LAURA LAÍSE PEREIRA DA ROCHA CARACTERIZAÇÃO MORFOQUANTITATIVA DO CORNO ANTERIOR DA MEDULA ESPINAL DO SAGUI (Callithrix jacchus) EM DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS E GÊNEROS Natal / RN 2019 LAURA LAÍSE PEREIRA DA ROCHA CARACTERIZAÇÃO MORFOQUANTITATIVA DO CORNO ANTERIOR DA MEDULA ESPINAL DO SAGUI (Callithrix jacchus) EM DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS E GÊNEROS Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Vagner Lobo Ladd Natal / RN 2019 Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN/ Bilbioteca Setorial do Centro de Biociencias. Rocha, Laura Laise Pereira da. CARACTERIZAÇÃO MORFOQUANTITATIVA DO CORNO ANTERIOR DA MEDULA ESPINAL DO SAGUI (Callithrix jacchus) EM DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS E GÊNEROS / Laura Laise Pereira da Rocha. - Natal, 2020. 71f.: il. Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Biociências, Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional. Orientador: Fernando Vagner Lobo Ladd. 1. Medula espinal. 2. Neurônios motores. 3. Envelhecimento. I. Ladd, Fernando Vagner Lobo. II. Título. RN/UF/ Dedico este trabalho ao meu esposo, Igor Araujo, companheiro de todas as horas, que sempre me apoiou e foi meu maior incentivador. Dedico também ao nosso filho, Miguel Heitor, que ainda nem nasceu, mas que já despertou em mim uma força que eu nem sabia que existia. Luz da minha vida! Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus, por ser o meu refúgio, a minha fortaleza, e por cuidar tão bem de mim. Aos meus pais Lênio e Sônia, pelo amor incondicional e por me abrirem as portas para as oportunidades que me trouxeram até aqui. Aos meus avós Zeca, Maria, Valdo e Francisca por acreditarem sempre em minha capacidade. Aos meus sogros Junior e Noelma por todo carinho e pelo constante incentivo. Aos meus irmãos Léo e Najara e aos meus cunhados Marcel e Lívia pelo companheirismo, amizade e torcida. As minhas afilhadas Gabriela e Isabela, por sempre aliviarem meu estresse, apenas com seus sorrisos, mesmo sem saberem. Ao meu amigo-irmão Khelven que almejou, se dedicou e alcançou comigo o ingresso na Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da UFRN. Aos meus companheiros de pesquisa, antes colegas de turma e que hoje tenho a honra de chamar de amigos, Raíssa e João por todo o apoio na elaboração deste trabalho. Levarei vocês para sempre em meu coração... Este momento é NOSSO! Aos demais amigos, aos quais não pretendo citar nomes para não correr o risco de esquecer algum, agradeço imensamente pelas vezes que me encorajaram no decorrer desta jornada, dizendo: “Você vai conseguir! ” Ao meu orientador Fernando Ladd agradeço pela confiança, compreensão e por dentre tantas orientações valiosas, ter me ensinado que a RESILIÊNCIA é o melhor caminho para o êxito. Aos professores Miriam Stela, Expedito Silva e Paulo Leonardo pela disponibilidade de sempre e pelas inúmeras contribuições. A todos que fazem parte do DMOR (corpo docente, funcionários e alunos) por todo apoio concedido durante esse período, em especial a funcionária Regina, ao professor Ruthnaldo ao doutorando Alexander, pelo apoio técnico. A família: Núcleo de Primatologia, pela compreensão de minha ausência em vários momentos. Ao Departamento de Morfologia/UFRN e ao Programa de Pós- Graduação em Biologia Estrutural e Funcional pela disponibilização de totais condições para a execução da pesquisa. Ao Instituto Internacional de Neurociencias Edmond e Lily Safra pela disponibilização do microscópio para a análise estereológica deste trabalho. A CAPES pelo apoio financeiro. A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para concretização de mais esta vitória em minha vida, o meu profundo agradecimento! “Se eu vi mais longe, foi por estar de pé sobre ombros de gigantes.” Isaac Newton “Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos.” Isaac Newton RESUMO A medula espinal é um importante centro neural, dentre as suas principais funções está a de promover a locomoção. É fato constatado que com o avançar da idade, essa função motora é severamente afetada. Apesar disso, pouco se sabe acerca das possíveis alterações morfoquantitativas relacionados ao envelhecimento de neurônios motores sobretudo no sagui, e se há respostas distintas ao envelhecimento relacionadas ao sexo. Vale salientar ainda que dados relacionados aos estudos associados à quantificação da medula espinal, ainda são bastante controversos, pois a maioria destes utilizam métodos de contagem bidimensionais, sendo a principal inovação deste trabalho a abordagem 3D das possíveis alterações morfoquantitativas. Nesse sentido, a presente pesquisa objetivou investigar as possíveis diferenças morfoquantitativas da medula espinal, utilizando técnicas de delineamento estereológico durante a senescência nos diferentes gêneros (machos e fêmeas). Para isso, utilizamos 18 saguis (Callithrix jacchus), os quais foram divididos em 6 grupos de acordo com suas faixas etárias e gêneros: grupo jovem macho (n=4), grupo adulto macho (n=4), grupo idoso macho (n=2), grupo jovem fêmea (n=4), grupo adulto fêmea (n=3) e grupo idoso fêmea (n=1). As medulas espinais foram devidamente coletadas após eutanásia seguida de perfusão, amostradas de forma sistemática, uniforme e aleatória e coradas utilizando o protocolo de Nissl. Posteriormente foram realizadas as análises estereológicas, nas quais foram estimados os volumes das substâncias (branca e cinzenta) da medula espinal, bem como parâmetros relacionados ao corno anterior, sendo eles: volume referência, densidade de volume neuronal, volume total, número total de neurônios e volume médio neuronal. Os resultados demonstram que houve uma redução no volume referência da substânciacinzentanasfêmeas no decorrer do envelhecimento, assimcomoestaredução foi observada no volume referência do corno anterior independentemente do gênero. Quando analisada a densidade de volume, houve uma diminuição no processode maturação, já com relação ao volume totalde neurônios do corno foi observada uma redução duranteoprocesso de maturação e envelhecimento nosmachos. Nãoforam encontradas diferenças significativas paras os demais parâmetros analisados. Palavras-chave: Medula espinal, Neurônios motores, Envelhecimento. ABSTRACT The spinal cord is one of the most important neural centers, among its main functions is to promote locomotion. It is scientifically proved that with advancing age this motor function is completely affected. Nevertheless, little is known about the possible morphoquantitative alterations related to motor neuron aging, especially in marmosets, and whether there are distinct responses to gender-related aging. The data related to studies associated with spinal cord quantification are still controversial, since most of them use two-dimensional counting methods, being the main innovation of this work the 3D approach of the possible morphoquantitative changes. This research aimed to investigate the possible morphoquantitative differences of the spinal cord, using stereological delineation techniques during senescence in different genders (males and females). For this, it were used 18 marmosets (Callithrix jacchus), which were divided into 6 groups according to their age groups and genders: young male group (n = 4), male adult group (n = 4), male elderly group (n = 2), female young group (n = 4), female adult group (n = 3) and female elderly group (n = 1). Spinal cords were collected after euthanasia followed by perfusion, systematically, uniformly and randomly sampled and stained using the Nissl protocol. Afterwards, stereological analyzes, were performed where the volumes of the substances (white and gray) of the spinal cord were estimated, as well as the parameters related to the anterior horn: reference volume, neuronal volume, density, total volume, total number of neurons and mean neuronal volume. The results demonstrate that there was a reduction in the gray matter reference volumes in females during aging, as well as a reduction in the anterior horn reference volume regardless of gender. When the volume density was analyzed, there was a reduction in the maturation process, while in relation to the total volume of the horn neurons a reduction was observed during the maturation and aging process in males. No significant differences were found for the other parameters analyzed. Key words: Spinal cord, Motor neurons, Aging. Lista de Ilustrações Figura 1 - Fotografias de secções transversais mostrado a anatomia da medula espinal do sagui. Em (A) representação do segmento cervical; (B) representação do segmento torácico; (C) representação do segmento lombar; (D) representação do segmento sacral. (Adaptado de WATSON, et. al, 2015 ) ............................................................................7 Figura 2 - Fotografia demonstrando a segmentação da medula espinal de um sagui. A medula espinal foi dividida em segmentos sob um microscópio de dissecção, com base no padrão de saída das raízes dorsais dos nervos espinhais. C, cervical; T, torácico; L, lombar; S, sacral; Co, coccígeo. (WATSON et al., 2015.) .............................................. 9 Figura 3 - Secção transversal esquemática da medula espinal. (MACHADO; HAERTEL, 2014) .......................................................................................................................... 10 Figura 4 - Imagem de seção transversal da medula espinal do sagui no nível de C7, dividida de acordo com as lâminas de Rexed. No corno anterior está descrito : 8Sp - lâmina VIII de Rexed (Circulada de verde) bem como a lâmina IX de Rexed com os seus agrupamentos de neurônios motores : Ax9 - neurônios motores axiais; FEx9 - neurônios motores extensores do antebraço; FFl9 - neurônios motores flexores do antebraço; Pec9 - neurônios motores peitorais; Tr9 - neurônios motores tríceps; LD9 - neurônios motores latissimus dorsi; (Destacados de vermelho) (Adaptada de WATSON, et al., 2015) ................................................................................................................................... 11 Figura 5 – Sagui(Callithrix jacchus)(Fonte: © 2019 Pixabay) ..................................... 20 Figura 6 – Imagem mostrando o processamentoe remoção da medula espinal. Da esquerda para direita temos a remoção da musculatura epiaxial, a remoção dos arcos vertebrais e a divisão em três porções. (Fonte: Pessoal) ............................................... 25 Figura 7 –Imagemmostrando a realização da biometria da medula espinal. À esquerda temos a medição de uma porção torácica da medula, utilizando o paquímetro. Na direita a pesagem de uma porção lombar, por meio da balança de precisão. (Fonte: Pessoal) 26 Figura 8– Imagem mostrando o procedimento da coloração de Nissl. (Fonte: Pessoal) ................................................................................................................................... 27 Figura 9- Imagem de secção transversal da medula espinal do sagui num aumento de 2x demonstrando a aplicação do Princípio de Cavalieri para a estimativa do volume referência das substâncias branca, cinzenta e do corno anterior. Observa-se o sistema teste utilizado (cruzes pretas) a/p 57816,2 µm². Coloração: Nissl.Escala de barra: 500 µm. . 30 Figura 10 – Imagem da secção transversal da medula espinal do sagui num aumento de 20x demonstrando a aplicação do Princípio de Delesse para a estimativa da densidade de volume neuronal do corno anterior. Observa-se o sistema teste utilizado (cruzes pretas). Coloração: Nissl. Escala de barra: 100 µm .................................................................. 31 Figura 11 - Imagem (40x) representativa da frame do fractionator óptico para estimativa do número total de neurônios. Linhas vermelhas são de inclusão e linhas amarelas são de exclusão; pontos amarelos correspondem aos neurônios contabilizados na área delimitada. Coloração: Nissl; Escala de barra: 50µm ................................................... 33 Figura 12- Imagem representando seqüências do eixo Z de análise em que foi padronizado uma espessura de 20 µm. Em que em (A) temos a espessura “zero”; em (B), temos a espero em 10 µm e em (C) a espessura em 20µm. Desse modo, o eixo Z de análise foi padronizado com 20 µm retirando as zonas de guardas da espessura total da secção (30µm) ........................................................................................................................ 34 Figura 13 -Imagem (40x) representativa do nucleator para estimativa do volume médio neuronal. Linhas verdes são os pontos de contato. Setas amarelas representam os pontos de toque das linhas na membrana do neurônio. Coloração: Nissl; Escala de barra: 50µm ................................................................................................................................... 35 Figura 14-Gráfico representativo da estimativa de volume da substância branca da medula espinal nos diferentes grupos etários jovem, adultos e senil, em fêmeas e machos.As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,132) ..................................... 38 Figura 15 - Gráfico representativo da estimativa de volume da substância cinzenta da medula espinal nos diferentes grupos etários jovem, adultos e idoso, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. O (*)indica onde foi observado diferença estatisticamente significativa (p= 0,015) ..................................................................... 39 Figura 16 -Gráfico representativo da estimativa de volume da medula espinal como um todo nos diferentes grupos etários jovem, adultos e idoso, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,095) ................................................................... 40 Figura 17 - Gráfico representativo da estimativa de volume do corno anterior da medula espinal nos diferentes grupos etários jovem, adultos e idoso, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,001)............................................... 41 Figura 18- Gráfico representativo da densidade de volume de neurôniosdo corno anterior nos diferentes grupos etários jovem, adultos e senil, em fêmeas e machos. As médiasdos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,05) ..................................................................... 42 Figura 19-Gráfico representativo do volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior nos diferentes grupos etários jovem, adultos e senil, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,002)............................................... 43 Figura 20- Gráfico representativo do número total de neurônios do corno anterior nos diferentes grupos etários jovem, adultos e senil, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,07)..................................................................... 44 Figura 21- Gráfico representativo do volume médio de neurônios do corno anterior nos diferentes grupos etários jovem, adultos e senil, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,1)....................................................................... 45 Lista de Tabelas Tabela 1 – Distribuição do número de animais por faixa etária e gênero..................... 23 Tabela 2 - Classificação da faixa etária por idade de acordo com a literatura. (Baseado em ABBOTT et, al., 2003) ................................................................................................ 24 Tabela 3 - – Protocolo Coloração de Nissil - LABNEURO ......................................... 28 Tabela 4 - Peso da medula espinal de sagui dado em gramas (g), comprimento (mm), nos diferentes grupos. Os valores de cada parâmetro são expressos como a sua média por grupo. ......................................................................................................................... 37 Lista de Abreviaturas Vref – Volume referência da medula espinal Vv – Densidade de volume do corno anterior Vtot – Volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior N – Número total de neurônios do corno anterior v – Volume médio de neurônios do corno anterior Vrefcinzenta - Volume referência da substância cinzenta Vrefbranca - Volume referência da substância branca Vrefcorno - Volume referência do corno anterior Sumário 1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 3 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 6 2.1 Macroestrutura e Microestrutura da medula espinal ......................................................... 6 2.2 Envelhecimento e medula espinal .................................................................................. 14 2.3 Gênero e medula espinal ............................................................................................... 16 2.4 Aspectos morfoquantitativos da medula espinal ............................................................ 18 2.5 O modelo experimental: Sagui (Callithrix jacchus) ........................................................ 20 3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 22 3.1. Objetivo geral .............................................................................................................. 22 3.2. Objetivos específicos .................................................................................................. 22 4. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 23 4.1 Sujeitos experimentais .................................................................................................. 23 4.2 Procedimento anestésico ............................................................................................... 24 4.3 Perfusão 24 4.4 Remoção da medula ...................................................................................................... 25 4.5 Biometria e Processamento histológico .......................................................................... 26 4.6 Obtenção das imagens ................................................................................................... 28 4.7 Análises estereológicas ........................................................................................ 29 4.7.1 Volume referência (Vref) ......................................................................................... 29 4.7.2 Densidade de volume do corno anterior (Vv) ................................................................ 31 4.7.3 Volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior (Vtot) .................................. 32 4.7.4 Número total de neurônios do corno anterior (N) ..................................................... 32 4.7.5 Volume médio de neurônios do corno anterior (v) ................................................... 35 4.8 Análise Estatística ................................................................................................ 36 5 RESULTADOS ............................................................................................................. 37 5.1. Biometria da medula .................................................................................................... 37 5.2. Volume referência medula espinal (Vref) ...................................................................... 38 5.2.1. Volume referência da substância branca (Vrefbranca) ................................................. 38 5.2.2. Volume referência da substância cinzenta (Vrefcinzenta) .............................................. 39 5.2.3Volume referência total (Vreftotal) .............................................................................. 40 5.2.4. Volume referência do corno anterior (Vrefcorno) ........................................................ 41 5.3 Densidade de volume do corno anterior (Vv) ....................................................................... 42 5.4 Volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior (Vtot) ......................................... 43 5.5 Número total de neurônios do corno anterior (N) ........................................................... 44 5.6.Volume médio de neurônios do corno anterior (v) ......................................................... 45 6. DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 46 6.1 Volume referência medula espinal (Vref) ...................................................................... 46 6.2 Densidade de volume do corno anterior (Vv) ....................................................................... 47 6.3. Volume médio de neurônios do corno anterior (v) ......................................................... 48 6.4. Número total de neurônios do corno anterior (N) ........................................................... 48 7. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 50 8. REFERÊNCIAS................................................................................................................ 51 8. ANEXO ............................................................................................................................. 57 3 1. INTRODUÇÃO Na presente pesquisa foi utilizado o corno anterior da medula espinal do sagui como estrutura de interesse, com o intuito de analisar quantitativamente, através de métodos estereológicos, a população neuronal (em especial dos neurônios motores) de acordo com diferentes faixas etárias (jovem, adulto e senil) e gênero (macho e fêmea). O sagui é um modelo muito útil para estudos com envelhecimento por possuir um dos menores tempos de vida entre os primatas, o que permite a avaliação longitudinal dos animais, desde a idade jovem até idade senescente (TARDIF et al., 2011). Ele apresenta uma alta capacidade reprodutiva, atingindo a maturidade sexual em torno dos 14 meses (RYLANDS et al., 1996). A partir de dois anos de idade, eles alcançam a vida adulta, estendendo-se até os 8 anos, quando algumas características do envelhecimento se tornam mais evidentes, como por exemplo, escassez dos tufos de pelos ao redor da orelha e “enrugamento” da pele no rosto (ABBOTT et al., 2003).A expectativa de vida no campo é de cerca de 10 anos, podendo atingir 16 anos no cativeiro(RYLANDS et al., 1996). O sistema nervoso, comanda várias funções primordiais para o bom funcionamento do organismo e se divide anatomicamente em sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso periférico (SNP). O SNC, localiza-se dentro do esqueleto axial, é constituído pelo encéfalo e pela medula espinal, e é responsável por receber e transmitir informações para todo o organismo. Podemos defini-lo como a central de comando que coordena as atividades do corpo. O SNP é formado pelos nervos e gânglios nervosos que conectam o SNC aos órgãos do corpo. É ao SNC que chegam as informações relacionadas a sensibilidade geral, e é dele que partem ordens destinadas aos músculos e glândulas. (MACHADO; HAERTEL, 2014) A medula espinal, objeto deste estudo experimental, é a parte mais alongada do SNC, caracterizada por um formato de cordão aproximadamente cilíndrico. Está localizada dentro do canal vertebral, estendendo-se inferiormente desde a base do encéfalo, na altura do forame magno até o nível da borda superior da vértebra L2 . Em corte transversal, a medula espinal é composta por uma substância cinzenta interna, em forma H, ou de borboleta e por uma substância branca (que envolve a substância cinzenta). A substância cinzenta está especializada regionalmente, dividida em cornos. O corno posterior é essencialmente sensitivo, e o corno anterior, é essencialmente motor. 4 Existe ainda o corno lateral no nível torácico, com funções essencialmente autônomas. (MARTINI, et. al., 2009) O corno anterior contém os corpos celulares dos neurônios motores inferiores (NMI) que recebem as informações vindas dos neurônios motores superiores (NMS), aqueles cujo corpo celular está localizado no córtex motor ou no tronco cerebral, ou dos interneurônios, cujo corpo celular está localizado na própria medula espinal. Estes neurônios ao receberem as informações emitem as respostas através de seus axônios, inervando os órgãos efetores, principalmente músculos esqueléticos (COSENZA, 2013). Os NMI são designados em dois tipos, os neurônios motores alfa (grandes) e neurônios motores gama (pequenos). Os primeiros são normalmente orientados longitudinalmente e cada grupo inerva um músculo individual, em corte transversal apresentam-se em aglomerados, separados por áreas com interneurônios. Os aglomerados, por sua vez, se organizam em medial (músculos axiais), intermédio (músculos da cintura) e lateral (músculos dos membros). Os neurônios motores gama, são menores e encontram-se em grande quantidade, dispersos entre os alfas, estes inervam as fibras intrafusais e por isso são também referidos como fusiformes (THOMSON; HAHN, 2012). Mudanças recentes na estrutura da população sugerem um envelhecimento demográfico, e isso explica a busca atual pela compreensão dos mecanismos desse processo natural. Sabe-se que a senescência, como processo biológico, assume mudanças morfofisiológicas, promovendo diversas alterações, dentre elas a deterioração motora, podendo causar grande impacto na qualidade de vida. No entanto apesar da literatura concordar que mesmo os mais saudáveis idosos experimentam alterações das funções dos sistemas cognitivo e motor, independentemente da espécie pouco se sabe acerca dos mecanismos que regem a dinâmica neural. Levando-se em consideração que sem os circuitos neuronais especiais da medula espinal, nem mesmo os mais complexos sistemas de controle motor do cérebro podem causar qualquer movimento muscular intencional, já que o cérebro envia apenas sinais de comando, dando orientações para a medula controlar as atividades motoras, e de que com o avançar da idade várias modificações morfológicas e fisiológicas ocorrem no sistema nervoso, fica evidente a importância da caracterização morfoquantitativa dos neurônios motores da medula espinal. 5 Vimos que diversos estudos (GORSKI; LOMBROSO, 1999), (FORGER, et al. 2016), (SIMERLY et al. 2002), (DAMIANI et al. 2005), apontam que existem alterações no sistema nervoso com relação ao dimorfismo sexual, sejam elas alterações celulares, fisiológicas ou anatômicas. Mas diante da complexidade deste fenômeno, ele ainda é muito pouco entendido. Muito já se sabe a cerca de componentes cerebrais, mas percebemos que neste campo de estudo ainda há uma lacuna com relação aos componentes da medula espinal. Na busca de contribuir para uma maior compreensão dos circuitos neurais nos diferentes sexos, no que diz respeito a população de neurônios motores da medula espinal, este trabalho foi pensado. O sagui foi escolhido como modelo experimental pelo fato do mesmo ser nativo do Brasil, não correr risco de extinção, ser de pequeno porte, apresentar boa capacidade de reprodução em cativeiro, e estarem próximos ao ser humano na escala filogenética. Dessa forma entender como o sistema nervoso motor do sagui, responde ao avanço da idade, bem como nos diferentes gêneros, poderá aprofundar na compreensão de como o mesmo fenômeno acontece em seres humanos, já que grande parte dos trabalhos são realizados apenas com roedores. Desta forma, este estudo visou estimar morfoquantitativamente (por meio de delineamento estereológico) os neurônios pertencentes ao corno anterior da medula espinal de saguis machos e fêmeas, que se encontravam em três períodos distintos do desenvolvimento pós-natal, (jovem, adulto ou senil), permitindo que se fizesse uma associação entre faixa etária e gênero com relação ao volume referência (do órgão e do corno estudado), bem como à densidade de volume neuronal, volume total, número total e volume médio destes neurônios. Podemos afirmar que os dados que estão sendo gerados nesta pesquisa possuem relevância dada a natureza do objeto de estudo (devido a sua proximidade filogenética com humanos) bem como a forma de abordagem das análises estruturais, de modo que contribuirá com o entendimento do processo de envelhecimento do sistema nervoso motor. 6 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Macroestrutura e Microestrutura da medula espinal A medula espinal é uma estrutura alongada, que apresenta forma aproximadamente cilíndrica, ligeiramente achatada no sentido ântero-posterior, sendo constituída por uma parte central de substância cinzenta, circundada por revestimento externo de substância branca. Em cortes transversais, a substância cinzenta é vista como um pilar em forma de “H” ou de borboleta. (MACHADO; HAERTEL 2014) (WATSON, et. al, 2015) (Figura 1). 7 Figura 1 Fotografias de secções transversais mostrado a anatomia da medula espinal do sagui. Em (A) representação do segmento cervical; (B) representação do segmento torácico; (C) representação do segmento lombar; (D) representação do segmento sacral. (Adaptado de WATSON, et. al, 2015 ) A medula espinal é revestida em sua superfície por três meninges, são elas: pia- máter, aracnóide-máter e dura-máter. As meninges e o líquido cerebrospinal (LCS), juntos a circundam e a protegem. A pia-máter trata-se de uma membrana delicada e transparente, localizada na camada mais interna. O LCS está localizado no espaço subaracnóideo, entre a pia-máter e a aracnóide-máter. Externamente à aracnóide-máter está o espaço sub-dural seguido da dura-máter, um revestimento espesso e rígido. A dura- máter da medula espinal é separada do osso adjacente da coluna vertebral por um espaço extra-dural cheio de gordura. (MOORE; DALLEY, 2001) 8 As meninges e a medula espinal encontram-se dentro da coluna vertebral. No feto de 3 meses, a medula espinal e o canal vertebral possuem o mesmo comprimento, mas a partir daí coluna vertebral cresce mais rapidamente de modo que no adulto, a medula se estende do forame magno ao nível da segunda vértebra lombar, assim a medula espinal adulta ocupa apenas os dois terços superiores da coluna vertebral.(CRAVEN, 2004) Assim como a coluna vertebral, a medula espinal também está dividida em regiões: Cervical, torácica, lombar, sacral e coccígea. No homem ela é composta por segmentos medulares que correspondem a 31 pares de nervos espinais, sendo 5 cervicais, 12 torácicos, 5 lombares, 5 sacrais e 1 coccígeo. Os nervos espinais emergem em intervalos regulares, a partir dos forames intervertebrais, eles são vias de comunicação entre a medula espinal e regiões específicas do corpo, e são formados por raízes dorsais (sensitivas) e raízes ventrais (motoras) tanto à direita quanto à esquerda do corpo. (MARTINI; TIMMONS; TALLITSCH, 2009) (DÂNGELO; FATTINI, 2010). Nas variadas espécies de animais, quer domésticos ou não, a morfologia e as relações da medula espinal diferem entre si. No cão, esta estrutura é composta por 36 segmentos, sendo 8cervicais, 13 torácicos, 7 lombares, 3 sacrais e 5 coccígeos. Nesta espécie, a referida estrutura termina entre a sexta e a sétima vértebras lombares. (HENKER et al., 2018) No sagui (Callithrix jacchus), a medula espinal é constituída por 34 segmentos, sendo 8 cervicais, 12 torácicos, 7 lombares, 3 sacrais e 4 segmentos coccígeos. Segundo WATSON et. al. (2015), a medula espinal do sagui podes ser dividida anatomicamente e funcionalmente em 6 regiões: a pré-braquial (C1-C3) que enerva os músculos do pescoço, braquial (C4-C8) responsável por enervar os membros superiores, pós-braquial (T1-L1) contendo os neurônios pré-ganglionares do sistema nervoso simpático, crural (L2-L5) que inerva os membros inferiores, pós-crural contendo os neurônios pré-ganglionares do sistema nervoso parassimpático e caudal responsável por inervar a cauda e cada uma dessas regiões apresentam peculiaridades, deste modo, secções em níveis distintos implicarão em significativas diferenças morfológicas. (HENKER et al., 2018) (Figura 2). 9 Figura 2 - Fotografia demonstrando a segmentação da medula espinal de um sagui. A medula espinal foi dividida em segmentos sob um microscópio de dissecção, com base no padrão de saída das raízes dorsais dos nervos espinhais. C, cervical; T, torácico; L, lombar; S, sacral; Co, coccígeo. (WATSON et al., 2015.) Quando a medula espinal é vista externamente, duas intumescências proeminentes podem ser observadas, a superior, chamada intumescência cervical e a inferior, chamada de intumescência lombar. A intumescência cervical é a fonte dos grandes nervos espinais, que suprem os membros superiores. A intumescência lombar é a fonte dos grandes nevos espinais, que suprem os membros inferiores. A formação destas intumescências se deve pela maior quantidade de neurônios e, portanto, de fibras nervosas que entram ou saem destas áreas. (TORTORA; DERRICKSON, 2010)(GRAY; GOSS; MAYO, 2007). Inferiormente à intumescência lombar, a medula espinal termina com uma estrutura coniforme afilada, chamada de cone medular, partindo do cone medular encontra-se o filamento terminal, no qual extensões das meninges ancoram a medula ao cóccix. O filamento terminal é cercado pelos nervos espinais caudais, cuja coleção é chamada de cauda equina (MENESES, 2011). 10 A substância cinzenta contém uma grande concentração de corpos celulares dos neurônios, além de neuroglia e vasos sanguíneos. Podemos distinguir de cada lado, três colunas ou cornos, que são os cornos anterior, posterior e lateral. Este último corno está presente nos segmentos torácicos e lombares superiores da medula. (SNELL, 2003) (Figura 3) Figura 3- Secção transversal esquemática da medula espinal. (MACHADO; HAERTEL, 2014) Essa divisão anatômica tem uma certa correspondência com a disposição funcional dos neurônios que são encontrados nas três diferentes regiões. O corno posterior é essencialmente sensitivo, o intermédio é responsável por funções autônomas. Já no corno anterior predominam os neurônios motores, ou motoneurônios, cujos axônios irão sair pela raiz ventral dos nervos espinais para inervar os músculos somáticos. As raízes dorsais e as raízes ventrais fundem-se ao nível dos forames intervertebrais (LORENZ; COATES; KENT, 2011) (DIAZ; MORALES, 2016). A substância cinzenta da medula espinal também pode ser dividida em porções menores, chamadas lâminas de Rexed (em homenagem ao neurocientista que as descreveu no início dos anos 50). Ele subdividiu a substância cinzenta nas 10 lâminas eponímicas enumeradas como: as lâminas de Rexed I a X. Primeiramente ele subdividiu em gatos e mais tarde a divisão foi extrapolada para humanos. As lâminas de I a IX estão dispostas de dorsal a ventral, enquanto a lâmina X consiste em um círculo de células ao redor do canal central. As lâminas correspondem a tipos celulares específicos com 11 significado funcional. As lâminas de I a VI estão relacionadas a aferências sensitivas, correspondendo ao corno dorsal da substância cinzenta. As lâminas VII e VIII são locais onde a maioria dos interneurônios é encontrada. A Lâmina IX, corresponde ao corno ventral, nela estão contidas as maiores células da medula espinal, os neurônios motores alfa que suprem fibras musculares extrafusais esqueléticas. (BICAN; MINAGAR; PRUITT, 2013) (DIAZ; MORALES, 2016) (BROWN; FYFFE, 1981). Dentro da lâmina IX podemos delimitar grupos de neurônios motores. O grupo ventromedial inerva a musculatura axial do corpo. O grupo dorsolateral inerva a musculatura apendicular, ou seja, dos membros. (COSENZA, 2013) (MACHADO; HAERTEL 2014) (Figura4) Figura 4 Imagem de seção transversal da medula espinal do sagui no nível de C7, dividida de acordo com as lâminas de Rexed. No corno anterior está descrito : 8Sp - lâmina VIII de Rexed (Circulada de verde) bem como a lâmina IX de Rexed com os seus agrupamentos de neurônios motores : Ax9 - neurônios motores axiais; FEx9 - neurônios motores extensores do antebraço; FFl9 - neurônios motores flexores do antebraço; Pec9 - neurônios motores peitorais; Tr9 - neurônios motores tríceps; LD9 - neurônios motores latissimus dorsi; (Destacados de vermelho) (Adaptada de WATSON, et al., 2015) 12 Os neurônios motores podem ser classificados em Neurônios Motores Superiores (NMS) ou primeiros neurônios e Neurônios Motores Inferiores (NMI) ou segundos neurônios. Os NMS, estão localizados na área motora do na área motora do córtex cerebral (giro pré-central), enquanto os neurônios motores inferiores (NMI), estão localizados tanto no tronco cerebral quanto na porção anterior da medula espinal. Os NMS regulam a atividade dos NMI, através do envio de mensagens químicas (neurotransmissores), o que promove a contração dos músculos voluntários do corpo. Os NMI na medula espinal ativam músculos estriados voluntários do corpo, tais como aqueles dos membros (superiores e inferiores), tronco, pescoço, bem como do diafragma. (THOMSON; HAHN, 2012)(LAHUNTA; GLASS; KENT, 2014). A substância branca, conforme mencionado anteriormente circunda a substância cinzenta. Suas fibras podem ser agrupadas de cada lado em três funículos ou cordões: funículo anterior, funículo lateral e funículo posterior. Cada funículo contém diversos feixes de fibras que conduzem impulsos nervosos em sentido ascendente, descendente e associação. (MARTIN, 2013)(Figura 3) É interessante notar ainda que na parte cervical e torácica alta da medula, o funículo posterior é dividido pelo sulco intermédio posterior em fascículo grácil e fascículo cuneiforme. Esses tratos medeiam posição, vibração e sensação de toque leve. Fibras de transmissão de sensação dos membros inferiores estão localizadas medialmente (fascículo grácil) e aqueles que transmitem a sensação dos membros superiores estão localizados mais lateralmente (fascículo cuneiforme) (DOWLATI, 2017) (MARTINEZ, 2014) (Figura 3). Os tratos ascendentes conduzem informações aferentes, que podem ou não chegar a consciência. Estas informações podem ser divididas em dois grupos principais: exteroceptivas, que se originam fora do corpo, como dor, temperatura e tato, e proprioceptivas, que se originam dentro do próprio corpo, por exemplo nos músculos e nas articulações. As sensações de dor e de temperatura ascendem pelo trato espinotalâmico lateral, as do tato leve e de pressão ascendem pelo trato espinotalâmico anterior. A informação inconsciente, oriunda dos músculos, das articulações, da pele e do tecido subcutâneo, atinge o cerebelo por meio dos tratos espino cerebelares anterior e posterior e do trato cuneo-cerebelar. A informação sobre dor, temperatura e tato élevada pelo trato espinotectal até o colículo superior do mesencéfalo. O trato espino-reticular representa a via, desde os músculos, as articulações e a pele, para formação reticular, ao 13 passo que o espino-ovilar representa uma via indireta para as informações adicionais atingirem o cerebelo (SNELL, 2003) Os principais feixes de fibras descendentes na medula espinal humana são chamados tratos córtico-espinais, que são as vias relacionadas aos movimentos voluntários, discretos e dependentes de habilidades, em especial, os das extremidades distais dos membros. Existem ainda outros quatro tratos descendentes, estes tem origem em estruturas do tronco encefálico e são chamados conforme o local emque se iniciam : rubro-espinal (tem início no núcleo rubro, situado no mesencéfalo), atua tanto sobre os neurônios motores alfa como sobre os neurônios gama, facilitando a atividade dos músculos flexores e inibindo dos extensores; vestíbulo-espinal (tem origem nos núcleos vestibulares, na altura do núcleo e da ponte), age de maneira inversa ao rubro, estando relacionado à atividade postural; retículo-espinal (inicia na formação reticular), podem facilitar ou inibir as atividades dos neurônios alfa e gama, estando envolvido no movimento voluntário e na atividade reflexa e tecto-espinal (origina-se do colículo superior do mesencéfalo), que está relacionado aos movimentos posturais reflexos, em resposta aos estímulos visuais. Todos esses tratos são importantes no controle da motricidade, as fibras do rubro-espinal e do córtico-espinal lateral influenciam preferencialmente os neurônios do grupo lateral, que controlam a musculatura apendicular, os demais irão atuar na musculatura axial (COSENZA, 2013) (MACHADO; HAERTEL, 2014)(SNELL, 2003) 14 2.2 Envelhecimento e medula espinal Os resultados apresentados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) demonstraram um aumento considerável da população com mais de 60 anos de idade para as próximas décadas, sendo de admitir que no ano de 2025 haja mais de 800 milhões de pessoas com idade superior a 65 anos e no ano de 2050 o número de idosos terá ultrapassado o número de jovens em todo o mundo. Assim sendo, este escalão etário reflete, atualmente, uma categoria social que não pode ser ignorada (FECHINE; TROMPIERI, 2012). O envelhecimento é um fenômeno que atinge todos os seres humanos. Sendo caracterizado como um processo dinâmico, progressivo e irreversível (LITVOC; BRITO, 2004), que pode variar de indivíduo para indivíduo, sendo gradativo para uns e mais rápido para outros (CAETANO, 2006). Pode-se dizer que entender o processo de envelhecimento é de suma importância pois para que se desenvolvam estratégias que atenuem os efeitos da senescência se faz necessário conhecer a etiologia associada aos processos degenerativos que lhe estão associados (TUDORAŞCU, et al., 2014). Sabe-se que resposta motora é uma das principais variáveis que sofrem declínio durante o envelhecimento, por isso o entendimento do controle motor e as principais alterações envolvidas vêm sendo exploradas por várias linhas de pesquisa ao longo das últimas décadas . Para De Vitta (2000), com o avanço da idade é notável a perda de massa muscular, normalmente conhecida como sarcopenia. Rossi e Sader (2002), dizem-nos que esta perda contribui para outras alterações relacionadas com o envelhecimento, destacando-se a diminuição da densidade óssea e a menor força muscular. Os mesmos autores dizem que essas alterações na musculatura (atrofia) é detectada mediante perdas gradativas e seletivas das fibras esqueléticas. Para eles, o número de fibras no adulto é 20% maior do que nos idosos. Hayflick (1997) acrescenta que, após os 65 anos, ocorre redução na força dos músculos do dorso e do antebraço. Entretanto a força muscular nas mãos aumenta até os 30 anos e diminui de forma muito rápida após os 40 anos. 15 Gallahue e Ozmun (2005) afirmam que os discos intervertebrais dos idosos na maioria das vezes perdem uma porção do conteúdo de água, tornando-se mais fibrosos. Essa mudança, combinada com alterações de densidade mineral óssea nas vértebras ocasionam a compressão dos discos, que, por sua vez, influencia na redução da coluna vertebral, causando a perda subsequente de altura. Com o envelhecimento, o sistema nervoso pode apresentar alterações comoredução no número de neurônios, redução na velocidade de condução nervosa, redução da intensidade dos reflexos, restrição das respostas motoras, do poder de reações e da capacidade de coordenações (DE VITTA, 2000). Para Cançado e Horta (2002) o sistema biológico mais comprometido com o envelhecimento é o Sistema Nervoso Central (SNC).Esses autores expressam que o SNC é definido como unidades morfofuncionais pós-mitóticas, sem possibilidades reprodutoras, estando sujeito a fatores intrínsecos (genética, sexo, etc.) e extrínsecos (ambiente, sedentarismo, etc.), que exercem ações deletérias com o tempo, podendo ocorrer variações com uma mínima perda celular em uma região e prejuízos mais pronunciados em outras. Gallahue e Ozmun (2005) constataram que, no período compreendido entre os 20 e 90 anos, o córtex cerebral experimenta perda de 10% a 20 % de massa, podendo ocorrer em outras partes do cérebro prejuízo de até 50%. Assim, eles também acreditam que à medida que o cérebro envelhece, ocorre decréscimo no número de células nervosas. Embora haja o impacto do envelhecimento na função do sistema nervoso central como um todo, ainda há uma quantidade limitada de informações sobre as alterações que afetam a composição da medula espinal. Portanto, é fundamental buscar entender como esse componente tão importante do sistema nervoso motor muda com o avançar da idade. Tanaka (1984) e Tanida (1996) buscando alterações na medula cervical relataram que a área da medula espinal não tem correlação com a idade. Ishikaw et al. (2003) por meio de um estudo prospectivo em ressonância magnética (RM) e radiografia, viram que a área transversal da medula espinal cervical diminuiu com a idade, bem como o canal medular ósseo tornou-se mais estreito no decorrer do envelhecimento. Enquanto Laing et al. (2014) estudando os efeitos da idade na morfometria da medula espinal cervical e da coluna vertebral de ratos, demonstraram claramente que todas as variáveis analisadas (profundidade, largura, etc.) foram significativamente maiores nos animais idosos. 16 Presume-se que o processo de envelhecimento afete as unidades motoras por perda de motoneurônios ou atrofia das fibras musculares (TUDORAŞCU, et al., 2014) Seguindo essa linha de pesquisa, pela macroeletromiografia o tamanho da unidade motora foi avaliado entre jovens e idosos tanto no primeiro músculo interósseo dorsal, um músculo da mão por Masakado et al. (1994) quanto no músculo tibial anterior por Fling et al. (2009). O princípio do tamanho das unidades motoras foi preservado em ambos os estudos. Terao et al. (1996), relataram um declínio tanto dos pequenos motoneurônios, sendo este bastante significativo, quanto dos motoneurônios grandes, sendo este um declínio discreto ao longo da idade adulta. Fu et al. (2015) por sua vez, usaram o método fracionador isotrópico para revelar alterações associadas ao envelhecimento com relação ao número de células neuronais e não neuronais abrigadas pela medula espinal, e diferentemente do estudo supracitado detectaram que tanto o número de células neuronais quanto o número de células não neuronais aumentaram, com o avanço da idade. Eles viram que a diminuição ocorre com relação a densidades neuronais e não neuronais. Notamos, portanto que aspectos importantes que envolvem as alterações motoras sofridas pelo sistema nervoso, e em especial pela medula espinal permanecem não esclarecidos na literatura atual. Vale ressaltar ainda que os resultados destes estudos não são consistentes, pois os métodos de medição utilizados, permitem diversos possíveis erros, fazendo-se assim necessárias mais pesquisas com o intuito de preencher essa lacuna que existe acerca do tema. 2.3 Gênero e medula espinal Experiências em animais têm mostrado que circuitos específicos se desenvolvemde acordo com o sexo do animal, diferenciando os circuitos neurais no Sistema Nervoso Central (SNC) (DAMIANI, et. al, 2005). De acordo com Bao e Swaab (2007) o núcleo perivetricular hipotalâmico possui diferenças entre os gêneros, homens possuem maior número de neurônios nessa região se comparado às mulheres. Além disso, em homens esses neurônios aumentam em número com a idade, o que não se observa em mulheres. Gorski et al. (1978) viram que a área pré- optica medial (MPOA) é maior em machos do que em fêmeas. 17 Gorski e Lombroso (1999), acrescentaram que o volume do núcleo sexualmente dimórfico, situado na área pré-óptica (SDN-POA), é de quatro a cinco vezes maior em machos quando comparados a fêmeas. Forger, et al. (2016) detectaram que o núcleo ventromedial (VMH) é cerca de 25% maior em machos do que em fêmeas, sendo essa diferença dada tanto pelo tamanho do neurônio (corpo e dendrito), quanto pela densidade dendrítica. Segundo os mesmos autores, no núcleo arqueado, localizado também no hipotálamo o dimorfismo parece se dá na morfologia celular: enquanto nas fêmeas os astrócitos são bipolares, nos machos os mesmos são mais estrelados. De acordo com Simerly et al. (2002) as regiões do cérebro sexualmente dimórficas nem sempre são maiores nos machos, o núcleo periventricular anteroventral (AVPV), por exemplo é menor em machos que nas fêmeas, durante a fase adulta. Além das diferenças de número, volume, densidade, morfologias celulares, etc., de estruturas cerebrais, machos e fêmeas também podem apresentar divergências com relação à medula espinal. Estudos de Damiani et al. (2005) relatam que o núcleo espinal bulbocavernoso (SNB) é uma região sexualmente dimórfica. Segundo Damiani et al. (2005) o músculo bulbocavernoso é controlado por um grupo de neurônios motores chamado de núcleo de Onuf, o qual se encontra na região sacral da medula espinal e ele está presente em ambos os sexos, porém de maneira diferente, havendo mais neurônios motores em homens do que em mulheres, uma vez que nas mulheres o músculo bulbocavernoso (o qual o núcleo inerva) é menor, circundando apenas a abertura da vagina, servindo para constringi-la levemente. Os mesmos autores acreditam que há uma degeneração desses motoneurônios e uma consequente atrofia da musculatura bulbocavernosa nas fêmeas e que já em machos a produção de androgênios protege os neurônios da apoptose. Lenz e Sengelaub (2006) dizem que essa diferença se dá após o nascimento, período em que ocorre morte celular e desenvolvimento dendrítico dos motoneurônios, Forger e Breedlove (1986), também viram que além das fêmeas apresentarem significativamente menos motoneurônios e volumes nucleares menores do que os machos, as mulheres tratadas com o andrógeno no início do desenvolvimento não diferem significativamente dos machos no número de motoneurônios e possuem mais neurônios e maiores volumes nucleares do que as fêmeas não tratadas. 18 De acordo com Cruz-sánchez et al. (1997), que fez uma avaliação da perda neuronal, astrocitose e anormalidades dos componentes citoesqueléticos de neurônios motores grandes do corno anterior durante o envelhecimento, percentuais semelhantes de diminuição de neurônios motores foram observados em cada segmento da medula espinal de acordo com o avanço da idade, mas não foram observadas diferenças significativas entre os sexos. Silva et al. (2013) em uma análise topográfica-vértebro-medular do sagui (Callithrixjacchus), não encontraram diferença significativa entre machos e fêmeas nos valores médios para o comprimento da medula espinal, da intumescência cervical, da intumescência lombar e do cone medular. No artigo de Bahney e Von-Bartheld (2017) as estimativas de número total de células encontradas na medula espinal da mesma espécie (Macaca fascicularis) do artigo de Burishet al. (2010), foi de três a seis vezes menor. Supõe-se que esta diferença esteja relacionada ao gênero, tendo em vista que os espécimes utilizados por Bahney e Von- Bartheld(2017) foram fêmeas, enquanto que as espécies de Burish et al. (2010) foram machos. No entanto, o efeito do sexo no número de células na medula espinal do primata ainda não é claro (BURISH et al., 2010). 2.4 Aspectos morfoquantitativos da medula espinal Apesar dos trabalhos publicados, informações sobre os números reais dos neurônios motores na medula espinal ainda são, no entanto, divergentes, ou seja,a incerteza permanece em termos de composição numérica, tanto para a medula espinal humana quanto para a não-humana (HERCULANO-HOUZEL, 2017). Sirkin e Kuhlenbeck (1966) estimaram que existem entre 80.000 e 160.000 neurônios motores na medula espinal humana, Alverdes (1956) deu o número como 100.000 para toda a extensão da medula, sendo esta afirmação citada por Tomlinson et al. (1973). Enquanto estimativas derivadas de projeções indiretas postulavam que a medula espinal humana continha 13,5 milhões de neurônios (com base na extrapolação da medula espinal de cães), 20 milhões de neurônios (baseados na extrapolação de medula espinal de macaco, Herculano-Houzel (2017) ou um bilhão de neurônios. (TOMLINSON et., 1973) O estudo de Burishet al. (2010) usou o fracionador isotrópico para estimar o número total de células na medula espinal de oito espécies de primatas não humanos(entre 21 e 19 380 milhões), bem como o número de neurônios (entre 1,7 e 11,4 milhões), este trabalho sugeriu um limite superior para a relação glia-neurônio (GNR) de quase 40: 1. Em um estudo recente de Bahney et al 2017 foi examinado a composição celular da medula espinal tanto de humanos quanto de primatas não humanos, empregando a estereologia. As razões de células não neuronais e de neurônios nas medulas espinais de humanos e primatas não-humanos foram de 6:5 e 3:2, respectivamente, sugerindo que o relato anterior superestimou essa relação. Os autores não encontraram diferenças segmentares significativas na composição celular entre os níveis cervical, torácico e lombar. Com relação ao número de células neuronais e não neuronais das medulas espinais humanas, as estimativas foram de 1,5 a 1,7 bilhões de células não neuronais e 197 a 222 milhões de neurônios (13,4% de neurônios, 12,2% de células endoteliais, 74,8% de células gliais). No exemplo acima o delineamento estereologico foi voltado para quantificação do número total de células. Mas há várias aplicações para o método. Na pesquisa de Baastrup et al. (2010), por exemplo ele utilizou a estereologia nas lesões da medula espinal de ratos, com o intuito de observar a localização e o tamanho das mesmas. A estereologia é um conjunto de métodos baseados em amostragem Sistemática Uniforme e Aleatória (SURS), fornecendo dados morfoquantitativos confiáveis sobre estrutura de interesse (OLESEN et al., 2017).É um campo interdisciplinar que se preocupa em grande parte com a interpretação tridimensional de secções planas de materiais ou tecidos e tem se tornado uma ferramenta cada vez mais importante e eficiente com aplicações nas ciências morfofuncionais(WALLOE et al., 2011). Todos os métodos estereológicos são, em princípio, imparciais e precisos conferindo credibilidadesobre as informações estruturaise as características morfoquantitativas do tecido (GUNDERSEN et al., 2002; OLESEN et al., 2017). Como vimos métodos bidimensionais podem levar a conclusões incorretas ou imprecisasmesmo quando a quantificação é feita de maneira cuidadosa, pois se tratam de problemas conceituais metodologicos.Sem um procedimento de amostragem confiável conhecido por produzir resultados precisos, o conhecimento do número total de neurônios motores na medula espinal normal, ainda corresponde a uma lacuna enorme na literatura. (GUNDERSEN et al 2002; TOMLINSON; IRVING, 1977) 20 2.5 O modelo experimental: Sagui (Callithrix jacchus) Por serem filogeneticamente as espécies mais próximas de humanos, primatas não humanos são modelos bastante interessantes para pesquisas neurocientíficas. Dentre eles, o sagui (Callithrix jacchus), primata do Novo Mundo, pertencente à família Callitrichidae, (KINZEY, 1997), nativo do Brasil, que habita principalmente as regiões da caatinga e do cerrado brasileiro (STEVENSON; RYLANDS, 1998) vem adquirindo maior importância para a investigação em neurociência e áreas afins, incluindo a farmacologia, etologia, genética, endocrinologia e biologia reprodutiva. (NEWMAN et al., 2009) (Figura 5) Esta espécie destaca-se por sua utilização histórica em prol da biomedicina, (MANSFIELD, 2003) e vem sendo apontada como um importante modelo experimental nas pesquisas biomédicas em todo o mundo. Os animais desta espécie, possuem grande importância na área da pesquisa devido ao seu pequeno porte, facilidade no manejo, biossegurança e peculiaridades fisiológicas. (ABBOTT et al., 2003) Figura 5– Sagui (Callithrix jacchus)(Fonte: © 2019 Pixabay) O sagui é um modelo ideal para estudos com envelhecimento por possuir um dos menores tempos de vida entre os primatas, (TARDIF et al., 2011) o que permite a 21 avaliação longitudinal dos animais, desde a idade jovem até idade senescente (COLMAN, 2018). Ele apresenta uma alta capacidade reprodutiva, atingindo a maturidade sexual em torno dos 14 meses (RYLANDS et al., 1996). A gestação é de aproximadamente 140 dias, o que no geral garante 2 partos gemelares por ano, mesmo em cativeiro. Os filhotes nascem com 20 a 35 gramas, sendo amamentados em média por 100 dias. (STEVENSON; RYLANDS, 1998) A partir de dois anos de idade, eles alcançam a vida adulta, estendendo-se até os 8 anos, quando algumas características do envelhecimento se tornam mais evidentes, como por exemplo, escassez dos tufos de pelos ao redor da orelha e “enrugamento” da pele no rosto. (ABBOTT et al., 2003) A expectativa de vida no campo é de cerca de 10 anos, podendo atingir 16 anos no cativeiro. (RYLANDS et al., 1996) No ambiente natural são considerados arborícolas, diurnos, onívoros, alimentando- se principalmente de insetos e de grande variedade de matéria vegetal, como resinas arbóreas e frutos (CASTRO, 2003). Entretanto, são facilmente manuseados, sendo adaptáveis à vida em cativeiro. Morfologicamente, o sagui apresenta pouco ou nenhum dimorfismo sexual. Sendo caracterizados pela presença de garras, tufos de pêlos brancos em volta das orelhas, mancha branca na testa, finos anéis cinza-claros e largos anéis negros-agrisalhados em toda sua vasta pelagem, e cauda não-preênsil de tamanho longo, o que lhe confere equilíbrio (VIVO, 1991).O seu peso varia entre 230 a 420g, com comprimento do corpo medindo cerca de 30 cm. (ABBOTT et al., 2003) 22 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral Caracterizar morfoquantitativamente a medula espinal do sagui (Callithrix jacchus) com ênfase no corno anterior e nos motoneurônios, através de técnicas estereológicas, investigando as possíveis diferenças entre machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós natal (maturação e o envelhecimento) 3.2. Objetivos específicos Estimar os seguintes parâmetros da medula espinal em saguis:  Volume referência substância branca (Vrefbranca)  Volume referência substância cinzenta (Vrefcinzenta)  Volume referência corno anterior (Vrefcorno)  Densidade de volume do corno anterior (Vv)  Volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior (Vtot)  Número total de neurônios do corno anterior (N)  Volume médio de neurônios do corno anterior (vn) 23 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Sujeitos experimentais Todos os procedimentos descritos nesta pesquisa foram aprovados pela Comissão de Ética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN), sob o número de protocolo: 055/2019 (ver anexos). As medulas coletadas foram provenientes de animais utilizados em outros estudos que ocorreram no Núcleo de Primatologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), devidamente registrado (n° 1/24/92/0039-00) no Instituto Brasileiro do Meio Ambiente (IBAMA). Todos os procedimentos experimentais, foram desenvolvidos no Laboratório de Neuroanatomia (LABNEURO), pertencente ao Departamento de Morfologia (DMOR) da UFRN. Nesse sentido, esse estudo está em total conformidade com a Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais para fins Científicos e Didáticos. Foram utilizados 18 (dezoito) saguis (Callithrix jacchus) saudáveis, de diferentes faixas etárias (com idade entre 16 meses e 13 anos e 7 meses), sendo dez machos e oito fêmeas. Os mesmos foram então alocados em seis grupos, conforme tabela abaixo (Tabela 1). As faixas etárias foram estabelecidas de acordo com ABBOTT et al., 2003 (Tabela 2). Tabela 1 – Distribuição do número de animais por faixa etária e gênero. 24 Tabela 2 - Classificação da faixa etária por idade de acordo com a literatura. (Baseado em ABBOTT et, al., 2003) 4.2 Procedimento anestésico Os animais foram tranquilizados previamente com uma dose pré-anestésica de 10mg/kg quetamina e5mg/kg diazepan, via intramuscular. Como medicação anestésica, os animais receberam em associação quetamina e xilazina, nas doses de eutanásia de 90mg/kg e 15mg/kg respectivamente, ambos aplicados pela via intramuscular, seguido do anestésico inalatório isoflurano até atingirem o óbito. 4.3 Perfusão Atestado o óbito, os animais foram submetidos à perfusão transcardíaca, de acordo com o seguinte protocolo: 1 - Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame e sob ponto de água; 2 – Toracotomia; Nesta etapa o processo xifoide foi preso com o auxílio de uma pinça Allis, tracionando-o para cima, depois houve o incisão da pele e partes moles, dando acesso à cavidade torácica, seguido de uma incisão do músculo diafragma, para a exposição do coração. 3 - Cardiopunção; Foi introduzida uma agulha conectada a uma bomba peristáltica (Cole Parmer) no ápice do ventrículo esquerdo do coração, posicionando-a na direção da aorta ascendente então foi realizada uma incisão no átrio direito e a agulha foi ligada à bomba a um fluxo de 60ml/min, promovendo-se a impulsão de 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, com o objetivo de lavar todo o sistema 25 circulatório, seguido de 700 ml de uma solução de formaldeido a 4% em tampão fosfato 0,1M, Ph 7,4, (a primeira metade a um fluxo inicial de 60 ml/min e a segunda metade a um fluxo mais lento, de 30 ml/min). O tempo da perfusão foi de aproximadamente 40 minutos. 4.4 Remoção da medula A retirada da medula iniciou-se mediante incisão e afastamento da pele na linha mediana dorsal, desde a região cranial até a base da cauda, e seguiu com a remoção da musculatura epiaxial, para isso foram utilizados instrumentos cirúrgicos. Em seguida foi feita a remoção dos arcos vertebrais, mediante o uso de alicates de corte lateral e o rebatimento das meninges, para a exposição da medula. As medulas foram removidas da coluna vertebral, divididas em três porções e pós-fixadas na mesma solução fixadora (formaldeido a 4%) por pelo menos 72h. (Figura 6) Figura 6 – Imagem mostrando o processamento e remoção da medula espinal. Da esquerda para direita temos a remoção da musculatura epiaxial, a remoção dos arcos vertebrais e a divisão em três porções. (Fonte: Pessoal) 26 4.5 Biometria e Processamento histológico Cada porção da medula espinal foi medida e pesada, utilizando um paquímetro e uma balança de precisão.(Figura 7) Figura 7 –Imagem mostrando a realização da biometria da medula espinal. À esquerda temos a medição de uma porção torácica da medula, utilizando o paquímetro. Na direita a pesagem de uma porção lombar, por meio da balança de precisão. (Fonte: Pessoal) A partir daí a medula foi seccionada em vinte segmentos equidistantes, sendo a metade deles amostrados, para a obtenção da primeira fração (Fseg), estes foram levados para a imersão em tampão sacarose 30% 0,1M, pH 7,4, no qual permaneceram nessa solução por 24 horas para garantir a crioproteção. Terminada esta etapa, cada segmento foi embebido individualmente, contendo gel Tissue-Tek® OCT Compound. Com isso, deu-se início o processo de criomicrotomia, que foi realizado em um criostato Lupetec® CM2850, com temperatura abaixo de -20 ºC. As secções obtidas foram seriadas e uniformes a uma espessura de 30 μm. As secções foram armazenas em solução anti-congelante e todas as secções de um mesmo segmento foram colocadas no mesmo compartimento de coleta. Então uma secção de cada segmento foi montada em lâmina, de maneira sequenciada, totalizando dez secções em cada lâmina para representação de um animal. Nesta etapa foram utilizadas lâminas gelatinizadas e os cortes de tecido foram previamente lavados em solução de tampão fosfato 0,1M pH 7,4, a fim de obter maior aderência. O tempo de secagem foi de 60 minutos, e deu-se início então a coloração pelo método de Nissl, segundo o protocolo descrito abaixo. (Figura 8) 27 (Tabela. 3) As lâminas permaneceram mergulhadas no xilol II até a montagem das lamínulas com Erv-Mount sobre as lâminas, que se deu logo em seguida. Esta técnica tem como finalidade delimitar os grupamentos neuronais. Figura 8– Imagem mostrando o procedimento da coloração de Nissl. (Fonte: Pessoal) 28 Tabela 3 - – Protocolo Coloração de Nissl - LABNEURO 4.6 Obtenção das imagens As secções da medula montadas em lâminas histológicas foram analisadas em campo claro através de microscópio óptico (Nikon Eclipse Ni-U). As imagens digitais foram obtidas através de uma câmera de vídeo (Nikon DS-Ri1) acoplada ao microscópio (Nikon Eclipse Ni-U), ajustado com as objetivas de 2x e 20x, conectada a um computador com o software NIS instalado. 29 4.7 Análises estereológicas 4.7.1 Volume e referencia (Vref) O volume referência foi estimado a partir da aplicação do princípio de Cavalieri, assim o volume das substâncias branca (Vrefbranca) e cinzenta da medula espinal (Vrefcinzenta), bem como o volume do corno anterior (Vrefcorno)foram estimados, ou seja, de todo o órgão e um volume referência da região de interesse. Para essa etapa foram utilizadas as imagens em objetiva de 2x para que se pudesse observar toda a área seccional. As diferenças de coloração evidenciadas pelo método de Nissl foram utilizadas como critério de delimitação citoarquitetônica das regiões. Para tal, um sistema teste quadrático com área conhecida foi aplicado sobre a imagem de toda a medula (Figura 9) e a seguinte fórmula foi utilizada: V= ∑p . (a/p) . t . (F -1seg ) . (F -1 sec ) Onde ∑p é o somatório de pontos do sistema teste que tocam a estrutura desejada (neste caso substância branca, substancia cinzenta ou o corno anterior); a/p é a área associada a cada ponto do sistema teste, t é a espessura das secções,F -1seg é a fração de amostragem dos segmentos e F -1 sec é a fração das secções. O valor da F -1seg , foi proveniente da divisão da medula em vinte segmentos iguais, os quais foram amostrados de forma aleatória (por meio do uso de uma tabela de números aleatórios), dessa forma apenas os segmentos de números ímpares ou pares, ou seja, dez segmentos foram utilizados para cada animal. Como esta fração está elevada a potência de (-1), o valor utilizado na equação é o inverso da razão de segmentos aleatoriamente 1 amostrados por segmentos totais (10 = ), ou seja, 2. 20 2 O valor da F -1sec foi proveniente do fatiamento de cada segmento (supracitado), em secções de 30 µm de espessura. A F -1sec é representada pelo inverso da razão de espessura da secção pelo comprimento de segmento. Como o comprimento total da medula espinal variou entre os animais, temos que o valor de F -1sec é diretamente proporcional aos valores do tamanho de segmento em cada animal. 30 Figura 9- Imagem de secção transversal da medula espinal do sagui num aumento de 2x demonstrando a aplicação do Princípio de Cavalieri para a estimativa do volume referência das substâncias branca, cinzenta e do corno anterior. Observa-se o sistema teste utilizado (cruzes pretas) a/p 57816,2 µm². Coloração: Nissl.Escala de barra: 500 µm. 31 4.7.2 Densidade de volume do corno anterior (Vv) A densidade de volume, ou seja, o espaço ocupado por todos os neurônios motores no corno anterior, se deu através da aplicação do método de Delesse. Para essa etapa foram utilizadas as imagens em uma objetiva de 20x, nas quais aplicou-se um grid que serviu para contagem do número de pontos do sistema que tocam os corpos celulares (PN) eonúmero de pontosquetocamtodooespaço de interesse (PT) (Fig. 10), sendo o espaço de interesse delimitado visualmente pelos aglomerados de neurônios motores presentes no corno anterior. As diferenças de evidenciadas pelo método de Nissl foram utilizadas como critério de identificação das células. Desse modo a densidade de volume (Vv) foi calculada com a seguinte formula: Vv (%) = ∑ PN/ ∑ PT . 100 Figura 10 – Imagem da secção transversal da medula espinal do sagui num aumento de 20x demonstrando a aplicação do Princípio de Delesse para a estimativa da densidade de volume neuronal do corno anterior. Observa-se o sistema teste utilizado (cruzes pretas). Coloração: Nissl. Escala de barra: 100 µm. 32 4.7.3 Volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior (Vtot) O volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior, se deu através da aplicação da seguinte equação: Vtot = Vv . Vrefcorno Onde: Vtot é o volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior; Vv é a densidade de volume de neurônios do corno anterior; Vref é o volume referência do corno anterior. 4.7.4 Número total de neurônios do corno anterior (N) O número total de neurônios do corno anterior, foi estimado por meio do método do fracionador pela ferramenta do dissector óptico (Figura 11) e (Figura 12). Através da aplicação da seguinte fórmula: − 𝑵 ≔ ∑𝑸 . 𝑭−𝟏 . 𝑭−𝟏 . 𝑭−𝟏 .𝑭−𝟏 𝑺𝒆𝒄çã𝒐 𝑺𝒆𝒈𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 Á𝒓𝒆𝒂 𝑨𝒍𝒕𝒖𝒓𝒂 Onde: 𝐹−1 𝑆𝑒𝑐çã𝑜 é a fração de amostragem das secções (2) 𝐹−1 𝑆𝑒𝑔𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 é a fração de amostragem dos segmentos (foi variável) 𝐹−1 é a fração de área que foi efetivamente contada (12,25) À𝑟𝑒𝑎 𝐹−1 𝐴𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 é a fração da espessura do corte efetivamente utilizada para contagem (1,5) Q- é o número de neurônios amostrados em disectors ópticos. (foi variável) 33 Figura 11 - Imagem (20x) representativa da frame do fractionator óptico para estimativa do número total de neurônios. Linhas vermelhas são de inclusão e linhas amarelas são de exclusão; pontos amarelos correspondem aos neurônios contabilizados na área delimitada. Coloração: Nissl; Escala de barra: 100µm. 34 Figura 12- Imagem (20x) representando seqüências do eixo Z de análise em que foi padronizado uma espessura de 20 µm. Em que em (A) temos a espessura “zero”; em (B), temos a espessura em 10 µm e em (C) a espessura em 20µm. O eixo Z de análise foi padronizado com 20 µm retirando as zonas de guardas da espessura total da secção (30µm). Coloração: Nissl; Escala de barra: 100µm. 35 4.7.5 Volume médio de neurônios do corno anterior (v) O volume neuronal, foi estimado pelo método do nucleator (Figura 12). Através da aplicação da seguinte fórmula: ?̅?𝑁 = 𝜋. 𝑡. ∑ 𝑙2𝑖 𝑖 Onde: li2 é uma distância medida a partir de um ponto fixo da célula, até uma borda arbitrariamente escolhida na mesma. O software estereológico utilizado foi o Stereo Investigator® versão 11.09. Figura 13 -Imagem (20x) representativa do nucleator para estimativa do volume médio neuronal. Linhas verdes são os pontos de contato. Setas amarelas representam os pontos de toque das linhas na membrana do neurônio. Coloração: Nissl; Escala de barra: 100µm. 36 4.8 Análise Estatística A análise estatística foi conduzida pelo teste de Análise de Variância ANOVA, Two Way seguida pelo teste post hoc de Tukey, realizada através do software estatístico Minitab 19®. O nível de significância foi fixado em p ≤ 0,05. 37 5 RESULTADOS As variáveis paramétricas estão sendo apresentadas aqui como média seguida do (CV); em que CV refere-se ao coeficiente de variação observado, sendo este o quociente entre o desvio padrão e a média. 5.1. Biometria da medula Os dados biométricos da medula espinal estão sumarizados na Tabela 4. Tabela 4 - Peso da medula espinal de sagui dado em gramas (g), comprimento (mm), nos diferentes grupos. Os valores de cada parâmetro são expressos como a sua média por grupo. Gênero Idade Peso (g) Comprimento (mm) Jovem 110,37 (0,07) 0,55 (0,09) Adulto 110,20 (0,07) Macho 0,59 (0,12) Senil 102,29 (0,31) 0,70 (0,3) Jovem 119,38 (0,06) 0,65 (0,11) Adulto 120,63 (0,04) Fêmea 0,58 (0,03) Senil 0,903 (0,0) 97,17 (0,0) 38 5.2. Volume referência medula espinal (Vref) 5.2.1. Volume referência da substância branca (Vrefbranca) Para volume da substância branca encontramos os seguintes resultados: Jovem macho: 220,89 mm³ (0,13); Adulto macho: 215,63 mm³ (0,32); Idoso macho: 218,30 mm³ (0,24); Jovem fêmea: 290,17 mm³ (0,27); Adulto fêmea: 175,03 mm³ (0,26); Idoso fêmea: 136,52 mm³ (0,0) (Figura 14) Figura 14-Gráfico representativo da estimativa de volume da substância branca da medula espinal nos diferentes grupos etários jovem, adultos e senil, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,132) 39 5.2.2. Volume referência da substância cinzenta (Vrefcinzenta) Para volume da substância cinzenta encontramos os seguintes resultados: Jovem macho: 126,31 mm³ (0,08); Adulto macho: 129,11 mm³ (0,28); Idoso macho: 103,04 mm³ (0,13); Jovem fêmea: 167,44 mm³ (0,24); Adulto fêmea: 117,94 mm³ (0,06); Idoso fêmea: 56,74 mm³ (0,0) (figura 15) Figura 15 - Gráfico representativo da estimativa de volume da substância cinzenta da medula espinal nos diferentes grupos etários jovem, adultos e idoso, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. O (*) indica onde foi observado diferença estatisticamente significativa (p = 0,015). 40 5.2.3Volume referência Total (Vreftotal) Para volume total da medula encontramos os seguintes resultados: Jovem macho: 347,21 mm³ (0,11); Adulto macho: 340,24 mm³ (0,29); Idoso macho: 321,34 mm³ (0,21); Jovem fêmea: 457,61 mm³ (0,25); Adulto fêmea: 292,97 mm³ (0,15); Idoso fêmea: 193,26 mm³ (0,0) (Figura 16). Figura 16 -Gráfico representativo da estimativa de volume da medula espinal como um todo nos diferentes grupos etários jovem, adultos e idoso, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,095) 41 5.2.4. Volume referência do corno anterior (Vrefcorno) Para volume do corno anterior encontramos os seguintes resultados: Jovem macho: 86,52 mm³ (0,02); Adulto macho: 75,43 mm³ (0,20); Idoso macho: 62,37 mm³ (0,16); Jovem fêmea: 93,28 mm³ (0,15); Adulto fêmea: 71,65 mm³ (0,11); Idoso fêmea: 36,79 mm³ (0,0) (Figura 17). Figura 17 - Gráfico representativo da estimativa de volume do corno anterior da medula espinal nos diferentes grupos etários jovem, adultos e idoso, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,001) 42 5.3 Densidade de volume do corno anterior (Vv) Para densidade de volume encontramos os seguintes resultados: Jovem macho: 7,6% (0,15); Adulto macho: 4,9% (0,09); Idoso macho: 5% (0,02); Jovem fêmea: 6% (0,27); Adulto fêmea: 6% (0,18); Idoso fêmea: 8,4% (0,0) (Figura 18). Figura 18-Gráfico representativo da densidade de volume de neurônios do corno anterior nos diferentes grupos etários jovem, adultos e senil, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,05) 43 5.4 Volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior (Vtot) Para o volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior, encontramos os seguintes resultados: Jovem macho: 6,6 mm³ (0,14); Adulto macho: 3,68 mm³ (0,23); Idoso macho: 2,83 mm³ (0,15); Jovem fêmea: 5,8 mm³ (0,31); Adulto fêmea: 4,15 mm³ (0,20); Idoso fêmea: 3,09 mm³ (0,0) (Figura 19). Figura 19-Gráfico representativo do volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior nos diferentes grupos etários jovem, adultos e senil, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,002) 44 5.5 Número total de neurônios do corno anterior (N) Para o número total de neurônios do corno anterior, encontramos os seguintes resultados: Jovem macho: 1.277.695,7 (0,24); Adulto macho: 1.277.148,9 (0,24); Idoso macho: 927.347,7 (0,45); Jovem fêmea: 1.840.202,7 (0,35); Adulto fêmea: 1.444.200,5 (0,59); Para esse parâmetro não foi possível utilizar a fêmea idosa por dificuldade na visualização de suas células. (Figura 20) Figura 20- Gráfico representativo do número total de neurônios do corno anterior nos diferentes grupos etários jovem, adultos e senil, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,07) 45 5.6.Volume médio de neurônios do corno anterior (v) Para o volume médio de neurônios do corno anterior, encontramos os seguintes resultados: Jovem macho: 3.293,8 mm³ (0,3); Adulto macho: 3.336,7 mm³ (0,17); Idoso macho: 3.088,6 mm³ (0,29); Jovem fêmea: 3.113,9 mm³ (0,3); Adulto fêmea: 2.943,7 mm³ (0,63); Para esse parâmetro não foi possível utilizar a fêmea idosa por dificuldade na visualização de suas células. (Figura 21). Figura 21- Gráfico representativo do volume médio de neurônios do corno anterior nos diferentes grupos etários jovem, adultos e senil, em fêmeas e machos. As médias dos grupos estão representadas nas barras verticais e o erro padrão da média (±EPM) nas barras horizontais, logo acima. (p= 0,1). 46 6. DISCUSSÃO 6.1 Volume referência da medula espinal (Vref) O volume referência da substância cinzenta da medula espinal (Vrefcinzenta), durante o envelhecimento apresentou-se significativamente menor na fêmea idosa quando comparada as fêmeas jovens com uma redução de 66,11%. Similarmente ao efeito do envelhecimento na substância cinzenta, houve uma diminuição significativa no volume referência do corno anterior (Vrefcorno), onde se observou uma redução de 60,55% entre as fêmeas jovens e a idosa. Do mesmo modo, uma diferença foi claramente identificada entre machos jovens e a fêmea idosa no volume deste corno, apresentando uma redução de 57,47%. Embora não significativa observamos que similar tendência (de diminuição), ocorreu de um modo progressivo com o avançar da idade, independentemente do gênero. Esperava-se que as diferenças nos volumes supracitados refletiria em uma diminuição no volume referência total da medula espinal (Vreftotal), a medida que a idade se estendesse, no entanto essa diferença não foi significativa. Uma explicação para ocorrência é o fato de que de acordo com os nossos achados a substância branca compõe a maior quantidade da medula espinal, apresentando 290,17 mm³ (no grupo de valor mais elevado) enquanto a substância cinzenta, apresenta em seu grupo mais elevado um valor de 167,44 mm³. Associadamente ao fato de que os resultados do volume referência da substância branca (Vrefbranca) não foram estatisticamente significativos entre os grupos. Da mesma maneira do nosso trabalho, Cakmak et al., (2017) através da aplicação do princípio de Cavalieri calcularam os volumes da substância cinzenta e da substância branca da medula espinal de codornas. Em contraste com os nossos achados eles observaram que o volume da substância cinzenta era maior que a substância branca. Isso pode ter se dado devido a diferença entre as classes de animais, já que eles utilizaram aves e nós mamíferos, bem como pela diferença na região estudada, tendo em vista que esses autores restringiram seu estudo apenas aos segmentos cervicais e nós analisamos todos os segmentos. No que concerne acerca da quantificação estereológica de volume na medula espinal de acordo com envelhecimento, não foi encontrado nada na literatura. Contudo Fu et al., (2013) analisaram o desenvolvimento pós-natal e a maturação utilizando o 47 método do fracionador isotrópico em combinação com a proteína nuclear neuronal como marcador de células e identificaram uma ampliação no volume em camundongos de 4 a 40 semanas, os autores documentaram que isso foi acompanhado por um aumento do número de células não neuronais. 6.2 Densidade de volume do corno anterior (Vv) A densidade dos neurônios presentes no corno anterior, obteve significância estatística apenas nos machos, que diminuiu 36,06% durante a maturação (do grupo jovem para o adulto), e se manteve constante no envelhecimento (do grupo adulto para o idoso). Já em fêmeas apesar do gráfico demonstrar um aumento de aproximadamente 28,5% no envelhecimento, estes dados não foram significativos de acordo método estatístico utilizado. Os dados descritos na literatura sobre a densidade neuronal de medula espinal relacionada à idade corroboram com nossos dados, por exemplo, Fu et al., (2015) utilizando o método do fracionador isotrópico em ratos machos de 15 semanas, 7 meses, 13 meses e 25 meses, revelaram que as densidades de células neuronais e não neuronais abrigadas pela medula espinal diminuiram 19% com o avanço da idade. Durante o processo de senescência, o volume total ocupado pelos neurônios do corno anterior (Vtot), foi afetado apenas em machos, apresentando 44,13% de redução na fase de maturação (jovem para adulto) e 57% de redução durante o envelhecimento (de jovem para idoso). Sabendo que Vtot é o produto entre a densidade (Vv) e o volume referência do corno (Vrefcorno) e que (como já mencionado anteriormente em nosso estudo), foi verificado que com o avançar da idade o Vrefcorno apresentou uma diminuição progressiva tanto em machos quanto em fêmeas, enquanto o Vv diminuiu em machos e aumentou em fêmeas, fica justificado portanto o estabilidade do resultado do Vtot encontrado para fêmeas. 48 6.3. Volume médio de neurônios do corno anterior (vn) A hipertrofia neuronal é bem conhecida em algumas partes do sistema nervoso central como um mecanismo compensatório para a perda neuronal, (CABELLO et al., 2002) no entanto no que concerne ao volume médio dos neurônios do corno anterior nosso estudo não reportou alteração estatística significativa entre os grupos analisados. Em contraste aos nossos achados Dockery et al., (1997), utilizando métodos estereológicos para quantificação do volume neuronal médio do corno anterior, da região cervical da medula espinal, de camundongos acometidos pela síndrome de Wobbler, documentaram que o volume médio neuronal foi menor no grupo idoso quando comparado com o grupo jovem. Segundo os autores este fato sugere que houve perdas dos grandes neurônios motores como avanço da idade. Valendo ressaltar que neste estudo eles utilizaram uma espécie de animal diferente da nossa, bem como a condição de saúde dos mesmos, o que possivelmente seja responsável pela discordância nos resultados. 6.4. Número total de neurônios do corno anterior (N) Com relação ao número total dos neurônios do corno anterior não houveram diferenças estatísticas significativas, apesar dos resultados apresentarem uma sutil redução no decorrer do processo de senescência independente do gênero. Dado este que corrobora com o encontrado por Tsukagoshi et al., (1979) que por meio da quantificação morfométrica do segmento cervical da medula espinal em humanos identificaram que não houve diferença com o avançar da idade tanto para os neurônios motores maiores quanto para os menores. Contudo em sua maioria há um consenso nos dados descritos na literatura de que os números de neurônios motores da medula espinal reduzem, com o avanço da idade. Tomlison et al., (1973), Terao et al., (1996) e Kawamura et al. (1977), por meio de estudos realizados em humanos, analisaram o número total de neurônios motores nos segmentos lombar e sacral da medula espinal, demonstrando diminuição no número de neurônios em diferentes faixas etárias (jovens, adultos e idosos). Somado a esse achado Kawamura et al. (1977) relataram uma perda de neurônios motores grandes e médios com o avanço da idade. Além disso, Terao et al., (1996) documentaram que essa perda neuronal se deu 49 principalmente por uma queda acentuada dos pequenos neurônios no decorrer do envelhecimento. Tendo em vista que esses estudos foram realizados por métodos não estereológicos, foram restritos apenas a uma região da medula e foram realizados em uma espécie diferente da usada nesta pesquisa, não podemos correlacionar diretamente esses dados com os nossos. Em conformidade com os estudos anteriores Tomlinson e Irving (1977) estudando a mesma região e as mesmas faixas etárias no mesmo modelo experimental, também observaram redução no numero de neurônios. No entanto, um achado notável nesse estudo é que nenhuma evidência de perda de neurônios motores existia até os 60 anos de idade, mas além dessa idade havia evidências claras e crescentes de uma população decrescente de neurônios motores. Fato este, que corrobora parcialmente com o que foi encontrado no presente estudo, pois não foram observadas diferenças significativas no número neuronal com o decorrer do processo de senescência (entre jovens, adultos e idosos). Temos que levar em consideração um ponto bastante importante, que neste estudo não analisamos alterações entre os animais dentro de cada grupo. Assim, consideramos provável que se tivéssemos feito uma investigação entre os animais dentro do grupo idoso teríamos encontrado alguma alteração, o que nos oferece oportunidades concretas para futuras pesquisas sobre este tema. 50 7. CONCLUSÃO De acordo com os objetivos propostos e métodos empregados, os resultados apresentados permitem concluir que, no sagui:  A biometria das medulas não revela alterações significativas tanto em relação ao comprimento quanto ao peso quando comparados de acordo com a idade e com o gênero;  O volume referência da substância branca não apresenta diferença durante a maturação e o envelhecimento, como também, não apresenta diferenças entre gêneros;  Há hipotrofia da substancia cinzenta relacionada ao gênero;  Há estabilidade quanto ao volume total das medulas;  O corno anterior da medula se hipotrofia com a idade independentemente do gênero;  Há uma redução nos machos com relação a densidade de volume neuronal do corno anterior no processo de maturação;  O volume total de neurônios do corno anterior reduz entre machos com o processo de senescência;  Há estabilidade quanto ao número total de neurônios motores, contudo no gráfico é observada uma sutil diminuição com o avanço da idade;  O volume neuronal não apresenta resultados estatisticamente significativos. 51 8. 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