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Title: Perfil transcricional e alterações histopatológicas na Leishmaniose visceral canina
Authors: Nascimento, Paulo Ricardo Porfirio do
Keywords: Histopatologia;Leishmaniose visceral canina;Transcriptoma;Inflamassoma
Issue Date: 13-Dec-2016
Citation: NASCIMENTO, Paulo Ricardo Porfirio do. Perfil transcricional e alterações histopatológicas na Leishmaniose visceral canina. 2016. 124f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2016.
Portuguese Abstract: Introdução: Os cães são considerados os principais reservatórios domésticos de Leishmania infantum no Brasil e apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, variando de perda de peso, anemia grave, hepatoesplenomegalia e lesões dérmicas disseminadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de expressão gênica em células do baço e do sangue periférico de cães naturalmente infectados por L. infantum e investigar as alterações histopatológicas no baço, fígado, intestino e pele, visando identificar possíveis vias imunorreguladoras envolvidas na patogênese da LVC. Metodologia: Vinte e um cães oriundos do Centro de Controle de Zoonoses de Natal-RN foram estudados e um subgrupo destes animais (n=8) foi utilizado para estudos de expressão gênica global. A carga de Leishmania nos diversos tecidos, foi estimada por qPCR e cultura para Leishmania foi realizada. O RNA total do baço e do sangue periférico foi extraído e as bibliotecas de cDNA foram obtidas e sequenciadas em plataforma Illumina. As sequências obtidas foram filtradas e alinhadas contra o genoma de Canis familiaris pelo software Bowtie. A expressão gênica diferencial foi analisada usando o protocolo do Cufflinks, a anotação funcional e as características moleculares dos genes foram obtidas no banco de dados Gene Ontology e KEGG através do pacote STRINGdb. Fragmentos de fígado, duodeno, pele e baço foram coletados, processados e corados com hematoxilina/eosina e imunofluorescência para análises histopatológicas. Resultados: As cargas parasitárias estimadas para baço e fígado apresentam correlação, porém não há correlação entre a carga parasitária destes tecidos com aquela presente no sangue. Aproximadamente 756 genes se mostraram super expressos no baço de animais sintomáticos, como CTLA4, CCL2 e IL27; além destes, cerca de 1.190 genes apresentaram expressão reprimida neste mesmo grupo, como BMP6, C1QB e C1QC. As vias de ativação de células NK, receptores dos tipos Toll-like e NOD-like expressas no baço de animais sintomáticos estavam com expressão elevada, enquanto as vias de síntese de âncoras de GPI e ativação do imunoproteossoma estavam reprimidas. A progressão da LVC resulta em desorganização da citoarquitetura do baço, com perda parcial da delimitação entre polpa branca e vermelha. É observado infiltrado inflamatório no fígado, duodeno e pele. Validando o achado do transcriptoma, foi observada por imunofluorescência a presença de CTLA4, CCR7 e NLRP3 no baço de animais sintomáticos. Conclusões: A desregulação de mecanismos tipicamente associados à imunidade inata pode estar diretamente envolvida na patogenia da LVC. Além disso, uma alta eficiência no processamento e apresentação de antígenos parecem ser responsáveis, pela resistência ao desenvolvimento dos sinais clínicos e integridade tissular durante a infecção por L. infantum em cães.
Abstract: Background: Dog is the main domestic reservoir of Leishmania infantum in Brazil. Those animals present a wide spectrum of clinical manifestations, varying from weight loss, anemia to hepatosplenomegaly and skin lesions. The goal of this study was to evaluate the gene expression profile in the spleen and peripheral blood cells from naturally Leishmania-infected dogs and to study the histology of the spleen, liver, gut and skin, in order to determine possible molecular pathways and histopathological process underlying the mechanisms related to disease progression and resistance. Methodology: 21 dogs was studied and a sub group (n=8) was selected for transcriptomic studies. In addition, spleen, liver, gut and blood parasitism were estimated by qPCR and parasite was isolated from the spleen by culture. Total RNA was extracted and cDNA libraries were constructed and sequenced in an Illumina platform. The reads obtained were filtered and aligned against Canis familiaris genome using Bowtie. Differential gene expression was analyzed using the Cufflinks workflow, functional annotation and molecular features for each gene was obtained from Gene Ontology and KEGG database using STRINGdb. A fragment of liver, gut, skin and another spleen fragment were collected, processed and stained by HE and immunofluorescence for histopathological analysis. Results: Parasite load estimated in the spleen and liver were strongly associated, however no correlation was observed between them and circulating parasite estimation. Approximately, 756 genes were upregulated in the spleens of symptomatic dogs, as CTLA4, CCL2 and IL27, furthermore, about 1,190 genes were downregulated in the same group of animals, as BMP6, C1QB and C1QC. We found that NK cells activation, toll-like and NOD-like receptors pathways are highly expressed in the spleen of symptomatic dogs, while GPI-anchors synthesis and immunoproteasome activation related genes are downregulated in these animals. Additionally, we observed that in symptomatic animals, the cytoarchitecture of spleen is altered, with partial loss of the delimitation between white and red pulp. Furthermore, an intense inflammatory infiltrate in the liver, gut and skin of these animals. Confirming the RNA-Seq findings, we observed by immunofluorescence CTLA4, CCR7 and NLRP3 are overexpressed the spleen of symptomatic dogs. Conclusions: These findings suggest that misregulation of innate immunity is involved in CVL and an efficient antigen presentation maybe decisive for resistance to clinical signs development and tissue integrity during L. infantum infection in dogs.
URI: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/23361
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