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Anxiety-like behavior induced by salicylate depends on age and can be prevented by a single dose of 5-MeO-DMT
(2020-01-08) Winne, Jessica; Boerner, Barbara C.; Malfatti, Thawann; Brisa, Elis; Doerl, Jhulimar; Nogueira, Ingrid; Leão, Emelie Katarina Svahn; Leão, Richardson Naves
Salicylate intoxication is a cause of tinnitus and comorbidly associated with anxiety in humans. In a previous work, we showed that salicylate induces anxiety-like behavior and hippocampal type 2 theta oscillations (theta2) in mice. Here we investigate if the anxiogenic effect of salicylate is dependent on age and previous tinnitus experience. We also tested whether a single dose of DMT can prevent this effect. Using microwire electrode arrays, we recorded local field potential in young (4-5- month-old) and old (11-13-month-old) mice to study the electrophysiological effect of tinnitus in the ventral hippocampus (vHipp) and medial prefrontal cortex (mPFC) in an open field arena and elevated plus maze 1h after salicylate (300mg/kg) injection. We found that anxiety-like behavior and increase in theta2 oscillations (4-6 Hz), following salicylate pre-treatment, only occurs in young (normal hearing) mice. We also show that theta2 and slow gamma oscillations increase in the vHipp and mPFC in a complementary manner during anxiety tests in the presence of salicylate. Finally, we show that pre-treating mice with a single dose of the hallucinogenic 5-MeO-DMT prevents anxiety-like behavior and the increase in theta2 and slow gamma oscillations after salicylate injection in normal hearing young mice. This work further support the hypothesis that anxiety-like behavior after salicylate injection is triggered by tinnitus and require normal hearing. Moreover, our results show that hallucinogenic compounds can be effective in treating tinnitus-related anxiety.
Automatic tracking of cells for video microscopy in patch clamp experiments
(2014-06-20) Peixoto, Helton M; Munguba, Hermany; Cruz, Rossana MS; Guerreiro, Ana MG; Leão, Richardson Naves
Background Visualisation of neurons labeled with fluorescent proteins or compounds generally require exposure to intense light for a relatively long period of time, often leading to bleaching of the fluorescent probe and photodamage of the tissue. Here we created a technique to drastically shorten light exposure and improve the targeting of fluorescent labeled cells that is specially useful for patch-clamp recordings. We applied image tracking and mask overlay to reduce the time of fluorescence exposure and minimise mistakes when identifying neurons. Methods Neurons are first identified according to visual criteria (e.g. fluorescence protein expression, shape, viability etc.) and a transmission microscopy image Differential Interference Contrast (DIC) or Dodt contrast containing the cell used as a reference for the tracking algorithm. A fluorescence image can also be acquired later to be used as a mask (that can be overlaid on the target during live transmission video). As patch-clamp experiments require translating the microscope stage, we used pattern matching to track reference neurons in order to move the fluorescence mask to match the new position of the objective in relation to the sample. For the image processing we used the Open Source Computer Vision (OpenCV) library, including the Speeded-Up Robust Features (SURF) for tracking cells. The dataset of images (n = 720) was analyzed under normal conditions of acquisition and with influence of noise (defocusing and brightness). Results We validated the method in dissociated neuronal cultures and fresh brain slices expressing Enhanced Yellow Fluorescent Protein (eYFP) or Tandem Dimer Tomato (tdTomato) proteins, which considerably decreased the exposure to fluorescence excitation, thereby minimising photodamage. We also show that the neuron tracking can be used in differential interference contrast or Dodt contrast microscopy. Conclusion The techniques of digital image processing used in this work are an important addition to the set of microscopy tools used in modern electrophysiology, specially in experiments with neuron cultures and brain slices.
Characterization of cell types affected by noise-induced tinnitus in the auditory cortex of mice
(2019-08-17) Sousa, Ingrid Nogueira; Leão, Emelie Katarina Svahn; ; ; Leão, Ricardo Maurício Xavier; ; Leão, Richardson Naves;
Tinnitus is an abnormal state of nerve cell activity of the auditory system, leading to perception of phantom sounds such as ringing of the ears. Although tinnitus perception is not harmful per se, it can lead to severe psychological stress, anxiety and depression. Several studies indicate the auditory cortex as a potential target for transcranial magnetic/direct current stimulation to alleviate tinnitus perception, yet little is known of how tinnitus alters cortical circuits. Here we investigate cellular populations of layer 5 (L5) of the primary auditory cortex (A1) in a mouse model of noise-induced tinnitus. L5 pyramidal cells (PCs) were routinely subdivided into putative corticofugal projecting type A, or contra-lateral projecting type B PCs, post hoc. We found that membrane properties were different between younger (P16-23) and mature cells (P38-52), and therefore we opted to only include animals ≥1 month of age for noise-overexposure (4-20kHz, 90dB, 1,5 hrs). Next we compared passive and active membrane properties between the two PC subtypes as well between control and tinnitus-like animals. We also used transgenic Chrna2-cre mice to investigate inhibitory Martinotti cells between the experimental groups. We found that noise overexposure did not change passive membrane properties of either type A or type B PCs when examined 5-8 days later. Instead we found type A PCs to fired with a significantly lower firing frequency in response to positive current injections (150pA) following noise overexposure (control A: 20,3±1,8Hz, n=11, noiseoverexposed: 16,1±1,2Hz, n=19, p=0.050), while contrarily type B PCs significantly increased steady state firing frequency (Control B: 13,3±1,3Hz, n=13, noise-overexposed: 19,5±2,4Hz, n=22, p=0,048). Interestingly, preliminary data from Martinotti cells from noise-overexposed animals show a trend of higher initial firing frequency than control (control M: 70,05±6,5Hz, n=8, noise-overexposed: 80,5±3,4Hz, n=12) and steady state frequency (control M: 20,35±4,4Hz, noise-overexposed: 33,5±4,9Hz). Since Martinotti cells are specifically connected to type A PCs through recurrent inhibition, this could suggest that Martinotti cells protects type A PCs from acoustic over-activity. Preliminary data using a genetic activity marker (CaMPARI, n=4 mice) also suggests that noise-overexposure does not affect cells uniformly in layer 5-6 of the A1.Together, these results are a first step in identifying specific cortical neurons affected by noise-induced tinnitus and quantify electrophysiological differences seen for each subtype. To understand the cellular mechanisms of tinnitus is crucial for improving treatments of tinnitus using cortical stimulation.
Chrna2-Martinotti Cells Synchronize Layer 5 Type A Pyramidal Cells via Rebound Excitation
(2017-02-09) Hilscher, Markus M.; Leão, Richardson Naves; Edwards, Steven J.; Leão, Emelie Katarina Svahn; Kullander, Klas
Martinotti cells are the most prominent distal dendrite–targeting interneurons in the cortex, but their role in controlling pyramidal cell (PC) activity is largely unknown. Here, we show that the nicotinic acetylcholine receptor α2 subunit (Chrna2) specifically marks layer 5 (L5) Martinotti cells projecting to layer 1. Furthermore, we confirm that Chrna2-expressing Martinotti cells selectively target L5 thick-tufted type A PCs but not thin-tufted type B PCs. Using optogenetic activation and inhibition, we demonstrate how Chrna2-Martinotti cells robustly reset and synchronize type A PCs via slow rhythmic burst activity and rebound excitation. Moreover, using optical feedback inhibition, in which PC spikes controlled the firing of surrounding Chrna2-Martinotti cells, we found that neighboring PC spike trains became synchronized by Martinotti cell inhibition. Together, our results show that L5 Martinotti cells participate in defined cortical circuits and can synchronize PCs in a frequency-dependent manner. These findings suggest that Martinotti cells are pivotal for coordinated PC activity, which is involved in cortical information processing and cognitive control.
Chrna2-OLM interneurons display different membrane properties and h-current magnitude depending on dorsoventral location
(2019-07) Hilscher, Markus M.; Nogueira, Ingrid; Mikulovic, Sanja; Kullander, Klas; Leão, Richardson Naves; Leão, Emelie Katarina Svahn
The hippocampus is an extended structure displaying heterogeneous anatomical cell layers along its dorsoventral axis. It is known that dorsal and ventral regions show different integrity when it comes to functionality, innervation, gene expression, and pyramidal cell properties. Still, whether hippocampal interneurons exhibit different properties along the dorsoventral axis is not known. Here, we report electrophysiological properties of dorsal and ventral oriens lacunosum moleculare (OLM) cells from coronal sections of the Chrna2‐cre mouse line. We found dorsal OLM cells to exhibit a significantly more depolarized resting membrane potential compared to ventral OLM cells, while action potential properties were similar between the two groups. We found ventral OLM cells to show a higher initial firing frequency in response to depolarizing current injections but also to exhibit a higher spike‐frequency adaptation than dorsal OLM cells. Additionally, dorsal OLM cells displayed large membrane sags in response to negative current injections correlating with our results showing that dorsal OLM cells have more hyperpolarization‐activated current (Ih) compared to ventral OLM cells. Immunohistochemical examination indicates the h‐current to correspond to hyperpolarization‐activated cyclic nucleotide‐gated subunit 2 (HCN2) channels. Computational studies suggest that Ih in OLM cells is essential for theta oscillations in hippocampal circuits, and here we found dorsal OLM cells to present a higher membrane resonance frequency than ventral OLM cells. Thus, our results highlight regional differences in membrane properties between dorsal and ventral OLM cells allowing this interneuron to differently participate in the generation of hippocampal theta rhythms depending on spatial location along the dorsoventral axis of the hippocampus.
Chronic in vivo optogenetic stimulation modulates neuronal excitability, spine morphology, and Hebbian plasticity in the mouse hippocampus
(2019-02-15) Moulin, Thiago C.; Petiz, Lyvia L.; Rayêe, Danielle; Winne, Jessica; Maia, Roberto G.; Cruz, Rafael V. Lima da; Amaral, Olavo B.; Leão, Richardson Naves
Prolonged increases in excitation can trigger cell‐wide homeostatic responses in neurons, altering membrane channels, promoting morphological changes, and ultimately reducing synaptic weights. However, how synaptic downscaling interacts with classical forms of Hebbian plasticity is still unclear. In this study, we investigated whether chronic optogenetic stimulation of hippocampus CA1 pyramidal neurons in freely moving mice could (a) cause morphological changes reminiscent of homeostatic scaling, (b) modulate synaptic currents that might compensate for chronic excitation, and (c) lead to alterations in Hebbian plasticity. After 24 hr of stimulation with 15‐ms blue light pulses every 90 s, dendritic spine density and area were reduced in the CA1 region of mice expressing channelrhodopsin‐2 (ChR2) when compared to controls. This protocol also reduced the amplitude of mEPSCs for both the AMPA and NMDA components in ex vivo slices obtained from ChR2‐expressing mice immediately after the end of stimulation. Finally, chronic stimulation impaired the induction of LTP and facilitated that of LTD in these slices. Our results indicate that neuronal responses to prolonged network excitation can modulate subsequent Hebbian plasticity in the hippocampus.
Contribuições para o estudo do código neural
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-02-25) Santos, Vitor Lopes dos; Ribeiro, Sidarta Tollendal Gomes; Tort, Adriano Bretanha Lopes; ; http://lattes.cnpq.br/3181888189086405; ; http://lattes.cnpq.br/0649912135067700; ; http://lattes.cnpq.br/6484208511184541; Lima, Bruss Rebouças Coelho; ; http://lattes.cnpq.br/5980898319479714; Mohan, Madras Viswanathan Gandhi; ; http://lattes.cnpq.br/1995273890709490; Moraes, Márcio Flávio Dutra; ; http://lattes.cnpq.br/3132451355090021; Leão, Richardson Naves; ; http://lattes.cnpq.br/0683942077872227
Os recentes avanços técnicos das duas últimas décadas para o registro de sinais neuroeletrofisiológicos foram essenciais para que se testassem hipóteses há muito propostas acerca de como células nervosas processam e armazenam informação. No entanto, ao permitir maior detalhamento dos dados coletados, as novas tecnologias levam inevitavelmente ao aumento de sua complexidade estatística e, consequentemente, à necessidade de novas ferramentas matemático-computacionais para sua análise. Nesta tese, apresentamos novos métodos para a análise de dois componentes fundamentais nas atuais teorias da codificação neural: (1) assembleias celulares, definidas pela co-ativação de subgrupos neuronais; e (2) o padrão temporal de atividade de neurônios individuais. Em relação a (1), desenvolvemos um método baseado em análise de componentes independentes para identificar e rastrear padrões de co-ativação significativos com alta resolução temporal. Superamos limitações de métodos anteriores, ao efetivamente isolar assembleias e abrir a possibilidade de analisar simultaneamente grandes populações neuronais. Em relação a (2), apresentamos uma nova técnica para a extração de padrões de atividade em trens de disparo baseada na decomposição wavelet. Demonstramos, por meio de simulações e de aplicação a dados reais, que nossa ferramenta supera as mais utilizadas atualmente para decodificar respostas de neurônios e estimar a informação de Shannon entre trens de disparos e estímulos externos.
Crosstalk between mitochondria, calcium channels and actin cytoskeleton modulates noradrenergic activity of locus coeruleus neurons
(2019-03-03) Oliveira, Ramatis B. de; Petiz, Lyvia L.; Lim, Rebecca; Lipski, Janusz; Gravina, Fernanda S.; Brichta, Alan M.; Callister, Robert J.; Leão, Richardson Naves; van Helden, Dirk F.
Locus coeruleus (LC) is the name of a group of large sized neurons located at the brain stem, which provide the main source of noradrenaline to the central nervous system, virtually, innervating the whole brain. All noradrenergic signalling provided by this nucleus is dependent on an intrinsic pacemaker process. Our study aims to understand how noradrenergic neurons finely tune their pacemaker processes and regulate their activities. Here we present that mitochondrial perturbation in the LC from mice, inhibits spontaneous firing by a hyperpolarizing response that involves Ca2+ entry via L‐type Ca2+ channels and the actin cytoskeleton. We found that pharmacological perturbation of mitochondria from LC neurons using the protonophore carbonyl cyanide m‐chlorophenylhydrazone (CCCP), induced a dominant hyperpolarizing response when electrophysiological approaches were performed. Surprisingly, the CCCP‐induced hyperpolarizing response was dependent on L‐type Ca2+ channel‐mediated Ca2+ entry, as it was inhibited by: removal of extracellular Ca2+; addition of Cd2+; nifedipine or nicardipine; but not by intracellular dialysis with the Ca2+ chelator BAPTA, the latter indicating that the response was not due to a global change in [Ca2+]c but does not exclude action at intracellular microdomains. Further to this, incubation of slices with cytochalasin D, an agent that depolymerises the actin cytoskeleton, inhibited the hyperpolarizing response indicating an involvement of the actin cytoskeleton. The data are consistent with the hypothesis that there is crosstalk between mitochondria and L‐type Ca2+ channels leading to modulation of noradrenergic neuronal activity mediated by the actin cytoskeleton.
Delivery of differentiation factors by mesoporous silica particles assists advanced differentiation of transplanted murine embryonic stem cells
(2013) Garcia-Bennett, Alfonso E.; Kozhevnikova, Mariya; König, Niclas; Zhou, Chunfang; Leão, Richardson Naves; Knöpfel, Thomas; Pankratova, Stanislava; Trolle, Carl; Berezin, Vladimir; Bock, Elisabeth; Aldskogius, Håkan; Kozlova, Elena N.
Stem cell transplantation holds great hope for the replacement of damaged cells in the nervous system. However, poor long-term survival after transplantation and insufficiently robust differentiation of stem cells into specialized cell types in vivo remain major obstacles for clinical application. Here, we report the development of a novel technological approach for the local delivery of exogenous trophic factor mimetics to transplanted cells using specifically designed silica nanoporous particles. We demonstrated that delivering Cintrofin and Gliafin, established peptide mimetics of the ciliary neurotrophic factor and glial cell line-derived neurotrophic factor, respectively, with these particles enabled not only robust functional differentiation of motor neurons from transplanted embryonic stem cells but also their long-term survival in vivo. We propose that the delivery of growth factors by mesoporous nanoparticles is a potentially versatile and widely applicable strategy for efficient differentiation and functional integration of stem cell derivatives upon transplantation.
Direct reprogramming of adult human somatic stem cells into functional neurons using Sox2, Ascl1, and Neurog2
(2018-06-08) Araújo, Jessica Alves de Medeiros; Hilscher, Markus M.; Marques-Coelho, Diego; Golbert, Daiane C. F.; Cornelio, Deborah A.; Medeiros, Silvia R. Batistuzzo de; Leão, Richardson Naves; Costa, Marcos Romualdo
Reprogramming of somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPS) or directly into cells from a different lineage, including neurons, has revolutionized research in regenerative medicine in recent years. Mesenchymal stem cells are good candidates for lineage reprogramming and autologous transplantation, since they can be easily isolated from accessible sources in adult humans, such as bone marrow and dental tissues. Here, we demonstrate that expression of the transcription factors (TFs) SRY (sex determining region Y)-box 2 (Sox2), Mammalian achaete-scute homolog 1 (Ascl1), or Neurogenin 2 (Neurog2) is sufficient for reprogramming human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSC) into induced neurons (iNs). Furthermore, the combination of Sox2/Ascl1 or Sox2/Neurog2 is sufficient to reprogram up to 50% of transfected hUCMSCs into iNs showing electrical properties of mature neurons and establishing synaptic contacts with co-culture primary neurons. Finally, we show evidence supporting the notion that different combinations of TFs (Sox2/Ascl1 and Sox2/Neurog2) may induce multiple and overlapping neuronal phenotypes in lineage-reprogrammed iNs, suggesting that neuronal fate is determined by a combination of signals involving the TFs used for reprogramming but also the internal state of the converted cell. Altogether, the data presented here contribute to the advancement of techniques aiming at obtaining specific neuronal phenotypes from lineage-converted human somatic cells to treat neurological disorders.
Dos efeitos ansiolíticos da 5-MeO-DMT no cérebro e comportamento do camundongo
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2022-03-31) Lima, Margareth de Brito Nogueira; Leão, Richardson Naves; Leão, Emelie Katarina Svahn; https://orcid.org/0000-0001-7295-1233; http://lattes.cnpq.br/1279823352935722; http://lattes.cnpq.br/0683942077872227; http://lattes.cnpq.br/7749123102268411; Santos, Rafael Guimarães dos; Laplagne, Diego Andres; Gavioli, Elaine Cristina; http://lattes.cnpq.br/1759328747578795; Amaral, Olavo Bohrer
Ansiedade é uma desordem de circuitos, ou seja, uma circuitopatia mundialmente prevalente que afeta substancialmente a qualidade de vida das pessoas. Para tratá-la adequadamente, é necessário que sejam revertidos os processos que levam ao maufuncionamento dos circuitos neuronais. Ainda não há um tratamento completamente eficaz para tratar tal transtorno. Inúmeras pesquisas vêm apresentando resultados promissores e seguros com psicodélicos serotonérgicos, evidenciando um potencial terapêutico desses compostos. No entanto, os seus mecanismos de ação ainda não foram completamente elucidados. Muitos estudos clínicos têm conseguido mitigar duradouramente os sintomas da depressão e da ansiedade com apenas uma dose, o que faz desses compostos alternativas bastante interessantes aos tratamentos clássicos disponíveis na psiquiatria. Esses efeitos duradouros podem ser explicados por uma possível indução à neuroplasticidade, à neuroproteção e a uma modulação de agentes ligados à inflamação. Alguns estudos comprovaram um aumento na neuritogênese, sinaptogênese e neurogênese proveniente do tratamento com esses compostos. Neste estudo, procuramos identificar como o psicodélico serotonérgico 5- metoxi-N,Ndimetiltriptamina (5-MeO-DMT) afeta prolongadamente a atividade neuronal e a expressão de genes relacionados à plasticidade (BDNF, CREB, ARC, ZIF268, mTORC1, NF-kB e TRIP8b) em estruturas cerebrais classicamente relacionadas à ansiedade, como a amígdala basolateral, a região CA1 do hipocampo ventral e o córtex cingulado anterior, localizado no córtex medial pré-frontal de camundongos adultos uma hora, cinco horas e cinco dias após o tratamento. Após avaliarmos as propriedades eletrofisiológicas de camundongos 5 dias depois do tratamento com 5-MeO-DMT, verificamos diferenças nas propriedades passivas da membrana, além de alterações na amplitude e frequência dos disparos neuronais na região do giro denteado hipocampal. A avaliação da expressão gênica uma hora após o tratamento revelou um aumento na expressão dos genes iniciais imediatos ARC e ZIF268 no córtex cingulado anterior e na amígdala basolateral. Outra avaliação feita 5 horas após o tratamento mostrou uma diminuição do gene NR2A em CA1 ventral. Verificamos também um aumento significativo do gene TRIP8b em CA1 ventral 5 dias após o tratamento. Investigamos se o 5-MeO-DMT produz mudanças no comportamento de camundongos após 24 horas e 5 dias de tratamento, com e sem condições de estresse. Também avaliamos os níveis séricos basais de corticosterona em camundongos e após estresse de contenção aguda. Verificamos que camundongos tratados com 5-MeO-DMT apresentaram níveis significativamente menores de corticosterona basal após 5 dias, além de apresentar um comportamento menos ansioso. Estes achados moleculares, celulares e comportamentais sugerem que a 5-MeO-DMT produz efeitos imediatos e duradouros em camundongos, embora sejam necessários mais estudos para considerar a sua possibilidade terapêutica e também para desvendar quais vias de sinalização são subjacentes ao papel da 5-MeO-DMT na plasticidade sináptica.
Efeitos da administração aguda de quetamina sobre as oscilações eletrofisiológicas da região CA1 hipocampal
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-02-05) Caixeta, Fabio Viegas; Tort, Adriano Bretanha Lopes; ; http://lattes.cnpq.br/3181888189086405; ; http://lattes.cnpq.br/0821385137367871; Calganotto, Maria Elisa; ; Leão, Richardson Naves; ; http://lattes.cnpq.br/0683942077872227; Neuenschwander, Sergio; ; http://lattes.cnpq.br/9217956361436464
Em humanos, a administração de quetamina - um antagonista não-competitivo do receptor glutamatérgico do tipo NMDA - causa um amplo espectro de sintomas associados à esquizofrenia. Dado o papel dos ritmos cerebrais na realização de tarefas cognitivas, tem sido sugerido que a patofisiologia da esquizofrenia estaria relacionada a desordens de oscilações corticais. Neste estudo utilizamos o registro do potencial de campo elétrico em múltiplos eletrodos implantados no hipocampo de ratos sob o efeito de injeções sistêmicas de doses sub-anestésicas de quetamina (25, 50 e 75 mg/kg IP) para investigarmos as alterações comportamentais e eletrofisiológicas neste modelo animal de psicose. A quetamina alterou o padrão de locomoção e causou diversas mudanças na dinâmica de oscilações neurais. A potência nas bandas de frequência gama e oscilações de alta frequência (OAF) aumentou em todas as profundidades do eixo CA1-giro denteado, enquanto a potência de teta variou dependendo da camada registrada. A coerência de fase de gama e de OAF aumentou entre as camadas de CA1. A quetamina aumentou o acoplamento entre frequências (AEF) de fase-amplitude entre teta e OAF em todas as doses, mas teve efeitos opostos no AEF entre teta e gama de acordo com a dose. Nossos resultados demonstram que o modelo de esquizofrenia induzido por hipofunção dos receptores NMDA está associado com alterações de interações de alta ordem entre oscilações neurais
Efeitos da nicotina no complexo do septo medial na via septo hipocampal em camundongos anestesiados por Ketamina
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-02-24) Góis, José Henrique Targino Dias; Leão, Richardson Naves; Tort, Adriano Bretanha Lopes; ; http://lattes.cnpq.br/3181888189086405; ; http://lattes.cnpq.br/0683942077872227; ; http://lattes.cnpq.br/8071490159397863; Nascimento, George Carlos do; ; http://lattes.cnpq.br/1489371044894987; Figuerola, Wilfredo Blanco; ; http://lattes.cnpq.br/9912829629195282
A administração de nicotina em seres humanos e roedores é pensada como um melhorador de memória e atenção, também pelo seu efeito positivo na Doença de Alzheimer. O complexo do Septo Medial / Banda Diagonal de Broca (MS/DBB) é um dos principais sistemas colinérgicos – massivamente projetado para o hipocampo através da Fímbria-Fórnix, via esta chamada de via septo-hipocampal. Foi demonstrado que o MS/DBB afeta diretamente o potencial de campo local (LFP) e a organização rítmica do hipocampo, especialmente na geração do ritmo teta - um LFP rítmico intrinsecamente relacionado com a função mnemônica do hipocampo. Experimentos in vitro deram evidências de que a nicotina aplicada no MS/DBB pode gerar um ritmo teta na rede local do MS/DBB. Assim, o presente estudo se propõe a elucidar a função da nicotina no MS/DBB sobre a via septo-hipocampal. Experimentos in vivo, comparando o efeito de microinfusões no MS/DBB de solução salina (n = 5) ou nicotina (n = 8) em camundongos anestesiados por ketamina/xilazina mostraram um aumento na densidade de potência no espectro banda de gama (35 a 55 Hz) em ambas as estruturas (teste de Wilcoxon Rank-Sum, p = 0,038), mas sem alterar a coerência entre as estruturas na mesma banda (teste de Wilcoxon Rank-Sum, p = 0,60). Houve também uma diminuição na densidade potência na banda delta (1-3 Hz) – oscilação induzida pela ketamina. Realizamos também experimentos in vitro sobre o efeito da nicotina na voltagem de membrana e no potencial de ação de neurônios do MS/DBB. Registramos neurônios (n=22) em current-clamp antes e depois da presença de nicotina no meio extracellular; 12 neurônios responderam à nicotina, metade aumentou a taxa de potenciais de ação; outros seis diminuíram, diferindo significativamente no limiar do potencial de ação (- 47,3 ± 0,9 mV vs. -41 ± 1,9 mV, respectivamente, p = 0,007) e na largura do disparo (1,6 ± 0,08 vs. 2 ms ± 0,12 ms, respectivamente, p = 0,01). Além disso, realizamos outro conjunto de experimentos in vitro, relativo à conectividade das três grandes populações neuronais de MS / DBB que usam a acetilcolina, GABA ou glutamato como neurotransmissores. O registro pareado de patch-clamp mostrou que neurônios glutamatérgicos e GABAérgicos realizam contatos intra-septais capazes de produzir correntes sinápticas em neurônios pós-sinápticos do MS/DBB. A probabilidade da conectividade entre diferentes populações neuronais foi implementada em um modelo realista que corrobora que a rede é altamente sensível à geração de ritmo gama. Juntamente com os dados disponíveis, o conjunto completo de experiências corrobora que a nicotina pode atuar como potenciador cognitivo, e um substrato eletrofisiológico provável é através da indução de oscilação gama no circuito local do MS/DBB.
Efeitos da sinalização por Sonic Hedgehog sobre a proliferação de células-tronco neurais e gliogênese no córtex cerebral em desenvolvimento
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-10-15) Araújo, Geissy Lainny de Lima; Costa, Marcos Romualdo; Leão, Richardson Naves; ; http://lattes.cnpq.br/0683942077872227; ; http://lattes.cnpq.br/6118493598074445; ; http://lattes.cnpq.br/3280694112370226; Pereira, Cecilia Hedin; ; http://lattes.cnpq.br/9205085846499207; Pereira, Rodrigo Neves Romcy; ; http://lattes.cnpq.br/9209418339421588
O Sonic Hedgehog (Shh) é um morfógeno com importantes ações no sistema nervoso central (SNC) em desenvolvimento, assim como na vida adulta em quadros de lesão tecidual e processos tumorigênicos. A relação da sua via de sinalização com proliferação, diferenciação e sobrevivência celular é amplamente estudada em regiões ventrais do SNC. No entanto, o papel da sinalização por Shh em egiões dorsais, como o telencéfalo dorsal, origem do córtex cerebral, não está bem documentada. A partir do cultivo de células de roedores retiradas do telencéfalo dorsal em desenvolvimento, observamos a influência do Shh sobre a proliferação e diferenciação das células-tronco neurais. Utilizando vídeo-microscopia de tempo intervalado, podemos avaliar o tempo de ciclo celular, tamanho de células progenitoras antes da divisão celular e tipo de divisão sofrida pelas células na presença ou na ausência de sinalização por Shh. Verificamos um aumento do número de células em estado proliferativo assim como um aumento de células reativas para o marcador astrocitário GFAP com o tratamento com Shh. Em contrapartida, após bloqueio da sinalização por Shh, observamos um menor número de células em estado proliferativo, desaceleração do ciclo celular, aumento da morte celular e redução da astrogliogênese. Por fim, com intuito de avaliar a influencia do Shh in vivo, nós injetamos fármacos agonista (Purmorfamina) e antagonista (Ciclopamina) da via de sinalização dessa proteína em diferentes períodos da gestação de roedores. Ao avaliar os animais na vida pós-natal, observamos um aumento no número de progenitores gliais gerados com o tratamento com Purmorfamina na substância branca, enquanto na substância cinzenta não parece haver alteração dessa população em ambos os tratamentos. Além disso, a população de células astrocitárias, evidenciada por marcadores específicos, parece estar alterada com a manipulação da sinalização por Shh. Em conjunto, nossos dados sugerem que a Shh está presente no telencéfalo dorsal em períodos precoces do desenvolvimento e influencia a geração, sobrevivência e proliferação de progenitores e células gliais.
Effects of N, N-Dimethyltryptamine on the phenotype and diathesis of a mice model of depression
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2023-07-31) Cruz, Rafael Vitor Lima da; Leão, Richardson Naves; Araújo, Draulio Barros de; https://orcid.org/0000-0002-6934-2485; http://lattes.cnpq.br/7818012155694188; http://lattes.cnpq.br/0683942077872227; http://lattes.cnpq.br/4565857246678087; Moulin, Thiago Cavalcante; Leão, Emelie Katarina Svahn; Belchior, Hindiael Aeraf; Petiz, Lyvia Lintzmaier
A depressão é um transtorno neurológico que afetou 4,4% da população global em 2017. Ela é caracterizada por apatia e anedonia, o que impacta significativamente a vida social e profissional. A etiologia da depressão ainda não foi completamente elucidada, embora fatores genéticos, humorais, ambientais e comportamentais tenham sido correlacionados com seu desenvolvimento. O tratamento convencional geralmente envolve medicamentos serotoninérgicos de ação lenta, que frequentemente apresentam efeitos colaterais mais prejudiciais à condição clínica do que os próprios sintomas. Nas últimas duas décadas, a Hipótese Neurogênica da Depressão tem associado a produção de novos neurônios no hipocampo adulto ao mecanismo neurobiológico essencial para aliviar os sintomas pelos antidepressivos clássicos. Ao mesmo tempo, as drogas psicodélicas têm ressurgido como uma categoria de moléculas capazes de aumentar a plasticidade neuronal. Infelizmente, as propriedades alucinógenas desses compostos, dificultaram sua assimilação generalizada. Nesta fase da pesquisa psicodélica, é necessário compreender o envolvimento da experiência subjetiva, a experiência psicodélica, no seu potencial terapêutico. Essa compreensão nos permitirá delimitar formas mais eficazes, acessíveis e abrangentes para aplicação desses compostos em diferentes populações. Neste trabalho, induzi a depressão em camundongos usando o modelo de Estresse Leve Crônico Imprevisível, administrei uma única dose de DMT e mitiguei os sintomas semelhantes à depressão, anedonia e ansiedade, com eficiência notável, uma vez que esse superou até mesmo o tratamento com antidepressivo clássico. Nossos dados sugerem que o DMT é uma ferramenta valiosa para a psiquiatria, e a experiência subjetiva pode ajudar os profissionais a terem mais controle sobre o resultado, uma vez que fornecemos dados que apontam para a importância da consideração do set and setting para um desfecho positivo.
Estados psicodélicos e sono no cérebro do rato: estudos comportamentais, eletrofisiológicos e moleculares
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2020-04-29) Souza, Annie da Costa; Ribeiro, Sidarta Tollendal Gomes; Santos, Vitor Lopes dos; ; ; ; Tort, Adriano Bretanha Lopes; ; Leão, Richardson Naves; ; Aguiar, Cleiton Lopes; ; Cota, Vinicius Rosa;
Psicodélicos clássicos são substâncias conhecidas por induzir estados alterados de consciência. Esses estados dependem da atividade de receptores serotonérgicos 5-HT2A e 5-HT1A. Porém, devido à longa proibição dessas drogas, pouco é conhecido quanto aos correlatos eletrofisiológicos no cérebro. No primeiro capítulo do presente trabalho, investigamos os efeitos da 5-MeO-DMT(DMT) e do d-LSD, dois potentes agonistas serotonérgicos, na atividade eletrofisiológica do hipocampo (HP) e do córtex pré-frontal (PF) de ratos. Encontramos alterações típicas de comportamento nos 15 minutos subsequentes à injeção das drogas, tais como aumento da locomoção, ocupância da arena, e ocorrência de comportamentos estereotipados (wetdog shake, andar descoordenado etc). Em acordo com resultados prévios, encontramos alterações nos potenciais de campo local (‗local field potential‘, LFP) no PF, bem como no HP. Enquanto a potência na faixa de frequência de theta (5-10Hz) gama (30-100Hz) diminuiu em ambas as áreas nos primeiros 30 minutos após a injeção de DMT, a potência na faixa de delta (0.5-4.5Hz) não apresentou variação significativa. De modo semelhante, porém tardio, o HP apresentou diminuição da potência na faixa de gama após ~4h30min da injeção de d-LSD. Além disso, encontramos um aumento da coerência entre PF e HP na faixa de delta e gama para os experimentos DMT na condição experimental de injeção intraperitoneal (i.p.). Considerando que os achados acima mencionados sugerem que DMT e d-LSD levam a estados cerebrais alterados em termos de eletrofisiologia, decidimos compará-los ao ciclo sono-vigília. Análises de mapa de estados definidos por razões espectrais demonstraram que ambas as substâncias promovem uma mudança no ciclo sono-vigília. Os animais apresentaram maior velocidade durante estados classificados eletrofisiologicamente como sono de movimento rápido dos olhos (‗rapid eye movement‘, REM) e sono de ondas lentas (‗slow wave sleep‘, SWS). Em alguns casos foi possível observar também transições pouco usuais entre estados (WK para REM). Em outras palavras, ainda que o animal estivesse comportamentalmente acordado, essa vigília é similar a estados de sono, pelo menos em termos eletrofisiológicos. Em suma, esses resultados corroboram parcialmente achados anteriores e trazem alguns pontos ao debate. Adicionalmente, os novos resultados encontrados aqui contribuem para um melhor entendimento das mudanças eletrofisiológicas causadas por alucinógenos no cérebro. O segundo capítulo dessa tese é dedicado à investigação do papel cognitivo das fases do sono em termos moleculares (e eletrofisiológicos). O sono desempenha um papel importante na consolidação de memórias, entretanto, pouco se sabe sobre os aspectos moleculares que estão por trás desse papel e sobre qual dinâmica tal perfil apresentaria durante as fases de SWS e sono REM. Em estudo prévio, demonstramos que a CaMKIIα fosforilada, uma proteína quinase relacionada à plasticidade sináptica, diminui durante o SWS e encontra-se com níveis aumentados durante o sono REM no HP de ratos. Tal efeito ocorre somente em animais que foram previamente expostos a objetos novos na vigília precedente, assim como na indução transcricional de genes imediatos (IEG) dependentes de CaMKII durante o sono REM, conforme estudos anteriores de nosso grupo. Tal indução de IEG se dá inicialmente no HP e depois, gradualmente, se transfere ao córtex somestésico primário (S1). Hipotetizamos que o SWS e o sono REM possuem papéis e perfis de fosforilação proteica distintos no processamento de memórias durante o sono. Mais especificamente, fizemos um ‗screening‘ das proteínas fosforiladas no S1 e no HP durante ambas fases do sono em animais expostos (+) ou não expostos (-) à novidade na vigília anterior. Identificamos 535 fosfoproteínas no total para as regiões HP (198) e S1 (337), dentre as quais 90 proteínas foram significativamente moduladas (S1=69; HP=21). Através de análises ontogenéticas encontramos que as proteínas moduladas pertencem a diversas classes, por exemplo, relacionadas à organização de citoesqueleto, processamento de RNA, vias de sinalização por cálcio etc. Os resultados apontam para uma maior abundância de proteínas significativamente moduladas no S1 de animais expostos a novidade durante o SWS (S1=23 HP=9, SWS+ x SWS-). Possivelmente essa modulação (diminuição/aumento) da abundância de proteínas fosforiladas está relacionada aos estados de ativação e desativação (‗up and down‘ states) que ocorrem no SWS. Já durante o sono REM, há menor número de proteínas moduladas (S1=3; HP=3, REM+ x REM-). É possível que a novidade/estímulo gere uma fosforilação mais seletiva de proteínas relacionadas ao processamento sensorial, principalmente durante o sono REM. Encontramos que proteínas relacionadas à plasticidade sináptica estão moduladas e que algumas delas se correlacionam com fusos corticais durante o SWS e sono intermediário (IS). Por exemplo, a Relina, proteína que regula positivamente a morfogênese sináptica, está aumentada durante o sono REM+ comparado ao SWS+, e se correlaciona positivamente com o número de fusos durante o SWS e IS. Comparando os mesmos grupos encontramos que a CaCNA, um canal de cálcio dependente de voltagem, encontra-se com níveis diminuídos de fosforilação. A CaCNA desfosforilada forma um complexo (com Ca+2\Calcineurina) que atua na regulação transcricional de genes relacionados a plasticidade sináptica. As análises funcionais das proteínas que servem de marcadores dos grupos experimentais e análises de correlação com fusos indicam que há enriquecimento concomitante de vias relacionadas a cascatas envolvidas na regulação positiva e negativa da ‗força sináptica‘ (por exemplo, proteínas quinases e fosfatases). Tal ideia é corroborada por achados prévios do nosso grupo e também por evidências recentes de outros grupos (e.x. poda e ‗reforço‘ de sinapses durante o REM após aprendizado motor). Nosso estudo indica que o SWS e o sono REM possuem diferentes perfis de fosforilação de proteínas relacionadas à modulação sináptica, sugerindo que possuem papéis distintos e complementares na consolidação de memórias. Nossos achados corroboram a teoria do entalhamento de memórias durante o sono, no qual algumas sinapses são ‗fortalecidas‘ enquanto outras são ‗enfraquecidas‘.
Estimulação optogenética do septo medial no rato anestesiado e em livre comportamento
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-10-15) Souza, Annie da Costa; Ribeiro, Sidarta Tollendal Gomes; Leão, Richardson Naves; ; http://lattes.cnpq.br/0683942077872227; ; http://lattes.cnpq.br/0649912135067700; ; http://lattes.cnpq.br/9697174530550588; Queiroz, Cláudio Marcos Teixeira de; ; http://lattes.cnpq.br/3384801391828521; Leão, Emelie Katarina Svahn; ; http://lattes.cnpq.br/1279823352935722; Cota, Vinícius Rosa; ; http://lattes.cnpq.br/6882402886706744
O ritmo teta consiste em uma oscilação eletrofisiológica hipocampal presente em várias espécies de mamíferos (4-12 Hz, com variações entre espécies). Essa oscilação está presente durante a vigília ativa de ratos e também é predominante no PCL desta espécie durante o sono de movimento rápido dos olhos (sono REM). Vários trabalhos demonstraram que o ritmo teta é importante em tarefas cognitivas. O septo medial é uma região importante na geração do ritmo teta hipocampal. Possui projeções colinérgicas, GABAérgicas e glutamatérgicas para o hipocampo, que por sua vez, possui projeções de feedback para o septo. Além do septo, outras regiões estão envolvidas na regulação do teta, formando uma rede complexa de interação e coordenação entre áreas que resultam no ritmo. A optogenética é uma ferramenta desenvolvida recentemente que tem sido amplamente utilizada em pesquisas de diversas áreas. Ela nos permite manipular a atividade elétrica de neurônios através de estimulação luminosa. A técnica consiste em, através de um vetor viral, induzir a expressão neuronal de canais iônicos associados a opsinas (ex.: ChR2), que uma vez infectados passam a ser sensíveis a luz de determinado comprimento de onda. O presente trabalho de pesquisa de mestrado teve como objetivo implantar a optogenética em animais em livre comportamento pioneiramente no Brasil, através de experimentos com implantes crônicos de eletrodos e fibras óptica em animais infectados com vetor viral para expressão de ChR2. Foram realizadas cirurgias de injeções de vírus no septo medial; resultados histológicos confirmaram a expressão de ChR2 através da marcação da proteína repórter eYFP no septo e também em processos hipocampais. Além disso, foram realizados experimentos agudos com estimulação luminosa do septo medial e registro de potenciais de campo local (PCL) no próprio septo e hipocampo em animais anestesiados. Ainda nesses experimentos foi possível registrar potenciais de ação no septo. Nesses experimentos observamos aumento da taxa de disparo dos neurônios septais durante estimulação luminosa (n=300 estímulos). Além disso, encontramos uma resposta evocada no PCL do hipocampo no início do pulso luminoso. Também foram realizados experimentos crônicos com estimulação luminosa do septo medial e registro de PCL do hipocampo em animais em livre comportamento. Através de análise do PCL, verificamos se a estimulação luminosa do septo é capaz de induzir ritmo teta no hipocampo.
Imageamento de cálcio em fatias frescas de cérebro para avaliação de alterações na atividade de neurônios piramidais do córtex auditivo primário de camundongos expostos ao ruído
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2020-12) Araujo, Aelton Silva; Takahashi, Daniel Yasumasa; Leão, Katarina Emelie Svahn; Leão, Richardson Naves; Sousa, Ingrid Nogueira
O zumbido é a percepção fantasma de um som na ausência de estímulo externo. Em modelos animais de zumbido induzido por ruído são relatadas alterações como hiperatividade e maior sincronia de neurônios no núcleo coclear dorsal, colículo inferior, núcleo geniculado medial e córtex auditivo primário. No entanto, ainda é necessário descrever quais classes neuronais são mais afetadas pela exposição ao ruído no córtex auditivo primário, região putativa para tratamentos que envolvem modulação da atividade neuronal. Utilizando um indicador de cálcio geneticamente codificado (GCaMP6f), analisamos os efeitos da exposição ao ruído na atividade de células excitatórias CamKIIα positivas das camadas infragranulares (5-6) em fatias frescas de cérebro de camundongos expostos ao ruído.
Increased hippocampal excitability and impaired spatial memory function in mice lacking VGLUT2 selectively in neurons deﬁned by tyrosine hydroxylase promoter activity
(2014-04-11) Nordenankar, Karin; Smith-Anttila, Casey J. A.; Schweizer, Nadine; Viereckel, Thomas; Birgner, Carolina; Mejia-Toiber, Jana; Morales, Marisela; Leão, Richardson Naves; Walle´n-Mackenzie, A˚sa
Indicadores de cálcio e de voltagem codificados geneticamente na detecção de potenciais de ação e inputs sinápticos em cultura de neurônios hipocampais
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2013-03-04) Vieira, Hermany Munguba; Leão, Richardson Naves; ; http://lattes.cnpq.br/0683942077872227; ; http://lattes.cnpq.br/6762407295457000; Leão, Emelie Katarina Svahn; ; http://lattes.cnpq.br/1279823352935722; Amaral, Olavo Bohrer; ; http://lattes.cnpq.br/4987439782337345
Neurônios se comunicam por meio de sinapses, trocando mensagens capazes de modificar o potencial de membrana de outros neurônios. Demonstrar o papel desses sinais e decodificar essa linguagem elétrica representa o grande objetivo da neurociência moderna. Atualmente, a eletrofisiologia é o ramo da neurociência capaz de investigar esses recursos elétricos de neurônios - que vão desde registros de condutância e comportamento cinético de canais iônicos individuais até a demonstração de neurônios individuais implicados em comportamentos complexos. Nesse sentido, diferentes estados cerebrais e comportamentos implicam o recrutamento de grandes conjuntos de neurônios se comunicando em um estado coerente, dinâmico. Além disso, essas grandes populações são formadas por diversos subtipos neuronais cuja análise requer ténicas que possibilitem uma resolução temporal e espacial de células individuais e, prefencialmente, de subtipos específicos. Apenas recentemente, indicadores ópticos geneticamente codificados surgiram como ferramentas não invasivas de alta resolução espacial e temporal utilizados para monitorar a atividade de neurônios individuais e populações neuronais específicas. O número crescente de novos indicadores optogenéticos, juntamente com a ausência de comparações em condições idênticas, gerou dificuldade em escolher a mais adequada das proteínas, dependendo do desenho experimental. Portanto, o objetivo deste estudo foi comparar três proteínas repórter recentemente desenvolvidas: os indicadores de cálcio GCaMP3 e R-GECO1, e o indicador de voltagem VSFP butterfly1.2. Foram expressos em neurônios do hipocampo em cultura, os quais foram submetidos a registros de patch-clamp e de imageamento óptico. Os três grupos (cada um expressando uma proteína) exibiram valores semelhantes de potencial de membrana (em mV, GCaMP3: -56 ± 8,0; R-GECO1: -57 ± 2,5; VSFP: -60 ± 3,9; p = 0,86), no entanto, o grupo de neurônios que expressam VSFP mostrou uma média mais baixa de resistência de entrada do que os outros grupos (em Mohms, GCaMP3: 161 ± 18,3; GECO1-R: 128 ± 15,3; VSFP: 94 ± 14,0; p = 0,02). Cada neurônio foi submetido a injeções de correntes com frequências diferentes (10 Hz, 5 Hz, 3 Hz, 1,5 Hz, e 0,7 Hz) e as suas respostas de fluorescência foram registradas. Em nosso estudo, apenas 26,7% (4/15) dos neurônios que expressam VSFP mostraram sinal de fluorescência detectável em resposta a potenciais de ação. O valor médio de sinal-para-ruído (SNR), obtido em resposta a cinco potenciais de aҫão (a 10 Hz) foi pequeno (1,3 ± 0,21), no entanto a cinética rápida do VSFP permite a discriminação de disparos, como picos individuais, com detecção de 53% dos APs evocados. Freqüências abaixo de 5 Hz, assim como variaҫões no potencial de membrana subliminares, foram indetectáveis devido ao alto ruído do sinal de fluorescência. Por outro lado, os indicadores de cálcio mostraram maior alteração na fluorescência, seguindo o mesmo protocolo (cinco potenciais de aҫão a 10 Hz). Entre os neurônios expressando GCaMP3, 80% (8/10) exibiram sinal, com um valor médio de SNR de 21 ± 6,69 (soma), enquanto que para os neurônios expressando R-GECO1, 50% (2/4) dos neurônios demonstraram sinal com um valor médio SNR de 52 ± 19,7 (soma). Para protocolos de 10 Hz, 54% dos disparos foram detectados com evocado GCaMP3 e 85% com o R-GECO1. Disparos foram detectados em todas as frequências e os sinais de fluorescência foram também detectados a partir de despolarizações subliminares. Sendo GCaMP3 o indicador mais provável de produzir sinal de fluorescência e com alto SNR, alguns experimentos foram realizados somente com essa proteína. Observamos que GCaMP3 é eficaz na detecção de inputs sinápticas (envolvendo influxo de Ca2+), com alta resolução espacial e temporal. Também foram observadas diferenças entre os valores de SNR resultantes dos disparos evocados, em comparação com os disparos espontâneos. Em registros de grupos de células, GCaMP3 mostrou clara discriminação entre células ativadas e silêncio, revelando-se como uma ferramenta potencial em estudos de sincronização neuronal. Assim, nossos resultados sugerem que os indicadores de cálcio disponíveis atualmente permitem estudos detalhados sobre a comunicação neuronal, que vão desde dendritos individuais até a investigação de eventos de sincronia em redes neuronais geneticamente definidas. Em contraste, VSFPs representam uma tecnologia promissora para monitorar a atividade neural e, apesar de ainda requererem melhoramentos, podem se tornar mais apropriados do que os indicadores de cálcio, uma vez que os neurônios trabalham em uma escala de tempo mais rápida do que eventos de cálcio podem prever

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