Proteína-C reativa ALT ……….............................................................……………Alanina-aminotransferase AST …………….............................................……………….Aspartato-aminotransferase AC ............................................................................................................. Água de coco IS ......................................................................................................Intensidade do sinal LPC .......................................................................................Ligadura e punção do ceco ICV .......................................................................................................Indocianina verde ix SUMÁRIO RESUMO ..................................................................................................................... vii ABSTRACT ................................................................................................................ viii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ....................................................................... ix 1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 11 2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 14 2.1. OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 14 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 14 3. JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 15 4. MÉTODOS .......................................................................................................... 16 4.1. CHOQUE HEMORRÁGICO .......................................................................... 16 4.2. SEPSE ABDOMINAL E DELINEAMENTO DOS GRUPOS DE ESTUDO ..... 16 4.3. REPOSIÇÃO VOLÊMICA ............................................................................. 17 4.4. ESCORE CLÍNICO ....................................................................................... 17 4.5. EXAMES LABORATORIAIS ......................................................................... 18 4.6. IMAGENS DE FLUORESCÊNCIA PULMONAR (EX VIVO). ......................... 18 4.7. AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DE LESÃO PULMONAR................................. 19 4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................... 20 5. ARTIGO PRODUZIDO (Artigo objetivo da tese) .................................................. 21 6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES/CONCLUSÕES ............................ 45 7. REFERÊNCIAS ................................................................................................... 49 x 11 1. INTRODUÇÃO A sepse é uma afecção cuja fisiopatologia está ligada a um desequilíbrio entre substâncias anti-inflamatórias e proinflamatórias que irão mediar uma resposta aos danos causados aos tecidos orgânicos1. O processo infeccioso da sepse abdominal é desencadeado basicamente por bactérias gram-negativas e anaeróbias2. Mesmo com o avanço crescente no tratamento da sepse, esta ainda é uma grande causa de mortes em unidades de terapia intensiva, principalmente em pacientes politraumatizados, em usos de cateteres, ventilação mecânica, dependentes de esteroides e portadores de pneumonia3. Tal fato deve-se à grande chance do quadro clínico evoluir para um choque séptico em que é frequente ocorrer falência de múltiplos órgãos e sistemas (FMOS)3,4. Apesar do tratamento intensivo com reanimação agressiva, controle de pressão arterial e oferta adequada de oxigênio, pacientes com sepse muitas vezes persistem apresentando sinais de hipoperfusão tecidual, o que pode levar à acidose e, finalmente, FMOS5-10. Investigadores têm demonstrado em modelos em ratos que a sepse é caracterizada pela diminuição da velocidade do fluxo da microcirculação, aumento da heterogeneidade de fluxo, aumento de estase vascular e diminuição da densidade de capilares perfundidos11-14. As arteríolas, vasos capilares e vênulas da microcirculação funcionam como um complexo integrado para funções homeostáticas, hemostáticas e imunes. A sepse resulta em disfunção de todos estes sistemas via desregulação do controle vasomotor, lesão endotelial, ativação da coagulação, e distúrbio nas funções dos leucócitos15-17. Em resumo, a sepse provoca mudanças no ambiente microvascular, muitas das quais mediadas pela ativação e disfunção das células endoteliais. O resultado final comum desses efeitos é a diminuição do transporte de oxigênio para as células que, se não corrigidos, podem levar à FMOS e morte18-22. Trabalhos relevantes têm estudado a composição da água de coco. Santoso et al23 descreveram informações detalhadas sobre a presença de vitaminas, açúcares, ácidos orgânicos, ácidos graxos, aminoácidos, eletrólitos e minerais na água de coco (Cocus nucifera L.). Aleixo et al24 determinaram o 12 conteúdo de selênio na água de coco, usando a espectrometria de absorção atômica. Uma característica relevante da água de coco é sua capacidade antioxidante, exercida em parte pelo selênio25-27. Elementos traço e metais em pequenas dosagens foram determinados na água de coco, com potencial para uso na hidratação por via intravenosa e para substituir ou complementar soluções de nutrição parenteral28,29. A água de coco pode servir como solução para hidratação intravenosa, se outra solução não estiver disponível, conforme demonstrado por Campbell-Falck et al, que relataram um caso bem sucedido de hidratação intravenosa nas Ilhas Salomon e descreveram seu uso por essa via desde a II Guerra Mundial30. A composição eletrolítica da água de coco com 6 meses da retirada do fruto assemelha-se mais à do líquido intracelular do que à do extracelular, e consiste principalmente de potássio, cálcio, magnésio e cloro. O sódio é encontrado em concentração bem mais baixa do que no plasma humano e dos mamíferos em geral31. A infusão da água de coco por via intravenosa não interfere com os mecanismos de hemostasia32,33. As estatinas inibem a 3-Hidroxi-3-metil-glutaril-CoenzimaA redutase (HMG-CoA redutase), e foram estudadas inicialmente no tratamento das dislipidemias e da aterosclerose, uma doença inflamatória do endotélio vascular, cuja patogênese tem muitas semelhanças com a patogênese da sepse34,35. As estatinas exercem múltiplos efeitos em várias células, através de vários mecanismos. Esses efeitos, denominados pleiotrópicos, têm sido descritos como antiinflamatórios e imunomoduladores, e modificam as interações entre o endotélio e os leucócitos, alterando as respostas dessas células36,37. Adicionalmente, as estatinas modulam a sinalização das células inflamatórias, repercutindo na redução da liberação de citocinas e de proteínas da fase aguda da sepse36,38, além de exercerem importantes efeitos antioxidantes por vários mecanismos39. Trauma acompanhado de choque hemorrágico é a terceira causa de morte no mundo e principal causa de óbitos em pessoas com idade abaixo de 45 anos40-42. Nesses casos, um grande volume de solução salina isotônica é atualmente o tratamento padrão para o choque por hipovolemia43. Devido à sua eficácia limitada, diferentes tipos de soluções de reposição volêmica têm sido avaliados nos últimos anos, no sentido de garantir melhor expansão plasmática 13 para os pacientes. Nos anos 80 surgiu estudo que demonstrou que solução salina hipertônica 7,5% melhorou significativamente os parâmetros hemodinâmicos dos pacientes chocados, mesmo quando infundidos pequenos volumes44. Durante os anos seguintes, outros estudos mostraram que as soluções hipertônicas faziam aumentar significativamente a pressão arterial45 e o débito cardíaco, revertendo o choque hipovolêmico sem comprometer a função cardiopulmonar46,47. Por outro lado, também é sabido que a reposição do volume plasmático com soluções isotônicas pode induzir a hemodiluição, que é bem tolerada pelos pacientes hígidos. Os efeitos imediatos podem depender da duração e intensidade do sangramento. Pacientes frequentemente chegam às salas de emergência hemodiluídos devido à perda de grande volume de sangue. A possível influência desse estado de hemodiluição sobre a resposta do paciente ao tratamento ou a evolução de pacientes não está bem esclarecido. Além disso, o sangramento contínuo nesses pacientes requer tratamento adicional, frequentemente cirúrgico47. A reposição de volume e a solução ideal nesta situação não estão bem estabelecidas, persistindo controvérsias. Com o presente protocolo foi estudada a ação da reposição volêmica com solução de água de coco modificada associada à sinvastatina por via venosa, em ratos submetidos a duplo desafio: sepse e choque hemorrágico. São situações comuns e graves na prática clínica diária, que continuam com alta morbidade e mortalidade nos dias atuais. 14 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL Este trabalho tem o objetivo de examinar se a sinvastatina atua sinergicamente com água de coco hipertônica na reposição volêmica e na evolução da sepse abdominal associada ao choque hemorrágico em ratos. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Avaliar a sobrevida e escores clínicos dos animais;  Comparar a reposição volêmica com água de coco a 3% de sódio com a solução salina 0,9%;  Avaliar o uso concomitante da sinvastatina intravenosa (i.v.) com a reposição volêmica;  Comparar dados laboratoriais entre os grupos. 15 3. JUSTIFICATIVA Pelo exposto, o choque hemorrágico é muito frequente, grave e induz respostas inflamatórias sistêmicas e danos a uma série de órgãos, através de vários mecanismos. Até os dias atuais, não há uma solução de reposição da volemia que atenda satisfatoriamente o tratamento do choque por perda sanguínea, especialmente quando associado à sepse. Os efeitos das estratégias de ressuscitação na resposta inflamatória ao choque e sepse não são bem conhecidos atualmente. Há algumas evidências recentes de que o plasma fresco pode ter efeito anti-apoptótico nas células endoteliais, que o sangue total fresco infundido precocemente tem efeito no controle da liberação de citocinas, e que soluções hipertônicas têm ação importante na redução da mortalidade do choque e da sepse. São achados clínicos e experimentais que têm demonstrado resultados ora satisfatórios, ora deletérios, demonstrando que a controvérsia persiste. Justifica-se o protocolo experimental aqui proposto, através do qual foi testado o uso da sinvastatina i.v. (de efeitos anti-inflamatórios e imunomoduladores) associado à água de coco, que foi utilizada na II Guerra Mundial para hidratação i.v. A partir de então, nenhum trabalho com metodologia bem estruturada foi publicado na literatura a respeito da reposição volêmica com água de coco em indivíduos chocados. A água de coco tem sido estudada especialmente quanto à sua composição, para uso oral, sabendo-se do seu teor em eletrólitos, aminoácidos, lipídeos, glicídeos, antioxidantes, pH ácido, etc. É grande o potencial da água de coco para uma série de aplicações na Medicina, de modo que se torna conveniente investir em estudo da sua utilização para reposição volêmica em casos de choque séptico. Será testada a hipótese de que a reposição volêmica com água de coco modificada com 3% de sódio, associada à sinvastatina i.v. contribui para diminuir a produção de citocinas proinflamatórias, reduzir a lesão de órgãos vitais e prolongar a sobrevida de ratos em modelo de choque e sepse. 16 4. MÉTODOS Este protocolo foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética para Uso de Animais (CEUA) institucional, protocolo 36/2014. O cuidado na utilização dos animais seguiu as normas vigentes da Legislação Brasileira para o uso científico de animais (Lei nº 11.794/2008). O estudo foi realizado nas dependências do Núcleo de Cirurgia Experimental-UFRN. Foi utilizado modelo animal de choque hemorrágico e sepse abdominal para a avaliação de possíveis efeitos da associação de sinvastatina e água de coco hipertônica na reposição volêmica em ratos Wistar, jovens machos, com peso variando entre 250 e 300g. Ficaram em jejum alimentar de 12 horas e hídrico de 3 horas antes de serem submetidos à anestesia para a realização do experimento. Foram anestesiados com uma mistura composta por cetamina (70 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), administrados por via intramuscular e re-administrados periodicamente se necessário, até o término dos experimentos. 4.1. CHOQUE HEMORRÁGICO Após a estabilização da anestesia, a monitorização foi instalada. A veia e artéria femoral contralateral foram dissecadas para a realização e monitorização da perda volêmica e sua reposição. Cânulas de silicone calibre 24F foram introduzidas na artéria femoral para monitorização da pressão arterial média e na veia femoral para drenagem sanguínea e reposição volêmica. Após um período de estabilização para os grupos de animais, o sangue foi drenado pela veia femoral até a pressão arterial média (PAM) estabilizar em 35 mmHg, sendo anotado o volume de sangue retirado de cada animal para cálculo da reposição volêmica. A PAM foi monitorada através de Equipamento para Medição de Pressão Arterial Invasivo (SP, Brazil). O quadro de choque hemorrágico foi mantido por um período de 60 minutos. 4.2. SEPSE ABDOMINAL E DELINEAMENTO DOS GRUPOS DE ESTUDO Completados 60 minutos de choque, com os animais anestesiados, foi feita laparotomia mediana, ligadura e punção do ceco. Após este período, os animais receberam a reposição volêmica por via intravenosa ao longo de 10 17 minutos. O volume de reposição foi igual ao dobro do volume sanguíneo perdido. Para cada solução infundida para reposição volêmica houve um grupo de animais, totalizando 4 grupos (n=8/grupo), segundo o seguinte delineamento: 1) reposição com solução salina 0,9%; 2) reposição com água de coco + NaCl 3%; 3) reposição com água de coco + NaCl 3% de sódio + sinvastatina (microemulsão) 5 mg/Kg i.v.; 4) reposição com água de coco não modificada. Durante o período de choque, indução da sepse e reposição volêmica, os animais foram mantidos em microambiente aquecido a 37ºC (placa aquecedora Insight, São Paulo, Brasil) e anestesiados até o final do experimento. 4.3. REPOSIÇÃO VOLÊMICA A água de coco foi obtida de espécimes de coco (Cocus nucifera L.) de 6 meses (período desde a inflorescência até a colheita dos frutos), com técnica estéril, retirada do coco imediatamente antes da administração dos animais e devidamente modificada até atingir o nível de NaCl 3%, através da introdução de volume de NaCl 10% previamente calculado para atingir esta concentração. Foi determinado o pH da água de coco, com pHâmetro (Micronal, São Paulo, Brasil), em média pH 5,8; o pH foi previamente reajustado para o valor 7,4 com utilização de bicarbonato de sódio 10% gota a gota. Tanto o pH, quanto o conteúdo de NaCl para 3%, foram ajustados imediatamente antes da infusão intravenosa. Foi utilizada solução salina 0,9% de procedência B. Braun, Rio de Janeiro, Brasil. Todas as soluções foram infundidas através de bomba de infusão (B. Braun, Rio de Janeiro, Brasil), calculando-se o volume usado sempre durante 10 min., em velocidade de infusão constante. Durante a infusão todas as soluções foram aquecidas a 36,5ºC. 4.4. ESCORE CLÍNICO O escore clínico dos ratos foi determinado após seis e 18 horas da reanimação, os demais exames, após 18 horas. Estes intervalos de tempo e a análise dos escores foram escolhidos com base em trabalho anterior54. A pontuação consistiu em analisar os seguintes parâmetros: 1- presença de piloerecção, 2- frequência respiratória alterada, 3- alteração fecal, 4- 18 lacrimejamento/alterações da pálpebra, 5-contração do abdome, 6- falta de resistência ao segurar, 7- mudança na temperatura corporal, 8- resposta de alerta (escapar após o toque), 9-exploração do ambiente, e 10- atividade locomotora comprometida. Para cada parâmetro foi atribuído 1 ponto, e na ausência do parâmetro analisado, nenhum ponto. Em seguida, os pontos foram calculados para cada rato. Uma pontuação de 0 indicou que o animal não apresentava qualquer alteração clínica; uma pontuação entre 1 e 3 indicou sepse leve, entre 4 e 7 indicou sepse moderada e entre 8 e 10 indicou sepse grave. 4.5. EXAMES LABORATORIAIS Os animais sobreviventes após 18 hs de observação foram novamente anestesiados e submetidos à coleta de sangue por punção cardíaca para dosagens. O soro foi separado através de centrifugação a 3000rpm e estocado a -40ºC para posterior dosagem. Os níveis séricos de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e Interleucina 1-beta (IL-1β) foram determinados usando ensaio quantitativo com kits ELISA, de acordo com as recomendações do fabricante. (PeproTech, USA). Foram determinados aspartato-aminotransferase (AST), alanina-aminotransferase (ALT), uréia, creatinina, proteína C-reativa (PCR) e leucograma. Uréia e creatinina como indicadores de função renal e filtração glomerular. A PCR foi dosada pelo método da nefelometria. 4.6. IMAGENS DE FLUORESCÊNCIA PULMONAR (EX VIVO). Com os ratos ainda anestesiados, imediatamente após a coleta de sangue foi feita a injeção de indocianina verde (ICV) 10mg/Kg (Ophthalmos, São Paulo Brasil) pela veia femoral. Dez minutos após a injeção, os pulmões e a traqueia foram removidos, chegando à eutanásia dos animais. As imagens ópticas foram obtidas usando o equipamento InVivo FX para fluorescência (Carestream Molecular Imaging, USA). Filtros de excitação e de emissão foram fixados em 710 nm e 700 nm, respectivamente. Os pulmões foram colocados na câmara de imagem do equipamento. Um protocolo de imagenologia (tempo de exposição de 20 segundos, binning 2x2, f-stop 2.8, campo de visão 120 mm, e plano focal 10 mm) foi mantido para todos os exames, e as imagens foram 19 feitas comparando os grupos. As imagens ópticas do estudo ex vivo foram avaliadas qualitativamente através da avaliação da presença ou ausência de fluorescência na região dos pulmões inflamados, comparando apenas o grupo água de coco + Na 3% + sinvastatina com a fluorescência do grupo tratado com solução salina 0,9%. A análise quantitativa dos exames pulmonares foi realizada por medição da intensidade de sinal de fluorescência (IS) dos pulmões, utilizando o software Kodak Molecular 5.0. Uma região de interesse criada por uma ferramenta automatizada foi determinada em torno do órgão. As intensidades de sinal de interesse foram expressas como fluorescência arbitrária em pixels. Fluorescências em tons de cinza foram coloridas via software do equipamento para fins quantificação, de acordo com uma escala de cores definida com os maiores e menores níveis de intensidade de fluorescência média (vermelho - intensidade máxima e roxo intensidade luminosa mínima, respectivamente). Os alvos eram foco séptico e inflamação nos pulmões. 4.7. AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DE LESÃO PULMONAR. Os pulmões foram retirados e imersos em formalina tamponada 10% durante 48 horas, sendo em seguida embebidos em parafina. Seções de 4µm foram coradas com hematoxilina e eosina. A arquitetura pulmonar foi avaliada por microscopia óptica com microscópio BX50 equipado com câmera digital DS30 (Olympus, Japan). Duas secções aleatórias de tecido de quatro diferentes pulmões em cada grupo foram examinadas por um investigador sem conhecimento prévio dos grupos. Os escores de lesão pulmonar foram quantificados de acordo com os critérios usados por Matute-Bello et al, que estabelecem valores totais entre 0 e 1 (Tabela 1)48. 20 Tabela 1 – Sistema de avaliação de lesão pulmonar (adaptado de Matute-Bello at al)48. Escore por campo Parâmetro 0 1 2 A. Neutrófilos no espaço alveolar Nenhum 1-5 >5 B. Neutrófilos no espaço intersticial Nenhum 1-5 >5 C. Membranas hialinas (presença) Nenhum 1 >1 D. Debris proteináceos enchendo os espaços Nenhum 1 >1 aéreos E. Espessamento do septo alveolar Nenhum 2x – 4x >4x A 1 C s ore 1 n ero e a pos 4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados foram armazenados e analisados estatisticamente através do software SPSS 17.0 e GraphPad Prism® 7.00 for Windows, GraphPad Software, La Jolla, Califórnia, EUA, (www.graphpad.com). Os resultados dos parâmetros analisados foram confrontados estatisticamente empregando-se o método de comparações múltiplas, pela análise de variância (ANOVA) com medidas repetidas, seguido dos testes de Student, e de Tukey para comparação entre grupos. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando p<0,05. 21 5. ARTIGO PRODUZIDO (Artigo objetivo da tese) EFFECTS OF HYPERTONIC COCONUT WATER AND SIMVASTATIN IN THE TREATMENT OF SEPSIS AND HEMORRHAGIC SHOCK IN RATS Foi publicado originalmente em Inglês no periódico Acta Cirúrgica Brasileira que possui fator de impacto 0,58 e Qualis B3 da CAPES para a área Medicina II. EFEITOS DA ÁGUA DE COCO HIPERTÔNICA E SINVASTATINA NO TRATAMENTO DA SEPSE E CHOQUE HEMORRÁGICO EM RATOS1 Vanessa de Fátima Lima Paiva MedeirosI, Ítalo Medeiros AzevedoI, Marília Daniela Ferreira CarvalhoI, Eryvaldo Sócrates Tabosa EgitoII, Aldo Cunha MedeirosIII DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S0102-865020160120000008 IAlunos do doutorado, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal-RN, Brasil. Aquisição e interpretação dos dados, procedimentos técnicos, preparação do manuscrito. IIProfessor titular, Departmento de Farmácia, UFRN, Natal-RN, Brasil. Bolsista CNPq/PQ.1D. Análise e interpretação de dados, procedimentos técnicos, revisão crítica. IIIProfessor titular, Chefe do Núcleo de Cirurgia Experimental, UFRN, Natal-RN, Brasil. Bolsista CNPq/PQ.2. Concepção, delineamento, responsável pelo conteúdo científico e intelectual do estudo; análise e interpretação dos dados; revisão crítica. __________________________________________________________ RESUMO Objetivo: Reanimação e tratamento de choque e sepse são controversos e desafiadores. O objetivo deste estudo foi examinar os efeitos da água de coco + NaCl 3% + sinvastatina na reanimação em modelo murino de sepse e choque hemorrágico. Métodos: Ratos Wistar machos adultos foram submetidos a sepse por ligadura e punção do ceco e choque hemorrágico, divididos em quatro grupos de reposição hidroeletrolítica. 1. solução salina 0,9%; 2. água de coco + NaCl 3%; 3. água de coco + NaCl 3% + sinvastatina (microemulsão) 10 mg / Kg i.v; 4. água de coco não modificada. Escore clínico, histologia e fluorescência do pulmão foram avaliados para estudar inflamação. Citocinas séricas e leucócitos foram determinados. Resultados: O tratamento com água de coco + NaCl 3%+ sinvastatina resultou em resultados significativamente melhores de sobrevivência, análises bioquímicas e histopatologia comparando com os animais submetidos aos outros tratamentos. Conclusão: Em 22 conclusão, a água de coco + simvastatina exerceu efeitos moduladores no choque e sepse através de reduzindo níveis de citocinas proinflamatórias, além de redução de lesões pulmonares, dados bioquímicos e atividade dos neutrófilos. Também ficou demonstrado que a administração de água de coco com Nacl 3% + simvastatina, influenciou positivamente na função do fígado e dos rins e melhorou o escore clínico dos animais. Palavras chave: Sepse. Choque hemorrágico. Citocinas. Ressuscitação. Coco. Água. Ratos. _______________________________________________________________ ABSTRACT Purpose: Resuscitation and treatment of shock and sepsis are controversial and challenging. The aim of this study was to examine the effects of coconut water + Nacl 3%+ simvastatin in resuscitation in a murine model of sepsis and hemorrhagic shock. Methods: Adult male Wistar rats were subjected to sepsis by cecal ligation and puncture and hemorrhagic shock assigned to four fluid replenishment groups. Animals received 1. saline 0,9%; 2. coconut water (CW) + NaCl 3%; 3. coconut water + NaCl 3% + simvastatin (microemulsion) 10 mg/Kg i.v; 4. Natural coconut water. Clinical score and lung tissue was assessed for inflammation. Serum cytokines TNF-α, IL-1 β and leucocytes were determined. Results: The results of this study indicated that coconut water+NaCl 3%+ simvastatin decreased significantly serum cytokines, Survival, biochemical analysis and lung histopathological testing when compared to saline and other treatments.. Conclusion: In conclusion, coconut water Na 3% + simvastatin positively affected shock and sepsis rats through a mechanism associated with downregulation of cytokines, in addition to other well-known effects such as decreased lung injury, biochemical data and neutrophil activity. We also demonstrated that coconut water with Nacl 3%+simvastatin administration clearly made liver and kidney function better and improved clinical score. Key words: Sepsis. Hemorrhagic shock. Cytokines. Resuscitation. Water. Coconut. Rats. _______________________________________________________________ 23 INTRODUÇÃO A fisiopatologia da sepse está relacionada a um desequilíbrio entre substâncias anti-inflamatórias e pró-inflamatórias, que irá mediar a resposta para o dano dos tecidos corporais1. Apesar do tratamento intensivo com ressuscitação agressiva, controle da pressão arterial e fornecimento adequado de oxigênio, pacientes com sepse frequentemente persistem mostrando sinais de hipoperfusão tecidual, o que pode levar à acidose e, eventualmente, à falência de múltiplos órgãos2-4. Pesquisadores mostraram que a sepse é caracterizada pela diminuição da velocidade de fluxo microcirculatório, aumento da heterogeneidade desse fluxo, aumento estase vascular e diminuição do número de capilares perfundidos5,6. A falha no fluxo sanguíneo na microcirculação resulta em shunts de sangue para os tecidos, levando ao déficit de oxigênio necessário para o metabolismo celular normal7,8. Mediadores inflamatórios sistêmicos e endotoxinas alteram as conexões intracelulares e os sinais utilizados pelas células endoteliais, atuando como um sistema unificado. Essa interrupção pode resultar em alteração na distribuição do fluxo sanguíneo nos tecidos9. O choque hemorrágico e consequente hipoperfusão tecidual levam a uma redução da oxigenação celular, acidose metabólica e hipotermia10. A redução do suprimento de O2 provoca aumento do metabolismo anaeróbico e redução dos níveis de ATP e cálcio intracelular, que promovem mudanças significativas na função celular, estimulando a liberação de citocinas pró- inflamatórias. Estas, por sua vez, podem alterar a função imunológica de macrófagos e linfócitos, causando imunossupressão e aumento do risco de infecção11. Alguns trabalhos que estudaram a composição da água de coco (AC). Santoso et al.12 descreveram a presença de vitaminas, açúcares, ácidos orgânicos, ácidos graxos, aminoácidos, minerais e eletrólitos na água do coco (Cocus nucifera L.). Aleixo et al13 determinaram o seu teor de selênio utilizando a espectrometria de absorção atômica. Outra característica importante da AC é a sua capacidade antioxidante14-16. Elementos traço e metais em pequenas doses foram determinados, levando a acreditar que a AC tem potencial de uso 24 como soluções de hidratação intravenosa ou nutrição parenteral suplementar17. Campbell-Falck et al.18 relataram um caso bem sucedido de hidratação intravenosa nas Ilhas Salomão e descreveram seu uso para este fim durante a II Guerra Mundial. A composição eletrolítica da AC aos 6 meses assemelha-se aos meios intracelular e extracelular e consiste principalmente em potássio, cálcio, magnésio e cloro. O sódio é encontrado em uma concentração muito menor do que no plasma humano19. Embora a AC já tenha sido descrita como solução viável para ressuscitação, relatos do seu uso intravenoso são escassos20,21. Há evidências de que não interfere nos mecanismos de hemostasia22. As estatinas inibem a HMG-CoA redutase e têm sido intensamente estudadas para a prevenção da aterosclerose, doença inflamatória do endotélio vascular, cuja patogênese tem semelhanças com a patogênese da sepse23. Embora os efeitos das estatinas tenham sido inicialmente designados apenas para tratar os altos níveis de colesterol, muitos outros benefícios vieram a ser considerados e estudados. As estatinas exercem múltiplos efeitos em várias células, através de diversos mecanismos. Estes efeitos pleiotrópicos foram descritos como antiinflamatórios, modificando as interações entre o endotélio e leucócitos24,25. Além disso, as estatinas modulam a sinalização das células inflamatórias, que por sua vez reduzem a liberação de citocinas e proteínas da fase aguda da sepse26 e exercem outros importantes efeitos antioxidantes27. A solução ideal para a reposição de volume em situações de sepse associada ao choque hemorrágico ainda não está bem estabelecida. Neste protocolo estudamos os efeitos de uma solução de AC modificada, combinada com sinvastatina intravenosa, para reposição de volume sanguíneo em ratos submetidos a um duplo desafio: sepsis e choque hemorrágico. Esta situação é comum e muito grave na prática cirúrgica, especialmente no trauma, com alta morbidade e mortalidade. Este estudo teve como objetivo examinar os efeitos da AC hipertônica combinada com sinvastatina, como fluido de ressuscitação em modelo de choque hemorrágico e sepse abdominal em ratos. 25 MÉTODOS Este protocolo foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética para Uso de Animais (CEUA) da UFRN, sob o protocolo 36-2014. O cuidado na utilização dos animais seguiu as normas vigentes da Legislação Brasileira para o uso científico de animais (Lei nº 11.794/2008). O estudo foi realizado nas dependências do Núcleo de Cirurgia Experimental-UFRN. Foi utilizado modelo animal de choque hemorrágico e sepse abdominal para a avaliação de possíveis efeitos da associação de sinvastatina e água de coco hipertônica na reposição volêmica em ratos Wistar jovens, com peso variando entre 250 e 300 g. Ficaram em jejum alimentar de 12 horas e hídrico de 3 horas antes de serem submetidos à anestesia para a realização do experimento. Foram anestesiados com uma mistura composta por cetamina (70 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), administrados por via intramuscular e re-administrados periodicamente se necessário, até o término dos experimentos. Choque Hipovolêmico Após a estabilização da anestesia, a monitorização foi instalada. A veia e artéria femoral contralateral foram dissecadas para a realização e monitorização da perda volêmica e sua reposição. Cânulas de silicone calibre 24F foram introduzidas na artéria femoral para monitorização da pressão arterial média (PAM) e na veia femoral para drenagem sanguínea e reposição volêmica. Após um período de estabilização para os grupos de animais, o sangue foi drenado pela veia femoral até a PAM estabilizar em de 35 mmHg, sendo anotado o volume de sangue retirado de cada um deles para cálculo da reposição volêmica. A PAM foi monitorada através do Medidor de Pressão Arterial Invasivo (Insight, Ribeirão Preto, SP, Brazil). O quadro de choque hemorrágico foi mantido por um período de 60 minutos. Sepse Abdominal e Delineamento dos Grupos de Estudo Completados 60 minutos de choque, com os animais anestesiados, foi feita laparotomia mediana, ligadura e punção do ceco. Após este período, os animais receberam a reposição volêmica por via intravenosa ao longo de 10 26 minutos. O volume de reposição foi igual ao dobro do volume sanguíneo perdido. Para cada solução infundida para reposição volêmica houve um grupo de animais, totalizando 4 grupos (n=8/grupo): 1) reposição com solução salina 0,9%; 2) reposição com água de coco + NaCl 3%, 3) reposição com água de coco + NaCl 3% de sódio + sinvastatina (microemulsão) 5 mg/Kg i.v; 4) reposição com água de coco normal. Durante o período de choque e reposição volêmica, os animais foram mantidos em microambiente aquecido a 37ºC (placa aquecedora Insight, São Paulo, Brasil) e anestesiados até o final do experimento. Reposição Volêmica A água de coco foi obtida de espécimes de coco (Cocus nucifera L.) de 6 meses (período desde a inflorescência até a colheita dos frutos), com técnica estéril, retirada do coco imediatamente antes da administração nos animais e devidamente modificada até atingir o nível de NaCl 3%. Foi determinado o pH da água de coco, com pHâmetro (Micronal, São Paulo, Brasil), em média 5,8; o pH foi previamente reajustado para o valor 7,4 com utilização de bicarbonato de sódio 10%, bem como o conteúdo de NaCl para 3%, imediatamente antes da infusão intravenosa. Foi utilizada solução salina 0,9% de procedência B. Braun, Rio de Janeiro, Brasil. Todas as soluções foram infundidas através de bomba de infusão (B. Braun, Rio de Janeiro, Brasil), calculando-se o volume usado sempre durante 10 min., em velocidade de infusão constante. Durante a infusão todas as soluções foram aquecidas a 36,5ºC. O protocolo experimental incluiu avaliação de parâmetros clínicos, de exames séricos, hematológicos, de imagem e sobrevida, 18 horas após a ressuscitação volêmica. Escore Clínico O escore clínico de todos os animais foi examinado após seis e 18 horas da reanimação, sendo os demais exames realizados apenas após 18 horas. Os intervalos de tempo para análise foram escolhidos com base em estudo anterior28. A pontuação do escore consistiu em analisar os seguintes parâmetros: 1- presença de piloerecção, 2- frequência respiratória alterada, 3- alteração fecal, 4-lacrimejamento/alterações da pálpebra, 5-contração do 27 abdome, 6- falta de resistência ao segurar, 7- mudança na temperatura corporal, 8- resposta de alerta (escapar após o toque), 9-exploração do ambiente, e 10- atividade locomotora comprometida. Para cada parâmetro foi atribuído 1 ponto, e na ausência do parâmetro analisado, nenhum ponto. Em seguida, os pontos foram calculados para cada rato. Uma pontuação de 0 indicou que o animal não apresentava qualquer alteração clínica; uma pontuação entre 1 e 3 indicou sepse leve, entre 4 e 7 indicou sepse moderada e entre 8 e 10 indicou sepse grave. Exames Laboratoriais Os animais sobreviventes após 18 hs de observação foram novamente anestesiados e submetidos à coleta de sangue por via intracardíaca para dosagens. O soro foi separado através de centrifugação a 3000rpm e estocado a -40ºC para posterior dosagem. Os níveis séricos de TNF-α e IL-1β fora determinados usando ensaio quantitativo com kits ELISA, de acordo com as recomendações do fabricante (PeproTech, USA). Foram determinados aspartato-aminotransferase (AST), alanina-aminotransferase (ALT), uréia, creatinina, proteína C-reativa (PCR) e leucograma. Ureia e creatinina como indicadores de função renal e filtração glomerular. A PCR foi dosada pelo método da nefelometria. Imagens de fluorescência pulmonar. Imediatamente após a coleta de sangue, com os animais ainda anestesiados, foi feita injeção i.v. de indocianina verde (ICV) 10mg/Kg, (Ophthalmos, São Paulo Brasil). Dez minutos após a injeção, os pulmões e a traqueia foram retiratos, atingindo a eutanásia dos ratos. As imagens ópticas foram obtidas usando o equipamento InVivo FX para fluorescência (Carestream Molecular Imaging, USA). Filtros de excitação e de emissão foram fixados em 710 nm e 700 nm, respectivamente. Os pulmões foram colocados na câmara de imagem do equipamento. Um protocolo de imagenologia (tempo de exposição de 20 segundos, binning 2x2, f-stop 2.8, campo de visão 120 mm, e plano focal 10 mm) foi mantido para todos os exames, e as imagens foram feitas comparando grupos. As imagens ópticas do estudo ex vivo foram avaliadas qualitativamente através da avaliação da presença ou ausência de 28 fluorescência na região dos pulmões inflamados, comparando apenas o grupo CW + Na 3% + sinvastatina com a fluorescência do grupo tratado com solução salina 0,9%. A análise quantitativa dos exames pulmonares foi realizada por medição da intensidade de sinal de fluorescência (SI) dos pulmões, utilizando o software Kodak Molecular 5.0. Uma região de interesse criada por uma ferramenta automatizada foi determinada em torno do órgão. As intensidades de sinal de interesse foram expressas como fluorescência arbitrária em pixels. Fluorescência em tons de cinza foram coloridos via software para fins de quantificação de acordo com uma escala de cores definida com os maiores e menores níveis de intensidade de fluorescência média (vermelho - intensidade máxima e roxo intensidade luminosa mínima, respectivamente). Os alvos eram foco séptico e inflamação nos pulmões. Avaliação Histológica de Lesão Pulmonar Os pulmões foram retirados e imersos em formalina tamponada 10% durante 48 horas, sendo em seguida embebidos em parafina. Seções de 4µm foram corados com hematoxilina e eosina. A arquitetura pulmonar foi avaliada por microscopia óptica com microscópio BX50 equipado com câmera digital DS30 (Olympus, Japan). Duas secções de tecido aleatórias de quatro diferentes pulmões em cada grupo foram examinadas por um investigador sem conhecimento prévio dos grupos. Os escores de lesão pulmonar foram quantificados de acordo com os critérios usados por Matute-Bello et al, que estabelecem valores totais entre 0 e 1 (Tabela 1)29. 29 Tabela 1 – Sistema de avaliação de lesão pulmonar (adaptado de Matute-Bello at al). De acordo com a American Thoracic Society29. Parâmetro Escore por campo 0 1 2 a.Neutrófilos no espaço alveolar Nenhum 1-5 >5 b. Neutrófilos no espaço intersticial Nenhum 1-5 >5 c. Membranas hialinas Nenhum 1 >1 d. Debris proteináceos enchendo os Nenhum 1 >1 espaços aéreos e. Espessamento do septo alveolar Nenhum 2x – 4x >4x Escore = [(20 x A) + (14 x B) + (7 x C) + (7 x D) + (2 x E)]/(número de campos x 100) Análise Estatística Os dados foram armazenados e analisados estatisticamente através do software SPSS 17.0 and GraphPad Prism® 7.00 for Windows, GraphPad Software, La Jolla, Califórnia, EUA, www.graphpad.com. Os resultados dos parâmetros analisados foram confrontados estatisticamente empregando-se o método de comparações múltiplas, pela análise de variância (ANOVA) com medidas repetidas, seguido dos testes de Tukey ou do teste t de Student para comparação entre grupos. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando p<0,05. RESULTADOS Um rato do grupo salina morreu durante os experimentos. Todos os outros animais sobreviveram. A administração de água de coco + NaCl 3% + sinvastatina evitou diversas reações clínicas adversas após a indução da sepse. Para investigar esses efeitos, avaliamos o efeito da associação de água de coco + NaCl 3% + sinvastatina na da sepse/choque, usando escores clínicos. Seis horas após a LPC, os ratos apresentaram sinais clínicos evidentes de sepse, e a maioria dos animais do grupo sepse teve sepse grave. A associação de água de coco + NaCl 3% + sinvastatina reduziu o escore 30 clínico 18 horas após LPC, melhorando o estado clínico desses animais (As médias destes dados estão resumidos na Fig. 1) 1 0 ** * # # 9 S e v e re S e p s is 8 7 6 5 M o d e ra te S e p s is 4 3 2 M ild S e p s is 1 0 in ,9 % a 3 % a t W 0 s t C e + N v a lin W im S a C + S 3 %a + N W C Figura 1 – Resultados da pontuação clínica dos animais, segundo os grupos de tratamentos. *p<0,05 quando comparado com CW+Na3%+sinvastatina; **p<0,01 quando comparado com CW+Na3%+sinvastatina; ##p<0,01 quando comparado com CW+Na3%+sinvastatina. Os níveis séricos das citocinas inflamatórias TNF-α e IL-1β fora medidos em todos os grupos. Os valores encontrados foram menores nos animais do grupo tratado com água de coco + NaCl3%, associada a sinvastatina. Embora todos os grupos tenham mostraram uma diferença significativa (p<0,05) em comparação com o grupo cujos animais foram tratados com solução salina, os melhores resultados foram encontrados nos animais com reposição volêmica através de água de coco + NaCl 3%, associada a sinvastatina (Tabela 2). Mais estudos nesta área são necessários para decifrar o mecanismo dessa questão em particular. C lin ic a l s c o re 2 4 h a f te r 31 Tabela 2 – Dosagem de interleucinas nos animais submetidos a choque hipovolêmico e sepse abdominal. Citocinas Grupos TNF  (pg/ml) IL-1 (pg/ml) Reposição Salina 0,9% 545.5±36ab 174.9±16a AC Na3% 364.8±42ab 86.2±12a ACNa3%S 181.7±16.1b 48.1±8a AC 210.1±14.5a 70.3±5a *Média  Desvio Padrão. (1) Medidas seguidas de mesma letra diferem entre si significativamente ao nível de 5% de probabilidade pelo teste t de Tukey. AC, água de coco. TNF, fator de necrose tumoral; IL, interleucina. Quanto às dosagens bioquímicas, o tratamento dos animais com a associação água de coco com Na3% e sinvastatina, teve os mais baixos níveis de proteína C-reativa, AST, ALT, uréia e creatinina, com diferenças estatisticamente significativas, comparando com os demais grupos (tabela 3). O mesmo ocorreu com a leucometria, onde os valores de leucócitos totais e neutrófilos dos animais tratados com água de coco + Na3%, associada a sinvastatina, mostraram-se significativamente abaixo dos valores dos demais grupos. Entretanto, como se observa na tabela 4, o percentual de eosinófilos foi significativamente mais elevado nos ratos tratados com esta associação (p<0,05). 32 Tabela 3 – Dosagens bioquímicas nos animais submetidos a choque hipovolêmico e sepse abdominal. Bioquímica Proteína Uréia Creatinina AST ALT Grupos C-reativa (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) Reposição (mg/dl) 9.40  55,2±6,2ab 62,5±4,9a 76,8±4,9ab 3,78±0,5ab Salina 0,9% 2.2ab 4.72  39,5±9,3a 39,3±5,7a 47,1±3,4a 2,64±0,6a AC Na3% 0.39a 2.72  32,1±2,4ab 26,5±2,6a 35,3±2,9ab 1,36±0,2ab ACNa3%S 0.46ab 4.45  42,1±7,4b 36,5±2,6a 45,3±4,0b 2,86±0,3b AC 0.57b *Média  Desvio Padrão. (1) Medidas comparativas entre grupos, seguidas de mesma letra, diferem significativamente entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. AC – água de coco; Na – sódio; S – sinvastatina; AST – aspartato aminotransferase; ALT – alanina aminotransferase. Tabela 4 – Leucometria total, neutrófilos, linfócitos e eosinófilos nos animais submetidos a choque hipovolêmico e sepse abdominal. Leucócitos Grupos Leucócitos/µL) Neutrófilos (%) Eosinófilos(%) Reposição 12.46  Saline 0,9% 1.26ab 77.37  6.4ab 0.39  0.4a AC Na3% 8.72  0.39a 54.50  7.0a 4.57  0.5a ACNa3%S 6.68  0.56a 47.17  6.6ab 5.41  0.6a AC 8.32  0.53b 57.10  8.5b 3.68  0.7a *Média  Desvio Padrão. (1) Medidas seguidas de mesma letra diferem entre si significativamente ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. AC – água de coco. 33 A B C D E F Figura 2 – Comparação entre grupos A expressão do marcador de fluorescência foi mais intensa após injeção i.v. da indocianina verde nos animais tratados com salina (A,B,C) quando comparado com os ratos do grupo tratado com água de coco +NaCl3% + sinvastatina (D,E,F). A intensidade dos finais de fluorescência foi mais pronunciada no pulmão direito. Tabela 5 – Intensidade do sinal de fluorescência após injeção intravenosa de indocianina verde (10 mg/kg). Grupos Intensidade do sinal Salina 0,9% 230±12.1a AC Na3% S 117±8.3a *Média  Desvio Padrão. (1) Medidas comparativas entre grupos, seguidas de mesma letra, diferem significativamente entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste t. AC – água de coco; S – sinvastatina. A intensidade do sinal (IS) de fluorescência dos pulmões foi medida nos animais dos grupos salina e água de coco NaCl3% + simvastatina. As imagens foram significativamente mais intensas nos pulmões dos animais do grupo salina em comparação com os animais do grupo água de coco NaCl3% + sinvastatina, como demonstrado na figura 2. A Tabela 5 mostra que os correspondentes dados quantitativos da intensidade dos sinais fluorescentes dos pulmões dos animais do grupo salina foram significativamente mais elevados, em comparação com o grupo água de coco NaCl3% + sinvastatina 34 10 minutos após a injecção intravenosa de 10 mg / kg de indometacina verde (p<0,05). Análise histopatológica Como mostrado na Figura 3, alterações histopatológicas e lesões pulmonares foram evidentes nos tecidos dos pulmões de ratos após indução de sepse por LPC e choque hemorrágico. A análise por microscopia ótica de tecidos pulmonares de animais tratados com solução salina a 0,9% apresentaram espessamento do septo alveolar com aumento da celularidade. Estes animais desenvolveram aumento no número de neutrófilos, mononucleares e células intersticiais no septo alveolar. Edema alveolar esteve também presente nos pulmões deste grupo. No grupo de animais tratados com água de coco + NaCl3% + sinvastatina ficou evidente que o dano histológico e a infiltração de leucócitos foram significativamente menores. Não houve um aumento do número de neutrófilos no septo alveolar, e de edema nos espaços alveolares (Figura 3), resultando em escore histopatológico significativamente menor do que nos grupos salina e água de coco (AC). Os escores histopatológicos referentes a todos os grupos estudados estão resumidos na Tabela 6. 35 A B C D Figura 3 – Seleção de imagens representativas coradas em hematoxilina e eosina da histopatologia de pulmões de ratos tratados com salina (A, B) ou com água de coco + NaCl 3% + sinvastatina (C, D). Número significativamente maior de neutrófilos, mononucleares e células intersticiais nos espaços alveolar e intersticial, espessamento do septo alveolar e aumento de celularidade em A, B, comparado com C,D. Aumento 200X. Tabela 6 – Escores histopatológicos. Grupos Escores Salina 0,9% 0.78±0.04ab AC Na3% 0.30±0.02b AC Na3%S 0.23±0.01a AC 0.51±0.04ab *Média  Desvio Padrão. (1) Medidas comparativas entre grupos, seguidas de mesma letra, diferem significativamente entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. AC, água de coco; Na, sódio; S, sinvastatina. 36 DISCUSSÃO Está bem estabelecido que o choque hemorrágico causa danos aos tecidos e aumenta a hipóxia e a atividade pro-inflamatória. Uma ressuscitação rápida com fluidos adequados é essencial para minimizar esses danos e melhorar a perfusão tecidual. O presente estudo examinou uma alternativa para reduzir o dano causado pela hipovolemia usando água de coco normal e modificada com Na 3%, que mostrou resultados positivos em comparação com a ressuscitação com solução salina a 0,9%. No presente estudo, comparamos os efeitos de solução salina 0,9%, água de coco modificada (Na 3%) e água de coco + Na 3%+ simvastatina e água de coco normal, em parâmetros laboratoriais como citocinas séricas, dosagens bioquímicas e contagem de leucócitos, em modelo experimental de choque hemorrágico associado com sepse abdominal. Modelos experimentais de sepse e choque hemorrágico têm sido estudados isoladamente em outros estudos30-32. Do ponto de vista molecular, a água de coco demonstrou ter efeito na regulação da resposta inflamatória através da expressão sérica de TNF-a e IL- 1β. Isto é parti ular ente importante, uma vez que não existem estudos até agora, considerando o papel da água de coco i.v na resposta de citocinas após indução de choque e sepse simultâneos. A este respeito portanto, esta é a primeira vez que foi demonstrada uma resposta da associação do tratamento i.v. com sinvastatina adicionada à água de coco em choque hemorrágico + sepse. No presente trabalho a resposta das citocinas TNF-α e IL-1β foi significativamente menor do que nos controles. O TNF-α é onsi erado o principal agente inflamatório em casos de choque hemorrágico e desempenha um papel crucial na liberação de outras citocinas pró-infamatórias (IL-1β, IL-6), levando a excesso de inflamação e autodestruição celular33. Farias et al.34 demonstraram uma redução estatisticamente significativa na expressão de citocinas pró-inflamatórias em ratos chocados, tratados por reposição sanguínea com água de coco, em comparação com solução salina e sangue fresco. No presente estudo, demonstramos que o tratamento de ratos com sepse e choque hemorrágico com água de coco modificada com sódio 3% + sinvastatina reduziu 37 significativamente os níveis de citocinas séricas, parâmetros bioquímicos e leucócitos periféricos. Essa redução foi maior do que após tratamentos com outros fluidos de reposição volêmica. A sinvastatina tem mostrado efeitos imunomoduladores independentes da ação de redução significativa da hiperlipidemia, finalidade original para a qual esta droga foi inicialmente desenvolvida35. Esses efeitos, denominados pleiotrópicos, incluem ação anti-inflamatória36, melhora na função endotelial e microvascular, na isquemia/reperfusão37 e na sepse38. Com todas essas propriedades, a sinvastatina atuou sinergicamente com a AC para melhorar os parâmetros estudados em ratos com choque hemorrágico e sepse simultânea. Neste estudo, usamos sinvastatina sob a forma de microemulsão intravenosa, com base no fato de que esta apresentação, desenvolvida no Laboratório de Sistemas Dispersos da UFRN, tem partículas em escala nanométrica, com potencial para uso i.v. sem efeitos adversos. Os resultados obtidos neste estudo com a infusão i.v. de AC provavelmente estão relacionados às suas propriedades físico-químicas. Alguns estudos têm demonstrado evidências científicas de uso de água de coco na prática médica, justificada pelo seu conteúdo de açúcares, vitaminas, minerais, aminoácidos, ácidos orgânicos e ácidos graxos39. Além disso, a AC tem uma quantidade significativa de antioxidantes14,15 que protegem o organismo contra o estresse oxidativo, no presente modelo representado pela hipóxia inerente ao choque hemorrágico16. A indocianina verde (ICV) tem sido amplamente utilizada por décadas na oftalmologia para imagens de retina e na cardiologia para estudo do débito cardíaco. A ICV tem um bem documentado perfil de uso com segurança40,41. No presente estudo utilizamos uma dose mais elevada de ICV para roedores comparado com o descrito para pacientes, com o objetivo de compensar a meia-vida curta no sangue de ratos (1,5 - 2,3 min) em comparação com pacientes (3-4 min) 42,43. A dose utilizada de ICV proporcionou um contraste prolongado e permitiu imagens fluorescentes em pulmões sem Injeção de dose adicional. Nossos resultados mostraram que os tecidos pulmonares inflamados e normais diferiram significativamente da fluorescência dos controles. Com base 38 no comportamento da intensidade de fluorescência nos diferentes grupos de ratos com sepse, é provável que a vasodilatação nos pulmões inflamados e microvasos neoformados levaram a uma rápida entrada do agente de contraste ICV nos tecidos pulmonares. A imagem de fluorescência é limitada a órgãos e tecidos superficiais, porque a forte dispersão e a absorção de luz no tecido biológico restringe a profundidade de penetração de fótons para alguns milímetros. Como a fluorescência não foi detectável com o nosso equipamento em pulmões de ratos in vivo, decidimos realizar imagens ex vivo e imagens representativas foram obtidas e gravadas em pulmões afetados. Uma maneira de melhorar ainda mais a especificidade deste método seria usar agentes de contraste específicos para a doença em combinação com um marcador para neovascularização. Conclusão A substituição do volume com água de coco modificada com Na 3%, combinada com sinvastatina i.v. teve uma influência positiva no tratamento de ratos com modelo de sepse + choque hemorrágico. Os achados podem ter significativas implicações terapêuticas na área clínica e futuros estudos são necessários para comprovação. REFERÊNCIAS 1. Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. 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O modelo desenhado correspondeu às expectativas, sendo capaz de produzir dados que podem ser úteis para o tratamento de choque séptico. Apesar de terem sido gerados em estudo de pesquisa básica em animais, podem ter implicações clínicas futuras. A análise estatística dos dados obtidos mostrou-se adequada como instrumento auxiliar na interpretação dos achados deste estudo. Justificativa para o uso de solução de água de coco com cloreto de sódio 3%: Uma estratégia de ressuscitação de indivíduos com choque hemorrágico com pequenos volumes de líquidos modula a resposta inflamatória e diminui o dano aos órgãos vitais após o uso de solução salina hipertônica43. Solução salina hipertônica a 3% fornece efeitos imunomoduladores e metabólicos semelhantes aos observados com concentrações de solução salina hipertônica 7,5%. A solução salina hipertônica a 7,5% de NaCl tem sido amplamente estudada e tem mostrado vários benefícios sobre o padrão de atendimento com solução salina convencional 0,9%. Além da melhoria significativa no fluxo sanguíneo sistêmico e microcirculatório, pequeno volume de líquidos hipertônicos na reposição volêmica atenua a marginação de neutrófilos, diminui a lesão pulmonar e a translocação bacteriana, e reverte a disfunção imune celular que ocorre após hemorragia em casos de choque43,44 Apesar dos potenciais efeitos salutares da solução salina hipertônica a 7.5% no tratamento do choque hemorrágico, esta solução não tem aprovação para uso clínico nos Estados Unidos e Canadá, como também no nosso país. Por outro lado, a solução salina hipertônica 3% (SSH 3%) é aprovada pelo Food and Drug Administration-USA para terapia do choque e hiponatremia grave. Além disso, tem sido utilizada com bons resultados no tratamento de hipertensão intracraniana refratária em pacientes com traumatismo craniano50- 52. 46 Com base nestas observações, especulamos no nosso estudo se a água de coco modificada com sódio 3% poderia ser eficaz na ressuscitação de animais com choque hemorrágico. Neste estudo, nós avaliamos o potencial hemodinâmico, metabólico e imunomodulador nos benefícios do tratamento de ratos Wistar com SSH 3% + água de coco + sinvastatina. Este tratamento foi comparado com solução salina convencional 0,9%, água de coco + SSH 3% e água de coco não modificada. Além disso, procuramos determinar se havia diferença entre os tratamentos acima descritos no comportamento clínico dos animais. Ficou comprovado que o tratamento que associou SSH 3% + água de coco + sinvastatina foi mais eficaz do que os demais do ponto de vista clínico, imunológico e metabólico. Nossos resultados estão de acordo com os observados em outros estudos, que não associaram a sinvastatina como imunomoduladora53. Com a realização de um estudo piloto, foi possível detectar algumas imperfeições e fazer ajustes na metodologia, especialmente na realização dos exames de imagem de fluorescência. Inicialmente foi tentado o exame in vivo, porém, a capacidade de penetração da fluorescência através da parede torácica mostrou-se limitada, tornando impossível a visualização dos pulmões por este método. Consequentemente, os exames de fluorescência para testar o grau de comprometimento pulmonar foram realizados ex vivo. A detecção dessa variável só foi possível devido à realização do estudo piloto, reforçando a sua importância em projetos experimentais dentro desta linha de pesquisa. Deve-se ressaltar o esforço dispendido na realização deste trabalho e da publicação gerada a partir dele, uma vez que o modelo experimental de choque hipovolêmico requer perícia técnica para monitorizar e manter os animais vivos durante o experimento. Destaca-se também a área técnica na realização e interpretação dos exames de dosagens, histopatologia e estatística, que foram fundamentais para o bom termo do trabalho. Pesquisa por nós realizada nos bancos de dados do Pubmed, Web of Sciences e Scielo apontou para a inexistência de trabalhos publicados com o mesmo objetivo, utilizando a água de coco modificada ou não para uso intravenoso, além da associação com sinvastatina intravenosa, especialmente 47 no modelo experimental de choque hemorrágico e sepse. Tal fato nos deixa confiantes de que produzimos contribuição relevante para o estudo e tratamento de problema grave como é o choque hemorrágico associado à sepse, comum na prática clínica. Esse trabalho foi recentemente publicado, documentando a originalidade do mesmo na nossa linha de pesquisa. Esta pesquisa demonstra a real importância da Academia no sentido de elaborar perguntas relevantes e procurar respondê-las nas bancadas dos laboratórios da melhor maneira possível, apesar das limitações de recursos. A experiência vivenciada no Curso de Doutorado foi de grande importância para a aquisição de conhecimentos que puderam contribuir para o desenvolvimento do estudo e de outros modelos experimentais em outras pesquisas, bem como avançar nesse mesmo modelo, para a verificação de outros resultados. Uma das maiores preocupações foi tentar evitar riscos, buscando seguir rigorosamente o protocolo metodológico, dessa forma permitindo a reprodutibilidade integral de nosso estudo pela comunidade científica, objetivando estimular a obtenção de outros resultados que tragam maiores contribuições ao meio acadêmico no tema choque e sepse. Alguns aspectos do nosso trabalho são fontes de motivação para a ampliação da investigação: incluir nos futuros trabalhos a repercussão do tratamento em outros órgãos vitais, dar ênfase à imunohistoquímica, outros marcadores bioquímicos e imunológicos para choque e sepse, bem como exames de imagem no nível molecular. O indiscutível crescimento intelectual daqueles que se acharam envolvidos na execução deste trabalho, como é o meu caso, serviu de recompensa ao esforço desprendido e atuou como norte, ampliando horizontes para que esta linha de pesquisa se consolide ainda mais, vinculada ao Núcleo de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia-UFRN e ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde. Durante o período de quatro anos foram publicados 05 artigos científicos, em periódicos indexados, o que contribuiu para o enriquecimento intelectual da autora do ponto de vista crítico e científico, correspondendo às 48 expectativas e tornando possível o cumprimento do cronograma previamente estabelecido. Conclui-se, então, que este trabalho contribuiu para evidenciar novos conhecimentos a respeito da reposição volêmica e ressuscitação de ratos Wistar no modelo experimental utilizado, com perspectivas do uso clínico de soluções à base de água de coco modificada. Adicionalmente, o Programa de Pós-Graduação de Ciências da Saúde cumpriu sua missão de contribuir substancialmente com a formação da autora. 49 7. REFERÊNCIAS 1. Bone, RC. The pathogenesis of sepsis. Ann Intern Med. 1991; 115:457-69. 2. Pereira Junior GA, et al. Fisiopatologia da sepse e suas implicações terapêuticas. Medicina, Ribeirão Preto. 1998;31: 349-62. 3. 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Publicado no periódico Acta Cirúrgica Brasileira que possui fator de impacto 0.58 e Qualis B3 da CAPES para a área Medicina II. Therapeutic use of coconut water. Publicado no periódico Journal of Surgical and Clinical Research Qualis C da CAPES para a área Medicina II.