UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO ASPECTOS CARIOGENÔMICOS EM ESPÉCIES MARINHAS DE PERCOMORPHA (HAEMULIDAE E LABRIDAE): UMA PERSPECTIVA EVOLUTIVA ________________________________________________ Tese de Doutorado Natal/RN, setembro de 2017 CLÓVIS COUTINHO DA MOTTA NETO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO ASPECTOS CARIOGENÔMICOS EM ESPÉCIES MARINHAS DE HAEMULIDAE (PERCIFORMES) E LABRIDAE (LABRIFORMES): UMA PERSPECTIVA EVOLUTIVA Clóvis Coutinho da Motta Neto Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Sistemática e Evolução. Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina Natal-RN 2017 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB Motta Neto, Clovis Coutinho da. Aspectos cariogenômicos em espécies marinhas de Haemulidae (Perciformes) e Labridae (Labriformes): uma perspectiva evolutiva / Clovis Coutinho da Motta Neto. - Natal, 2017. 144 f.: il. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução. Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina. 1. Aspectos Cariogenômicos - Tese. 2. Haemulidae - Tese. 3. Labridae - Tese. I. Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 597.2/.5 CLÓVIS COUTINHO DA MOTTA NETO ASPECTOS CARIOGENÔMICOS EM ESPÉCIES MARINHAS DE HAEMULIDAE (PERCIFORMES) E LABRIDAE (LABRIFORMES): UMA PERSPECTIVA EVOLUTIVA Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Sistemática e Evolução, com ênfase em Padrões e Processos Evolutivos. Aprovado em 29 de Setembro de 2017. Comissão Examinadora: Dr. Marcelo de Bello Cioffi – UFSCar Dr. Paulo Augusto de Lima Filho – IFRN Dr. José Garcia Júnior – IFRN Dr. Allyson Santos de Souza – UFRN “Clóvis Coutinho da Motta, Júlio Huete Garcia, Pátria Regina Huete, Luciano Previatti, Fernando Huete, Roberto Coutinho da Motta, Maria do Bom Sucesso Dantas Meirelles, Bozó – in memorian” “Fortis in arduis” (John McDougal) AGRADECIMENTOS A realização do presente trabalho foi unicamente possível devido a todo incentivo e apoio das seguintes pessoas e instituições as quais gostaria de expressar o meu agradecimento: Ao Professor Dr. Wagner Franco Molina, pela oportunidade, apoio, estímulo e crença na realização deste trabalho. Meu sincero e profundo agradecimento pelo direcionamento a luz. Á Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), aos seus funcionários de forma generalizada e sua comunidade acadêmica, por sempre manterem as portas abertas e pelo suporte fornecido aos estudantes. Ao programa de Pós-graduação em Sistemática e Evolução (PPGSE), todo seu corpo docente e secretariado por todo apoio, oportunidade e direcionamento fornecido aos discentes. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES) pelo fomento dos Programas de Pós-Graduação da UFRN. Ao Dr. André Marques Seco pelo auxílio nos experimentos de metilação do DNA na Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), ao Professor Dr. Marcelo Guerra e a Professora Dra. Andrea Pedrosa Harand pelo acolhimento no Laboratório de Citogenética e Evolução Vegetal (UFPE). Ao Drs. Andreas Houben e Joerg Fuchs pela oportunidade na participação nos cursos de Plant Cytogenetics e Flow Cytometry (UFPE). Ao Professor Dr. Daniel Benetti e seus alunos Julian Fiorentino e Zachary Daugherty por todo suporte no período de visita as instalações de aquicultura da Rosentiel School of Marine and Atmospheric Science, pertencente ao Departamento de Ecossistemas Marinhos e Sociedade da Universidade de Miami (EUA). Ao Professor Dr. Paulo Augusto Lima Filho e ao Dr. Gideão Wagner Werneck Félix da Costa pela correção e aconselhamento durante a qualificação. Excepcionalmente ao Dr. Gideão Wagner Werneck Félix da Costa pelo incansável suporte nos procedimentos laboratoriais. Ao Professor Dr. Roberto Ferreira Artoni pela co-orientação, carinho, acolhimento e disponibilização de estrutura laboratorial para a realização de uma parcela significativa deste trabalho. A todos os componentes do Laboratório de Biologia Evolutiva da Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG), destacando o elo de amizade com Daiane Niedzielski, Gabriel Marra, Miguel Soto, e em especial Jonathan Pena Castro pelo auxílio nos procedimentos laboratoriais desenvolvidos naquela instituição e Fernanda Silva. Ao Professor Dr. Marcelo Vicari, por todo apoio desde a época da defesa de minha dissertação de mestrado e aos integrantes do Laboratório de Biologia Cromossômica, Estrutura e Função (UEPG), dirigido por este. Aos Professores Drs. Marcelo de Bello Cioffi e Luís Antônio Carlos Bertollo, ambos da Unversidade Federal de São Carlos (UFSCar), a Professora Dra. Kátia Scortecci da UFRN, ao Professor Dr. Oscar Shibatta da Universidade Estadual de Londrina (UEL) e ao Professor Dr. Ricardo Rosa da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) pelo auxílio na elaboração dos manuscritos. Ao Professor Dr. Jorge Eduardo Lins do Rêgo pelos conselhos e orientações pessoais e ao Professor Dr. José Garcia Jr. no auxílio na identificação de alguns espécimes e direcionamentos sempre construtivos. Á todos os membros do Laboratório de Genética de Recursos Marinhos (LGRM): Allyson Santos, Amanda Borges, Aparecida Fernandes, Divana Eliva, Ericka Santos, Gideão Costa, Inaílson Cunha, Ingrid Accioly, Jeane Kinen, Josineide Costa, Juliany Wölkmer, Karlla Amorim, Paulo Filho, Rafael Soares, Rodrigo Xavier, Gideão Costa, Vanessa Sales e Washington Candeia. Ao Serviço Geológico do Brasil (CPRM), seus funcionários e colaboradarores, especialmente aos colegas do Núcleo de Apoio de Natal (NANA) pelo companheirismo e apoio. A todos aqueles que contribuíram direta ou inderetamenete para a realização deste trabalho. Aos amigos verdadeiros e a minha família, em especial e amorosamente aos meus pais: Ricardo José Meirelles da Motta e Maria Cristina Huete Meirelles da Motta, pelo carinho e apoio incondicional que nenhum adjetivo seria capaz de descrever, dispensando as palavras. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 12 1.1 Aspectos Evolutivos, Taxonômicos e Biológicos de Labridae (Labriformes) 13 1.2 Aspectos Evolutivos, Taxonômicos e Biológicos de de Haemulidae (Perciformes) 16 1.3 Dispersão Larval e Padrões Genéticos em Labridae e Haemulidae 22 1.4 Fisiografia e Aspectos Oceanográficos do Atlântico 25 1.5 A Pluma dos Rios Amazonas e Orinoco 27 1.6 Aspectos Citogenéticos em Percomorpha 29 1.7 Marcadores Estruturais Cromossômicos 33 1.8 Metilação do DNA 36 1.9 Detecção da Biodiversidade Através de Marcadores Moleculares 38 2 OBJETIVO GERAL 42 2.1 Objetivos Específicos 42 3. MATERIAL E MÉTODOS 44 3.1. Material 44 3.2. Métodos 49 3.2.1. Preparações Cromossômicas 49 3.2.1.1 Técnica de Estimulação Mitótica com lisados bacterianos 49 3.2.2 Obtenção de Cromossomos Mitóticos 49 3.2.3 Preparação das Lâminas 50 3.2.4 Técnicas de Bandamentos Cromossômicos 50 3.2.4.1 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos 50 3.2.4.2 Detecção de Heterocromatina Constitutiva 51 3.2.4.3 Coloração com Fluorocromos CMA3 e DAPI 51 3.2.4.4 Hibridização Fluorescente in situ (FISH) 52 3.2.4.5 Revelação de regiões de DNA metiladas 54 4. ANÁLISES CROMOSSÔMICAS 55 5. PREPARAÇÃO DE CARIÓTIPOS 56 6. CAPÍTULOS 57 6.1 Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae (Teleostei, Perciformes): Evidências de manutenção evolutiva sintênica 57 6.2 Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias repetitivas ricas em Tol2/Alu em espécies de Bodianus (Labriformes, Labridae) 73 6.3 CAPÍTULO III – Marcadores mitocondriais e nucleares de DNA apontam a espécie endêmica Bodianus insularis Gomon & Lubbock, 1980 como uma sinonímia de Bodianus pulchellus (Poey, 1860) (Labridae) 93 7. CONCLUSÕES 118 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GENERALIZADAS 121 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Mapa das populações de espécies de Haemulidae dos gêneros Anisotremus e Haemulon distribuídas na costa do Pacífico e Atlântico do continente americano. 20 Figura 2. Árvore consenso de análise Bayesiana dos dados combinados de CytB, COI, RAG2 e TMCO-4c4, representando as espécies nominais de Haemulon, associada a dados referentes as regiões e área de distribuição. 21 46 47 Figura 3. Espécies dos gêneros Haemulon e Anisotremus coletadas para o estudo. Figura 4. Espécies de Labridae do gênero Bodianus utilizadas no estudo. Figura 5. Mapa dos pontos de coleta das espécies utilizadas no estudo. 48 FIgura 6. Cariótipos das espécies de Anisotremus através de coloração convencional com Giemsa, bandamento C e hibridização in situ com sondas DNAr 18 e 5S. (Cap. I) 63 Figura 7. Cariótipos das espécies de Haemulon através de coloração convencional com Giemsa, bandamento C e hibridização in situ com sondas DNAr 18 e 5S. (Cap. I) 64 Figura 8. Relações filogenéticas baseadas em dados moleculares, associadas a informações citogenéticas e valores de área de distribuição de espécies da família Haemulidae. (Cap. I) 67 Figura 9. Cromossomos metafásicos das espécies B. insularis e B. rufus, submetidas ao FISH com sondas DNAr 5S e 18S; Tol2 e Alu. (Cap. II) 79 Figura 10. Cromossomos metafásicos das espécies B. insularis e B. rufus sob coloração com DAPI e imunodetecção de sítios metilados 5mC. (Cap. II) 80 Figura 11. Idiograma ilustrando a distribuição de sequências repetitivas e o padrão de metilação nos cromossomos metafásicos de B. insularis e B. pulchellus. (Cap. II) 81 Figura 12. Espécimes de Bodianus rufus, B. pulchellus e B. insularis. (Cap. III) 96 Figura 13. Árvore de máxima verossimilhança baseada na combinação de sequências de DNAr 16S, COI e Rodopsina das espécies de Bodianus. (Cap. III) 104 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Dados de número e localidade das espécies coletadas. (Cap.I) 60 Tabela 2. Caracteres merísticos das espécies de Bodianus do Atlântico. (Cap. III) 97 Tabela 3. Primers utilizados para a amplificação das sequências de genes mitocondriais e nuclear nas espécies de Bodianus. 98 Tabela 4. Números de acesso no Genbank das sequências de Bodianus analisadas. (Cap. III) 100 Tabela 5. Distâncias de pareamento (p-distance) (diagonal inferior) e erros padrões (diagonal superior) das espécies de Bodianus baseadas nas sequências parciais de DNAr 16S, COI e Rodopsina. (Cap. III) 103 Tabela 6. Média interespecífca das distâncias de emparelhamento (p-distance) (diagonal inferior) e diferenças nucleotídicas (diagonal supeior) com seus respectivos erros padrões baseados nas sequencias parciais dos genes de DNAr 16S, COI e Rodopsina. (Cap. III) 104 Tabela 7 Diferenças nucleotídicas das sequências dos genes 16S, COI e Rodopsina entre as espécies Bodianus insularis, B. pulchellus e B. rufus. 104 LISTA DE ABREVIATURAS 5mC – 5’metilcitosina a – Acrocêntrico Ag-RONs – Regiões organizadoras de nucléolo AgNO3 – Nitrato de prata Ba(OH)28H2O – Hidróxido de bário BOD –região BOD C – Centromérico (a) CMA3 – Cromomicina A3 COI – Citocromo Oxidase Subunidade I CytB – Citocromo B DAPI – 4',6-diamidino-2-fenilindol DNA – Ácido desoxirribonucléico DNAr/rDNA – Ácido desoxirribonucléico ribossomal FISH – Hibridização fluorescente in situ FITC – Isotiocianato de fluoresceína HCl – Ácido clorídrico m – Metacêntrico M.a – Milhões de anos atrás NaCl – Cloreto de sódio NF – Número fundamental NF/FN – Número fundamental P – Pericentromérico (a) pb/bp – Pares de bases PCR – Reação em cadeia da polimerase RAG2 – Gene ativante da recombinação 2 RB – Razão entre os braços maior e menor Rhod – Gene da rodopsina RNA – Ácido ribonucléico RONs – Regiões organizadoras de nucléolos RPM – Rotações por minuto sm – Submetacêntrico SSC – Solução salina de citrato de sódio st – Subtelocêntrico T – Telomérico(a) TMCO4 – gene da proteína transmembranar e domínios helicoidais 4 RESUMO A Série Percomorpha é maior divisão entre os vertebrados, constituindo o maior e mais derivado clado de peixes teleósteos. Dentre suas Ordens, Perciformes e Labriformes constituem modelos adequados à investigação do conservadorismo e diversificação cromossômica. Em Perciformes o conservadorismo cromossômico é representado por cariótipos basais com 2n=48 acrocêntricos, extensivamente compartilhados por uma parcela considerável de espécies. As causas e extensão do conservadorismo cariotípico em várias famílias desta Ordem não são inteiramente claras. Diante da diversidade de espécies em Labriformes, aspectos mais detalhados de sua evolução cariotípica ou mesmo status taxonômico de algumas espécies merecem particular atenção. Com vistas a contribuir com novas informações sobre essas questões foram implementadas análises cromossômicas convencionais (coloração convencional com Giemsa, bandamento C e Ag-RONs, fluocrocromos base-específicos) e citomoleculares (hibridização in situ com sondas DNAr 18S, DNAr 5S). Oito espécies dos gêneros Anisotremus e Haemulon da família Haemulidae (Perciformes) foram analisadas, incluindo amostras de diferentes áreas do Atlântico, como modelo de evolução conservativa. Em 2 espécies do gênero Bodianus da família Labridae (Labriformes), foram analisados também aspectos da evolução de sequências repetitivas particulares (DNAr 18S, DNAr 5S, Alu e Tol2) nos cromossomos por hibridização com 5 metilcitosina (5mC). Adicionalmente, foram realizadas comparações filogenéticas, utilizando sequências de DNA mitocondrial (COI e 16S) e nuclear (Rodopsina) para verificar o status taxonômico da espécie Bodianus insularis, endêmica das ilhas Meso-Atlânticas. Todas as espécies de Haemulidae apresentaram 2n=48a, sítios Ag-RONs simples e heterocromatina centromérica reduzida, além de considerável compartilhamento de sítios de DNAr 5S e 18S, confirmando a ocorrência de estase cariotípica na família. Os padrões cariotípicos das populações de A. virginicus e H. chrysargyreum entre o Caribe e Atlântico Sul não revelaram variações cromossômicas decorrentes da barreira dos deságues dos rios Amazonas/Orinoco. Em Bodianus, as análises identificaram uma notável região descondensada em um par cromossômico subtelocêntrico, denominada região BOD. Entre suas características constitutivas e funcionais particulares, se mostram DAPI-, argentofílica (Ag+), marcantemente hipometilada e saturada de elementos transponíveis, sugerindo que a participação destes elementos móveis pode ter contribuído para sua gênese e dinâmica epigenética complexa. Quanto a espécie endêmica B. insularis, sua divergência genética é muito inferior à apresentada por espécies diferenciadas sugerindo que embora represente um grupo geograficamente isolado, constitua uma sinonímia de B. pulchellus. A divergência nos ritmos de diversificação cariotípica entre Haemulidae e Labridae é aqui discutida à luz de características cariotípicas intrínsecas que podem favorecer o tamponamento e a fixação de mudanças cromossômicas e aspectos biológicos das espécies que contribuem para as condições particulares de evolução cariotípica desses dois grupos de peixes marinhos. Palavras-chave: Percomorpha, Perciformes, estase cariotípica, Labriformes, metilação do DNA, status taxonômico ABSTRACT Percomorpha series is the largest division among vertebrates, constituting the largest and most derived clade of teleostean fishes. Among its Orders, Perciformes and Labriformes constitue adequated models for the investigation of conservatism and chromosomal diversification. In Perciformes the chromosomal conservatism is represented by basal karyotypes with 2n = 48 acrocentric, extensively shared by a considerable portion of species. The causes and extent of the karyotypic conservatism in various families of this Order are not entirely clear. In front of the diversity of species in Labriformes, more detailed aspects of its karyotype evolution or even the taxonomic status of some species deserve particular attention. In order to contribute with new information on these issues, it was implemented conventional chromosome analysis (conventional staining with Giemsa, C-banding and Ag- NORs, base-specific fluochromes) and cytomolecular (in situ hybridization with 18S rDNA, 5S rDNA) probes were implemented. Eight species of the genera Anisotremus and Haemulon of the family Haemulidae (Perciformes) were analyzed, including samples from different areas of the Atlantic, as a model of conservative evolution. In 2 species of the Bodianus genus Labridae (Labriformes), it was also analyzed aspects of the evolution of particular repetitive sequences (DNAr 18S, DNAr 5S, Alu and Tol2) in the chromosomes by hybridization with 5 methylcytosine (5mC). Additionally, phylogenetic comparisons were performed using mitochondrial (COI and 16S) and nuclear (Rhodopsin) DNA sequences to verify the taxonomic status of the Bodianus insularis species, endemic to the Meso-Atlantic islands. All Haemulidae species presented 2n = 48a, single Ag-NORs sites and reduced centromeric heterochromatin, besides considerable sharing of rDNA 5S and 18S sites, confirming the occurrence of karyotype stasis in the family. The karyotypic patterns of the populations of A. virginicus and H. chrysargyreum between the Caribbean and the South Atlantic did not reveal chromosomal variations due to the barrier of the discharges of the Amazonas / Orinoco rivers. In Bodianus, the analyzes identified a remarkable decondensed region in a subtelocentric chromosomal pair, denominated BOD region. Among its particular constitutive and functional characteristics, it is DAPI-, Argentofílica (Ag +), markedly hypomethylated and saturated with transposable elements, suggesting that the participation of these mobile elements may have contributed to its genesis and complex epigenetic dynamics. In relation to the endemic species B. insularis its genetic divergence is much inferior to that presented by differentiated species suggesting that although it represents a geographically isolated group, it constitutes a synonym of B. pulchellus. The divergence in the rates of karyotype diversification between Haemulidae and Labridae is discussed here in the light of intrinsic karyotype characteristics that may favor the buffering and the fixation of chromosomal changes and biological aspects of the species that contributes to particular conditions of karyotype evolution of these two groups of marine fish. Key words: Percomorpha, Perciformes, karyotype stasis, Labriformes, DNA methylation, taxonomic status Introdução 12 1. INTRODUÇÃO No ambiente marinho alguns grupos biológicos se destacam por desempenharem intrincadas relações ecológicas, comporem uma importante parcela de sua biodiversidade, além de se apresentarem como modelos evolutivos pertinentes para elucidações biogeográficas, possuindo inextricáveis particularidades taxonômicas e filogenéticas. No Atlântico dois grupos têm sido intensamente investigados pelas complexas relações que desempenham junto as regiões costeiras e insulares, são as famílias Haemulidae (Perciformes) e Labridae (Labriformes). A famlila Haemulidae é composta por espécies que possuem grandes contigentes populacionais e uma distribuição global por vastas áreas, fazendo-se presente em praticamente todos os oceanos do globo. Os Labridae são particularmente interessantes por apresentarem casos de reversão sexual e por desempenharem relações marcantes junto ao ambiente recifal, com profundas influências ecossistêmicas (Gomon, 2006). Do ponto de vista citogenético, os Haemulidae vêm sendo utilizados modelarmente como uma exemplificação adequada de estaticidade carioevolutiva presente na Série Percomorpha, caracterizada pela presença de 48 cromossomos acrocêntricos, reduzido conteúdo heterocromático, sítios simples de regiões organizadoras nucleolares (RONs), assim como de DNA ribossômico das subunidades 5S e 18S. Esse padrão é considerado basal para a maioria dos Percomorpha investigados até então, aonde variações são consideradas aspectos derivados. Os Labridae, por sua vez, vem sendo investigados como derivações desse padrão sinapomórfico, havendo a presença de cromossomos bibraquiados em muitas espécies e recentemente a detecção de regiões caracteristicamente descondensadas, possivelmente atuando como pseudogene na carioevolução de alguns taxa dessa família (Molina et al., 2012). Ambas as famílias vêm acumulando conhecimentos citogenéticos gradativamente durante os últimos anos, seja pela utilização de análises mais refinadas e resolutivas, seja pela ampliação do espectro filogenético com a adição de novas espécies ou realocações. Aqui são investigados aspectos cariogenômicos que possivelmente influenciaram a evolução de espécies das Introdução 13 famílias Haemulidae e Labridae com vistas a indetificar a influência de elementos epigenéticos na evolução dos dois grupos, assim como a utilização de marcadores moleculares para verificação do status taxonômico em detrimento ao fenótipo de algumas espécies. 1.1 Aspectos Evolutivos, Taxonômicos e Biológicos de Labridae (Labriformes) Classificações taxonômicas em diversos grupos de peixes têm passado por intensa revisão através de análises moleculares mais inclusivas, aspectos da biologia do desenvolvimento e análises de estruturas corporais internas complexas e fósseis (Westneat & Alfaro, 2005; Westneat et al., 2005; Rocha et al., 2008; Tavera et al., 2012; Santini, 2016). Essas abordagens têm permitido a identificação de 3.900 novas espécies nos últimos 10 anos, elevando o número de espécies de peixes para mais de 34.000 (Eschmeyer & Fong, 2017). Um dos maiores avanços sistemáticos atuais consistiu na reformulação da Divisão Percomorpha (=Percomorphacea), através de informações geradas por estudos moleculares (Near et al., 2012; Betancur-R. et al., 2013), embora ainda contestada como um grupo não natural (Nelson et al., 2016). Anteriormente essa Divisão encontrava-se com status de incertae sedis, mas atualmente foi fracionada em nove grupos supraordinais composto por seis Séries: Ophidiimorpharia, Batrachoidimorpharia, Gobiomorpharia, Scombrimorpharia, Carangimorpharia; e das três Subséries: Anabantomorphariae, Carangimorphariae, Ovalentariae e Percomorpharia (Wiley & Jhonson, 2010; Nelson et al., 2016). Percomorpharia, destaca-se por ser o maior clado dos Percomorpha incluindo 11 Ordens cujas mais proeminentes são Perciformes, Labriformes, Lophiiformes e Tetraodontiformes, com pelo menos 151 famílias incluindo 3 das 10 mais diversas famílias de peixes: Labridae, Serranidae e Scorpaenidae (Betancur-R et al., 2013). Destacando-se como uma nova Ordem, Labriformes evidencia um agrupamento mais restrito entre as famílias Labridae, Scaridae e Odacidae, ao passo que as famílias Embiotocidae, Cichlidae e Pomacentridae foram Introdução 14 recentemente movidas para Ovalentaria (Wainwrigh et al., 2012). Labriformes engloba os bodiões e espécies relacionadas, sendo dividida nas famílias Labridae, Scaridae, Odacidae, Embiotocidae, Cichlidae e Pomacentridae. Foi primeiramente proposta por Kaufman e Liem (1982), porém tendo sua monofilia questionada constantemente (Wiley & Jhonson, 2010). Dentre os Labriformes, Labridae destaca-se por ser a família mais especiosa, apresentando-se como um dos grupos mais diversificados em termos morfológicos, de tamanho e espectro cromático (Westneat & Alfaro, 2005; Nelson et al., 2016). Labridae apresenta-se composta por 71 gêneros e cerca de 551 espécies, dependendo da taxonomia utlizada (Parenti & Randall, 2000; Westneat, 2002; Westneat & Alfaro, 2005; Nelson et al., 2016; Eschmeyer & Fong, 2017). A riqueza de espécies, os morfótipos e os colomorfos dos Labridae, associados as interações ecológicas que desenvolvem junto ao hábitat e os aspectos evolutivos relacionados a estrutura bucal faz com que essa família seja considerada a contraparte oceânica dos ciclídeos (Stiassny & Jensen 1987; Streelman & Karl 1997; Verheyen et al., 2003). Os Labridae são estritamente marinhos e conhecidos popularmente por bodiões, com representação global e marcante presença nos oceanos Atlântico, Índico e Pacífico, com maior número de registro de espécies nas águas tropicais, temperadas e subárticas (Nelson et al., 2016). Existe ainda um grande número de espécies exclusivamente de águas frias (Choat & Bellwood, 1995; Cowman, 2014). Cerca de trinta espécies ocorrem na costa brasileira (Moura et al., 2003; Nelson et al., 2016). Podem ser encontrados em profundidades que variam de águas rasas até 100 metros de profundidade, ocupando uma grande variedade de hábitats incluindo bancos de algas, rochas, recifes localizados em bancos de areia e recifes de corais (Westneat et al., 2002). Exploram praticamente todos os recursos tróficos incluindo zooplâncton, muco coralíneo, detritos, algas, gastrópodes, bivalves, ectoparasitas e peixes (Wainwright & Bellwood 2002; Westneat et al., 2002, 2005; Westneat & Alfaro, 2005). Em muitas espécies ocorre hermafroditismo protogínico (com o desenvolvimento inicialmente dos órgãos sexuais femininos, que posteriormente podem converter-se em masculinos) e variados padrões de Introdução 15 coloração (Westneat, 2002; Nelson et al., 2016. Tais padrões podem alterar- se tanto em função do fenômeno de reversão sexual como também da fase ontogenética, dificultando a identificação taxonômica (Parenti et al., 2011). De particular interesse dentro da família Labridae, o gênero Bodianus destaca-se por ser um dos mais diversos, além de habitar diferentes regiões proporcionando excelentes oportunidades para análises evolutivas e da irradiação do gênero. Seus representantes são conhecidos como peixes- porcos devido ao prolongamento do focinho, sendo o corpo comprimido lateralmente, o neurocrânio projetado frontalmente e a extremidade anteroventral da dentição agudamente angular (Gomon, 2006; Santini et al., 2016). Inicialmente a filogenia molecular para Bodianus se restringia a poucas espécies (Westneat & Alfaro, 2005; Alfaro et al., 2009; Cowman et al., 2009; Kazancıoglu et al., 2009), enquanto que filogenias baseadas em 43 caracteres morfológicos eram mais robustas e completas (Gomon, 2006). Análises recentes envolvendo maior número de espécies e marcadores moleculares mais resolutivos têm ampliado e fornecido uma visão mais clara e precisa das relações filogenéticas no gênero, além de traçar aspectos cronoevolutivos da sua diversificação (Santini et al., 2016). Os dados evidenciaram que Bodianus é um gênero parafilético associado a outros dois gêneros (Clepticus e Semicossyphus). Seu surgimento se deu no Mioceno (~17 a 9 milhões de anos), sendo o centro de origem na região do Pacífico Sudoeste / Indo-Oeste e com pelo menos dois eventos de invasão no Atlântico Oriental e Ocidental, um no Índico Ocidental e três no Pacífico Oriental (Santini et al., 2016). Esses elementos sugerem uma revisão mais ampla para esse gênero que vem sendo utilizado para análise de evolução cromossômica, apresentando-se como um modelo mais derivado do que a maioria dos Percomorpha analizados citogeneticamente até então (Santini et al., 2016; Molina et al., 2012). Introdução 16 1.2 Aspectos Evolutivos, Taxonômicos e Biológicos de Haemulidae (Perciformes) Os Haemulidae apresentam clareza com relação a dinâmica da especiação entre habitats e regiões geográficas (Rocha et al., 2008), proporcionando uma oportunidade singular de avaliar os mecanismos promotores de diferenciação nesses habitats e regiões. Esse fato ocorre porque existem pares de espécies irmãs e geminais em populações do Novo Mundo (Jordan, 1908; Thomson et al.,2000; Lessios, 2008; Tavera et al., 2012), além também da possibilidade de utilização de relógios moleculares bem definidos em análises direcionadas à essa família (Rocha et al., 2008). São em grande parte marinhos, com algumas espécies habitando águas salobras e raramente águas dulcícolas. Seus representes estão presentes nos oceanos Atlântico, Índico e Pacífico, com um maior número de ocorrências concentradas na região costeira delimitada entre os trópicos (Nelson et al., 2016). Com relação ao habitat, acredita-se que primariamente a maioria dos ancestrais comuns de Haemulidae do Novo Mundo são de fundos macios (arenosos e lodosos), sendo a exploração dos fundos rochosos uma condição derivada (Hardy & Linder, 2005). A divisão dos Haemulidae do Novo Mundo em dois grandes grupos ecológicos, demonstra que os de habitat de fundo rochoso parecem ter evoluído três vezes independentemente durante a história evolutiva da subfamília Haemulinae. Eventos de diversificação associados à fracionamentos de habitat e consequentemente divisões ecológicas, parecem ter gerado mais linhagens com menos espécies em ambientes de fundos macios do que a taxa dos especiosos que habitam fundos rochosos, sugerindo a ocorrência contínua de especialização na família (Tavera et al., 2012). Apesar da reestruturação ocasionada pela nova resolução da divisão Percomorpha (Near et al., 2012; Betancur-R. et al., 2013), a família Haemulidae permaneceu alocada na Subordem Percoidei, a maior da divisão (46 famílias, 319 gêneros e cerca de 2.095 espécies) sendo composta por 135 espécies, distribuídas em 19 gêneros e duas subfamílias, Plectorhinchinae e Haemulinae. Dados recentes, utilizando marcadores Introdução 17 mitocondriais (16S), genes (COI e CytB), exóns nucleares (RAG2) e íntrons nucleares (S7), sugerem uma separação evolucionária precoce entre as duas subfamílias Haemulinae e Plectorhynchinae na história da família Haemulidae (Tavera et al., 2012). Haemulinae apresenta atualmente 92 espécies válidas distribuídas nos gêneros Anisotremus (monofilético), Boridia, Brachydeuterus, Conodon (monofilético), Emmelichthyops, Haemulon (parafilético), Haemulopsis (monofilético), Inermia, Isacia, Microlepidotus (monofilético), Orthopristis (monofilético), Parakuhlia, Pomadasys (parafilético), Xenichthys, Xenistius e Xenocys e em Plectorhinchinae, com 43 espécies válidas distribuídas entre os gêneros Diagramma, Genyatremus (monofilético), Parapristipoma e Plectorhinchus (parafilético) (Bernardi et al., 2008; Tavera et al., 2012; Eschmeyer & Fong, 2017; Nelson et al., 2016). Originária do Novo Mundo, Haemulinae tem seus representantes conhecidos vulgarmente como roncadores devido ao som que produzem quando rangem seus dentes faringeais (Lindeman & Toxey, 2002). Plectorhinchinae tem suas origens no Indo-Pacífico oriental, havendo também um centro de origem secundário no Atântico ocidental e sua alfa taxonomia é corroborada por estudos moleculares (Bernardi et al., 2008; Sanciangco et al., 2011). No Brasil tem-se registro de 19 espécies, pertencentes aos gêneros Anisotremus, Boridia, Conodon, Genyatremus, Haemulon, Haemulopsis, Orthopristis e Pomadasys, com a ocorrência de pelo menos 14 espécies para a região Nordeste (Júnior et al., 2015). No Atlântico os gêneros Anisotremus e Haemulon se destacam pela abundância e importância ecológica que desempenham nos recifes de corais, além de possuírem semelhanças singulares que sobrepõem a classificação taxonômica clássica, sendo sugeridos inclusive agrupamentos de espécies de Anisotremus em Haemulon baseados em marcadores moleculares (Bernardi et al., 2008; Rocha et al., 2008). Estes dois gêneros têm se revelado modelos adequados para estudos evolutivos e de especiação, pelo fato de seus representantes possuírem larga área de distribuição, clara identificação visual das formas adultas e taxonomia alfa bem resolvida (Bernardi et al., 2008; Rocha et al., 2008). Na costa brasileira ocorrem três espécies do gênero Anisotremus – A. virginicus, A. surinamensis e A. Introdução 18 moricandi, além de sete espécies de Haemulon – H. aurolineatum, H. chrysagyreum, H. melanurum, H. parra, H. plumierii, H. steindachneri e H. squamipinna (Floeter et al., 2003; Nelson et al., 2016). Haemulon representa o táxon mais especioso do Novo Mundo sendo de recente diversificação (Near et al., 2013; Nelson et al., 2016). Assim como Anisotremus, apresenta ocorrência de espécies geminais alopátricas no Pacífico Leste e Atlântico Oeste, bem como estruturações populacionais observadas nas regiões zoogeográficas das províncias do Caribe e do Brasil. Essas, sugerem ter sido influenciadas pela ação de barreiras biogeográficas, como o fechamento do Istmo do Panamá e a Barreira Amazônica (Rocha et al., 2008; Motta-Neto et al., 2011b) (Figura 1). Análises moleculares (CytB, COI, TMO 4c4 e RAG2) realizadas em 19 espécies nominais de Haemulon, apontam estruturações populacionais tão avançadas nas quais já ocorre a separação das espécies H. steindachneri do Atlântico e do Pacífico em unidades taxonômicas distintas, bem como forte variação intraespecífica em populações do Caribe e Brasil. Além desses resultados é possível também observar com base nos dados fornecidos pelo estudo, a formação de clados relacionados aos hábitos alimentares das espécies do gênero, evidenciando eventos de especiação associados a ocorrência progressiva de variações dietéticas em resposta ecológica a ocupação de novos nichos provavelmente resultado de adaptações morfológicas as alterações de hábito (Rocha et al., 2008; Motta-Neto et al., 2012). Essa dinâmica evolucionária pode ter repercutido nos padrões genéticos, adaptações ecológicas e distribuição espacial do grupo (Figura 2). Análises moleculares semelhantes (CytB, 1º íntron da proteína ribossomal S7) foram desenvolvidas em espécies de Anisotremus e inferiram que a especiação nesse gênero se iniciou entre 11 e 12 milhões de anos atrás (M.a). Particularmente, a divergência entre os pares de espécies geminais A. virginicus / A. taeniatus ocorreu entre 3.1-3.5 M.a, e A. surinamensis / A. interruptus ocorrendo por volta de 2 M.a, em ambos os casos as separações ocorreram em situação alopátricas, fortemente associadas ao fechamento dos Istmo do Panamá e a possível influência da Pluma Amazônica (Bernardi et al., 2008). Introdução 19 Cariotipicamente os Haemulidae representam um modelo categórico de exemplificação da estase evolutiva preponderante nos Percomorpha. Uma parcela significativa das espécies dessa Ordem cariotipadas até então, tem apresentado como característica basal a presença de 48 cromossomos acrocêntricos, reduzido conteúdo heterocromático, sítios simples de regiões organizadoras nucleolares (RONs), assim como de DNA ribossômico das subunidades 5S e 18S (Accioly & Molina 2007; Molina, 2007; Motta-Neto et al., 2011a, b; Arai, 2011). Esse conjunto intrigante de características cromossômicas cristalizadas ao longo da evolução da maior Ordem dentre os vertebrados, nos faz refletir a respeito da dinâmica carioevolutiva do grupo, necessitando de uma investigação mais aprofundada. A utilização de ferramentas mais resolutivas, nesse caso, vem a se tornar essencial a fim de que se possa identificar marcadores cromossômicos efetivos capazes de investigar a arquitetura genômica, a dinâmica carioevolutiva e diferenciar as espécies dessa família satisfatoriamente, como os atributos morfológicos e as análises moleculares o fazem. Introdução 20 Figura 1. Mapa das populações de espécies de Haemulidae dos gêneros Anisotremus e Haemulon distribuídas na costa do Pacífico e Atlântico – A. caesius ( ),A. dovi ( ),A. davidsonii ( ), A. interruptus ( ), A.moricandi (X), A. surinamensisi ( ), A. taeniatus ( ) A. virginicus ( ), H. aurolineatum ( ), H. album ( ), H. boschmae ( ),H. carbonarium ( ), H. chrysagyreum (▓), H. flaviguttatum ( ), H. flavolineatum ( ), H. macrostomum ( ), H. maculicauda ( ), H. melanurum (░), H. parra ( ), H. plumierii ( ), H. scudderii ( ),H. sciurus ( ), H. sexfaciatum ( ), H. steindachneri Atlântico ( ), H. steindachneri Pacífico ( ), H. squamipinna ( ), H. striatum ( ). Os pares de espécies geminais (com presença no Atlântico e no Pacífico) estão representadas com símbolos correspondentes: A. surinamensis ( ) – A. interruptus ( ), A. virginicus ( ) – A. taeniatus ( ), H. album ( ) – H. sexfaciatum ( ), H. steindachneri Atlântico ( ) – H. steindachneri Pacífico ( ). As barras ao lado da simbologia das espécies, representa ocorrência das mesmas espécies ( ), espécies geminais ( ) e espécies endêmicas ( ). A descontinuação nas chaves de ligação, ( ) e ( ), indica a presença de barreiras. Em destaque a deságua dos rios Amazonas e Orinoco, e a máxima projeção da pluma de água doce acordo com os meses de agosto ( ), setembro ( ) e outubro ( ). Os dados projetados foram obtidos da sonda Aquarius (NASA) para a verificação da salinidade nos oceanos no planeta, durante os meses de setembro a novembro de 2011. Introdução 21 O Oceano Pacífico é considerado o centro de origem das espécies de Haemulidae do Novo Mundo, havendo primeiramente a colonização do Atlântico Ocidental com posteriores invasões reversas, seguidas pela ocorrência de eventos vicariantes (Barreira do Panamá). A convergência desses elementos resultou em divergência alopátrica, sendo este tipo de especiação comum para muitos organismos marinhos (Tavera et al., 2012). A especiação alopátrica influenciou tanto a história evolutiva dos Haemulidae do Novo Mundo. Em Anisotremus ocorrem dois casos com os pares de espécies geminais entre os oceanos Pacífico e Atlântico – A. taeniatus / A. virginicus e A. interruptus / A. surinamensis (Bernardi et al., Figura 2. Árvore consenso de análise Bayesiana dos dados combinados de CytB, COI, RAG2 e TMCO-4c4, representando as espécies nominais de Haemulon, associada a dados referentes as regiões e área de distribuição – Atlântico Ocidental ( ), Caribe ( ), costa do Brasil ( ) e Pacífico Oriental ( ); informações citogenéticas disponíveis e valores referentes a área de distribuição em km2 sob as barras em cinza no interior da forma geométrica representativa para a distribuição. Adaptado de Rocha et al., 2008. Introdução 22 2008). Em Haemulon o mesmo ocorre entre os pares de espécies geminais H. scudderii / H. parra, H. sexfaciatum / H. álbum, sendo o caso mais claro de especiação alopátrica observado para a espécie H. steindachneri (Rocha et al., 2008). Nesses dois gêneros as populações do Atlântico e Pacífico foram separadas a aproximadamente 3 milhões de anos pelo fechamento do Istmo do Panamá (Bernardi et al., 2008; Rocha et al., 2008). Apesar do isolamento populacional promovido estritamente pela ação de barreiras biogeográficas, a evolução na família Haemulidae parece ter ocorrido, em parte, através de rápidas adaptações ecológicas após o fracionamento de nichos, resultando em modificações morfoecológicas particulares (Bernardi et al., 2008; Rocha et al., 2008; Motta-Neto et al., 2012). 1.3 Dispersão Larval e Padrões Genéticos em Labridae e Haemulidae Os peixes recifais em sua maioria são altamente fecundos, produzindo altas quantidades de ovos periodicamente (Sale, 1991). Peixes de pequeno porte possuem vantagens em ambientes recifais, por atingir a maturidade sexual em habitats com poucos recursos alimentares e capacidade de explorar áreas estruturalmente complexas. Geralmente apresentam estágios larvais entre semanas ou meses e suas larvas são capazes de participar ativa ou passivamente de sua própria dispersão (Wirth & Bernatchez, 2001; Hoaraua et al., 2002). O potencial dispersivo de uma espécie está intrinsecamente relacionado com os padrões genéticos que ela apresenta. Espécies com fluxo gênico irrestrito tendem a apresentar homogeneidade genética enquanto outras com baixa vagilidade apresentam condições propicias para a diversificação genética (Molina, 2007). Shulman e Bermingham (1995) afirmam que as distâncias atingidas durante a fase de dispersão podem afetar uma série de fatores biológicos nas espécies, como: 1 - o fluxo gênico e a diferenciação genética das espécies; 2 - a extensão e o tamanho da população intercruzante; 3 – o número de barreiras efetivas ao fluxo gênico e o potencial para a especiação; 4 – o potencial adaptativo físico e biótico de populações locais às condições ambientais; 5 – a escala espacial de comunidades ecológicas; e 6 – a distribuição geográfica das espécies. Introdução 23 A associação entre diferentes fatores como o período de desova, o comportamento larval e ação de correntes em diferentes escalas, sugerem causas múltiplas para a diversificação citogenética em algumas espécies de peixes marinhos (Molina & Galetti, 2004). Nos Labridae, por exemplo, a duração da fase larval planctônica parece ser extremamente variável entre as espécies, podendo variar de 15 dias (Diproctacanthus xanthurus) a 121 dias (Thalassoma ballieui) (Victor, 1986). Neste aspecto, tem sido apontada uma correlação negativa entre o potencial dispersivo e a diversificação cariotípica entre as subfamílias de Labridae e Pomacentridae (Molina & Galetti, 2004; Sena & Molina, 2007). Apesar da abundância nos ambientes marinhos costeiros e insulares, pouco se sabe a respeito da desova de Haemulidae (McFarland et al., 1985). A maioria das espécies recifais apresenta ovos pelágicos (Jan, 2000) e após uma existência larval de aproximadamente 15 dias (determinados pela contagem dos anéis de crescimento diário no otólito), as pós-larvas se estabelecem próximas às algas marinhas (Ogden & Quinn, 1984). Apenas Haemulidae e talvez Lutjanidae, proporcionem evidências de uma existência larval curta (McFarland et al., 1985). Esta condição poderia limitar sua dispersão no ambiente marinho, reduzindo o fluxo gênico nas espécies que compõem o grupo, resultando numa situação favorável à diversificação genética. Entretanto esse fato contrasta fortemente com a extensa distribuição Neotropical deste grupo (Nelson et al., 2016). Ainda que apresenta um período larval curto, é possível observar a manutenção do fluxo gênico em muitas espécies de Haemulidae, promovida basicamente pela ocorrência de grandes contingentes populacionais e pelas estratégias de reprodução utilizadas por estas (Shulman & Bermingham, 1995; Green et al., 2015). A distribuição em grandes cardumes cria um background favorável à manutenção de fluxo gênico entre populações vizinhas, que se sobrepõem, mantendo a homogeneidade genética dessa espécie. Esse tipo de situação foi observada em estudos populacionais da espécie Haemulon flavolineatum, no Caribe, onde apesar do isolamento de populações pela distância, o curto período pelágico larval dessa espécie e a grande retenção das larvas em seus recifes natais, constatou-se a existência de fluxo gênico entre populações vizinhas favorecendo a existência de uma Introdução 24 alta conectividade entre as populações através de dispersão larval do tipo stepping-stone (Purcell et al., 2006). As estratégias de reprodução dos hemulídeos consistem na utilização de ovos pelágicos, assim como a sincronização do período de desova, que praticamente ocorre durante todo ano, utilizando fases lunares e correntes favoráveis à dispersão dos mesmos. Após a eclosão dos ovos, formam-se cardumes de pós-larvas que migram para a base dos recifes de corais dos quais são originárias até a fase pré-adulta do desenvolvimento, muitos meses após a eclosão desses ovos. Essa migração é intermediada pelas movimentações entre os sítios de alimentação e refúgio (Ogden, 1984), com os juvenis ocorrendo tipicamente em águas mais rasas em relação aos adultos e apresentando muitas mudanças ontogenéticas de habitats durante o crescimento (Lindeman & Toxey, 2002). Isso reforça o potencial dispersivo por natação ativa dos representantes de alguns grupos como a família Haemulidae, reiterando a manutenção do fluxo gênico e homogeneização genética no grupo (Galetti et al., 2006; Molina, 2007). No Atlântico, representantes dos Haemulidae encontram-se distribuídos em função de diferentes condições bióticas e abióticas (Lecchini & Galzin, 2003), ambas condicionadas por contingências históricas (Bowen et al., 2006; Rocha et al., 2005, 2008; Bernardi et al., 2008). As barreiras biogeográficas que mediam a distribuição de suas espécies podem ser definidas por fatores físicos, como o fluxo das correntes marinhas, temperatura e salinidade das águas dos oceanos. Além dessas, certas condições biológicas, como adaptações fisiológicas às alterações ambientais que promovem a dispersão larval, podem favorecer fluxo gênico entre determinadas regiões. O entendimento das relações entre fatores físicos, padrões de distribuição das espécies e abundância das mesmas no ambiente recifal, podem prover uma interessante percepção sobre o papel dos processos físicos na estruturação das comunidades de peixes e sobre seus padrões genéticos (Sinclair, 1988; Grant & Bowen, 1998; Lessios et al., 1999; Lecchini & Galzin, 2003). Apesar dos crescentes avanços na compreensão dos padrões ecológicos e biogeográficos de inúmeras famílias e espécies de peixes do Atlântico Ocidental, existem substanciais lacunas no que diz respeito aos Introdução 25 aspectos genéticos de alguns grupos, o que é verificado acentuadamente na família Haemulidae, sobretudo quanto aos seus aspectos citogenéticos. Na região do nordeste do Brasil, estudos envolvendo este grupo de peixes marinhos são particularmente pertinentes tendo em vista que seus representantes constituem um recurso natural importante, proveniente da pesca artesanal, para a economia das populações locais, por constituírem uma considerável parcela da biomassa marinha. Além disso, apresentam um componente fundamental da ictiofauna dos recifes de corais desta região oceânica (Floeter et al., 2001). No oceano, dois fatores principais parecem determinar a associação genética de populações de peixes de recifes de coral, separadas através da dispersão planctônica larval: os ciclos de vida das espécies e os fatores oceanográficos (Molina & Galetti 2004; Sena & Molina, 2007). A possível associação entre o período pelágico larval e os rearranjos cromossômicos, pode ser testada em alguns grupos característicos de peixes recifais como Labridae e Pomacentridae (amplamente presentes nos ambientes de recifes de corais) através de análises citogenéticas comparativas de espécies com habilidades de dispersão diferenciadas (Molina, 2007). Dentre os rearranjos que são mais facilmente identificados no cariótipo ancestral com cromossomos exclusivamente acrocêntricos (a) (2n=48; NF=48), estão os eventos de inversão pericêntrica, que também podem ser medidos pelo NF particular ou pelo cálculo da média de um grupo filogeneticamente relacionado. Além desses aspectos biológicos e evolutivos, dentro de um ambiente extenso, contínuo e com a ausência de limitações visíveis como no caso do Oceano Atlântico, a análise dinâmica de fatores oceanográficos pode fornecer algumas evidências para a compreensão dos eventos que possam promover isolamentos e evolução de grupos em simpatria ou alopatria como no caso de espécies de Haemulidae (Rocha 2008, Motta-Neto et al., 2011b). 1.4 Fisiografia e Aspectos Oceanográficos do Atlântico O oceano Atlântico teve sua formação entre 170 a 200 M.a (Seton et al., 2012), sincronicamente a separação do supercontinente Pangea em Introdução 26 decorrência da erupação da Província Magmática Atlântica Central (Blackburn et al., 2013). Possui uma área total estimada em aproximadamente 100.000.000 km2, cobrindo cerca de 20% da superfície do planeta e possuindo a maior área de drenagem da Terra, onde recebe a deságua da maioria dos grandes rios do mundo: Mississippi (Estados Unidos), Orinoco (Venezuela), Amazonas (Brasil), Rio da Prata (Argentina), Congo (República Democrática do Congo), Niger (Nigéria), Loire (França), Reno (Holanda), Elba (Alemanha) (Barnes et al., 2017). Esse oceano é caracterizado pela presença de uma cadeia de montanhas submarinas conhecida como Cordilheira Mesoatlântica, que nos picos mais elevados pode chegar a até 3000 metros de altura metros a partir do assoalho oceânico (Levin & Gooday, 2003). Dessa cordilheira se erigem as ilhas dos Açores (Portugal), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (Brasil), Bouvet (Noruega), Santa Helena, Tristão da Cunha e Gough (Reino Unido). Das margens continentais da África e da América do Sul originam-se as ilhas Canárias (Espanha), Madeira (Portugal), Cabo Verde (Portugal), Fernando de Noronha (Brasil), Falklands (Reino Unido) e Antilhas (Caribe) (Barnes et al., 2017). As correntes oceânicas exercem grande influência nos ecossistemas marinhos, impactando fortemente a produtividade primária nos oceanos (Merino & Monreal-Gómez, 2009). No Atlântico algumas correntes se destacam por influenciar elementos como biodiversidade e a quantidade biomassa de algumas regiões, sendo as principais: Corrente Norte Equatorial – surge ao norte do arquipélago de Cabo Verde dirigindo-se para oeste; Corrente Sul Equatorlal: forma-se na costa oeste africana ao sul do golfo da Guiné, fluindo também para oeste; Corrente do Brasil: é uma vertente da Corrente Sul Equatorial e desloca-se para o sul da costa leste sulamericana; Corrente do Golfo do México dirige-se do Sudeste da costa da Flórida e é intensificada pela Corrente das Antilhas que flui para o norte da costa de Porto Rico, Hispaniola e Cuba; e a Corrente de Benguela: que flui para noroeste do Cabo da Boa Esperança seguindo a costa oeste africana (Philander, 2001; Boldwitch, 2017). A biodiversidade oceânica e a distribuição de espécies de peixes recifais é limitada por fatores ocenográficos físicos (correntes, barreiras, Introdução 27 temperatura, salinidade, etc) e condições biológicas (adaptações fisiológicas, dispersivas e etológicas) que influenciam o fluxo gênico entre determinadas regiões (Sinclair, 1988; Grant & Bowen, 1998; Lessios et al., 1999; Lecchini & Galzin, 2003). Esses elementos propiciam a ocorrência de quatro províncias biogeográficas principais no Atlântico: a da Costa do Brasil, a do Caribe, a da Cordilheira Mesoatlântica e a do Atlântico ocidental (Floeter et al., 2008). Essas províncias biogeográficas estão limitadas por cinco barreiras biogeográficas bem definidas: a Cordilheira Mesoatlântica (Briggs, 1974), a Ponte de Terra do Mar Vermelho (Steininger & Rögl,1984; Bellwood & Wainwright, 2002), o fechamento do Istmo do Panamá (Coates & Obando, 1996), a formação da Corrente de Benguela (Shannon, 1985; Marlow et al., 2000) e a Pluma formada pela deságua dos rios Amazonas e Orinoco (Hoorn et al., 1995). De especial interesse para as duas principais províncias biogeográficas do Atlântico Oriental, a Província do Brasil e a Província do Caribe, a Pluma de água doce e sedimentos formada pela dos rios Amazonas e Orinoco tem um potencial atuante intermitente ou semi-poroso nessa região (Rocha, 2003). Isso pode ser evidenciado a partir da distribuição de espécies que ocorrem primariamente na Costa Brasileira, mas também são encontradas em simpatria com taxa intimamente relacionados ao norte dessa barreira, na província caribenha (Floeter & Gasparini, 2000; Rocha, 2003; Floeter et al., 2008). Dessa forma, tal barreira pode favorecer a ocorrência de fluxo gênico entre essas regiões, gerando coesão populacional entre as duas províncias biogeográficas. 1.5 A Pluma dos Rios Amazonas e Orinoco Estimativas recentes indicam que cerca de 12% das espécies brasileiras de peixes de recifes são endêmicas. Este endemismo é gerado em parte pela barreira formada pela descarga de água doce e de sedimentos de grandes rios no nordeste da América do Sul, sobretudo pelos rios Amazonas, Orinoco e seus afluentes (Rocha, 2003). O Rio Amazonas e seus afluentes possuem uma área de drenagem de 6.915.000 km2 que corresponde a 40% do continente sulamericano e sua Introdução 28 bacia se ditribui por oito países (Bolívia, Brasil, Equador, Guiana, Peru, Venezuela, Guiana Francesa e Suriname). Seu volume total de descarga é de 209.000 m3/s (12 bilhões de litros por minuto) correspondendo a 20% do total da deságua mundial (água doce) nos oceanos do mundo (Spilki et al., 2016). O Rio Orinoco é um dos maiores rios da América do Sul, estendendo- se por 2.140 km. Esse rio cobre os territórios da Venezuela e Colômbia e sua bacia de drenagem abrange uma área de cobertura de 927.000 km2 com um volume de descarga de 36.000 m3/s, sendo considerado o 3º mais volumoso em deságua do mundo (Spilki et al., 2016). O massivo volume de água da desembocadura desses dois rios não permite que a água do mar penetre na foz dos rios (e a água doce acaba sendo transportada cerca de 500 km mar adentro (Nittrouer & DeMaster, 1986; Salisbury et al., 2011). A pluma de água doce e sedimentos dos Rios Amazonas e Orinoco distribui-se por uma área de cerca de 106 km2, formando uma camada hiposalina relativamente rasa que pode se estender até uma profundidade de aproximadamente 30 metros na plataforma continental da região amazônica (Grodsky et al., 2012). Essa camada acaba sendo dirigida por ventos e correntes sazonais para o norte em direção ao Caribe e retrorefletida para o leste nos meses de setembro e outubro (Lentz, 1995a, b; Rocha, 2003; Moura et al., 2016). As características físicas das deságuas desses rios os tornam uma região fronteiriça para a distribuição de muitos grupos de organismos vivos (esponjas, corais escleractíneos e peixes) que habitam regiões rasas, entre outros grupos de organismos costeiros e associados a recifes (Miloslavich et al., 2001) Adversamente, muitas espécies associadas a recifes (algas, esponjas, cnidários e peixes) ocorrem em ambos os lados das deságuas do Amazonas e do Orinoco, com a possível ocorrência de mecanismos de conectividade relacionados dispersão larval em larga escala, rafting ou migração demersal através de stepping stone (Luiz et al., 2011). Nesse contexto, o aumento no conhecimento sobre os peixes recifais do Atlântico tem sido reforçado pela verificação da ocorrência de espécies de peixes, anteriormente consideradas endêmicas do Brasil ou Caribe, ocorrendo na província biogeográfica vizinha (Rocha, 2003; Sampaio et al., 2016). Estes achados merecem um re-exame Introdução 29 dos padrões de distribuição e processos de especiação em peixes de recifes tropicais do Atlântico Ocidental. Um ponto fundamental para a compreensão dos efeitos da barreira amazônica sobre a fauna da costa do Atlântico encontra-se na sua datação. Hoorn (1996) afirma que a conexão entre a paleo-Amazônia e o Atlântico tem sido bem estabelecida desde o início do Mioceno Tardio (10,4 M.a) (Figura 1). Diante da ação temporal dessa conexão e mediante o endemismo observado nas províncias biogeográficas do Caribe e da costa brasileira através de um isolamente parcial dessas áreas, sugere-se que a barreria amazônica deva se comportar dentro do modelo de especiação Parapátrica (Moura et al., 2016). Nos peixes recifais, a especiação parapátrica é dificilmente detectada devido ao fato de apresentar um impriting biogeográfico extremamente similar ao da especiação alopátrica, o qual apresenta pares de espécies relativamente jovens com distribuição geográfica não sobrepostas. Assim, a barreira amazônica atua permitindo fluxo gênico restrito entre populações divergentes (Rocha & Bowen, 2008). Diante do efeito da barreira amazônica em populações de Haemulidae de ocorrência nas províncias biogeográficas do Caribe e do Brasil, análises citogenéticas envolvendo a prospecção de marcadores cromossômicos podem auxiliar na detecção e compreensão dos possíveis rearranjos crípticos presentes nos cromossomos dessas populações de peixes marinhos. Esse tipo de situação já foi constatada, para populações de espécies do gênero Haemulon de ocorrência caribenha e brasileira, em que se observaram diferenciações sutis principalmente com relação ao DNAr 5S, fornecendo citótipos diferenciados para cada uma das populações, possivelmente resultado do efeito de isolamento da barreira amazônica (Motta-Neto et al., 2001b) (Figura 1). 1.6 Aspectos Citogenéticos em Percomorpha Os Percomorpha marinhos caracterizam-se como modelo importante para o entendimento da estrutura genética das populações desse ambiente, apresentando tanto exemplos de conservação cromossômica, compartilhada Introdução 30 por várias espécies, quanto de diversificação cariotípica em alguns grupos (Klinkhardt et al., 1995, 1998; Brum & Galetti, 1997). Até meados de 2000 haviam dados cariotípicos disponíveis para apenas 8% dos Percomorpha (Galetti et al., 2000; Galetti et al., 2006). Dez anos depois esse número subiu para 12% com relação as espécies de peixes, sendo 3.425 espécies/subespécies (incluindo ágnatos, cartilaginosos, peixes de nadadeiras raiadas, e nadadeiras lobadas). Dados genéticos para peixes seguiam até então na razão de 52 Ordens (83% do total) e 264 famílias para dados de tamanho de genoma e 53 Ordens (84% do total), 269 famílias (52% do total) para dados cariotípicos, de acordo com as resoluções filogenéticas clássicas (Arai, 2011). Essas informações demonstram uma profunda carência no lento avanço do conhecimento citogenético para este que é o maior grupo de vertebrados, com crescimento de apenas 4% em dez anos, ainda que dispondo atualmente de técnicas citogenéticas avançadas e marcardores moleculares modernos resolutivos. Grande parte do conhecimento citogenético deste grupo é proveniente de representantes dulcícolas (Accioly & Molina, 2007; Van der Laan et al., 2014) e até então apenas algumas famílias de peixes marinhos foram exiguamente estudadas sob a luz da citogenética, entre elas estão Haemulidae, com 17 espécies (8%) cariotipadas, e Labridae com 58 (9%) das espécies cariotipadas (Arai, 2011). 1.6.1 Estase Cariotípica Os estudos citogenéticos realizados em Percomorpha têm demonstrado um extraordinário conservadorismo cariotípico, de forma que a maioria das espécies cariotipadas apresenta 2n=48 e NF=48, com pequenas modificações sobre esses valores (Galetti et al., 2000; Molina & Bacurau, 2006; Motta-Neto et al., 2011a, b; Molina et al., 2013; Costa et al., 2016). Isto sugere que, em alguns grupos, a especiação não foi seguida por diferenciação cariotípica significante (Molina & Galetti, 2002; Molina & Galetti, 2004; Motta-Neto et al., 2011a). Em Percormorpha observa-se a presença de blocos heterocromáticos reduzidos encontrados preferencialmente em posição pericentromérica, além Introdução 31 da presença de regiões organizadoras de nucléolos (RONs) simples, provavelmente devido a esta pequena quantidade de heterocromatina são condições basais (Mandrioli, 2000; Affonso et al., 2001; Ene, 2003; Molina, 2006; Motta-Neto et al., 2011b; Molina et al., 2013). De uma forma geral, isto pode manifestar uma pequena influência nos processos de diferenciação cariotípica. Essa pequena quantidade de heterocromatina, presente na maioria das espécies desse grupo, pode ser uma das explicações para o compartilhamento de características cariotípicas comuns e pouco dinâmicas a todo o grupo, conhecidas como estase cariotípica (Molina, 2006; Motta- Neto et al., 2011a, b; Motta-Neto et al., 2012). Esse fenômeno é caracterizado pela ausência de qualquer mudança no número cromossômico (estase cromossômica), nos níveis de ploidia e provavelmente na composição e estrutura genômica, não ocorrendo variações sintênicas significativas nas espécies que conservam essa característica, no decorrer do período evolutivo (Kahl, 2015). Dessa forma, a presença de um único locus Ag-RON, encontrado na maioria das espécies dos Percomorpha analisados até então, pode estar relacionado a essa pequena quantidade de heterocromatina que propicia a restrição da dispersão de sequências de genes ribossomais no cariótipo (Motta-Neto et al., 2011a, b). Exemplos de ocorrência de estase cariotípica podem ser claramente observados nas famílias Pomacanthidae, Chaetodontidae, Gerreidae, Belonidae, Mugilidae, Scianidae, Sparidae, Lutjanidae, Serranidae e Ephippidae (Affonso et al., 2001; Accioly & Molina, 2007; Molina, 2007, Cipriano et al., 2008; Arai, 2011; Costa et al., 2016). Um modelo extremamente pujante e didático para se ilustrar a condição de estase cariotípica pode ser observado na família Haemulidae, onde análises intragenéricas têm demonstrado uma pronunciada manutenção de caracteres citogenéticos basais (e.g. gênero Haemulon) (Motta-Neto et al., 2011b) que se extendem também a comparações intergenéricas (Haemulopsis corvinaeformis X Conodon nobilis) (Motta-Neto et al., 2011a). Introdução 32 1.6.2 Diversificação Cariotípica De encontro a essa tendência conservada de carioevolução, um dos mecanismos que permite explicar a ocorrência de diversificação cromossômica estrutural em alguns grupos de Percomorpha, é a ocorrência de inversões pericêntricas, que à primeira vista parece representar um mecanismo frequente de rearranjo nessa Série (Cano et al., 1982; Galetti et al., 2000; Ueno & Takai, 2000; Molina & Galetti, 2004). A variabilidade numérica derivada de processos de fissão e fusão tem sido relatada em muitas famílias (Amores et al., 1993). Em Labriformes, e notavelmente na família Labridae, os eventos robertsonianos mostram claramente um número diploide reduzido, indicando a ocorrência de amplos eventos de fusões cêntricas (Ueno & Takai, 2000). Dentro dessa família, a variação numérica diploide pode ser de 22 cromossomos, variando em número de 32 até 48 (Arai, 2011) e números fundamentais iguais ou maiores do que 48, como observado no gênero Bodianus (Ojima & Kashiwagi, 1980; Molina et al., 2012). Esse fato sugere que inversões pericêntricas constituem, embora pouco comuns em relação a outros grupos (e.g., Pomacentridae), um dos principais mecanismos de diversificação cariotípica dentro dessa família. Ainda dentro de Labridae, paralelamente as derivações cariotípicas numéricas e estruturais, estudos citogenéticos recentes demonstram a ocorrência de um fenômeno peculiar para espécies da tribo Hypsigenyini (Molina et al., 2012). Trata-se da ocorrência de uma singular região heterocromática descondensada em um par cromossômico subtelocêntrico, a qual se apresenta DAPI-, argentofílica e com ausência de sítios DNAr 18S. Tal região caracteriza uma classe de DNA com características constitutivas e funcionais particulares, merecendo uma abordagem mais aprofundada com marcadores mais elucidaticos para investigá-la. Sabe-se hoje que tanto o conservadorismo quanto a diversificação cromossômica em espécies de Percomorpha parece refletir a existência de alguns padrões biológicos que favorecem ou não o fluxo gênico nesse grupo, como por exemplo, o tamanho das populações, a amplitude da área de distribuição geográfica e a influência de barreiras geográficas (Galetti et al., Introdução 33 2006). Apesar dos crescentes avanços em relação aos dados moleculares de DNA que embasam as novas resoluções taxonômicas da moderna sistemática de peixes, muitas questões ainda desafiam principalmente as resoluções para taxa superiores – Gênero e Ordem (Nelson et al., 2016). Assim sendo, a abordagem mais resolutiva possível seria justamente aquela capaz de integrar análises sintéticas de morfologia, filogenética molecular, amplitude genômica e a própria cariologia comparativa, muito mais do que focar exclusivamente em uma ou outra (Arai, 2011). Nesse sentido, as ferramentas citogenéticas tornam-se uma força pivotante e propelente capaz de caracterizar regiões genômicas, datar eventos evolutivos e caracterizar polimorfismos populacionais sutis. Tornando possível, dessa forma, a detecção de regiões de ocorrência de corredores de fluxo gênico e mapeamento de ocorrência de populações inteiras, que algumas vezes os dados morfológicos não são capazes de verificar em vista da ocorrência de taxas assincrônicas diferenciais de evolução entre os aspectos citogenéticos e morfológicos – taquitelia (White, 1973; Motta-Neto et al., 2012). 1.7 Marcadores Estruturais Cromossômicos Os genomas eucarióticos possuem grandes quantidades de DNA repetitivo, cuja a frequência de repetição de sequências as configura em moderadamente a altamente repetitivas e sua organização (em tandem ou dispersas) podem ser relacionadas ao seu papel funcional (Lopéz-Flores & Garrido-Ramos, 2012). Nesse contexto, algumas sequências específicas de localização física conhecida nos cromossomos podem ser utilizadas como marcadores genéticos, sendo essenciais em estudos de ligação e comparativos (Benevides & Guénet, 2012). Esses marcadores são capazes de resolver questões biológicas de maneira eficiente, além de contribuir amplamente para investigações evolutivas populacionais e de questões relacionadas a biologia da conservação (Sunnucks, 2000). Dentre as sequências mais estudadas de DNA repetitivo, os genes de RNA ribossômico (rRNA) destacam-se por desempenhar um papel vital na síntese protéica constituindo o principal componente estrutural e catalítico dos ribossomos. Ao passo que, para as Introdução 34 sequências dipersas, os elementos transponíveis (transposons e retrotransposons), constituem uma fração siginificativa do DNA altamente repetitivo como um todo (López-Flores & Garrido-Ramos, 2012). 1.7.1 Sequências de DNAr 5S e 45S No contexto da abordagem molecular, a técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH), destaca-se por ser extremamente informativa e não se aplicar somente à citogenética (principalmente citogenética clínica e citotaxonomia) como também biologia do desenvolvimento e melhoramento genético (Liehr et al., 2002, 2006; Yang et al., 2009; Yang & Alexander, 2009). Os marcadores mais difundidos em estudo que envolvem hibridização in situ referem-se ao DNA ribossômico (DNAr). Nos eucariotos, as sequencias codantes de DNAr são conhecidas por serem as mais conservadas e consequentemente constituírem ótimos marcadores para estudos filogenéticos, embora algumas variações intra e interespecíficas possam ocorrer (Gornung, 2013). A disposição dos genes do RNA ribossomal organiza-se em duas famílias multigênicas distintas compostas por centenas de milhares de cópias cujos genes se organizam em arranjos em tandem. Uma classe é representada pelo DNAr 45S (maior subunidade ribossômica) que codifica para os RNAr 18S, 5,8S e 26S/28S e a outra é representada pelo DNAr 5S que codifica para RNAr 5S (menor subunidade ribossômica) (Martins & Galetti, 2001). As cópias múltiplas de DNAr 45S correspondem as regiões organizadoras de núlceolo (RONs) e pelo fato de terem vários domínios divergentes, o tamanho dos genes podem variar consideravelmente entre filos, podendo ser utilizado para a reconstrução de divergências relativamente recentes (e.g. Cenozóico) (Hills & Dixon, 1991; Martins et al., 2000). O DNAr 5S, por outro lado, é associado a formação de nucléolo e pelo fato de ser uma sequência mais curta, é um marcador muito efetivo para realizar inferências filogenéticas através de grandes escalas de tempo (Long & David, 1980; Hills & Dixon, 1991; Martins et al., 2000). Na maioria dos peixes teleósteos, cerca de 70% das espécies Introdução 35 cariotipadas até então, observa-se uma propensão a ocorrência de sítos DNAr 18S simples, principalmente observadas nas famílias Anastomidae, Gasteropelicidae, Parodontidae, Gymnotidae, Sternopygidae, Hypopomidae, Callichthyidae, Heptapteridae, Loricariidae, Pimelodidae, Pseudopimelodidae, Siluridae e Trichomycteridae (Gornung et al., 2013). Exceções a essa tendência podem ser observadas nas famílias Erythrinidae e Cobitidae, algumas espécies de caracídeos das subfamílias Bryconinae, Serrasalminae e algumas espécies de ciprinídeos, onde se encontram variações marcantes com relação ao número de cluster DNAr 18S (Gornung et al., 2013). Dessa forma a ocorrência de sítios DNAr 18S em um único par, tem sido assumida como uma condição plesiomórfica em peixes (Amemmyia & Gold, 1988). Apesar de altamente conservada mesmo entre espécies não relacionadas, a sequência codante de DNAr 5S apresenta variações com relação a ocorrência de inserções/ deleções no espaçador não transcrito (NTS), minirepeats e ocorrência de pseudogenes em diversos organismos (Nelson & Honda 1985; Leah et al., 1990; Sajdak et al., 1998). Justamente essa variação no NTS do DNAr 5S tem sido utilizada em estudos evolucionários, além de servirem como marcadores para diferenciação de espécies e populações (Martins et al., 2000). 1.7.2 Elementos Transponíveis As seqüências de DNA repetitivo no genoma dos eucariotos podem ser categorizadas em duas classes. Uma dessas classes compreende os DNAs satélites, minissatélites e microssatélites, caracterizando-se por ser sequências repetitivas em tandem compostas por centenas de pares de bases repetidas múltiplas vezes no genoma. A outra que varia de moderadamente a muito repetida e com capacidade de mobilidade intragenômica, conhecidas como elementos transponíveis (Jurka et al., 2005; Kuhn et al., 2012; Charlesworth et al., 1994). Os elementos transponíveis podem ser caracterizados basicamente em Retrotransposons, cujo flanqueamento ocorre nas repetições longas terminais - LTRs (movendo-se pelo genoma via transcriptase reversa), e os não-LTRs, nos quais faltam as repetições terminais (conhecidas como: LINEs – elementos intercalados Introdução 36 longos e SINEs – elementos intercalados curtos) (Bohne et al., 2008; Ferreira et al., 2011). Nesse contexto destaca-se Tol2, que é um membro da família de elementos transponíveis hAT (Calvi et al., 1991), com comprimento de 4,7 kb, possui suas repetições terminais invertidas nos pares de base 17 e 19, comportando um gene interno que catalisa a reação de transposição deste elemento (Koga et al., 1999, 2003; Koga & Hori, 2001). Atualmente reconhece-se a importância da abordagem citogenética com elementos transponíveis pois os mesmos apresentam forte associação com regiões heterocromáticas, atuam na regulação e reparo de genes, e por sua natureza repetitiva influenciam a ocorrência de rearranjos cromossômicos e diferenciação de cromossomos sexuais influenciando a evolução genômica e cariotípica (Cioffi et al., 2010; Ferreira et al., 2011; Valente et al., 2011). 1.8 Metilação do DNA Na vanguarda dos estudos citogenéticos, as técnicas moleculares têm ampliado significativamente o conhecimento da organização genômica em grande escala e a modelagem epigenética da cromatina (Fuchs et al., 2006). Os estudos moleculares voltados para o processo de metilação do DNA vêm sendo desenvolvidos desde meados da década de 1970, onde para diversos filos, os primeiros estudos voltavam-se à investigação da presença de sítios de ilhas de dinucleotídeos CpG (Citosina-fosfato-Guanina, no quinto carbono), através de espectrofotometria e cromatografia convencional e de camada fina, que estão diretamente correlacionados com o conteúdo de 5- metilcitosina (Vanyushin et al., 1973). Com o passar do tempo esses estudos foram dirigindo-se à cromatina no contexto clastogênico relacionando a presença de sítios 5-metilcitosina hiper e hipometilados com a ativação e inativação de genes envolvidos na carcinogênese em tecidos neoplásicos inclusive associados à instabilidade cromossômica (Baylin et al., 1991; Almeida et al., 1993; Feinberg, 1993; Barbin et al.,1994). De fato, muitos estudos epigenéticos apontam a metilação do DNA sendo catalisada por uma família conservada de DNA metiltransferases Introdução 37 (Dnmt’s) que é amplamente dispersa no genoma de protistas, fungos, plantas e animais. As ilhas CpG’s, que são regiões de DNA não metiladas e localizadas em regiões cromatínicas abertas e que possuem mais de 50% de conteúdo GC acessíveis à nucleases, promovem a metilação de genes ativos próximos a esses sítios, geralmente na região 5’ terminal de genes housekeeping, ocupando apenas parte da região transcrita, em regiões de replicação precoce nos cromossomos. A quantidade de ilhas CpG’s correlaciona-se com a quantidade de genes ativos nos cromossomos correspondentes (Craig & Brickmore, 1994; Dyachenko et al., 2010, Shevchuk et al., 2010). Atualmente a utilização de marcadores metilatórios tem sido utilizada em estudos para se verificar diversas funções como a inibição da transcrição e alongamento do transcrito, supressão da recombinação dos homólogos, regulação da expressão gênica, controle epigenético do impriting genômico, inativação de elementos móveis, diferenciação celular, dinâmica cromatínica em cromossomos sexuais, morfogênese e remodelação da estrutura da cromatina em que é possível identificar-se modificações pós-traducionais nas porções N-terminais das caudas dos centros das histonas nucleossomais tais como acetilação, metilação, fosforilação, ubiquitinização, glicosilação, ADP- ribosilação e sumoilação (Colot & Rossignol, 1999; Martin & Zhang, 2005; Kouzarides, 2007; Dyachenko et al., 2010; Marques et al., 2011; Schmid et al., 2016). Os marcadores apresentados até então, possuem extensa e resolutiva utilização principalmente para questões relacionadas a diversificação filogenética, rearranjos cromossômicos, análise da cromatina sexual, dinâmica da arquitetura genômica, regulação gênica e controle epigenômico. Porém esses marcadores cromossômicos não são capazes de individualmente responder a outras questões que requerem, por exemplo, um nível mais aprofundado de análise, como a identificação de sutilezas associadas a biodiversidade, mapeamento genético e reconstrução filogenética. Para esse tipo de análise torna-se necessária a utilização de marcadores moleculares com maior sensibilidade e especificidade. Introdução 38 1.9 Detecção da Biodiversidade Através de Marcadores Moleculares Os marcadores moleculares são ferramentas indispensáveis para a determinação da variabilidade genética e biodiversidade com elevados níveis de acurácia de reprodutibilidade (Arif & Khan, 2009). Eles são capazes de fornecer informações sobre variações alélicas em determinados locus (Schlötterer, 2004). Nos últimos 30 anos a tecnologia dos marcadores moleculares tem nos permitido estudar uma vasta gama de elementos associada a descoberta genes, respondendo a diversas questões biológicas como o mapeamento de genes em populações, estudos evolucionários, reconstruções filogenéticas, diversidade genética, genética da conservação, além de testes de paternidade e aplicações forenses (Maheswaran, 2004; Schlötterer, 2004; Frankham et al., 2002). Essencialmente, os marcadores moleculares desenvolvidos até então são variantes de três categorias básicas de marcadores genéticos: variantes de proteína (alozimas), variações em repetições de sequências de DNA (minissatélites, microssatélites) e polimorfismos de sequências de DNA (Restriction Fragment Length Polymorphisms – RFLPs e Amplified fragment length polymorphisms – AFLPs) (Schlötterer, 2004). Os primeiros marcadores moleculares reais estabelecidos foram as alozimas (variações alélicas de enzimas), variantes de proteína em enzimas que podiam ser distintas em gel de eletroforese de acordo com diferenças de tamanho e carga causados por substituições de aminoácidos (Schlötterer, 2004). Os primeiros estudos em Drosophila que demonstraram quantidades elevadas de polimorfismos intrapopulacionais permitiram a elucidação da teoria neutra da evolução molecular (Huby & Lewontin, 1966; Harris, 1966; Lewontin & Hubby, 1966; Jhonsson et al., 1966; Kimura, 1968; King & Jukes, 1969). A utlilzação dessa tecnologia serviu de base para a elaboração dos primeiros mapas genéticos baseados em dados de DNA (Kerem et al., 1989) e estudos populacionais e biogeográficos utilizando-se análises de DNA mitocondrial e ribossomal (Avise, 1994). A primeira metade da década de noventa foi marcada pela segunda geração de marcadores que revolucionaram o campo da genética molecular, sendo de maior impacto a utilização dos minis e microssatélites – sequências Introdução 39 de di, tri, tetra e pentanucleotídeos repetidos em tandem dispersas nos genomas de todos os organismos eucarióticos, tanto em regiões codantes como nas não codantes, que frequentemente demonstram o comprimento do polimorfismo advindo de crossing over desigual ou conversão gênica (Jeffreys et al., 1999). Os microssatélites foram os primeiros marcadores a utilizarem efetivamente a tecnologia de PCR, sendo difundida sua grande amplificabilidade por tal técnica (Lit & Luty., 1989; Weber & May, 1989; Schlötterer, 2004). Exemplos da utilização desses marcadores podem ser encotrados em estudos de conservação e manuseio da águia harpia selvagem (Harpia harpyja) (Banhos, et al., 2008), diversidade genética do peixe extremamente ameaçado arowana asiática (Scleropages formosus) (Yue et al., 2004) e do camarão black tiger (Penaeus monodon) (Li et al., 2007). Uma terceira geração de marcadores moleculares foi desenvolvida durante a segunda metade da década de noventa, cujos os principais foram os RAPDs (Randomly Amplfiied Polymorphic DNA), e AFLPs (Fragment Length Polymorphisms) (Zabeau & Vos, 1993; Vos et al., 1995; Maheswaran, 2004). A principal vantagem dos mesmos é que não necessitam a priori de conhecimentos direcionados ao primer nas espécies alvo (Schlötterer, 2004). RAPDs utlizam um único primer (8-10pb), que se liga a ambas as fitas de DNA a baixas temperaturas de anelamento e aumentam a similaridade de múltiplas regiões amplificantes, representando um locus particular – multilocus (Arif & Khan, 2009). Esse marcador já foi utilizado em estudos de diversidade genética de peixes marinhos dos gêneros Stegastes (Dias Jr. et al., 2007) e Abudefduf (Rodrigues & Molina, 2007) e também para a identificação de populações ameçadas do lagostin de água doce Austropotamobius pallipes (Gouin et al., 2001). Os AFLPs são marcadores multilocus que envolvem a utilização de enzimas de restrição e amplificação por PCR. Os pontos mais relevantes da técnica são a alta especificidade e reprodutibilidade devido ao uso das enzimas, adaptadores específicos e altas temperaturas de anelamento para a amplificação seletiva (Arif & Khan, 2009). Exemplos do uso desse marcador podem ser observados em estudos de diversidade e coeficiente de Introdução 40 inbreeding em roedores da espécie Peromyscus polionotus subgriseus (Dasmahapatra et al., 2008), diversidade de tubarões tigre-da-areia (Carcharodon taurus) e do tubarão branco (Carcharodon carcharias) (Zenger et al., 2006). Atualmente os métodos de high-throughput não tratam de avanços conceituais, mas de aplicações aperfeiçoadas em larga escala dos métodos já existentes. Nesse contexto, os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) se destacam por poderem ser utilizados em larga escala a um custo moderado (Chen & Sulivan, 2003). Esses marcadores focam numa única posição nucleotídica no genoma, sendo necessário, portanto, o conhecimento prévio a respeito de variação alélica na determinada posição genômica (Schlötterer, 2004). Amplamente utilizado hoje em dia e apesar de não se caracterizar como um marcador molecular propriamente dito, o sequenciamento de DNA é capaz de caracterizar uma determinada região genômica em múltiplos indivíduos fornecendo as informações genéticas mais resolutivas de uma determinada sequência (Schlötterer, 2004). Atualmente é o método mais seguro para se estimar história demográfica, utilizando-se múltiplas regiões genômicas (Schlötterer, 2004). Dentro da categoria de sequenciamento encontramos algumas variações muito particulares como DNA barcoding, marcadores de regiões controle mitocondriais, marcadores de genes mitocondriais de proteínas codantes e marcadores mitocondriais ribossomais. O DNA Barcoding tem se tornado uma ferramenta acurada, rápida e promissora nos últimos tempos para a identificação de vários taxa, revelando espécies até então não reconhecidas pela ciência (Arif & Khan, 2009, Lima- filho et al., 2015, Souza et al., 2016). O Barcode de DNA animal (600-800 pb), gene mitocondrial da citocromo oxidase I (COI), tem sido proposto como um marcador universal para a quantificação de biodiversidade global, aperfeiçoando a maneira como a humanidade se relaciona a biodiversidade selvagem (Janzen et al., 2005). Exemplos do uso dessa técnica podem ser encontrados na identificação de crustáceos anfípodes (Wit et al., 2006), de subprodutos do pescado as suas espécies respectivas (Kochzius et al., 2010), e espécies de peixes regionais para fins de conservação (Asgharian et al., 2011). Introdução 41 Os genes mitocondriais de proteínas codantes são marcadores poderosos quando se trata de análise de diversidade em níveis categóricos baixos como famílias, gêneros e espécies. O genoma animal contém treze genes de proteínas codantes, sendo amplamente utilizado para análises moleculares – Citocromo b (CytB) (Arif & Khan, 2009). Esse marcador já foi utilizado em estudos de diversidade genética em ciclídeos (Farias et al., 2001), identificação de espécies referentes a indústria do pescado de acordo com regulamentações internacionais (Pepe et al., 2005) e estudos populacionais de manejo e conservação de populações de gorais asiáticos (Nemorhaedus spp.) (Min et al., 2004). Os marcadores mitocondriais de RNA ribomossomal baseiam-se no fato da mitocôndria dos genomas animais possuírem dois genes de RNAs ribossomais (RNAr), DNAr 12S e 16S. O gene DNAr 12S é altamente conservado e tem sido aplicado na exploração da diversidade genética de níveis taxonômicos superiores, por exemplo, filos, ordens e subordens (Colgan et al., 2000; Wang et al., 2001; Møller & Gravlund, 2003). Por outro lado, o gene DNAr 16S é regularmente usado para estudos de níveis taxonômicosintermediários como famílias e gêneros. Para análises moleculares, esses marcadores são primeiramente amplificados por PCR utilizando-se primers conservados e os amplicons são sequenciados. Os dados do sequenciametno são então alinhados e comparados através de ferramentas bioinformáticas (Arif & Khan, 2009). Esses marcadores já foram utilizados para se verificar a filogenia de espécies do gênero Epinephelus (Serranidae) e da Ordem Pleuronectiformes (Craig et al., 2001; Pardo, 2005), além das relações de parentesco e status sistemático em quatro genera de arraias no Mediterrâneo e Mar Negro (Turan, 2008). Objetivos 42 2. OBJETIVO GERAL Os Percomorpha oferecem uma oportunidade singular de se estudar a evolução in loco, por se caracterizarem como um grupo diverso com relações filogenéticas e história evolucionária relativamente bem definidas para algumas famílias, grande diversidade evolutiva e complexidade estrutural epigenética. Essas características refletem-se em exemplos tanto de estase (Haemulidae), como de diversificação cariotípica e ocorrência de fenômenos estruturais cromossômicos (Labridae). Diante desses aspectos, o presente trabalho visou investigar os processos envolvidos na estase cariotípica (Haemulidae), caraterizar uma classe particular de heterocromatinas com intrigantes características funcionais (Labridae) e verificar as relações filogenéticas em algumas espécies Atlânticas de Percomorpha (Labridae). 2.1 Objetivos Específicos • Verificar a ocorrência de variações cariotípicas em populações das espécies Anisotremus virginicus, Haemulon melanurum e H. steindachneri (Haemulidae) sob efeito da Pluma dos rios Amazonas e Orinoco, entre as províncias biogeográficas do Brasil e Caribe através de hibridização in situ com sondas fluorescentes (FISH), com sondas DNAr 5S, DNAr 18S (Capítulo I). • Caracterizar citogeneticamente as espécies dos gêneros Anisotremus – A. moricandi, A. surinamensis e A. virginicus; e Haemulon – H. aurolineatum, H. chrysaryireum, H. parra, e H. squamipinna através das metodologias de hibridização in situ fluorescente (FISH), com sondas DNAr 5S, DNAr 18S; verificando o nível de sintenia e ocorrência de estase cariotípica nesses gêneros (Capítulo I). • Caracterizar citogeneticamente pela primeira vez a espécie de Haemulidae: Haemulon squamipinna através de técnicas de citogenética tradicional (Giemsa, Ag-RONs e Bandamento C) e Objetivos 43 moleculares (fluorocromos base-específicos: DAPi-, CMA3+; FISH: DNAr 5S e 18S) (Capítulo I). • Investigar uma região cromossômica com características especiais recorrente no gênero Bodianus, que se apresenta descondensada, argentofílica, não associada às RONs e reativa a fluorocromos base específicos, visando estabelecer o padrão de metilação na mesma, sua associação a elementos transponíveis e dispersão filogenética (Capítulo II). • Verificar o estatus taxonômico dos representantes da tribo Hypsigenyini através do sequenciamento parcial dos genes Rodopsina, Citocromo Oxidase I e DNAr 16S, para se verificar as relações filognéticas entre as espécies da tribo, confrontando os resultados com dados merísticos (Capítulo III). Material e Métodos 44 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material Exemplares de Haemulidae foram coletados nas duas Províncias Biogeográficas do Atlântico Ocidental: a da Costa Brasileira e a do Caribe. As da costa brasileira foram coletadas em diferentes pontos do litoral do Estado do Rio Grande do Norte, RN (Município de Extremoz: Praia de Santa Rita – SR: 5º69’90,62”S, 35º19’28,63”O e Praia da Redinha – RE: 5°45'05,4"S 35°12'07,5"O; Município de Touros: Praia de Carnaubinha – CA: 5º13’11,97”S, 35º25’3,82”O; Município de Nísia Floresta: Praia de Búzios – BU: 6º01’03,42”S, 35º06’31,13”O) Nordeste do Brasil; Arquipélago de Fernando de Noronha, Estado de Pernambuco, PE (Praia da Conceição – FN: 3º83’97,52”S, 32º41’65,90”O) e Atol das Rocas, RN (AR: 3º86’44,53”S, 33º81’23,49”O) (Figura 5). As coletas nessas localidades foram realizadas mediante licença do IBAMA (ICMBIO/SISBIO 19135-5). Na costa caribenha, os espécimes foram provenientes de Key Largo (KL: 25º09’40,07”N, 80º45'’83,07”O) (Figura 5), no Estado da Flórida (EUA) e obtidas através de coletores profissionais licenciados (Florida Saltwater Product License SPL/RS #89332, Florida Marine Diver License MLD#663, Florida Special Activities License SA#314, Florida Retail License WD#4105, County Occupational License #53110-22128). Foram coletados espécimes de Anisotremus: A. moricandi (Ranzani, 1842) (n=1 – BU), A. surinamensis (Bloch, 1791) (n=3; n=2 – BU, n=1 – CA) e A. virginicus (Linnaeus, 1758) (n=13; n=3 – KL, n=5 – CA, n=5 – SR) Além de representantes do gênero Haemulon: H. chrysagyreum Günther, 1859 (n=8: n=4 – FN, n=1 – RA, n=3 – KL), H. flavolineatum (Desmarest, 1823) (n=11 – KL), H. melanurum (Linnaeus, 1758) (n=2 – KL) H. parra (Desmarest, 1823) (n=7: n=4 – FN, n=2 – SR, n=1 – BU) e H. squamipinna Rocha & Rosa, 1999 (n=7: n=6 – SR, n=1 – CA) (Figura 3). . Para os Labridae, foram obtidos exemplares de Bodianus insularis (Gomon & Lubbock, 1980) (n=4; 1 ♂ e 3 indivíduos com sexo não determinado) do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, RN (ASPSP – 0°55'01,3"N, 29°20'43,0"O), Bodianus pulchellus (Poey, 1860) (n=3, imaturos, um proveniente do litoral de Salvador, BA – SA: 12º58’20,0”S, 38º30’05,09”O; Material e Métodos 45 os outros dois da costa de Vitória, ES – VI: 20°17'42,1"S, 40°17'44,2"O), e Bodianus rufus (Linnaeus, 1758) (n=4, imaturos; sendo dois do litoral de Salvador, BA, e o os outros dois da costa de Vitória, ES) (Figuras 4 e 5), foram utilizados em análises citogenéticas e moleculares. Os procedimentos experimentais seguiram todas as normas do Comitê de Ética no uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (protocolo 044/2015). Após as coletas, os exemplares foram acondicionados em sacos plásticos contendo água do mar, inflados com oxigênio ou utilizando-se oxigenadores portáteis e transportados às dependências do Laboratório de Genética de Recursos Marinhos (LGRM), na UFRN, até que se procedesse às preparações cromossômicas, ou sendo processados em campo, quando provenientes do exterior ou de regiões insulares. Os espécimes utilizados foram fixados em formol por 5 dias e transferidos para álcool etílico 100% até identificação, armazenamento e depósito de exemplares testemunhos em coleções ictiológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Universidade Federal da Paraíba (UFPB) e Universidade Estadual de Londrina (UEL). Material e Métodos 46 Figura 3. Espécies dos gêneros Haemulon e Anisotremus coletadas para o estudo: H. chrysagyreum (n=8), H. flavolineatum (n=11), H. melanurum (n=2), H. parra (n=7), H. squamipinna (n=7), A. moricandi (n=1) (imagem gentilmente cedida por André Seale – todos os direitos reservados), A. surinamensis (n=3) e A. virginicus (n=9). Barra = 2cm. Material e Métodos 47 Figura 4. Espécies de Labridae do gênero Bodianus utilizadas no estudo: B. insularis (n=4, 1 macho e 3 indivíduos com sexo não determinado), B. pulchellus (n=6, imaturos) e B. rufus (n=7, imaturos). Barra = 2cm. Material e Métodos 48 Figura 5. Mapa dos pontos de coleta das espécies utilizadas no estudo. As localidades encontram-se designadas pelos seguintes símbolos e siglas: Key Largo (EUA) – KL ( ), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (BR) – SPSPA ( ), Fernando de Noronha (BR) – FN ( ), Atol das Rocas (BR) – RA ( ), pontos de coleta na costa do Estado do Rio Grande do Norte (BR) – RN ( ), Salvador (BR) – SA ( ) e Vitória (BR) – VI ( ). Em dastaque estão os locais da costa do Estado do Rio Grande do Norte (BR) onde foram realizadas as coletas: Praia de Carnaubinha – CA ( ), Praia de Santa Rita – SR ( ), Praia da Redinha – RE ( ); Praia de Búzios – BU ( ). Material e Métodos 49 3.2 Métodos 3.2.1 Preparações Cromossômicas 3.2.1.1 Técnica de Estimulação Mitótica com Lisados Bacterianos A metodologia apresentada aqui, in vivo, visou aumentar a taxa de divisão celular, provocada por uma infecção induzida por inoculação intramuscular e intraperitoneal de um complexo comercial de antígenos bacterianos e fúngicos atenuados, Munolanâ (Allergan Frumtost), seguindo a técnica preconizada por Molina (2010). Este procedimento consiste na inoculação de solução do composto (2 comprimidos/1 ml de água destilada) na linha lateral e na nadadeira dorsal do organismo. O volume injetado seguiu a proporção de 1 ml/50 g de peso corporal e foi realizado utilizando-se seringas de 2 ml. Em seguida, os animais foram mantidos em um aquário aerado de 24 a 48 horas, procedendo às técnicas de obtenção de cromossomos descritas a seguir. 3.2.2 Obtenção de Cromossomos Mitóticos A técnica de obtenção de cromossomos mitóticos adotada seguiu o método preparação in vitro descrito por Gold et al. (1990), na qual foram excisadas frações dos rins anterior (cefálico) e posterior. Esses órgãos foram colocados em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640 e dissociados com ajudas de seringas de vidros, transferindo-se o material logo em seguida para tubos de centrífuga de 15 ml, completando-se o volume com 10 ml de meio RPMI. Adicionou-se solução de colchicina 0,025% para a supressão do processo de divisão celular, deixando-se agir por 30 minutos em temperatura ambiente. Centrifugou-se o material por 10 minutos a 900 rpm. O excedente foi removido e acrescentou-se 9ml de solução hipotônica de KCl (0,075 M), com tempo de ação de 28 a 30 minutos a temperatura ambiente, centrifugando-se em seguida por 10 minutos a 4000 rpm. Uma solução fixadora de metanol e ácido acético (3:1) foi utilizada para fixação do material em três ciclos de Material e Métodos 50 centrifugação a 4000 rpm por 10 minutos, o material foi conservado à -20 oC em tubos de 1,5 ml com tampa e analisado posteriormente. 3.2.3 Preparação das Lâminas Um total de 100 µl de suspensão celular foi despejado sobre lâminas convencionais de laboratório, devidamente limpas e recobertas por um filme de água destilada a 60 ºC. Após o gotejamento, as lâminas foram postas para secar em ambiente estéril a temperatura ambiente e posteriormente a secagem, coradas com solução de Giemsa (5%) diluído em tampão fosfato (pH 6,8), durante 8 minutos, deixando-se secar novamente a temperatura ambiente. Após secas, as lâminas foram direcionadas a microscopia, onde as melhores metáfases (consideradas de acordo com o espalhamento dos cromossomos e condensação da heterocromatina) foram então capturadas e digitalizadas em fotomicroscópio de epifluorescência OlympusTM BX50 sob aumento de 1000X, equipado com sistema digital de captura de alta definição (câmera Olympus DP-73) através do software cellSensÒ OlympusTM. Esse processo de caprtura seguiu-se para todas as demais análises microscópicas. 3.2.4 Técnicas de Bandamentos Cromossômicos 3.2.4.1 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos As RONs foram caracterizadas utilizando-se impregnação pela prata idealizada por Howell & Black (1980), preparando-se previamente uma solução gelatinosa contendo 1 g de gelatina incolor acrescido de 50 ml de água e 0,5 ml de ácido fórmico. Adicionaram-se sobre as lâminas 300 µl de solução gelatinosa, 300 µl de nitrato de prata (AgNO3) 50% e por fim, 150 µl água destilada que foram homogeneizados e recobertas com lamínula. A lâmina com a solução em sua superfície foi colocada numa estufa a 60 ºC até que o filme da solução atingisse uma coloração âmbar. A solução e a lamínula foram retiradas da superfície da lâmina com um jato de água Material e Métodos 51 destilada, seca a temperatura ambiente e então analisadas sob microscópio óptico. 3.2.4.2 Detecção de Heterocromatina Constitutiva A revelação das regiões de heterocromatina constitutiva (bandamento C) foi realizada utilizando-se o método desenvolvido por Sumner (1972) com pequenas alterações, visando uma melhor qualidade das preparações. As lâminas após envelhecidas em estufa à 37 °C por um período de 72 horas, foram imersas em solução de HCl 0,2 N à temperatura ambiente, por 30 minutos, lavando-as logo em seguida em água destilada e deixadas a secar em temperatura ambiente. Após isso, foram incubadas à temperatura de 42 °C numa solução de Ba(OH)2.8H2O à 5% em períodos variáveis para cada espécime (partindo-se de 1:30min e ajustados a medida que repetições desse procedimento disponibilizavam resultados mais aprimorados, aumentando-se ou diminuindo o tempo de exposição a cada novo procedimento), sendo em seguida lavadas brevemente com HCl 0,2 N e mantidas em solução de 2X SSC a 60 ºC em estufa por uma hora. Após esta fase as lâminas foram coradas com Giemsa 5% e analisadas. 3.2.4.3 Coloração com Fluorocromos CMA3 e DAPI A coloração com o fluorocromo cromomicina A3 (CMA3) foi realizada seguindo a técnica de Schweizer (1980), com pequenas modificações. Após um processo de desidratação por 30 minutos em solução fixadora (metanol 3:1 ácido acético) e 1 hora em etanol 100%, as lâminas foram secas ao ar e um total de 30 µl de solução cromomicina (CMA3) (0,5 mg/ml – 10 ml) foi depositado em cada lâmina, sendo as mesmas cobertas por lamínulas, permanecendo 1 hora em câmara escura umedecida. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em água destilada, utilizando-se de um jato moderado para a retirada das lamínulas. Depois as lâminas foram secas em temperatura ambiente no escuro e sobre sua superfície aplicaram-se 30 µl do meio de montagem (Glicerol-Macllvaine, pH 7,0, 1:1), sendo coberta com lamínulas e o conjunto selado com base incolor Material e Métodos 52 de esmalte nas extremidades, para evitar que o meio de montagem se dispersasse durante a estocagem. As lâminas foram preservadas em câmara escura à temperatura ambiente por 4 dias e então analisadas utilizando-se os filtros microscópicos de fluorescência apropriados. Após analisadas, as lâminas foram novamente submetidas à lavagem com água destilada, utilizando-se do jato moderado para a retirada das lamínulas e secas ao ar no escuro. Posteriormente sobre as mesmas foi depositado um total de 30 µl de solução de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (2 µg/ml – 10 ml), sendo cobertas novamente por lamínulas e permanecendo por 30 minutos em câmara escura umedecida. Novamente foram submetidas à lavagem com água destilada, utilizando-se do jato moderado para a retirada das lamínulas e secas ao ar no escuro. Por último, aplicou-se novamente 30 µl do meio de montagem (Glicerol-Macllvaine, pH 7,0; 1:1), sobre cada lâmina no escuro e sobre as mesmas depositaram-se as lamínulas, sendo o conjunto selado com base incolor de esmalte nas extremidades. As lâminas foram preservadas em câmara escura à temperatura ambiente por 4 dias e então analisadas utilizando-se os filtros microscópicos de fluorescência apropriados. 3.2.4.4 Hibridização Fluorescente in situ (FISH) A hibridização in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Pinkel et al. (1986) com algumas modificações. A obtenção das sondas de DNAr foi realizada por PCR, designando-se dessa forma as sondas específicas para cada marcador. Dessa forma, para os marcadores ribossomais duas sequências foram isoladas do genoma da espécie de peixe Rachycentrum canadum (Euteleostei, Perciformes) e amplificadas utilizando-se os primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CG ATC-3’e B 5’-CGA GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994). A sonda DNAr 5S incluía 200 pares de bases (bp) do gene RNAr 5S e a de DNAr 18S corresponderam a um segmento de 1400 bp do gene RNAr 18S, obtido via PCR do DNA nuclear (Costa, 2015). Ambas as sondas foram marcadas por nick translation (Digoxigenina e Biotina – Nick TranslationMix, Roche) seguindo as recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Material e Métodos 53 Alemanha), sendo a de DNAr 5S com biotina-14-dATP e a de DNAr 18S com digoxigenina-11-dUTP de acordo com as recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha). As sondas do transposon Tol2 foram obtidas por PCR do DNA nuclear novamente de Rachycentron canadum utilizando-se os primers Tol2 4 5 F 5′– ATA GCT GAA GCT GCT CTG ATC – 3′ e Tol2 4 5 R 5′ – TCT AAT ATG CTT CCT TAG G – 3′, Tol2 5 f 5’ – CTG CTC TGA TCA TGA AAC AG – 3’ e Tol2 5 5’ – CTT CCT TAG GTT TGA TGG CG – 3’ (Kawakami & Shima, 1999). As sondas continham cópias de DNA Tol2 com 200 pb. A sonda amplificada com os primers Tol2 4 foi marcada biotina-14-dATP e a sonda com Tol2 5 com com digoxigenina-11-dUTP, ambas através de nick translation (DIG – e Biotin – Nick TranslationMix, Roche) seguindo as recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha). As soluções de hibridização consistiram de 240 µl de formamida 50%, 96 µl de sulfato dextrano 50%, 48 µl de 20XSSC, 80 µl de água q.s.p., perfazendo um volume total de 480 µl, sendo adicionado 1,5 µg de sonda (DNA marcado com biotina ou digoxigenina). Em seguida, a solução de hibridização foi transferida para um banho a 100 ºC, durante 10 minutos, para desnaturação do DNA e, imediatamente após, para um recipiente com gelo, impedindo a renaturação por choque térmico. As lâminas, contendo as preparações cromossômicas, foram lavadas com tampão PBS 1X por 5 minutos à temperatura ambiente, sob agitação e, posteriormente desidratadas em séries alcoólicas (70%, 80% e 100%) à frio. Em seguida, foram colocadas em RNAse (RNAse 0,4%/2X SSC) por 1 hora e 30 minutos, em câmara úmida a 37 °C. Após este período as lâminas foram lavadas em soluções salinas (0,005% em HCl 10 mM) a 37 ºC por 10 minutos e fixadas em formaldeído 1% a temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida o material foi desidratado em uma série alcoólica (70%, 80% e 100%), 5 minutos em cada banho, e tratado com formamida 70%/2X SSC a 70 °C, por 5 minutos, para desnaturação dos cromossomos. Uma nova desidratação em série alcoólica foi realizada, sendo posteriormente aplicados sobre a lâmina, 60 µl da solução de hibridização contendo a sonda desnaturada, permanecendo overnight a 37 oC em câmara úmida. Material e Métodos 54 Transcorrido o período, as lâminas foram lavadas em solução de formamida 15% 0,2X SSC a 42oC por 10 minutos, três vezes em 0,1X SSC a 60 °C, 5 minutos em cada lavagem, e em solução Tween 20 (0,05%/2X SSC), sob agitação, por 5 minutos. Foi realizado um tratamento com 100 ml de NFDM 5% (non fat dry milk – leite em pó desnatado) em 4X SSC, por 15 minutos à temperatura ambiente. As detecções das sondas foram feitas, colocando-se sobre as lâminas, 90 µl de avidina-FITC (fluoresceína isotil cianato-avidina conjugada) em NFDM 5% a 0,25 µg/µl ou anti-digoxigenina rodamina/NFDM 5%, por 30 minutos a 1 hora, em câmara úmida a temperatura ambiente, com três lavagens sucessivas com Tween 20, durante 5 minutos em cada lavagem. O sinal de hibridização foi amplificado com cerca de 70 µl de anti- avidina biotina-conjugada, por 30 minutos, havendo posteriormente três lavagens scuessivas com Tween 20 (0,5%/4X SSC), durante 5 minutos em cada lavagem. O sinal de hibridização da avidina-FITC foi amplificado com 90 µl de anti-avidina biotina conjugada em NFDM 5% por 30 minutos, com três lavagens adicionais com Tween 20 (5 minutos por lavagem). Este ciclo e o tratamento com FITC foram repetidos mais duas vezes. Para a detecção das sondas marcadas com digoxigenina, foi utilizada anti-digoxigenina rodamina conjugada em NFDM 5%. As lavagens com Tween 20 foram as mesmas para avidina-FITC. Finalmente as lâminas foram desidratadas em série alcoólica (70%, 80% e 100%), durante 5 minutos em cada banho. Os cromossomos foram contra-corados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml) (Vector) e as lâminas foram analisadas utilizando-se os filtros microscópicos de fluorescência apropriados. 3.2.4.5 Revelação de regiões de DNA metiladas Padrões de metilação do DNA nos cromossomos metafásicos foram avaliados pela análise da ligação de anticorpo monoclonal a 5-methylcytosine (5mC). A imunodetecção indireta do DNA metilado foi realizada de acordo com Marques et al. (2011). As lâminas foram tratadas com RNAse (Invitrogen) 20 mg/ml diluída em 1:200 em 2XSSC por uma hora, seguida a exposição por pepsina 1 mg/ml (1:100) em 0,01N HCl (100 μl por lâmina) por Material e Métodos 55 20 minutos. Seguiu-se a desnaturação do DNA em formamida 70% por 3 minutos a 75 ºC sendo posteriormente bloqueado com 3% de BSA diluído em 1X PBS, 0,1% Tween 20, por 30 min à 37°C e incubado com anticorpo primário mouse-anti-5-methylcytosine (Eurogentec™) em 1% BSA/1X PBS (1:100) overnight à 4°C. A detecção da 5mC foi feita utilizando anti-mouse-FITC diluído (1:200) em 1% BSA/1X PBS por 1h à 37° C. Por fim, as lâminas foram lavadas em 1X PBS, montadas com DAPI/Vectashield antifading (Vector Laboratories™) e analisadas em microscopia de fluorescência através de um fotomicroscópio Leica DMBL (©Leica Microsystems) equipado com uma câmera CCD Cohu (CohuHD Costar™), utilizando o software QFISH (©Leica Microsystems). A composição da imagem com os sinais de hibridização foi realizada no programa Photoshop CS5 (Adobe™). 4. ANÁLISES CROMOSSÔMICAS As preparações cromossômicas convencionais (coloração convencional com Giemsa, bandamento C e impregnação por nitrato de prata para a constatação das RONs) e moleculares (FISH, coloração com os fluorocromos base-específicos DAPI/CMA3, enzimas de restrição e incorporação do análogo de base 5’BrdU) forneceram as melhores metáfases (um número de trinta metáfases por indivíduo), que após fotografadas e analisadas permitiram o estabelecimento do padrão cariotípico, através da determinação da fórmula cromossômica e do Número Fundamental (NF), o qual se refere exclusivamente ao número total de braços cromossômicos verificados no cariótipo . A montagem dos cariótipos deu-se pela ordenação dos cromossomos quanto à posição dos centrômeros em metacêntricos (m) com a razão entre o braço maior e menor (RB) variando no valor de 1,00 a 1,70; submetacêntricos (sm), RB = 1,70 – 3,00; subtelocêntricos (st), RB = 3,00 – 7,00; e acrocêntricos (a), RB > 7,00 (Levan et al., 1964). Material e Métodos 56 5. PREPARAÇÃO DE CARIÓTIPOS Os cariótipos das espécies e os idiogramas foram montados com o uso dos softwares Adobe Photoshop CC™, Adobe Ilustrator CC™ e Corel Draw X5™. Os dados de distribuição das espécies foram obtidos a partir dos registros de observações fornecidos pelo serviço de global de informações e dados da biodiversidade marinha (Ocean Biogeographic Information System – http://www.iobis.org/). Os dados de projeção da pluma dos rios Amazonas e Orinoco foram obtidos por análises da sonda Aquarius (NASA – https://aquarius.umaine.edu/cgi/sci_data.htm) para a verificação da salinidade nos oceanos no planeta e a mensuração da área se deu através do software de domínio público Image J (Java 1.6.0_65 – 64 bits) (Schneider et al., 2012). Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 57 6. CAPÍTULOS 6.1 Capítulo I Estase cariotípica em Haemulidae (Teleostei, Perciformes): Evidências de manutenção evolutiva sintênica Clóvis C. Motta-Neto1*, Gideão W.W.F. Costa1, Karlla D.J. Amorim1, Marcelo B. Cioffi2, Luiz A.C. Bertollo2, Roberto F. Artoni3, Wagner F. Molina1 1Centro de Biociências, Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Brasil. 2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Paulo, Brasil. 3 Departamento de Biologia Molecular e Estrutral, Universidade Estadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa, Paraná, Brasil. *Autor correspondente: Clóvis C. Motta-Neto - Departmento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. E-mail: mottaneto.cc@gmail.com Resumo A conservação cariotípica em alguns grupos de peixes da Ordem Perciformes é reconhecidamente um exemplo de estase cariotípica. Haemulidae, cujos representantes são conhecidos como “roncadores”, é uma das famílias em que esta condição é largamente difundida. Suas espécies possuem cariótipos 2n=48a, RONs simples e heterocromatina caracteristicamente reduzida e pericentromérica. Os gêneros Anisotremus e Haemulon, o último o mais diverso da família, são amplamente distribuídos no Atlântico Ocidental e cujas informações citogenéticas ainda são limitadas. A ampliação dos dados citogenéticos de suas espécies permitem análises mais detalhadas sobre a extensão e evolução do conservadorismo cromossômico em Perciformes. Aqui são apresentados dados citogenéticos das espécies Anisotremus moricandi, A. surinamensis, populações de A. virginicus e H. chrysargyreum (Brasil e Caribe), Haemulon flavolineatum, H. melanurum, H. parra e H. squamipinna obtidos através de técnicas convencionais (Giemsa, bandamento C e Ag-RON, coloração com fluorocromos DAPI e CMA3) e de double-FISH com sondas DNAr 5S e 18S. Todas as espécies apresentaram 2n=48a, indicando conservadorismo numérico e estrutural dos cromossomos. Adicionalmente, comparações filogenéticas da organização e localização das sequências ribossomais com espécies de outros gêneros reforçam a manutenção de acentuadas homeologias cromossômicas intra- e cogenéricas, indicando a manutenção evolutiva de extenso conteúdo sintênico nesta família. Por outro lado, divergências pontuais, como co- localização dos genes RNAr 18S/5S ocorrem pontualmente durante a história evolutiva desses gêneros. O conservadorismo cariotípico presente em Haemulidae mantém-se mesmo diante dos processos de diversificação da família. Fatores bióticos e abióticos, como grandes contingentes populacionais e ausência de barreiras físicas e ecológicas ao fluxo gênico, aliados a peculiaridades intrínsecas da arquitetura cariotípica desse grupo de peixes, podem estar envolvidos na inércia evolutiva de seus cromossomos. Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 58 Palavras-chave: Haemulidae, estase cariotípica, evolução cromossômica, double FISH. Abstract The Karyotypic conservatism in some fish groups of the Perciformes Order is a recognizedly example of karyotypic stasis. Haemulidae, whose representatives are known as "grunts", is one of the families in which this condition is widespread. Its species have karyotypes 2n = 48a, single NORs and heterochromatin characteristically reduced and pericentromeric. The genera Anisotremus and Haemulon, the last being most diverse of the family, are widely distributed in the Western Atlantic and whose cytogenetic informations are still limited. The enlargement of the cytogenetic data of its species allows more detailed analyzes on the extent and evolution of chromosome conservatism in Perciformes. Here we present cytogenetic data of the species Anisotremus moricandi, A. surinamensis, populations of A. virginicus and H. chrysargyreum (Brazil and the Caribbean), Haemulon flavolineatum, H. melanurum, H. parra and H. squamipinna obtained through conventional techniques (Giemsa, C-banding and Ag-NORs, staining with the fluorochromes DAPI and CMA3) and double-FISH with 5S and 18S rDNA probes. All species presented 2n = 48a, indicating numerical and structural conservatism of the chromosomes. Additionally, phylogenetic comparisons of the organization and location of ribosomal sequences with species of other genera reinforce the maintenance of accentuated intra- and cogeneric chromosomal homeologies, indicating the evolutionary maintenance of extensive syntenic content in this family. On the other hand, point divergences such as co-localization of 18S/5S RNAr genes occur punctually during the evolutionary history of these genera. The karyotypic conservatism present in Haemulidae is maintained even in the face of family diversification processes. Biotic and abiotic factors, such as large populations and absence of physical and ecological barriers to gene flow, allied to the intrinsic peculiarities of the karyotype architecture of this group of fish, may be involved in the evolutionary inertia of their chromosomes. Key words: Haemulidae, karyotype stasis, chromosomal evolution, double FISH. Introdução Estase cariotípica é largamente difundida em alguns grupos de Perciformes (Molina, 2007) que demonstram pequena divergência cariotípica durante a divergência filética. Essa condição é pode ser encontrada em diversos organismos e se caracteriza pela ausência de mudanças no número cromossômico (estase cromossômica), na composição e estrutura genômica ou nos níveis de ploidia (Kahl, 2015). A estase cariotípica ocorre em grupos Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 59 tão diversos como plantas vasculares (Bomfleur, 2014) e plantas herbáceas (Mandáková et al., 2010; Samad et al., 2016); anfíbios (Aprea et al., 2004; Sessions & Kezer, 1991); aves (Ellegren, 2010) e peixes (Galetti et al., 2000; Molina & Bacurau; 2006; Motta-Neto et al., 2011a, b; Molina et al. 2013; Costa et al., 2016). A Ordem Perciformes é a maior dentre os vertebrados com 2.248 espécies e consequentemente a mais diversa entre os peixes (Nelson et al., 2016). Nesta Ordem, a subordem Percoidei abriga a maior parte das espécies (2095 espécies). Dados citogenéticos nesta subordem indicam que aproximadamente 40% das espécies analisadas (Arai, 2011), compartilham um cariótipo basal com 2n=48a. Outras características destes cariótipos são heterocromatina geralmente reduzida e encontrada preferencialmente na região centromérica dos cromossomos, além da presença de sítios simples de regiões organizadoras de nucléolos (RONs) (Mandrioli, 2000; Affonso et al., 2001; Ene, 2003; Molina, 2007; Motta-Neto et al., 2011b; Molina et al., 2013). Entre os Percoidei, as espécies da família Haemulidae apresentam elevado nível de compartilhamento de cariótipos com essas características (Motta-Neto et al., 2011a, b). A ampliação dos dados citogenéticos para outras espécies e populações desta família propiciam uma condição apropriada para a análise da manutenção sintênica da arquitetura cromossômica nesta subordem. Diante disso, aqui são apresentados dados citogenéticos de oito espécies e duas populações dos gêneros Anisotremus e Haemulon (Haemulinae) do Caribe e da costa do Brasil, obtidos através de técnicas de citogenética convencional (coloração com Giemsa, AgRONs, bandamento C, e coloração com os fluorocromos base-específicos CMA3 e DAPI), além do mapeamento de sequências DNAr 5S e 18S, afim de verificar se este fenômeno está difundido a nível macro ou microestrutural na família Haemulidae. Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 60 Material e Métodos Espécimes e Preparações Cromossômicas Exemplares da família Haemulidae foram coletados no litoral brasileiro e em Key Largo, na Flórida (EUA) (Figura 5, tabela 1). Após as coletas, os exemplares foram acondicionados em sacos plásticos contendo água do mar, com oxigenação e mantidos em aquários. Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica “in vivo” de acordo com Molina et al. (2010). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de Espécies N (total) Localidades Anisotremus moricandi (Ranzani, 1842) 01 Nísia Floresta, RN - 6º01’03,42”S, 35º06’31,13”O (BU, n=1) A. surinamensis (Bloch, 1791) 03 Nísia Floresta, RN - 6º01’03,42”S, 35º06’31,13”O (BU, n=2) Touros, RN - 5º13’11,97”S, 35º25’3,82”O (CA, n=1) A. virginicus (Linnaeus, 1758) 09 Key Largo, EUA - 25º09’40,07”N, 80º45'’83,07”O (KL, n=3) Touros, RN - 5º13’11,97”S, 35º25’3,82”O (CA, n=1) Extremoz, RN - 5º69’90,62”S, 35º19’28,63”O (SR, n=5) H. chrysargyreum Günther, 1859 08 Key Largo, EUA - 25º09’40,07”N, 80º45'’83,07”O (KL, n=3) Fernando de Noronha, PE - 3º83’97,52”S, 32º41’65,90”O (FN, n=4) Atol das Rocas, RN - 3º86’44,53”S,33º81’23,49”O (RA, n=1) H. flavolineatum (Desmarest, 1823) 11 Key Largo, EUA - 25º09’40,07”N, 80º45'’83,07”O (KL, n=11) H. melanurum (Linnaeus, 1758) 02 Key Largo, EUA - 25º09’40,07”N, 80º45'’83,07”O (KL, n=2) H. parra (Desmarest, 1823) 07 Extremoz, RN - 5º69’90,62”S, 35º19’28,63”O (SR, n=2) Fernando de Noronha, PE - 3º83’97,52”S, 32º41’65,90”O (FN, n=4) Nísia Floresta, RN - 6º01’03,42”S, 35º06’31,13”O (BU, n=1) H. squamipinna Rocha & Rosa, 1999 07 Extremoz, RN - 5º69’90,62”S, 35º19’28,63”O (SR, n=6) Touros, RN - 5º13’11,97”S, 35º25’3,82”O (CA, n=1) Tabela 1. Dados das espécies coletadas para a realização do presente estudo. Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 61 células do rim anterior, seguindo a metodologia desenvolvida por Gold et al. (1990). As regiões organizadoras de nucléolos e regiões heterocromáticas foram analisadas através das técnicas de Ag-RONs (Howell & Black, 1980), bandamento C (Sumner,1972), e adicionalmente pela coloração com os fluorocromos base-específicos CMA3/DAPI (Schweizer,1980). As amostras foram coletadas com autorização do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBIO/SISBIO) (Licença número 02001.001902/06-82) e os procedimentos experimentais seguiram todas as normas do Comitê de Ética no uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (protocolo 044/2015). Os marcadores ribossomais foram isoladas do genoma da espécie Rachycentrum canadum (Euteleostei, Perciformes) e amplificadas utilizando- se os primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CG ATC-3’e B 5’-CGA GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994). A sonda DNAr 5S incluiu 200 pares de bases (bp) do gene RNAr 5S e a de DNAr 18S corresponderam a um segmento de 1400 bp do gene RNAr 18S, obtido via PCR do DNA nuclear (Costa, 2015). O mapeamento físico das subunidades ribossômicas DNAr 5S e 18S foi realizado por meio de hibridização in situ (Pinkel et al., 1986). As sondas de DNAr 5S foram marcadas através de nick translation com biotina-14-dATP (Roche, Mannheim, Alemanha), e as DNAr 18S com digoxigenina-11-dUTP (Roche, Mannheim, Alemanha), de acordo com as especificações do fabricante. Para o DNAr 5S (Biotina – Nick TranslationMix, Roche), DNAr 18S (Digoxigenina – Nick TranslationMix, Roche). Aproximadamente trinta metáfases de cada espécime foram fotografadas utilizando-se o fotomicroscópio de epifluorescência OlympusTM BX50, sob aumento de 1000X, equipado com sistema de captura digital (Olympus DP-73) através do software cellSensÒ OlympusTM e utilizadas na confecção dos cariótipos. Os cromossomos foram classificados em relação a posição do centrômero (Levan et al., 1964) e organizados em ordem decrescente de tamanho. Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 62 Resultados Todas as espécies apresentaram valor diplóides de 48 cromossomos acrocêntricos (NF=48). Os cariótipos apresentaram simétricos com pequena variação de tamanho entre os maiores e os menores pares cromossômicos. Em algumas espécies foi possível observar a presença de constrições secundárias em alguns pares cromossômicos. Em A. virginicus (Figura 6) e H. squamipinna (Figura 7) essas constrições se localizam no 24º par e em H. squamipinna a localização se dá no 5º par cromossômico. Os sítios Ag-RONs estam localizados em um único par cromossômico, de forma destacada no braço curto do 24º par, excetuando-se as espécies H. chrysargyreum, no 5º par em posição subterminal e H. melanurum, no 10º par em posição pericentromérica do braço longo (Figura 7). As espécies apresentaram um baixo conteúdo heterocromático principalmente localizado nas regiões centroméricas e com destaque nas regiões organizadoras de nucléolos. Adicionalmente, foram realizadas colorações com fluorocromos base-específicos, que evidenciaram em todos os casos regiões mais coradas nos pares organizadores de nucléolos. Dados com essa metodologia não foram obtidos momentaneamente para A. surinamensis, A. moricandi e H. squamipinna (Figuras 6 e 7). Os sítios de DNAr 5S estavam localizados em posição terminal no braço curto do 10o par na maioria das espécies (Figuras 6 e 7), excetuando- se A. virginicus onde ocupava a região terminal do braço longo do 5º par, enquanto que em A. moricandi se localizava no braço curto do 24o par (Figura 6). As regiões DNAr 18S foram coincidentes com os sítios Ag-RONs. Divergências de localização foram observadas no cariótipo de H. chrysargyreum, onde se situavam em posição subterminal no 5o par e em H. melanurum, onde estas regiões estavam localizadas no braço curto do 10o par (Figura 7). Sintenias marcantes foram verificadas intra e intergenericamente, principalmente com relação a localização dos pares RONs, sítios DNAr 5S e DNAr 18S. Durante as análises, não se indentificou nenhuma variação estrutural dos cromossomos ou da organização dos genes ribossomais entre as populações da costa brasileira e do Caribe. Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 63 Figura 6. Cariótipos das espécies de Anisotremus através de coloração convencional com Giemsa (esquerda), bandamento C (centro) e hibridização in situ com sondas DNAr 5S e 18S (direita). Em destaque os pares organizadores nucleolares evidenciando sítios Ag-RONs, bandas- C e padrões de coloração com os fluorocromos DAPI/CMA3, sítios DNAr 5S e 18S. Barra = 5µm. . Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 64 Figura 7. Cariótipos das espécies de Haemulon através de coloração convencional com Giemsa (esquerda ), bandamento C (centro) e hibridização in situ com sondas DNAr 18 e 5S (direita). Em destaque os pares organizadores nucleolares evidenciando sítios Ag-RONs, bandas-C e padrões de coloraç ão com os fluorocromos DAPI/CMA3, sítios DNAr 5S e 18S. Barra = 5µm. Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 65 Discussão As oito espécies de Haemulidae apresentaram características similares quanto ao número e estrutura cariotípica. Esse conjunto, caracteristicamente formado por 2n=48a, sítios Ag-RONs simples e heterocromatina pericentromérica reduzida é considerado plesiomórfico entre os Percomorpha (Galetti et al., 2000; Molina, 2007). O mapeamento dos sítios DNAr 18S indicou sua localização ao longo da diversificação filética principalmente mantida no menor par cromossômico (par 24), exceto em H. chrysargyreum, onde ocupa a porção terminal do braço longo do 5o par. Embora 18S em outras espécies possa constituir valiosos marcadores citotaxonômicos, diante da recorrência de alguns padrões o seu uso se mostra restrito em Haemulidae. Os sítios DNAr 5S se mostram mais variáveis evolutivamente, localizando-se em um ou dois pares cromossômicos, mas também revelam regularidade de número e posição em cromossomos homeólogos. Frequentemente apresentam-se não sintênicos com o DNAr 18S, exceto em A. moricandi, a qual apresenta uma organização co-localizada. O conservadorismo cariotípico, que pelos dados obtidos para Haemulidae podem se estender também para aspectos da organização dos seus genes, está presente em diversos grupos de Percomorpha (Galetti et al., 2000, Molina, 2007). As causas e extensão desta condição ainda não são inteiramente compreendidas. Os cariótipos destes grupos se mantem conservados por não possuir as características intrínsecas promotoras de variação ou estão submetidos a forças seletivas que impedem mudanças? Fatores bióticos dos grupos e físicos do ambiente contribuem para essa condição de estase? A estase evolutiva é ampla e se traduz pela ausência de modificações nos diferentes níveis dos organismos ao longo da sua história evolutiva. Essa condição evolutiva em alguns casos pode se mostrar temporalmente transitória variando quando da ocorrência de fatores disruptivos (Burt, 2001). Em alguns casos caracteriza-se como um padrão determinado pela manutenção de uma característica que persistem por milhões de anos como resultado da seleção estabilizadora (Wake et al., Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 66 1983). Em termos adaptativos, a estase evolutiva pode refletir homeostase do desenvolvimento ou permanência estática em picos adaptativos (Lerner, 1954; Mayr, 1982; Charlesworth et al., 1982; Kirkpatrick, 1982; Templeton 1982; Nanney, 1982). Em geral é comum igualar estase (padrão) com inércia ou restrição (processo), bem como mudança evolucionária (padrão), com a ação da seleção (processo). Quando o processo evolutivo é considerado adaptativo, a estase é definida pela ação da seleção estabilizadora e flutuações na seleção direcional, enquanto as mudanças evolutivas seriam dirigidas pela seleção direcional ou disruptiva. A estase pode ainda indicar falta de variação genética, ou relações antagônicas entre as características sob seleção (Ackerly, 2016). Esta visão selecionista da estase organismal pode não ser propriamente aplicada à estase cariotípica vivenciada por vários grupos de peixes. As características cariotípicas refletem o marcado conservadorismo cromossômico dos sítios DNAr 18S em Haemulidae, por outro lado, as sequências DNAr 5S têm um padrão mais dinâmico. A discrepância no nível de diversificação cromossômica dos genes DNAr 18S e 5S em Haemulidae evidencia diferentes taxas evolutivas. De fato, o DNAr 18S representa uma das regiões do DNA nuclear mais estudadas, em grande parte por possuir uma taxa evolutiva muito lenta, possibilitando seu uso na evidenciação de divergências filogenéticas antigas alcançando 400 M.a. Por outro lado gene RNAr 5S já apresenta uma taxa evolutiva mais dinâmica com variações estruturais entre diferentes filos, sendo utilizado para a reconstrução de eventos evolutivos relativamente recentes (Hillis & Dixon, 1991). Evolutivamente, sítios DNAr 5S apresentam-se em três padrões básicos para Haemulidae. O primeiro, que abrange o maior número de espécies, é a ocorrência de um único sítio na posição pericentromérica do par 10, presente em A. surinamensis, H. flavolineatum, H. parra, H. squamipinna, H. chrysargyreum e H. melanurum, bem como em espécies de gêneros mais basais como Conodon (Figura 8). Um segundo padrão consiste na localização destes sítios no par 5º em posição terminal do braço longo, presente em H. aurolineatum – população da costa brasileira (Motta-Neto et al., 2011b), H. steindachneri (Motta-Neto, 2011b), Haemulopsis Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 67 corvinaeformis (Motta-Neto, 2011b) e A. virginicus (Figura 8). Um terceiro, menos comum consiste em dois sítios DNAr 5S nestes dois pares (pares 5 e 10), como em H. plumierii (Motta-Neto et al., 2011b), H. bonariense (Nirchio & Oliveira, 2014), possivelmente presente em H. aurolineatum – população do Caribe (Nirchio et al., 2007), e em Conodon nobilis (Motta-Neto et al., 2011a) (Figura 8). Figura 8. Relações filogenéticas baseadas em dados moleculares de espécies da família Haemulidae de diferentes regiões oceânicas. Atlântico Ocidental ( ), Caribe ( ), costa do Brasil ( ) e Pacífico Oriental ( ); informações citogenéticas disponíveis e valores referentes a área de distribuição em km2 sob as barras em cinza no interior da forma geométrica representativa para a distribuição. Adaptado de Bernardi et al., 2008; Rocha et al ., 2008; Tavera et al., 2012. A similaridade na localização e tamanho dos pares cromossômicos portadores dos sítios DNAr 5S e 18S em Haemulidae, indicam que possivelmente correspondam a cromossomos homeólogos. Desta forma, oferecem forte suporte da ocorrência de grupos sintênicos evolutivamente conservados nesta família. A estase cromossômica se estende a Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 68 conservação de ordem de genes (Ellegren, 2010), como parecem sugerir as regiões homeólogas dos cromossomos portadores de sítios ribossomais na família Haemulidae. A presença de pares cromossômicos homeólogos portadores de sítios ribossomais têm sido amplamente identificada em vários grupos de peixes (Martins & Galetti, 1999, 2000; Vicente et al., 2001; Centofante et al., 2002). A co-localização de sítios DNAr 5S e 18S em A. moricandi (24º par) e em H. melanurum (par 10), indica a ocorrência de condições disruptivas da estabilidade sintênica e se mostram como padrões derivados de organização do DNAr em Haemulidae. A heterocromatina nos cariótipos das espécies de Haemulidae, embora possa constituir um marcador citotaxonômico importante em alguns grupos de peixes (Lima & Molina, 2004), possui uma distribuição pericentromérica regular em Haemulidae. Dentre as regiões heterocromáticas, apenas aquelas equilocais aos sítios DNAr 18S apresentaram significativo conteúdo GC. Por outro lado, os sítios DNAr 5S, apesar de poderem se apresentar heterocromáticos, só apresentaram resposta positiva aos fluorocromos base-específicos quando estão co- localizados com o DNAr 18S, como evidenciado em H. melanurum. A tendência que diferentes cariótipos apresentam à ocorrência de certos tipos de rearranjos cromossômicos ao longo de suas trajetórias evolutivas poderia levar à fixação de cariótipos simétricos, apresentando cromossomos com tamanhos aproximados e mesma morfologia (White, 1973; King, 1981), caracterizando processos ortoseletivos, podendo, mediante características intrínsecas do cariótipo moduladas por processos seletivos, apresentar claras conotações evolucionárias (Molina, 2007). Cariótipos similares extensivamente distribuídos em um grupo poderiam ainda ser indicadores de separação relativamente recente, não havendo tempo suficiente na escala evolutiva para a fixação de rearranjos cromossômicos particulares (Sola et al., 1981). Embora algumas espécies do gênero Haemulon tenham sofrido diversificação recente (Near et al., 2013), esta condição parece pouco provável como explicação para a estase Capítulo I – Estase cariotípica em Haemulidae: Manutenção evolutiva sintênica 69 cariotípica presente entre inúmeras famílias marinhas de Percomorpha surgidas no Terciário. Fatores ambientais e intrínsecos da história de vida das espécies têm sido apontados como interferentes nos padrões cromossômicos de peixes marinhos (Molina & Galetti, 2004; Sena & Molina, 2007). Sem dúvida, os grandes efetivos populacionais das espécies de Haemulidae e suas vastas áreas de distribuição (Figura 8) podem dificultar o estabelecimento de mudanças cariotípicas evolutivas. Neste sentido, barreiras biogeográficas, como a da pluma dos rios Amazonas e Orinoco, estão associadas às divergências cromossômicas entre as populações de H. aurolineatum do Caribe (Nirchio et al., 2007) e as do litoral brasileiro (Motta-Neto et al., 2011b). Apesar do efeito da barreira do Amazonas na diversificação da fauna do Atlântico, sua participação pode não ser efetiva para muitas espécies de peixes (Rocha, 2003). De fato, as análises populacionais em A. virginicus (Caribe – litoral brasileiro) e H. chrysargyreum (Caribe – ilhas oceânicas do Atlântico Ocidental) não apresentaram qualquer diferenciação cariotípica. Os padrões citogenômicos presentes em Haemulidae ampliam substancialmente o espectro taxonômico analisado e confirmam o extenso conservadorismo em alguns grupos de Perciformes. Características intrínsecas dos cromossomos deste grupo, aliados a características biológicas e ambientais, parecem agir sinergicamente favorecendo o quadro de estase presente nesta família de peixes marinhos. Nesse sentido, a clarificação dos padrões genéticos pode contribuir para o estabelecimento. Referências Bibliográficas Arai, R. (2011). Fish Karyotypes: A Check List. Tokyo: Springer. Ackerly, D.D. (2016). 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Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 73 6.2 Capítulo II Hipometilação diferencial de sequencias repetitivas ricas em Tol2/Alu em espécies de Bodianus (Labriformes, Labridae) Clóvis C. Motta-Neto1, André Marques2, Gideão W.W.F. Costa1, Marcelo B. Cioffi3, Luiz A.C. Bertollo3, Rodrigo X. Soares1, Kátia C. Scortecci1, Roberto F. Artoni4*, Wagner F. Molina1 1 Center of Biosciences, Department of Cellular Biology and Genetics, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil 2 Laboratory of Plant Cytogenetics and Evolution, Department of Botany, Federal University of Pernambuco, Recife, Brazil 3 Department of Genetics and Evolution, Federal University of São Carlos, São Paulo, Brazil 4 Department of Structural and Molecular Biology and Genetics, State University of Ponta Grossa, Ponta Grossa, Brazil *Corresponding author: Clóvis C. Motta-Neto - Department of Cellular Biology and Genetics, Federal University of Rio Grande do Norte,. E-mail: mottaneto.cc@gmail.com Abstract Labriformes shows examples of extreme conservatism together with species presenting high chromosomal diversification. However, the cytological characterization of epigenetic modifications remains unknown for the majority of its species. In the Labridae, the most abundant fishes on tropical reefs, the genus Bodianus has been characterized by the occurrence of a peculiar chromosomal region, here denominated BOD. This region is exceptionally decondensed, heterochromatic, argentophilic, GC-neutral and, in contrast to classical secondary constrictions, shows no signals of hybridization with 18S rDNA probes. In order to characterize the BOD region, the methylation pattern, the distribution of Alu and Tol2 retrotransposons and of 18S and 5S rDNAs were analyzed by Fluorescence In situ hybridization (FISH) on metaphase chromosomes of two Bodianus species, B. insularis and B. pulchellus. Immunolocalization of the 5-methylcytosine revealed hypermethylated chromosomal regions, dispersed along the entire length of the chromosomes of both species, while the BOD regions exhibited a hypomethylated pattern. Hypomethylation of the BOD region is associated with the precise collocation of Tol2 and Alu elements, suggesting their active participation in the regulatory epigenetic process. This evidence underscores a probable differential methylatory action during the cell cycle, as well as the role of Tol2/Alu elements in functional processes of fish genomes. Key Words: Fish cytogenetics, Methylation, pseudo-NORs, Mobile elements, Repetitive DNA Introduction Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 74 Introduction Percomorphs represent important models of chromosomal evolution in fishes (Molina, 2007). Inside this group, Percomorpharia, corresponds to the largest clade and includes some of the most prominent orders, such as Perciformes, Labriformes, Lophiiformes, and Tetraodontiformes (Betancur-R et al., 2013). Some of such groups exhibit extensive chromosomal conservatism, while others are characterized by high rates of chromosomal evolution, with intra- and interspecific karyotype diversification (Molina, 2007; Lima-Filho et al., 2012; Molina et al., 2014a, b). Some Labriformes families carry preferential chromosomal rearrangements (Sena & Molina, 2007; Molina et al., 2014b; Almeida et al., 2017) and singular regional DNA organization (Molina et al., 2012; Amorim et al., 2016). Labridae, the fifth largest marine fish family, with approximately 600 species, displays remarkable ecological and evolutionary diversification (Parenti and Randall, 2000). Its phylogeny, where the relationships of the highest categories have been better recognized, is a long-standing and widely discussed problem (Westneat & Alfaro, 2005). Particular evolutionary trends, such as pericentric inversions and centric fusions, occur among tribes of this family (Molina & Galetti, 2004a; Sena & Molina, 2007; Molina et al., 2014b; Almeida et al., 2017). Indeed, while some groups have a karyotype conservatism (Sena & Molina, 2007), other ones present karyotypes modeled by pericentric inversions, such as the Hypsigenyini tribe and, notably, the species of the genus Bodianus (Molina et al., 2012). The Hypsigenyini tribe exhibits relatively symmetrical karyotypes, with 2n=48 and high fundamental number (NF) values in relation to other ones (Arai, 2011). Some Atlantic species, such as Bodianus rufus, B. pulchellus and B. insularis, have been detailed analyzed where phylogenetically particular shared chromosomal regions were identified. These regions, located on the short arms of the second subtelocentric chromosome pair, are characterized as exceptionally decondensed, heterochromatic and argentophilic, thus suggesting the presence of rDNA sites. However, such regions neither are GC-rich ones, nor exhibit hybridization signals with 18S Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 75 rDNA probes, indicating the presence of a pool of distinct repetitive sequences with unusual organization (Molina et al., 2012). Molecular analyses have significantly widened the knowledge of the genomic organization and epigenetic modeling of the chromatin, particularly with respect to histone modifications of the euchromatin and heterochromatin (Fuchs et al., 2006). DNA methylation is catalyzed by a conserved class of DNA methyltransferases (Dnmt’s) broadly present in protists, fungi, plants and animal genomes (Craig and Brickmore, 1994; Dyachenko et al., 2010). Islets of CpG dinucleotides (C-phosphate-G, on the fifth carbon) are correlated with 5-methylcytosine content (5mC) (Vanyushin et al., 1973), which indicates hyper- and hypomethylation patterns in the chromatin related to gene regulation (Baylin et al., 1991; Almeida et al., 1993; Feinberg, 1993; Barbin et al., 1994). Although the knowledge of the methylation patterns is growing among vertebrates, it is still restricted in fishes, especially in relation to repetitive DNA regions (transcriptional and non-transcriptional), which are apparently limited to the heterochromatic regions and sex chromosomes (Schmid et al., 2016). Repetitive sequences have been the target of intense investigation in several fish groups (Vicari et al., 2008; Cioffi et al., 2010b; Costa et al., 2014, 2016; Barbosa et al., 2015), showing extreme complexity in some species (Costa et al., 2015). In this context, probable synergic or antagonistic interactions between collocated distinct sequences still need to be clarified. In this study, we analyzed the DNA methylation pattern in the metaphase chromosomes of B. pulchellus and B. insularis, especially in the exclusive decondensed region (Ag+/CMA0/C+), here referred as BOD. The data were compared with the structural patterns of the chromosomes, identified by the 18S and 5S rDNAs and the transposable elements Tol2 and Alu mapping using FISH (Fluorescence in situ hybridization). Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 76 Material and Methods Specimens collection and conventional chromosome procedures Specimens of Bodianus pulchellus (Poey, 1860) (n=6, all immature individuals) from Bahia State (12º 58’ S, 38º 31’ W), on the northeastern Brazilian coast, and Bodianus insularis Gomon & Lubbock 1980 (n=5, 2 males and 3 immature individuals) from São Pedro and Paulo Archipelago (0º55’N, 29º21’W), were used in cytogenetic analyses. The specimens were collected under authorization provided by the Chico Mendes Institute of Biodiversity Conservation (ICMBIO/SISBIO) (license #19135-5) and all experimental procedures followed the rules of the Animal Ethics Committee of the Federal University of Rio Grande do Norte (protocol 044/2015). Mitosis stimulation followed the protocols developed by Molina (2001) and Molina et al. (2010), and mitotic chromosomes were obtained by means of the in vitro interruption of the cell cycle (Gold et al., 1990). An amount of 150μl of cell suspension was dropped onto a wet slide covered by a film of distilled water, heated to 60º C and dried at room temperature. The Ag-NOR sites and the extra nuclear argentophilic regions were identified according to Howell and Black (1980). Fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunostaining of methylated DNA Fluorescence in situ hybridization (FISH) was performed according to Pinkel et al. (1986). The 5S and 18S rDNA sequences were detected by two- color FISH analyses. Both ribosomal sequences were isolated from the Hoplias malabaricus (Teleostei, Characiformes) genome. The 5S rDNA included 120 base pairs (bp) of the 5S rRNA gene and 200bp from the non- transcribed spacer (NTS) (Martins et al., 2006). The 18S rDNA probes corresponded to a 1400bp segment from the 18S rRNA gene, obtained through PCR of the nuclear DNA (Cioffi et al., 2010a). The 5S rDNA probes were labeled with biotin-14-dATP by nick translation according to the manufacturer's recommendations (BioNick™ Labeling System; Invitrogen™, Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 77 San Diego, CA, USA). The 18S rDNA was labeled by nick translation with Digoxigenin-11-dUTP, in line with the manufacturer's recommendations (Roche™, Mannheim, Germany). The Tol2 transposon probes were obtained by PCR of the nuclear DNA of Rachycentron canadum using the primers Tol2-5F 5′-CTG TCA CTC TGA TGA AAC AG-3′ and Tol2-5R 5′-CTT TGA CCT TAG GTT TGG GC-3′ (Kawakami & Shima, 1999). The probes were labeled with Digoxigenin-11- dUTP by nick translation following the manufacturer's recommendations (Roche™, Mannheim, Germany). The (TTAGGG)n sequences were mapped by FISH using Telomere PNA FISH Kit/FITC according to manufacturer’s instructions (Dako Citomation). The Alu transposon probes were obtained by PCR of the genomic DNA of R. canadum using the primers Alu CL1 5’-TCC CAA AGT GCT GGG ATT ACA G-3’ and Alu CL2 5’-CTG CAC TC AGC CTG GG-3’ (Lengauer et al., 1992), and were labeled with Digoxigenin-11-dUTP by nick translation following the manufacturer's recommendations (Roche™, Mannheim, Germany). The chromosomes were counter-stained with Vectashield/DAPI (1.5mg/ml) (Vector™) and photographed with an Olympus BX50 epifluorescence microscope coupled to an Olympus DP73 digital camera, using cellSens software (Olympus™). The DNA methylation patterns in the metaphase chromosomes were evaluated through binding analysis of the monoclonal antibody to 5- methylcytosine. Indirect immunodetection of the methylated DNA was conducted according to Marques et al. (2011). The slides were treated with 20 mg/ml RNAse (Invitrogen™) diluted 1:200 in 2XSSC for one hour, followed by exposure to 1mg/ml pepsin (1:100) in 0.01 N HCl (100μl per slide) for 20 minutes. Hereafter denatured in 70% formamide for 3 min at 75°C and blocked with 3% BSA diluted in 1X PBS with 0.1% Tween 20, for 30 minutes at 37 ºC and incubated with the mouse-anti-5-methylcytosine primary antibody (Eurogentec™) in 1% BSA/1X PBS (1:100) overnight at 4 ºC. The 5mC was detected using anti-mouse-FITC diluted (1:200) in 1% BSA/1X PBS for 1 hour at 37 ºC. Finally, the slides were washed in 1X PBS, mounted with DAPI/Vectashield antifading (Vector Laboratories™) and analyzed by fluorescence microscopy under a Leica DMBL photomicroscope (©Leica Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 78 Microsystems) equipped with a CCD Cohu camera (CohuHD Costar™), using QFISH software. Composition of the image with the hybridization signals was done with Photoshop CS5 (Adobe™) software. The chromosomes were categorized as metacentric (m), submetacentric (sm), subtelocentric (st) and acrocentric (a), using the arms ratio proposed by Levan et al. (1964) and presented in descending order of size according to these categories. A single ideogram for both species was performed in order to highlight the repetitive sequences and the methylation patterns identified by 5mC. Results Bodianus pulchellus and B. insularis have 2n=48 and identical karyotypes, composed by 4m+12sm+14st+18a (NF=78). As previously described for these species (Molina et al., 2012), the 10th subtelocentric pair exhibits an extensive decondensed terminal region that can reach up to four times the size of the largest chromosome pair (Figures 1 and 2). Such particular region, present in both species, is herein referred to as BOD in a reference to the Bodianus genus. Ag-NOR sites are located in the terminal region of the pair No. 9 in both species (Figure 1a, b). These sites and the BOD region are also argentophilic (Figures 1a and b; highlighted), according to previous descriptions (Molina et al., 2012). Double-FISH with 5S and 18S rDNA probes revealed a non- syntenic location for these ribosomal genes. The 18S rDNA sites are exclusively located in the terminal regions on the short arms of the pair No. 9, coinciding with the Ag-NOR markings. No hybridization signals were detected in the BOD regions of both species (Figures 1a and b). On the other hand, 5S rRNA genes are located in the terminal regions on the long arms of the pair No. 16 in both species, and an extra pericentromeric site on the short arms of the pair No. 19, exclusively in B. insularis (Figures 1a and b). The hybridization with the transposable element Alu was only performed in B. insularis, while Tol2 mapping was performed in both of them. These sequences exhibited a similar distribution pattern in the chromosomes Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 79 preferentially located in the terminal regions of the chromosomes and particularly accumulated in the BOD one (Figures 7c, d and e; highlighted). Figure 9. Metaphase chromosomes of the species B. insularis (a, c, e) and B. pulchellus (b, d); the chromosome pairs bearing the BOD region are identified with asterisks and highlighted in the boxes. (a, b) - 18S (red signals) and 5S rDNA FISH (green signals). In the boxes, the argentophilic pattern showed in the BOD regions and the DAPI staining pattern, respectively. (c, d) - Distribution of the Tol2 element in the chromosomes. An accumulation of Tol2 sequences is perceptible in the BOD regions. (e) - Distribution of the Alu transposable element on the chromosomes of B. insularis. Bar = 5μm. Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 80 The hybridization signals with (TTAGGG)n probes were variable, with the majority having the same size, besides some chromosomes showing no detectable signals (data not shown). Immunostaining with 5mC revealed that most metaphase chromosomes of the two species are hypermethylated (Figures, 2b and d). By contrast, the BOD regions are markedly hypomethylated, as well as the centromeric regions of the majority of chromosomal pairs (Figure 8). Figure 10. Metaphase chromosomes of the species Bodianus pulchellus (a, b) and Bodianus insularis (c, d) under DAPI staining (left) and sequential immunodetection of methylated sites with the monoclonal antibody 5mC (right). The chromosome pairs bearing the BOD region are identified with asterisks and highlighted in the boxes. Bar = 5μm. Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 81 All results were summarized in the karyogram of the figure 3 below. Discussion Structural chromosome characteristics of Bodianus species The heterochromatic regions of fish karyotypes have been the target of intense investigation. Although displaying variations in the amount and distribution on chromosomes, heterochromatin can harbor a diversified panel of collocated sequences, whereby the effects of this interaction under gene regulation and dispersion pattern need to be better investigated (Costa et al., 2015). Functional biases could derive from the joint distribution of multigene families, or from their association with other repetitive sequences, constituting adaptive aspects and implying maintenance and dispersion in the chromosomes (Costa et al., 2016). Argentophilic decondensed regions in vertebrates are often related to NOR sites (Árnason, 1981; Schmid et al., 1982; Birstein, 1984; Supanuam et Figure 11. Idiogram illustrating repetitive sequence distribution and the methylation pattern in the metaphase chromosomes of B. insularis and B. pulchellus, a dashed line highlights the decondensed BOD region. Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 82 al., 2012). Previous cytogenetic studies identified an intriguing chromosomal region on homeologous pairs in B. pulchellus, B. insularis and B. rufus (Molina et al., 2012). Such region, now identified as BOD one, exhibit a high decondensed structure and a heterochromatic, GC-neutral and argentophilic constitution, but that does not exhibit any hybridization signals with 18S rDNA probes. The sharing of this particular set of constitutive and functional characteristics indicates that the origin of the BOD region precedes the phyletic diversification of those species (Molina et al., 2012), representing a very favorable sui generis condition for the study of the complexity of repetitive DNA arrangements in fishes. In several vertebrate species, including fishes, argentophilic marks not associated with rDNA sites, known as pseudo-NORs, were already described (Ozouf-Costaz et al., 1996; Pisano et al., 2000; Caputo et al., 2002; Dobigny et al., 2002; Gromicho et al., 2005; Cabrero & Camacho, 2008). Structurally, the BOD regions have similarities with pseudo-NORs that are tandem arrays of a heterologous DNA sequence. In some species, the pseudo-NORs do not exhibit promoter sequences and have high affinity for the upstream binding factor (UBF), a DNA binding protein and component of the Pol I transcription machinery which binds extensively across the rDNA repeat in vivo (Prieto & McStay, 2008). The formation of pseudo-NORs is associated to a special class of multigene families, like histones and ribosomal genes, from both protein- and non-protein-coding with capacity of translocation known as orphons (Childs et al., 1981, Cabrero & Camacho, 2008). Pseudo-NORs used to mimic real NORs in several aspects, as they can remain decondensed during mitosis when the transcription is inactivated and the nucleolus is broken down, forming novel silver positive secondary constrictions (Mais et al., 2005). UBF can displace histone H1 from histone octamers in vitro (Kermekchiev et al. 1997), thereby promoting the chromatin decompaction. Additionally, Ag-positive loci can be the result of the presence of residual acidic proteins with affinity for silver, reacting with this compound (Dobigny et al., 2002). In fact, pseudo-NORs are reactive to silver staining despite their transcriptional silence (Mais et al., 2005). The typical decondensation observed in secondary constrictions should be promoted by Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 83 the action of binding argyrophilic proteins that prevent the full condensation of that region (Prieto & McStay, 2008). These elements could explain the argentophilic and decondensed nature of the chromatin present in the BOD region. Bodianus displays karyotypes with a larger number of biarmed chromosomes when compared to other Labridae genera (Sena & Molina, 2007). This is a synapomorphic condition and indicates intense structural chromosome reorganization in this clade. However, several common characteristics, such as the presence of a single 18S rDNA site and the BOD region, could indicate a lower level of diversification among the youngest branches of this group. In fact, the presence of a single chromosome pair bearing 18S rDNA sites represent the most frequent condition found in fishes (Gornung, 2013) and several perciform groups (Motta-Neto et al., 2012; Costa et al., 2016). On the other hand, 5S rDNA sites present a more diversified distribution, being present on a single chromosome pair in B. pulchellus but on two pairs in B. insularis. The phyletic monitoring of ribosomal genes in chromosomes makes it possible to identify the sequential patterns of change or synteny maintenance over time, especially in conserved karyotypes, such as in Bodianus (Affonso et al., 2014; Fernandes et al., 2015; Costa et al., 2016). In some fish species, a high chromosome dynamism has been identified for Tol2 elements, which can be stored in different genomic regions (Koga & Hori, 1999), or be preferentially concentrated and collocated with 18S rDNA sites (Costa et al., 2013). Therefore, the presence of structural and functional characteristics of the BOD region, typical of pseudo-NORs, may indicate that these regions were originally repositories of rDNA. Indeed, Alu and Tol2 elements exhibit a remarkable accumulation in the BOD regions. Transposable elements are transposed by a cut-and-paste mechanism, involving their excision and insertion elsewhere in the chromatin. Additionally, the spreading of transposons can be concatenated with the capacity of the orphons translocation through the genome via dispersion and magnification of minor loci consisting of a few rDNA copies (Dubcovsky & Dvorak, 1995) as observed in Aegilops speltoides (Raskina et al., 2004). If the excision process of transposons is excessive, it may affect the function of a particular gene, Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 84 making it functionally unstable, requiring only that the transposon insertion occurs within or very close to the gene (Lippman et al., 2004), as observed in this study. Alu elements concentrates huge amounts of CpG islands that are genomic regions that contain a high frequency of CpG dinucleotides, commonly representing promoters, which are usually located in GC dense regions. CpG islands tend to be hypomethylated allowing an open chromatin organization and facilitating neighboring gene expression (Jones & Baylin, 2002; Gu et al., 2016). On the other hand, Alu sequences are punctuated by multiple CpG domains, many of which overlapping with known protein binding sites (Rowold & Herrera, 2000), possibly the same aforementioned argyrophilic binding proteins which keep the chromatin decondensed and consequently opened. Thus, the marked occurrence of Alu and Tol2 elements in the BOD regions could have significantly interfered in the ribosomal gene functionality, causing a pseudogenization process. Differential methylation in Bodianus metaphase chromosomes Despite the fact that a significant part of the genome of some organisms is composed of repetitive DNA sequences, their origins, dispersion and functional interaction remain largely unknown (Biemont & Vieira, 2006). In this context, methylation patterns help us understand the functional aspects of the genome. DNA methylation is an important epigenetic modification in the genome of vertebrates, where only small fractions of it are hypomethylated (Nakamura et al., 2014). An overview of methylation in the vertebrate genome indicates that more basal groups such as fish and amphibians have higher methylation levels than reptiles, mammals and birds and is inversely related to body temperature (Vanyushin et al., 1973; Jabbari et al., 1997; Varriale & Bernardi, 2006 a, b). Despite the occurrence of chromosomal rearrangements associated with DNA methylation, this process may suppress homologous recombination, enabling genomes rich in repeats to remain relatively stable (Colot & Rosignol, 1999). The immunolocalization of 5-methylcytosine in the metaphase chromosomes of the two Bodianus species revealed a primarily Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 85 hypermethylated pattern, despite the striking contrast observed in the BOD and the centromeric regions, both notably hypomethylated. In general, centromeric regions exhibit particular epigenetic characteristics, including DNA hypermethylation. The presence of hypomethylated regions in the centromeres of some chromosome pairs of the Bodianus species demonstrates an uncommon and likely functional condition of these regions, which are closely associated with the chromosome segregation process. DNA methylation is considered a controlling mechanism of gene expression, including the ribosomal ones (Ferraro & Lavia, 1983; Ferraro & Prantera 1988). Indeed, there is an inverse correlation between DNA methylation and the transcriptional activity of several eukaryotic genes (Kanungo, 1994), as well as nucleolar size and the number of rDNA loci sites (Bacali et al., 2014). In mammals, there is a strong relation between states of DNA methylation and gene silencing (Eden et al., 1994). Genes with methylated promoters are not generally expressed (Antequera et al., 1990). On the other hand, in invertebrates, the origins and meaning of methylation patterns are uncertain and showing, in some cases, the absence of a correlation between methylation and gene expression. Undoubtedly, the methylated genes of several invertebrates are transcribed, while their non- methylated counterparts may be silenced (Tweedie et al., 1997). In more basal fish groups, GC-rich heterochromatins, which are frequently related to NOR regions (Gornung, 2013), are highly methylated in the germ line, but to a lesser degree in somatic chromosomes (Covelo-Soto et al., 2014). The hypomethylation patterns of repetitive and ribosomal DNA classes can lead to chromatin decondensation (Carvalho et al., 2000; Jones & Baylin, 2002), as demonstrated here for the BOD regions. In some Perciformes species, Tol2 elements are distributed along the chromosomes and markedly associated with 18S rDNA sequences (Costa et al., 2013). In Bodianus, both the accumulation of these transposons in the BOD regions as well their hypomethylated nature, are notable. It has been reported that the methylation process plays a protective role against invasive DNAs or transposable elements (Yoder et al., 1997; Doerfler, 1991) and is a key mechanism in gene regulation and expression (Finnegan et al., 1998; Heslop-Harrison, 2000; Attwood et al., 2002). Indeed, the transposable Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 86 sequences in the human genome are highly methylated (Kricker et al., 1992). Fishes have shown hypermethylated regions confined to constitutive heterochromatin, particularly in heteromorphic sex chromosomes, demonstrating that several hypermethylated regions are co-localized with repetitive elements (Schmid et al., 2016). It is known that DNA methylation may limit the dispersion of various transposable elements in a number of genomes (Scortecci et al., 1997; Miura et al., 2001; Iida et al., 2006). However, this fact does not occur in the BOD regions! If methylation inhibits the dispersion of transposable elements, why is the BOD region, extremely rich in Alu and Tol2 elements and not methylated? The answer may be related to the following considerations: (1) Alu elements appear to be preferentially located in GC-rich genomic isochores (Deininger, 2006), explaining the accumulation of this transposable element in the 18S rDNA sites; (2) CpG islands, strongly present in Alu elements, are hypomethylated as a response to an overlapping between the CpG domains and the argyrophilic proteins binding sites, which prevent the full condensation of the heterochromatin through the displacement of the histone H1 from the histone octamers. This way, the open and decondensed heterochromatin may offer favorable conditions for the accumulation of the Tol2 retrotransposon in such region; (3) the epigenetic action promoted by the excessive excision of transposons inserted within or very close to the gene in the BOD region, affects its function and makes it functionally unstable. Therefore, novel NORs are formed in other chromosomal locations by the transposons spreading, associated with the translocation of orphons and the magnification of minor rDNA loci. Evidence suggests that in some fish species, such as Oryzias latipes, the Tol2 element, underwent a rapid expansion in the past, but acquired interactive control mechanisms (Iida et al., 2006). Therefore, in the same way compensatory evolutionary mechanisms may have been fixed in the Bodianus BOD region, thereby controlling the activity and dispersion of Tol2 and Alu elements. The delimitation of a preferential reservoir for these transposable elements in the BOD region would therefore constitute effective protection for genes allocated to the other chromosomes of the karyotype. Capítulo II – Hipometilação diferencial de sequencias ricas em Tol2/Alu em Bodianus 87 Conclusion DNA methylation is one of the epigenetic processes that has modulated the molecular evolution of life, but its influence in karyotype evolution and interaction in the structural chromosome regions are little known, especially for fish species. The use of monoclonal antibodies in Bodianus species provided an overview of the methylation pattern of metaphase chromosomes, with sufficient resolution to characterize the peculiar BOD regions. The complex composition of the BOD chromatin suggests that it is a pseudo-NOR containing a relict sequence of an ancestor rDNA. The DNA organization of such region provided evidence of its functional dynamics, possibly in the transcriptional control of Tol2 and Alu elements. In this sense, the methylation process, associated with the dispersion control of the transposable elements, may have played a particular active role in the evolutionary process of Bodianus species. References Affonso, P.R.A.M., Fernandes, M.A., Almeida, J.S., Molina, W.F. (2014). Sequential steps of chromosomal differentiation in Atlantic surgeonfishes: Evolutionary inferences. Sci. World J. ID 825703. doi: 10.1155/2014/825703 Almeida, L.A.H., Nunes, L.A., Bitencourt, J.A., Molina, W.F., Affonso, P.R.A.M. (2017). Chromosomal evolution and cytotaxonomy in wrasses (Perciformes; Labridae). J. Hered. 108, 239–253. Almeida, A., Kokalj-Vokac, N., Lefrançois, D., Viegas-Péquignot, E., Jeanpierre, M., Dutrillaux, B., Malfoy, B. (1993). Hypomethylation of classical satellite DNA and chromosome instability in lymphoblastoid cell lines. Hum. 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Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 93 6.3 Capítulo III Marcadores mitocondriais e nucleares de DNA apontam a espécie endêmica Bodianus insularis Gomon & Lubbock, 1980 como uma sinonímia de Bodianus pulchellus (Poey, 1860) (Labridae) Clóvis Coutinho da Motta Neto1*, Oscar Akio Shibatta, Ricardo de Souza Rosa, Allyson Santos de Souza1, Wagner Franco Molina1 1Centro de Biociências, Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do NorteNatal, Brasil 2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Paulo, Brasil 3 Departamento de Biologia Molecular e Estrutral, Universidade Estadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa, Paraná, Brasil *Autor correspondente: Clóvis C. Motta-Neto - Departmento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. E-mail: mottaneto.cc@gmail.com Resumo Avanços recentes têm ampliado o conhecimento das relações filogenéticas e a controversa taxonomia do gênero Bodianus. Contudo, entre suas 43 espécies, algumas ainda não foram geneticamente validadas. Bodianus possui particular interesse ecológico por suas interações tróficas com o ambiente recifal. Traços fenotípicos na forma do corpo e na coloração, inclusive ao longo desenvolvimento ontogenético, além de reversão sexual recorrente neste gênero, tornam sua taxonomia desafiadora. No oceano Atlântico foram descritas cinco espécies, B. scrofa, B. speciosus (Atlântico Oriental), B. rufus (Atlântico Ocidental), B. pulchellus (Atlântico Ocidental e ilhas do Atlântico Oriental) e B. insularis (Meso-Atlântico). Esta última, com distribuição restrita, é considerada endêmica do arquipélago de São Pedro e São Paulo, Ascensão e Santa Helena, ambientes insulares da região Meso- Atlântica. Dados moleculares, utilizando genes mitocondriais (COI e 16S rRNA) e nuclear (Rodopsina), foram empregados para testar a validade taxonômica de B. insularis e estabelecer suas relações filogenéticas. Entre as espécies do Atlântico, B. pulchellus e B. insularis mostram-se indiferenciadas, exibindo diferenças genéticas mínimas (0,1%) e se agrupam com B. rufus, formando um clado irmão com B. speciosus, enquanto B. scrofa é mais relacionada às espécies do Pacífico. O peculiar padrão de coloração de B. insularis, aliado a uma marcada similaridade morfológica e elevado nível de identidade genética com B. pulchellus, indica que B. insularis é um sinônimo, atribuído a um enclave populacional diferenciado de B. pulchellus. Palavras-chave: Labriformes, Hypsigenyini, taxonomia, espécies insulares, sinonímia. Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 94 Abstract Recent advances have enlarged the knowledge of phylogenetic relationships and the controversial taxonomy of the genus Bodianus. Nevertheless, among its 43 species, some have not been genetically validated yet. Bodianus has particular ecological interest because of the trophic interactions that it develops with the reef environment. Phenotypic traces in body shape and coloration, including along ontogenetic development, besides the sexual reversion recurrent in this genus, make its taxonomy challenging. In the Atlantic Ocean five species were described: B. scrofa, B. speciosus (Eastern Atlantic), B. rufus (Western Atlantic), B. pulchellus (Western Atlantic and East Atlantic islands) and B. insularis (Meso-Atlantic). The latter, with restricted distribution, is considered endemic of the St. Peter and St Paul archipelago, Ascension and St. Helena, island environments of the Meso-Atlantic region. Molecular data, using mitochondrial genes (COI and 16S rRNA) and nuclear (Rhodopsin), were used to test the taxonomic validity of B. insularis and establish their phylogenetic relations. Among the Atlantic species, B. pulchellus and B. insularis are undifferentiated, exhibiting minimal genetic differences (0.1%) and are grouped with B. rufus, forming a sister clade with B. speciosus, while B. scrofa is more related to Pacific species. The peculiar color pattern of B. insularis, associated with a marked morphological similarity and high level of genetic identity with B. pulchellus, indicates that B. insularis is a synonym, attributed to a distinct population enclave of B. pulchellus. Keywords: Labriformes, Hypsigenyini, taxonomy, insular species, synonymy Introdução Análises genéticas têm se transformado progressivamente em ferramentas complementares importantes para uma melhor definição taxonômica de peixes marinhos, possibilitando a discriminação de espécies crípticas, como também reavaliar e revalidar espécies previamente descritas (Byrkjedal et al., 2006; Lara et al., 2010; Baldwin et al., 2011; Trivedi et al., 2015; Uiblein & Gouws, 2015). Labridae (wrasses) é um dos grupos de peixes mais diversificados quanto aos padrões morfológicos, ecológicos e estratégias evolutivas (Westneat & Alfaro, 2005; Cowman et al., 2009). Um grande número de novas descrições ocorreu neste grupo nas últimas décadas principalmente para os gêneros Halichoeres e Xyrichtys (Randall, 1999a; Randall 1999b; Randall & Cornish, 2000; Rocha, 2004). Tamanha diversidade de espécies é acompanhada por dificuldades taxonômicas, fomentando a reavaliação e a reordenação de várias espécies dessa família (Parenti & Randall, 2011). Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 95 Muitos grupos de Labridae possuem padrões de coloração diversificados, que podem variar enormemente em uma mesma espécie (Rocha, 2004; Arnal et al., 2006; Choat et al., 2012). Além de variações populacionais, essas transições decorrem naturalmente de mudanças ontogenéticas ou de processos de reversão sexual (Marshall et al., 2003). Diante destas particularidades, os padrões de colorido nos wrasses, frequentemente úteis como caráter taxonômico, podem se mostrar muito variáveis (Rocha, 2004). Na família Labridae, o gênero Bodianus Bloch, 1790 (Hypsigenyini) possui 43 espécies reconhecidas (Gomon, 2006). Contudo, identificações taxonômicas e relações filogenéticas neste gênero ainda requerem revisões e só recentemente tem sido complementada por informações moleculares (Santini et al., 2016). Bodianus insularis Gomon & Lubbock, 1980 é uma das cinco espécies nominais reconhecidas no Atlântico. Ela habita as águas no entorno das ilhas de São Pedro e São Paulo, Santa Helena e Ascensão, regiões Meso- Atlânticas (Gomon, 2006). Possui reduzida informação biológica e ainda não foi alvo de estudos genéticos que confirmassem seu status taxonômico. Com vistas a veirificar a validação de Bodianus insularis como unidade taxonômica operacional e verificar suas relações filogenéticas com outras espécies Atlânticas, sobretudo com as espécies filogeneticamente mais próximas, B. rufus (Linnaeus, 1758) e B. pulchellus (Poey, 1860), foram realizadas análises das sequências dos genes mitocondriais 16S rRNA, citocromo oxidase subunidade 1 (COI) e do gene nuclear rodopsina (Rhod). Material e Métodos Coleta de espécimes Espécimes de Bodianus rufus, B. pulchellus e B. insularis (Figura 12), examinados como material comparativo, foram capturados através de mergulho livre. As análises genéticas e identificações taxonômicas das espécies foram realizadas com indivíduos de Bodianus rufus (n=4) e de B. pulchellus (n=3) coletados nos litorais de Salvador, Bahia (12º58’20,0”S, 38º30’05,09”O) e Vitória, Espírito Santo (20º17'34,26"S, 40º17'42,09"O), além Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 96 de B. insularis (n=2), coletados no Arquipélago São Pedro e São Paulo (0°55'N, 29°20'O) (Figura 5). Fragmentos de músculos e fígado de cada indivíduo foram removidos e estocados em microtubos (1.5ml) com etanol absoluto e armazenados à -20 ºC. Identificação taxonômica A identificação taxonômica das espécies B. rufus, B. pulchellus e da putativa espécie B. insularis (Figura 12) baseou-se em caracteres morfológicos (Tabela 1), de acordo com Gomon (2006). Os vouchers das espécies foram fixados em formaldeído 10%, preservados em etanol 70% e depositados no Museu de Zoologia da Universidade Estadual de Londrina (MZUEL). Figura 12. Espécimes de a) Bodianus rufus, b) B. pulchellus e c) B. insularis (adulto final). Barra de escala = 2 cm. a) b) c) Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 97 Espécie Espinnhas Raios nadadeira dorsal (Seg.) Raios totais Raios nadadeira anal (Seg.) Raios nadadeira caudal Raios nadadeira peitoral (Ram.) Escamas linha lateral Escamas acima linha lateral Escamas abaixo linha lateral Escamas pré- dorsais Arcos branquiais totais Dorsal Ventral B. rufus 12 10 22 12(11) 9-11 7-11 14 (13,15) 31 4 1/2-51/2 12-14 17-22 16-20 B. pulchellus 12 10 22 12 9-11 10-11 14(13) 31(32) 5-6 111/2-131/2 16-20 14-17 B. insularis 12 10 22 12(11) 10-11 10-11 14(15) 31(32) 5 1/2-61/2 13-16 19-25 15-17 B. scrofa 12 10 22-23 12(13) 9-10 9 15(16) 44-48 6-7 1/2 16-20 19-26 17-18 B. speciosus 12(13) 10 22(23) 12 10-11 9-11 15(14-16) 31(30-32) 5 1/2-61/2 11-141/2 11-16 14-17 Tabela 2. Caracteres merísticos das espécies de Bodianus do Atlântico, com ocorrência de padrões segmentados (Seg.) e ramificados (Ram.) (baseados em Gomon, 2006). Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 98 Extração, amplificação e sequenciamento de DNA Para a realização das análises moleculares foram utilizados 2 indivíduos de cada uma das espécies B. rufus, B. pulchellus e B. insularis. O DNA genômico foi extraído do tecido muscular e fígado, de acordo com Sambrook et al. (1989). Sequências parciais dos genes mitocondriais 16S e COI e do gene nuclear Rodopsina (Rhod) foram amplificados por PCR, utilizando primers e condições pré-estabelecidas na literatura (Tabela 3). Para efeito de comparação foram incorporadas sequências dos genes 16S, COI e Rhod de outras espécies Atlântico e Pacífico, obtidas no Genbank (Tabela 4). As reações de amplificação foram preparadas para um volume final de 25µl contendo 1,0µl de DNA total (50ng/µl), 3,0 U de Taq polimerase, 1,0µl de MgCl2 a 50 mM, 1,0µl de buffer 10x, 1,0µl de dNTP a 10mM, 1,0µl de primer (10µM) e água ultrapura para completar o volume final da reação. Os perfis térmicos para a PCR foram 95 ºC por 5 min, 35 ciclos (95 ºC, por 30s e temperatura de anelamento específico, 72 ºC por 45s) com o alongamento final de 72 ºC, por 7 min. Os produtos de PCR (5µl) foram purificados com exonuclease I (3,3U/reação) e fosfatase alcalina de camarão (0,66U/reação) (GE Healthcare), submetendo as amostras a 37 ºC por 30 min e posteriormente a 80 ºC por 15 min. As amostras foram sequenciadas em um ABI-PRISM 3500 Genetic Analyzer automatic DNA sequencer (Applied Biosystems). Gene Primers Tm oC Referências 16S L1987 (5’- GCC TCG CCT GTT TAC CAA AAA C - 3’) H2609 (5’- CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T - 3’) 52 Palumbi et al., 1991 COI FishF2 (5’- TCG ACT AAT CAT AAA GAT ATC GGC AC - 3’) FishR2 (5’- ACT TCA GGG TGA CCG AAG AAT CAG AA - 3’; 50 Ward et al., 2005 Rhod F2w (5' – AGC AAC TTC CGC TTC GGT GAG AA – 3’) R4n (5' – GGA ACT GCT TGT TCA TGC AGA TGT AGA T – 3’) 60 Jiménez et al., 2007 Análise das Sequências Tabela 3. Primers utilizados para a amplificação das sequências de genes mitocondriais e nuclear nas espécies de Bodianus. Tm = temperatura de anelamento. Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 99 As sequências dos genes mitocondriais 16S e COI e do gene nuclear Rodopsina foram conferidas através do BioEdit (Hall, 1999) e alinhadas usando MUSCLE (Edgar, 2004). As sequências de cada indivíduo foram concatenadas, formando uma única sequência de nucleotídeos e analisadas comparativamente com outras espécies ou populações de Bodianus obtidas no Genbank (Tabela 4). Sítios com gaps foram considerados nas análises. A média das taxas de divergência genética (p-distances) e a árvore de máxima verossimilhança foram obtidas com MEGA 6 (Tamura et al., 2013). Todas as sequências geradas neste estudo foram depositadas no Genbank (Tabela 4). O melhor modelo evolutivo para as sequências foi determinado pelo jModelTest2 (Darriba et al., 2012), através do critério de informação de Akaike (Akaike, 1973). Diapterus auratus e Eugerres plumierii (Gerreidae), que compõem um clado próximo a Labridae (Near et al., 2013), foram utilizadas como outgroups. O número de sítios polimórficos nas sequências foi estimado utilizando-se o DnaSP (Librado and Rozas, 2009), enquanto que as taxas de divergência média (distâncias-p) e o número médio de diferenças nucleotídicas intra e interespecíficos foram estabelecidos através do MEGA 6 (Tamura et al., 2013). Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 100 Species 16S COI Rhodopsin Bodianus insularis MF075246 MF075247 MF075236 MF075236 MF075238 MF075239 Bodianus rufus MF075244 MF075245 MF075232 MF075233 MF075240 MF075241 Bodianus rufus AY850866 JQ840770 - Bodianus pulchellus MF075248 MF075249 MF075234 MF075235 MF075242 MF075243 Bodianus pulchellus - FJ582902 - Bodianus mesothorax AY279681 KM224695 KP881292 Bodianus axillaris JF457253 GU805092 - Bodianus perditio JF457259 DQ884974 - Bodianus dictynna - KC684982 - Bodianus scrofa GQ341586 AF517582 DQ197833 Bodianus speciosus GQ341587 KY815370 - Diapterus auratus DQ027926 JQ841868 EF095622 Eugerres plumieri JQ740949 GU225265 EF095623 Resultados Caracteres morfológicos e de coloração Bodianus rufus, B. pulchellus e B. insularis exibem significativa similaridade morfológica. Vários caracteres morfológicos apresentam considerável grau de sobreposição, entre os quais, o número de raios da nadadeira caudal, de escamas pré-dorsais, escamas acima e abaixo da linha lateral e número de rastros branquiais (Gomon, 2006) (Tabela 2). Por outro lado, as espécies apresentam padrões de coloração significativamente distintivos. Em B. rufus (Figura 12a), os indivíduos adultos, em fase inicial do desenvolvimento, exibem uma coloração predominantemente amarelada abrangendo a mandíbula, a porção final da nadadeira dorsal e as nadadeiras caudal, anal, pélvica e peitoral. A região ântero-dorsal possui uma coloração púrpura-azulada se estendendo do focinho até próximo a porção terminal da nadadeira dorsal, elevando-se acima da linha lateral. Tabela 4. Números de acesso no Genbank das sequências de Bodianus analisadas. Negrito: sequências geradas no presente estudo. Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 101 Em B. pulchellus (Figura 12b), os indivíduos na fase adulta apresentam uma mancha amarelada na porção posterior da nadadeira dorsal estendendo-se por mais da metade da caudal e englobando o pedúnculo. Essa mancha é delimitada por faixas azuladas nas regiões basal e terminal e de coloração predominantemente avermelhada. O corpo apresenta-se avermelhado ântero-dorsalmente assim como as nadadeiras dorsal, anal, caudal (extremidade inferior) e pélvica. Com coloração menos conspícua em relação a B. pulchellus, os indivíduos adultos de B. insularis (Figura 12c) têm uma coloração corporal predominante avermelhada em todo o corpo, com tons cinza-escuros na cabeça e na porção distal das margens das escamas. Os últimos segmentos da nadadeira dorsal são amarelados assim como a porção intermediária da nadadeira caudal e os raios da nadadeira peitoral. Diversidade genética Após a obtenção de sequências parciais dos genes 16S (571 pares de base - pb), COI (449 bp) e rodopsina (417 bp), totalizando 1.437 bp. As análises comparativas indicaram que B. insularis possui 3.1% de divergência genética em relação à B. rufus e 0.1% em relação à B. pulchellus. Dentre as três espécies analisadas do subgênero Bodianus, B. insularis revelou uma maior diferença intraespecífica (0.3%), enquanto valores menores foram obtidos para B. rufus (até 0.1%) e B. pulchellus (0.0%). Comparações entre os perfis genéticos das espécies do Pacífico e do Atlântico apresentaram diferenças genéticas mais elevadas, variando entre 8.0 e 17.1%, em média, maiores do que as identificadas entre as espécies do Atlântico (Tabela 5), que, no entanto, apresentam diferenças mais conspícuas (0.1 a 16.3%). As sequências concatenadas dos genes 16S, COI e Rhod indicaram um número médio 46 diferenças nucleotídicas entre B. insularis e B. rufus, mas apenas duas em relação à B. pulchellus. Quatro sítios polimórficos são encontrados entre as sequências de B. insularis e B. pulchellus. A sequência do gene Rodopsina é similar entre B. rufus e B. insularis / B. pulchellus, embora possa ocorrer uma possível variação alélica C e T na posição 96 (Tabelas 6 e 7). Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 102 A árvore de Máxima Verossimilhança em geral apresenta clados diferenciados entre as espécies do Atlântico e Pacífico, exceto por B. scrofa que é filogeneticamente mais relacionada ao clado do Pacífico (Figura 13). O clado Atlântico é dividido em dois agrupamentos com alto suporte de bootstrap. Um deles é formado por B. rufus, enquanto que o outro agrupa B. pulchellus e B. insularis (Figura 13), refletindo a similaridade genética entre os indivíduos dessas duas espécies nominais (Tabela 5). Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 103 Species 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1. B. insularis1 - 0,001 0,001 0,001 0,002 0,005 0,005 0,007 0,008 0,011 0,016 0,008 0,010 0,009 0,009 2. B. insularis2 0,003 - 0,001 0,001 0,002 0,005 0,005 0,007 0,008 0,011 0,016 0,008 0,010 0,009 0,009 3. B. pulchellus1 0,001 0,001 - 0,000 0,000 0,005 0,005 0,007 0,008 0,011 0,016 0,008 0,010 0,009 0,009 4. B. pulchellus2 0,001 0,001 0,000 - 0,000 0,005 0,005 0,007 0,008 0,011 0,016 0,008 0,010 0,009 0,009 5. B. pulchellus 0,002 0,002 0,000 0,000 - 0,012 0,012 0,012 0,017 0,018 0,016 0,017 0,016 0,018 0,017 6. B. rufus1 0,031 0,033 0,032 0,032 0,067 - 0,000 0,001 0,008 0,010 0,015 0,008 0,010 0,009 0,010 7. B. rufus2 0,031 0,033 0,032 0,032 0,067 0,000 - 0,001 0,008 0,010 0,015 0,008 0,010 0,009 0,010 8. B. rufus 0,041 0,045 0,043 0,043 0,067 0,001 0,001 - 0,010 0,010 0,015 0,011 0,010 0,011 0,011 9. B. mesothorax 0,090 0,089 0,088 0,088 0,154 0,081 0,081 0,097 - 0,008 0,013 0,007 0,010 0,009 0,010 10. B. axillaris 0,126 0,127 0,126 0,126 0,171 0,116 0,116 0,117 0,077 - 0,015 0,010 0,010 0,012 0,012 11. B. dictynna 0,158 0,156 0,156 0,156 0,156 0,143 0,143 0,143 0,109 0,134 - 0,016 0,016 0,016 0,018 12. B. scrofa 0,102 0,102 0,101 0,101 0,163 0,098 0,098 0,125 0,077 0,110 0,143 - 0,010 0,009 0,010 13. B. speciosus 0,110 0,111 0,110 0,110 0,138 0,108 0,108 0,108 0,098 0,120 0,154 0,103 - 0,011 0,011 14. Diapterus auratus 0,151 0,152 0,153 0,153 0,220 0,146 0,146 0,163 0,142 0,165 0,200 0,146 0,159 - 0,007 15. Eugerres plumieri 0,142 0,143 0,143 0,143 0,190 0,137 0,137 0,149 0,140 0,156 0,199 0,151 0,159 0,085 - Tabela 5. Distâncias de pareamento (p-distance) (diagonal inferior) e erros padrões (diagonal superior) das espécies de Bodianus baseadas nas sequências parciais de DNAr 16S, COI e Rodopsina. Distâncias de pareamento (p-distance) (diagonal inferior) e erro padrão (diagonal superior). Negrito: sequências geradas no presente estudo. Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 104 Species B. insularis B. pulchellus B. rufus B. insularis (n=2) - 2 ± 0,900 46 ± 6,700 B. pulchellus (n=2) 0,001 ± 0,001 - 46 ± 6,800 B. rufus (n=2) 0,032 ± 0.005 0,032 ± 0,005 - Genes 16S COI Rhod Posições das Mutações 350 381 405 87 96 183 286 B. insularis 1 T G C C C T A B. insularis 2 C A T C C T T B. pulchellus 1 T G T C C T T B. pulchellus 2 T G T C C T T B. rufus 1 T G C T Y C G B. rufus 2 T G C T Y C G Atlântico Pacífico Tabela 7. Diferenças nucleotídicas das sequências dos genes 16S, COI e Rodopsina entre as espécies Bodianus insularis, B. pulchellus e B. rufus. Em negrito estão destacados sítios polimórficos entre B. insularis e B. pulchellus. Figura 13. Árvore de máxima verossimilhança baseada na combinação de sequências de DNAr 16S, COI e Rodopsina das espécies de Bodianus. Análises baseadas no modelo evolucionário GTR+G+I com 1000 réplicas de bootstrap. Números nos ramos indicam a porcentagem de bootstrap. Na caixa o agrupamento formado por indivíduos de B. pulchellus e B. insularis e em negrito as sequências geradas no presente estudo. *Outgroups. Tabela 6. Média interespecífca das distâncias de pareamento (p-distance) (diagonal inferior) e diferenças nucleotídicas (diagonal supeior) com seus respectivos erros padrões baseados nas sequencias parciais dos genes de DNAr 16S, COI e Rodopsina. Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 105 Discussão Biogeografia, aspectos morfológicos e merísticos de Bodianus do Atlântico O gênero Bodianus teve sua origem em áreas do Indo-Pacífico Ocidental e Pacífico Sul-Ocidental, onde ocorre o maior número de espécies, há cerca de 20 M.a., posteriormente sofreu um complexo processo de distribuição geográfica, no Índico e outras áreas do Pacífico, com pelo menos dois eventos de invasão do Atlântico Oriental e Ocidental (Santini et al., 2016). Bodianus é parafilético, uma vez que deveria incluir os gêneros Clepticus e Semicossyphus (Santini et al., 2016). Dentre as espécies do Atlântico, B. speciosus e B. scrofa apresentam relação distantes com B. rufus e B. pulchellus. Estas duas últimas espécies, filogeneticamente mais próximas, apresentam as distribuições geográficas mais extensas no Atlântico. De fato, B. rufus habita águas rasas (1 a 6m, atingindo a profundidade de 30m) do Atlântico Ocidental, distribuindo-se do sul da Flórida ao litoral do Estado de São Paulo, sempre associada aos recifes de corais, sendo substituída em profundidades maiores por B. pulchellus (Gomon, 2006). Bodianus pulchellus habita regiões de águas profundas a moderadamente profundas (18-110m), sempre associados a rochas ou coberturas de corais, distribuindo-se pelo Atlântico Ocidental de Bermuda (Caribe), englobando os recifes da costa da Carolina do Norte (USA) ao litoral do Estado de São Paulo (Brasil), estendendo-se ao arquipélago de São Tomé e Príncipe, no Atlântico Oriental (Gomon, 2006; Wirtz et al., 2007). A diversificação das espécies do Atlântico, B. rufus e B. pulchellus, remonta há aproximadamente 5 m.a. (Santini et al., 2016), portanto anterior ao fechamento do Istmo do Panamá (aproximadamente 2.8 a 3 m.a.) (Lessios, 1998; Leigh et al., 2014; O´Dea et al., 2016). Bodianus insularis habita profundidades intermediárias (12-35m), fazendo uso de substratos rochosos associados a algas calcárias, areia e detritos coralíneos, distribuindo-se exclusivamente no Arquipélago de São Pedro e São Paulo, e nas ilhas de Ascensão e Santa Helena (Gomon, 2006). O elevado nível de similaridade genética entre B. pulchellus e B. insularis, Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 106 indica uma divergência evolutiva muito recente, onde a atual distribuição desta última seria resultado do isolamento das ilhas Meso-Atlânticas, causado pelo afastamento dos continentes da América do Sul e África (Gomon, 2006). Geologicamente as idades de formação das ilhas Meso-Atlânticas, áreas onde B. insularis é descrita, é muito variada. Enquanto a idade estimada da ilha de Santa Helena é de 14,5 M.a. (Baker et al., 1967), a de ASPSP é de aproximadamente 9 M.a. (Hekinian et al., 2000), a da ilha de Ascensão é de apenas 1,15 M.a. (Nielson & Sibbett, 1996). A ocupação de regiões Meso-Atlânticas com idade mais recente que a da diversificação de B. rufus e B. pulchellus, como a ilha de Ascensão, aliada ao baixo nível de divergência entre B. pulchellus e os indivíduos de ASPSP, sinalizam que a colonização desta área, em particular, e das outras ilhas no meio do Atlântico, ocorreu em tempos recentes. Embora a idade das ilhas Atlânticas tenha marcada influência na riqueza de espécies de peixes, o isolamento geográfico constitui o fator primordial relacionado ao endemismo nestas regiões (Hachich et al., 2015). Divergências evolutivas entre espécies se reflete em variadas gradações morfológicas. Neste sentido, a comparação dos padrões merísticos de B. rufus, B. pulchellus e B. insularis revela similaridades e grande sobreposição de caracteres. Embora B. rufus e B. pulchellus possuam caracteres morfológicos que em conjunto se mostram conspicuamente distintos, por outro lado, os indivíduos de B. pulchellus e B. insularis exibem acentuado compartilhamento de características morfológicas e de contagens. Entre os caracteres diferenciados, apenas o número de escamas pré-dorsais e daquelas abaixo da linha lateral possuem alguma variação, apesar de ainda apresentarem alguma sobreposição. Sem dúvida as características distintivas mais conspícuas entre B. rufus, B. pulchellus e B. insularis se referem aos seus padrões de coloração, que diante de ausências de variações morfológicas mais evidentes, se sobressai como primeiro critério discriminatório entre elas (Gomon, 2006). Entre os teleósteos, a pigmentação em muitos casos se mostra um critério taxonômico pouco confiável (e.g. Attaran-Farimani et al., 2016; DiBattista et al., 2016; Nascimento et al., 2017). Adaptativamente a coloração Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 107 desempenha múltiplos papéis adaptativos, como o reconhecimento e escolha de parceiros, comportamento de agrupamento, camuflagem, coloração de aviso e isolamento pré-zigótico durante a especiação (Parichy, 2006). O polimorfismo cromático em peixes é um fenômeno bem conhecido sendo presente em teleósteos (Leclercq et al., 2010; Souza et al., 2011). A variação cromática pode manifestar-se sob a forma de dicromatismo sexual, como formas de variações geográficas e até mesmo em função de fatores ambientais como a transparência da água (Seehausen & Bouton, 1996; Maan et al., 2010; Castillo Cajas et al., 2012; Maan & Sefc, 2013). Em espécies de Bodianus do Atlântico, têm sido relatadas algumas variações cromáticas, embora o padrão de coloração seja em grande parte considerado distintivo e tenha sido utilizada como evidência complementar de possível ocorrência de hibridação entre B. rufus e B. pulchellus (Sazima & Gasparini, 1999). Bodianus rufus possui colorido conspícuo em relação às outras espécies e não apresenta mudanças abruptas de cor durante as fases do desenvolvimento ontogenético. A espécie caracteriza-se por juvenis com coloração corporal esbranquiçada e azul iridescente na parte anterior. Na sua fase adulta tem coloração predominantemente amarela na linha abaixo dos olhos, envolvendo a mandíbula, que pode se tornar avermelhada em indivíduos maiores e com uma característica listra marginal azulada na porção anterior da nadadeira dorsal, sendo o restante da mesma amarelada. Indivíduos adultos em fase final podem apresentar-se completamente púrpuras ou preto-azulados (Feddern, 1963; Gomon, 2006). Ao contrário de B. rufus, os padrões de coloração de B. pulchellus e B. insularis apresentam mudanças ontogenéticas abruptas (Feddern, 1963). Ambas as espécies apresentam variantes de coloração bastante similares, tanto em estágios juvenis, como na fase adulta. Os indivíduos adultos têm coloração predominantemente avermelhada, com tons acinzentados escuros na parte inferior do corpo em B. insularis (Gomon, 2006). Em suas fases juvenis, B. pulchellus e B. insularis apresentam similaridades cromáticas, apresentando-se amarelos com um spot preto na extremidade anterior da nadadeira dorsal, sendo distinguíveis somente pelo tamanho deste spot que se estende por oito espinhos da nadadeira dorsal em B. pulchellus e quatro em B. insularis (Gomon, 2006). Na fase adulta, a Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 108 coloração de B. pulchellus apresenta um tom de vermelho mais claro que B. insularis, revelando ainda a presença de uma região pálida na linha lateral, além de uma mancha amarelada no final da nadadeira dorsal e parte da nadadeira caudal (Gomon, 2006; Wirtz et al., 2007). Similarmente, B. pulchellus pode apresentar uma coloração predominante avermelhada, como B. insularis, em indivíduos com tamanho em torno de 60 mm, ou que excedam os 100 mm (Feddern, 1963; Sazima & Gasparini, 1999). Nas regiões insulares do Atlântico, sobretudo em ilhas Meso- Atlânticas, que apresentam estruturações populacionais, como nas ilhas do Arquipélago de São Pedro e São Paulo e Ascensão, onde B. insularis é reportada, populações de diferentes espécies de peixes têm apresentado padrões cromáticos e morfológicos diferenciados, em geral, associados às condições adaptativas locais (Bermingham et al., 1997; Molina et al., 2006; Affonso & Galetti, 2007; Cunha et al., 2014; Souza et al., 2016; Souza, A.S., comunicação pessoal). Fatores evolutivos relacionados aos padrões de colorido estão associados ao fluxo gênico reduzido, mutação, deriva genética e seleção natural (Rocha, 2004), que se mostram particularmente importantes em ambientes insulares. As ilhas Meso-Atlânticas apresentam substrato reduzido (Hachich et al., 2015), águas cristalinas de profundidade intermediária e visibilidade vertical que varia de 25 a 40m (Irving, 2013). Particularidades ambientais bióticas e abióticas, presentes em regiões insulares do Atlântico (Floeter et al., 2001), podem ter contribuído para o favorecimento de pressões seletivas ou condição neutra (deriva genética) capaz de fixar novos padrões de coloração em espécies do gênero Bodianus. A coloração vermelha em peixes que habitam profundidades moderadas e profundas, como as existentes em ambientes insulares (Floeter et al., 2001), é uma condição adaptativa frequente. Tem sido relacionada ao incremento da camuflagem, uma vez que os comprimentos de onda do vermelho são atenuados à medida que aumenta a profundidade, fazendo com que os exemplares com tons avermelhados apresentem um aspecto acinzentado (Pavlidis & Mylonas, 2011). Sob essas condições evolutivas diferenciadas é possível que o padrão de coloração vermelho-escuro, presente na fase adulta de B. insularis, possa representar uma condição Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 109 adaptativa (eg. maior cripsis), derivada da coloração característica de B. pulchellus. Padrões genéticos e status taxonômico dos Hogfishes Atlânticos A definição de espécie é um dos pontos mais controversos no processo evolutivo. Muitos grupos de peixes são difíceis de serem definidos taxonomicamente. Na ausência de definições biológicas claras e caracteres evolutivos robustos, a descrição de espécie se torna uma tarefa subjetiva. A identificação de B. insularis aparentemente retrata uma dessas situações. Sua discriminação se baseia em grande parte no padrão de coloração e no isolamento geográfico (e.g. Gomon, 2006). Se a primeira condição atende com fragilidade a uma definição de “morfoespécie”, dada a sua rápida aquisição em função de padrões adaptativos, a segunda é mais questionável, tendo em vista a ausência de associação com processos evolutivos intrínsecos de um grupo. Neste sentido, análises genéticas têm se mostrado eficientes em identificar a diversidade críptica em diferentes grupos de peixes (Marchio & Piller, 2013; Miya et al., 2015; Lim et al., 2016), o que não indica ser o caso entre B. insularis e B. pulchellus. Variação em barcode (gene COI) calculadas a partir de dados de cerca de duas centenas de teleósteos e Chondrichthyes apresentou uma variação média intraespecífica de 0,39% (Ward et al., 2005). Algumas estimativas da divergência genética em espécies de peixes Neotropicais dulcícolas indicam valores médios intra e interespecíficos de 0,81% e 10,94% (Henriques et al., 2015) ou mesmo um pouco menores 0,3% e 6,8%, respectivamente (Pereira et al., 2013). Em espécies marinhas os níveis de variação intra e interespecíficos indicam valores de 0.3% e 6,6% (Lakra et al., 2011). Apesar das sobreposições de variação intra e interespecíficas, que podem ocorrer em alguns grupos, níveis de divergência do gene COI superiores a 3%, valor estatisticamente suficiente para validação taxonômica (Ward et al., 2005), têm sido reportados entre espécies com características diferenciadas (Zemlak et al., 2009). Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 110 Análises intra-específicas em espécies de Bodianus, revelaram divergências médias do gene COI de 12.48% entre B. perditio da Austrália e da África do Sul (Zemlak et al., 2009), destacando o potencial das análises genéticas na identificação de espécies crípticas e em esclarecer aspectos taxonômicos no gênero Bodianus. O perfil genético de B. insularis, só agora disponível, foi esclarecedor quanto as suas relações filogenéticas com as demais espécies do Atlântico Ocidental. Neste sentido, as diferenças genéticas das sequências do gene COI maiores que 3% entre B. rufus, em relação a B. pulchellus e B. insularis, claramente situa B. rufus em um patamar taxonômico diferenciado. Por outro lado, a divergência genética entre B. pulchellus e B. insularis é significativamente baixa (0.1%) e mesmo inferior aos níveis médios de variação interpopulacional exibido em vários grupos marinhos do Atlântico, que se situam próximos a 0,3% (Ribeiro et al., 2012). Dados citogenômicos corroboram as similaridades genéticas entre B. pulchellus e B. insularis e a diferenciação destas em relação a B. rufus. Bodianus pulchellus e B. insularis apresentam características cromossômicas idênticas (2n; fórmula cariotípica, distribuição de heterocromatina, genes ribossomais principais), divergindo apenas quanto a um sítio extra 5S rDNA presente em indivíduos de B. insularis (Molina et al., 2012). A proximidade filogenética fica evidente entre B. pulchellus, B. insularis e B. rufus pelo compartilhamento de uma região peculiar de DNA repetitivo, que apresenta características de composição e organização incomuns entre os peixes (Molina et al., 2012; Motta-Neto et al., em preparação). Em labrídeos atlânticos, a ausência de diferenciação genética acompanhada de variações cromáticas tem sido explicada como resultado de condições ambientais adaptativas locais, características de coloração localizados em loci diferentes dos marcadores utilizados ou fruto de população relativamente recente. Tendo surgido possivelmente após a última máxima glacial, na qual colorações diferentes resultam de forte seleção, deriva, ou efeito fundador não acompanhado de equivalente diferenciação genética do marcador utilizado (Rocha, 2004). A ocorrência de uma ou mais dessas condições evolutivas tem sido sugerida em ilhas oceânicas atlânticas (Molina et al., 2006; Cunha et al., 2014; Lima-Filho et al., 2016; Souza et al., Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 111 2016) e poderiam deflagrar padrões cromáticos particulares nos indivíduos de Bodianus que viessem a habitar regiões Meso-Atlânticas remotas. Padrões de coloração são um dos fatores interpopulacionais mais variáveis em peixes e um passo rápido de diferenciação evolutiva (Gray & McKinnon, 2007; Koblmüller et al., 2008; Elmer et al., 2009; Maan & Sefec, 2013). Assim, padrões cromáticos variantes, e traços morfológicos pouco conspícuos, oferecem baixo suporte na categorização de espécies de Labridae. Mais apropriadamente, estas condições devem ser validadas como caráter diagnóstico, em associação com dados genéticos e morfológicos mais robustos (McMillan et al., 1999; Bernardi et al., 2004; Rocha, 2004; Souza et al., 2016). Apesar do isolamento geográfico, os indivíduos de Bodianus do ASPSP apresentam uma divergência genética e citogenômica (Molina et al., 2012) muito baixa, incapaz de distingui-la de B. pulchellus. Do ponto de vista biogeográfico, os dados sugerem que B. insularis constitui um enclave populacional alopátrico interno (enclave alopátrico dentro da área de distribuição da espécie) à distribuição de B. pulchellus. Em termos evolutivos e de conservação, esta população, e possivelmente as outras, presentes em Ascensão e Santa Helena, que merecem análises futuras, deve ser considerada como uma unidade taxonômica significante (UTS). Os dados genéticos, citogenéticos e morfológicos, não fornecem sustentação à manutenção taxonômica da espécie nominal B. insularis, indicando sinonímia com B. pulchellus. Considerações finais Os padrões cromáticos diferenciais entre B. insularis e B. pulchellus, presente em ASPSP, não refletem variação genética compatível com diferenciação interespecífica. A divergência genética entre ambas é menor que a encontrada para espécies marinhas verdadeiramente diferenciadas. Os aspectos fenéticos dos indivíduos do ASPSP sugerem adaptações particulares às características evolutivas locais. Embora os indivíduos identificados como B. insularis possam ser mais apropriadamente tratados sob o status de UTS, os padrões genéticos baseados nos diferentes genes Capítulo III – Marcadores de DNA apontam Bodianus insularis sinionímia de B. pulchellus 112 (COI, 16S rDNA, Rhod), indicam B. insularis como uma variação intra- específica e, portanto, sinonímia de B. pulchellus. Dessa forma, embora possa ser considerada como operational taxonomic unit (OTU), o seu status como espécie parece questionável. Referências Bibliográficas Affonso, P., Galetti, P.M. (2007). Genetic diversity of three ornamental reef fishes (Families Pomacanthidae and Chaetodontidae) from the Brazilian coast., 67(4): 925–933. Akaike, H. (1973). Information theory as an extension of the maximum likelihood principle. In: Petrov, B.N., Caski, F. (Eds.), Second International Symposium on Information Theory. Akademiai Kiado, Budapest, pp. 267–281. Arnal, C., Verneau, O., Desdevises, Y. (2006). 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CONCLUSÕES • A ampliação dos dados citogenéticos em um contexto filogenético mais amplo para a família Haemulidae confirma o conservadorismo cromossômico neste grupo. Esta condição afere estase cromossômica, tanto no que se refere a aspectos numéricos, como estruturais do cariótipo. • Processo de estase evolutiva também envolve a organização dos genes das espécies de Haemulidae. Regiões genômicas homeólogas presentes nos cromossomos portadores de sítios ribossomais sugerem a manutenção de largos trechos sintênicos entre seus gêneros, através da diversificacão filética. • Os genes ribossomais das espécies de Haemulidae demonstram taxas variáveis de diversificação de localização. Enquanto, regiões de DNAr 5S se mostraram mais dinâmicas e variáveis evolutivamente, as regiões de DNAr 18S se apresentam um padrão conservado. • A co-localização de sítios DNAr 5S e 18S em A. moricandi (par 24) e em H. melanurum (par 10), indicam condições disruptivas da estabilidade sintênica, revelando padrões derivados de organização do DNAr em Haemulidae. • Características próprias dos cromossomos de Haemulidae podem favorecer o processo de estase evolutiva, contudo, aspectos do ciclo de vida das espécies desta família, como grandes efetivos populacionais, vastas áreas de distribuição podem contribuir na restrição do estabelecimento de mudanças cariotípicas. • A ausência de variabilidade citogenética entre as populações, do Caribe e Atlântico Sul, das espécies A. virginicus e H. chrysargyreum, difere do padrão de divergência observado previamente entre populações de H. aurolineatum entre essas regiões. Embora dados Conclusões. 119 cromossômicos correspondam a marcadores evolutivos limitados para estudos populacionais, esse nível de variação inter-barreira do Amazonas não exclui a possibilidade que desempenhe efeitos diferenciados sobre o fluxo gênico entre diferentes espécies. • O compartilhamento do conjunto de características constitutivas e funcionais particulares da região BOD entre espécies de Bodianus, com larga divergência filética, indica que sua ocorrência precede a diversificação filética neste gênero. • A presença de características funcionais e estruturais da região BOD, típicas de pseudo-RONs, pode indicar que essas regiões foram originalmente repositórios de DNAr, o que é reforçado pelo acúmulo de elementos transponíveis Alu e Tol2 nessa região, possivelmente interferindo na funcionalidade do gene ribossomal e promovendo um processo de pseudogenização. • A composição complexa da cromatina da região sugere tratar-se de um relicto de pseudo-RON, possivelmente desempenhando uma dinâmica funcional no controloe dos elementos transponíveis que associada ao processo de metilação deve desempenhar um papel particularmente ativo no processo evolucionário nas espécies de Bodianus. • O elevado nível de similaridade genética entre B. pulchellus e B. insularis indica baixa divergência evolutiva, possivelmente decorrente da ocupação das ilhas Meso-Atlânticas cujo isolamento foi ampliado pelo afastamento dos continentes da América do Sul e África. • A comparação dos padrões merísticos de B. rufus, B. pulchellus e B. insularis revela grande similaridades e grande sobreposição de caracteres, observando-se uma maior proximidade entre B. pulchellus e B. insularis, do que qualquer uma delas com B. rufus. Conclusões. 120 • Particularidades ambientais bióticas e abióticas, presentes em regiões insulares isoladas da região Meso-Atlântica, podem ter contribuído para o favorecimento de pressões seletivas ou condição neutra (deriva genética) capaz de fixar novos padrões de coloração em espécies do gênero Bodianus. • Bodianus insularis apresenta uma divergência genética e citogenômica muito reduzida quando relacionada a B. pulchellus, onde os dados sugerem que B. insularis constitui um enclave populacional alopátrico interno à distribuição de B. pulchellus, indicando uma sinonímia em relação a esta. Referências Biblográficas. 121 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GENERALIZADAS Accioly, I.V., Molina, W.F. (2007). Contribuição à citogenética dos gêneros Pomadasys e Anisostremus (Haemulidae, Perciformes). Publica, III: 36–44. Ackerly, D.D. (2016). Principles of phylognenetics: ecology and evolution. Integrative Biology 200: 1–8. Affonso, P.R.A.M., Guedes, W., Pauls, E., Galetti Jr. P.M. (2001). 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