UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Complexos de vanilina e derivados: síntese, caracterização e estudo biológico Wendy Marina Toscano Queiroz de Medeiros Tese de Doutorado Natal/RN, agosto de 2018 1 WENDY MARINA TOSCANO QUEIROZ DE MEDEIROS COMPLEXOS DE VANILINA E DERIVADOS: SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO BIOLÓGICO. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, como um dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Química, pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientador (a): Prof.ª Dra. Ana Cristina Facundo de Brito Pontes Co-orientador: Prof. Dr. Daniel de Lima Pontes NATAL, RN 2018 Medeiros, Wendy Marina Toscano Queiroz de. Complexos de vanilina e derivados: Síntese, caracterização e estudo biológico / Wendy Marina Toscano Queiroz de Medeiros. - 2018. 174 f.: il. Tese (douotrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Programa de Pós- Graduação em Química. Natal, RN, 2018. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Cristina Facundo de Brito Pontes. Coorientador: Prof. Dr. Daniel de Lima Pontes. 1. Compostos de coordenação - Tese. 2. Cobre - Tese. 3. Zinco - Tese. 4. Fenantrolina- Tese. 5. Vanilóides - Tese. I. Pontes, Ana Cristina Facundo de Brito. II. Pontes, Daniel de Lima. III. Título. RN/UF/BCZM CDU CDU 546.55 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede Elaborado por Ana Cristina Cavalcanti Tinôco - CRB-15/262 3 Aos meus pais, Joana e Francisco, pelo amor incondicional, incentivo, dedicação em todos os momentos e pela educação que me proporcionaram. Dedico este trabalho aos dois, e principalmente a você, minha mãe, meu maior exemplo de fé e perseverança. 4 AGRADECIMENTOS À Deus, por abençoar e guiar meus passos, sempre me fortalecendo e me ajudando a superar os obstáculos que encontro em minha caminhada. Obrigada meu Deus por tantas graças e por mais essa conquista alcançada em minha vida. Às minhas irmãs Tuyanne e Sayama, por acreditarem em mim e permanecerem sempre ao meu lado. Obrigada pela família maravilhosa que somos. Ao meu namorado Cristiano Bessa, pelo amor, carinho, incentivo e por toda força que tem me dado para concluir este trabalho. Obrigada pelo seu apoio e por estar sempre me ajudando a não desanimar diante das dificuldades. Ao meu orientador Prof. Dr. Daniel Pontes, por todos os ensinamentos, discussões e contribuições que foram fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho. Obrigada pela confiança e pela orientação ao longo desses oito anos de convivência e muito aprendizado. Aos professores Dra. Ana Cristina, Dr. Ótom Anselmo e Dr. Francisco Ordelei, pelos conselhos, sugestões e colaborações que foram de grande valia. À Mayara Jane, pela contribuição com os ensaios biológicos; Aos meus orientandos, Francimar e Lalyson: aprendi muito com vocês. Obrigada por me proporcionarem ter essa experiência de orientação; Aos demais que fizeram e fazem parte do Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros: Verônica, Aimée, Anallicy, Dayana, Thuanny, Alexsandro, Juliany, Talita, Andresa, Magno, Katherine e Marco. Obrigada pela ajuda e incentivo que recebi de vocês, pelas trocas de experiências e momentos de descontrações. A todos os meus amigos que sempre me incentivaram e torceram pelo meu sucesso; À Fernanda Saadna, pelo apoio constante, afeto e por toda confiança depositada em mim ao longo de todos esses anos de amizade. Sei que sempre posso contar com você. Aos Professores Dr. Javier Alcides Ellena, do Instituto de Física de São Carlos, e Alejandro Ayala, do Laboratório de Cristalografia Estrutural da Universidade Federal do Ceará, pelas análises de difração de Raios-x de monocristal. Ao Laboratório de Bioinorgânica e Catálise da Universidade Federal do Paraná, na pessoa da professora Dra. Shirley Nakagaki, pela contribuição com as análises de EPR. Aos Professores Dr. Eduardo Henrique Silva de Sousa, do Laboratorio de bioinorgânica da Universidade Federal do Ceará, e Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha do Centro de Biociências da UFRN, pelas parcerias com os ensaios biológicos realizados. 5 Às professoras Caroline Medeiros e Aurigena Antunes, juntamente com a aluna de mestrado Emanuella Tavares, do Departamento de Biofísica e Farmacologia do Centro de Biociências da UFRN, pela parceria com os estudos in vivo realizados com os filmes de quitosana modificados. Ao Instituto de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, principalmente à central analítica, nas pessoas dos técnicos Joadir, Marcondes, Jhonatans e Elânea. Ao Programa de Pós Graduação em Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e à CAPES, pela ajuda financeira através da concessão da minha bolsa. A todos aqueles que de alguma forma contribuíram no desenvolvimento desse trabalho. 6 “Tente uma, duas, três vezes e se possível tente a quarta, a quinta e quantas vezes for necessário. Só não desista nas primeiras tentativas, a persistência é amiga da conquista. Se você quer chegar aonde a maioria não chega, faça o que a maioria não faz.” Bill Gates 7 RESUMO Com o presente trabalho tem-se como objetivo contribuir para o desenvolvimento da química bioinorgânica dos sistemas vanilóides com íons metálicos de cobre (II) e zinco (II), através da síntese e estudo estrutural de novos complexos metálicos de cobre(II)-phen e zinco(II)-phen aliados aos ligantes vanilóides de interesse biológico. Dentre os compostos sintetizados, destaca-se os complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] com estruturas elucidadas através da difração de Raio-X, associada às técnicas espectroscópicas e eletroquímica, as quais evidenciaram a formação de um sistema octaédrico com distorção tetragonal com alongamento do eixo axial (complexo de cobre) e compressão do eixo axial (complexo de zinco). Os ensaios biológicos realizados com o [Cu(phen)(van)2] demonstraram elevada atividade antitumoral. Esses resultados motivaram o desenvolvimento dos novos derivados [M(phen)(vglu)2], CS-MPV, [M(phen)(vpca)2] e [M(phen)(vpcaZnCl2)2], com M = Cu 2+ e Zn 2+ , os quais possam vir a potencializar a atividade anticancerígena já apresentada por esse sistema. Esses derivados foram caracterizados por IV e UV-Vis, sendo os complexos de cobre caracterizados ainda por eletroquímica e os complexos de zinco caracterizados por RMN 1 H. Através do infravermelho e UV-Vis foi possível indicar a presença do ligante fenantrolina em todos os complexos sintetizados, através de estiramentos dos anéis da phen e bandas intensas com transições π- π* na região do ultravioleta, respectivamente. As bases de Schiff formadas foram indicadas através do estiramento do grupo C=N (IV) e transições n- π* do grupo imina (UV-Vis). Os voltamogramas cíclicos dos complexos de cobre apresentaram par redox do metal, referente ao processo redox Cu 2+ /Cu 1+ , bem como processos de oxidação dos ligantes vanilóides. Os espectros de RMN 1 H apresentaram sinais com deslocamentos e acoplamentos que estão de acordo com as estruturas propostas para os complexos de zinco. No CS-MPV, filmes de quitosana foram modificados com [M(phen)(van)2], onde em meio aquoso os complexos precursores são facilmente liberados, podendo atuar como sistemas carregadores que possam ser seletivos quanto à via e a forma de administração dos complexos com vanilina. Além da caracterização estrutural, o CS-MPV foi analisado quanto à liberação e quantificação de [M(phen)(van)2] presente nos filmes, através de UV-Vis e eletroquímica. Os ensaios in vivo realizados com os filmes CS-ZPV mostraram potencial atividade cicatrizante em feridas cutâneas para o complexo [Zn(phen)(van)2] liberado na lesão dos ratos. Palavras chave:Compostos de coordenação. Cobre. Zinco. Fenantrolina. Vanilóides. 8 ABSTRACT The main objective of the present work is to contribute to the development of bioinorganic chemistry of the vanilloid systems with copper(II) and zinc(II) metal ions through the synthesis and structural study of new metal complexes of copper(II)-phen and zinc(II)-phen associated with vanilloid ligands of biological interest. Among the compounds synthesized, the [Cu(phen)(van)2] and [Zn(phen)(van)2] complexes is highlighted, with structures elucidated by X-ray diffraction, associated with spectroscopic and electrochemical techniques, which evidenced the formation of an octahedral system with tetragonal distortion with axial axis elongation (copper complex) and compression of the axial axis (zinc complex). Biological assays performed with [Cu(phen)(van)2] demonstrated high antitumor activity. These results motivated the development of the new derivatives [M(phen)(vglu)2], CS-MPV, [M(phen)(vpca)2] and [M(phen)(vpcaZnCl2)2], with M = Cu 2+ e Zn 2+ , which may potentiate the anticancer activity already presented by this system. These derivatives were characterized by IV and UV-Vis, with the copper complexes still characterized by electrochemistry and the zinc complexes characterized by 1 H NMR. Through the infrared and UV-Vis it was possible to indicate the presence of the ligand phenanthroline in all the synthesized complexes, through stretches of phen rings and intense bands with π-π transitions in the ultraviolet region, respectively. The formed Schiff bases were indicated by stretching the C=N (IV) group and n- π * transitions of the imine group (UV-Vis). The ciclic voltammograms of copper complexes have metal redox pair, related to the Cu 2+ /Cu 1+ redox process, as well as oxidation processes of vanilloid ligands. The 1 H NMR spectra showed signals at shifts and couplings that are consistent with the structures proposed for zinc (II) complexes. In CS-MPV, chitosan films were modified with [M(phen)(van)2], where in aqueous media the precursor complexes are easily released and can act as loading systems that can be selective for the route and form of administration of complexes with vanillin. In addition to the structural characterization, the CS-MPV was analyzed for the release and quantification of [M(phen)(van)2] present in the films, through UV-Vis and electrochemistry. The in vivo assays performed with the CS-ZPV films showed potential healing activity in skin wounds to the [Zn(phen)(van)2] complex released in rat injury. Keywords: Coordination compounds. Copper. Zinc. Phenanthroline. Vanilloid. 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Formação de adutos através da reação de substituição nucleofílica entre DNA e complexos metálicos, que resultam em coordenações de esfera (a) interna e (b) externa. (c) Interação de esfera externa envolvendo ligações não covalentes............................................................................ 28 Figura 2 - Interação da cisplatina com o DNA......................................................... 29 Figura 3 - Reação esquematizada da condensação entre amina primária e aldeído catalisada por ácido.................................................................................. 31 Figura 4 - Fórmula estrutural do composto 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído........... 32 Figura 5 - Fórmula estrutural dos compostos vanilina, capsaicina, eugenol e ácido ferúlico, com destaque ao grupo vanilóide em vermelho......................... 34 Figura 6 - Fórmula estrutural da 2-amino-2-deoxi-D-glucose.................................. 35 Figura 7 - Atuação esquemática da glucosamina em tecidos do corpo humano....... 35 Figura 8 - Fórmula estrutural proposta para a quitosana........................................... 36 Figura 9 - Fórmula estrutural da molécula 2-picolilamina....................................... 37 Figura 10 - Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) cis- [Cu(phen)Cl2] e (b) [Zn(phen)Cl2].......................................................... 43 Figura 11 - Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Zn(phen)(van)2].............................................................................. 44 Figura 12 - Fórmula estrutural proposta para a base de Schiff vglu........................... 44 Figura 13 - Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) [Cu(phen)(vglu)2] e (b) [Zn(phen)(vglu)2]............................................... 45 Figura 14 - Possíveis fórmulas estruturais resultantes das modificações da quitosana com [M(phen)(van)2], (a) originadas de uma reação intracadeia envolvendo ambos os aldeídos presentes no complexo precursor, (b) estrutura resultante de uma reação de reticulação inter- cadeias e/ou (c) originadas pela reação de apenas um dos grupos aldeídos disponíveis no complexo........................................................... 46 Figura 15 - Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) [Cu(phen)(vpca)2] e (b) [M(phen)(vpca)2].............................................. 47 Figura 16 - Fórmulas estruturais propostas para (a) [Cu(phen)(vpca-ZnCl2)2] e (b) [Zn(phen)(vpca-ZnCl2)2].......................................................................... 48 Figura 17 - Exibição ORTEP dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Cu(phen)(van)2], com átomos elipsoides e probabilidade de 50%......... 57 Figura 18 - Estruturas possíveis para complexo metálico octaédrico com dois ligantes vanilóides.................................................................................... 61 Figura 19 - Comprimentos das ligações de complexos de cobre (II) com íons N2O4 (R = aldeído). (a) L,L = N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina; (b) L = H2O; (c) L,L = N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina; (d) [Cu(phen)(van)2] (presente trabalho)....................................................... 63 Figura 20 - Gráfico do parâmetro T versus a media do comprimento de ligação Cu–Oaxial (Raxial). Compostos: (1) [Cu(van-NO2)2(tetrametileno)]; (2) [Cu(van)2(tetrametileno)]; (3) [Cu(phen)(van)2]; (4) [V(guaicol)2(tetrametileno)]; (5) [Mn(van)2(H2O)2]; (6) [Fe(van)2(H2O)2]; (7) [Ni(van)2(H2O)2]; (8) [Co(van)2(H2O)2]; (9) [Zn(metoxiacético)2(H2O)2]; (10) [Zn(van)2(H2O)2]; (11) [Cu(van)2(H2O)2]; (12) [Ti(guaiacol)2(Cl)2]; (13) [Cu(van)2(tetrametileno)2]; (14) [Zn(phen)(van)2]................................... 64 10 Figura 21 - Espectros de EPR do [Cu(phen)(van)2] (a) em solução congelada de DMF e (b) em estado sólido..................................................................... 65 Figura 22 - Desdobramento do campo cristalino para um complexo de Cu 2+ com distorção tetragonal com alongamento axial............................................ 66 Figura 23 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(van)2] (preto) e [Cu(phen)(van)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm -1 ........................................................................................ 69 Figura 24 - Sobreposição dos espectros vibracionais do [Zn(phen)(van)2] (preto) e [Cu(phen)(van)2] (vermelho) na região de 1700 a 500 cm -1 .................... 69 Figura 25 - Sobreposição dos espectros vibracionais do (a) cis-[Cu(phen)Cl2] (preto), [Cu(phen)(van)2] (vermelho) e vanilina (azul) e (b) [Zn(phen)Cl2] (preto), [Zn(phen)(van)2] (vermelho) e vanilina (azul) na região de 1750 a 500 cm -1 ........................................................................ 70 Figura 26 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos complexos [Cu(phen)(van)2] (preto), concentrações 1,7 x 10 -5 mol L -1 e 3,6 x 10 -3 mol L -1 para a ampliação na região das bandas d-d, e [Zn(phen)(van)2] (vermelho), 1,7 x 10 -5 mol L -1 ...................................... 74 Figura 27 - (a) Espectro eletrônico da vanilina (1,1 x 10 -4 mol L -1 ) obtido em solução aquosa com diferentes pH (3,0 a 9,5) (b) Sobreposição dos espectros da vanilina (preto) e íon vanilato (vermelho)........................... 76 Figura 28 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em água (preto) e metanol (vermelho) dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Zn(phen)(van)2]. 77 Figura 29 - Sobreposição dos espectros eletrônicos do complexo [Cu(phen)(van)2] em água (preto), metanol (vermelho), DMF (verde) e acetonitrila (azul)......................................................................................................... 78 Figura 30 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vanilina de - 1000 a 1000 mV,e do complexo [Cu(phen)(van)2] de (b) -450 a 400 mV e (c) -500 a 1000 mV......................................................................... 79 Figura 31 - Mecanismo de oxirredução da Vanilina................................................... 80 Figura 32 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo [Cu(phen)(van)2] em diferentes velocidades de varredura....................... 82 Figura 33 - Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente do pico catódico do complexo [Cu(phen)(van)2].................................................. 83 Figura 34 - Espectro de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)Cl2], obtido em D2O, 300 MHz................................................................................................... 85 Figura 35 - Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação homonuclear para o composto [Zn(phen)Cl2], em D2O, 300 MHz.......... 86 Figura 36 - Espectro de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)(van)2], obtido em D2O, 300 MHz.......................................................................................... 87 Figura 37 - Espectro de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)(van)2], obtido em D2O, 300 MHz, na região de 6,5 a 10 ppm.............................................. 88 Figura 38 - Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação homonuclear para o composto [Zn(phen)(van)2], em D2O, 300 MHz..... 90 Figura 39 - Ensaio de clivagem de DNA empregando o DNA do plasmídeo pBR322 (8,3 ng µL -1 por poço) com (a) o complexo metálico [Cu(phen)(van)2], e também com (b) 10 mmol L -1 de glutationa (GSH) ou (c) 1 mmol L -1 de H2O2. Todas as incubações foram realizadas durante 90 minutos no escuro................................................................... 91 Figura 40 - Estudo de clivagem de DNA do complexo precursor de cobre. Foi utilizado DNA plasmídico (8,3 ng L-1 por poço) e complexo 11 [Cu(phen)(Cl)2] (M1) em diferentes concentrações (40, 20, 10, 5 e 1 μM). A reação ocorreu na presença de GSH 10 mM e H2O2 1 mM, no escuro durante 90 minutos a 25 °C. O controle de DNA (ctrl1) contém apenas DNA; O controle de DNA 2 (ctrl2) contém DNA com complexo [Cu(phen)(van)2]; O controle de DNA 3 (ctrl3) contém DNA com GSH; O controle de DNA 4 (ctrl4) contém DNA com H2O2........... 92 Figura 41 - Estudo mecanicista das espécies oxidantes envolvidas na clivagem de DNA. Foi utilizado DNA de plasmídeo (8,3 ng / L por poço), GSH (1,5 mmol L -1 ), [Cu(phen)(van)2] (40 μmol L -1 ) juntamente com inibidores de radicais livres: histidina (histologia, 13 mmol L -1 ), manitol (man., 13 mmol L -1 ), SOD (4 U L-1), TEMPO (3,9 mmol L- 1) e catalase (cat., 3, 9 μmol L-1) incubados durante 60 minutos a 25 ºC. Reações realizadas sob condições aeróbicas (gel superior) e anaeróbicas (gel inferior).......................................................................... 94 Figura 42 - Ciclo catalítico proposto para oxidação e redução do complexo [Cu(phen)(van)2] pela GSH com produção de superóxido: (I) redução de Cu (II) por GSH; (II) produção de O2 •- via reoxidação de Cu (I); (III) produção de H2O2 por oxidação de Cu (I); e (IV) produção final de HO • ....................................................................................................... 95 Figura 43 - Detecção de superóxido utilizando a reação NBT a 37 ºC. (A) Alteração de cor após 60 minutos de reação de GSH (1,5 mmol L -1 ) com [Cu(phen)(van)2] a 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 75 μmol L -1 . (B) Curvas cinéticas para a reação de GSH (1,5 mmol L -1 ) e complexo (75, 60, 50, 40, 30, 20 e 10 μmol L-1) usando NBT (50 μmol L-1) como seletivo. Esta reação foi monitorada durante 60 minutos a 37 °C............ 96 Figura 44 - Viabilidade celular de [Cu(phen)(van)2] para (a) 786-0 (b) HUH-7, (c) B16-F10.................................................................................................... 97 Figura 45 - Viabilidade celular de (a) CuCl2 (b) o-fenantrolina e (c) vanilina contra linha celular 786-0.................................................................................... 97 Figura 46 - Estudos de citometria de fluxo para (a) células não tratadas (controle negativo), células tratadas com (b) cisplatina 10 μmol L-1 e (d) 50 μmol L -1 (controle positivo), e tratadas com (c) 10 μmol L-1 e (e) 50 μmol L-1 de [Cu(phen)(van)2].................................................................................. 99 Figura 47 - Gráfico de histograma 3D da análise de citometria de fluxo em células 786-0 tratadas sem (controle) e com [Cu(phen)(van)2] (5, 10, 20 e 50 μmol L-1)................................................................................................... 101 Figura 48 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vglu)2] (preto) e [Cu(phen)(vglu)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm -1 ........................................................................................ 102 Figura 49 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vglu)2] (preto) e [Cu(phen)(vglu)2] (vermelho) na região de 1720 a 500 cm -1 ........................................................................................ 103 Figura 50 - Sobreposição dos espectros vibracionais do (a) [Cu(phen)(van)2] (preto), [Cu(phen)(vglu)2] (vermelho) e vglu (azul) e (b) [Zn(phen)(van)2] (preto), [Zn(phen)(vglu)2] (vermelho) e vglu (azul) na região de 1720 a 500 cm -1 .................................................................... 104 Figura 51 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] (preto), concentrações 9,5 x 10 -6 mol L -1 e 2,2 x 10 -4 mol L -1 para a ampliação na região das bandas d-d, e [Zn(phen)(vglu)2] (vermelho), concentrações 1,49 x 10 -5 mol L -1 e 1,2 x 10 -4 mol L -1 para 12 expansão do espectro................................................................................ 106 Figura 52 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos compostos (a) [Cu(phen)(vglu)2] (preto), [Cu(phen)(van)2] (vermelho), D- glucosamina (azul) e base de Schiff vglu (verde) e (b) (a) [Zn(phen)(vglu)2] (preto), [Zn(phen)(van)2] (vermelho), D- glucosamina (azul) e base de Schiff vglu (verde).................................... 108 Figura 53 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos (a) [Cu(phen)(vglu)2] em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho) e (b) [Zn(phen)(vglu)2] em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho)........... 108 Figura 54 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vglu de -1000 a 1200 mV,e do complexo [Cu(phen)(vglu)2] de (b) -350 a 350 mV e (c) -450 a 1100 mV.................................................................................. 111 Figura 55 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo [Cu(phen)(vglu)2] em diferentes velocidades de varredura, na região de -320 a 320 mV.......................................................................................... 113 Figura 56 - Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente dos processos de redução do complexo [Cu(phen)(vglu)2]............................................. 114 Figura 57 - Espectro de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)(vglu)2] em DMSO, 499,60 MHz.............................................................................................. 114 Figura 58 - Sobreposição dos espectros de infravermelho da quitosana não modificada (vermelho) e (a) CS-CPV (preto) e (b) CS-ZPV (preto)....... 116 Figura 59 - Sobreposição dos espectros de IV dos compostos (a) vglu (preto), CS- CPV (vermelho) e [Cu(phen)(vglu)2] (azul) e (b) vglu (preto), CS-ZPV (vermelho) e [Zn(phen)(vglu)2] (azul)...................................................... 117 Figura 60 - MEV dos filmes CS, CS-CPV e CS-ZPV com ampliações de 500, 1000, 2000 e 4000 X................................................................................ 119 Figura 61 - MEV/EDS dos filmes (a) CS-CPV e (b) CS-ZPV................................... 120 Figura 62 - Espectros das soluções de PBS, obtidos após diferentes tempos de imersão dos filmes modificados (a) CS-CPV (ta = 0 min, tb = 1 min, tc = 5 min, td = 15 min, te = 30 min, tf = 60 min, tg = 120 min, t = 1320 min), com a curva cinética para todos os dados obtidos e (b) CS-ZPV (ta = 0 min, tb = 1 min, tc = 5 min, td = 15 min, te = 30 min, tf = 60 min, tg = 120 min, th = 1305 min), com a curva cinética para todos os dados obtidos....................................................................................................... 121 Figura 63 - Curvas de calibração dos complexos (a) [Zn(phen)(van)2], para λ = 271 nm, e (b) [Zn(phen)(van)2], para λ = 228 nm........................................... 122 Figura 64 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos dos compostos (a) vanilina, 1,6 x 10 -3 mol L -1 , [Cu(phen)(van)2], 9,0 x 10 -4 mol L -1 e do composto liberado no filme de cobre, 1,96 x 10 -4 mol L -1 , e (b) vanilina, 1,6 x 10 - 3 mol L -1 , [Zn(phen)(van)2], 9,0 x 10 -4 mol L -1 e do composto liberado no filme de zinco 1,91 x 10 -4 mol L -1 ....................................................... 123 Figura 65 - Sobreposição dos voltamogramas de Pulso Diferencial (DP) dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Zn(phen)(van)2], liberados no meio PBS em diferentes tempos............................................................... 124 Figura 66 - Análise macroscópica da ferida cutânea com (a) 0 dias, (b) 7 dias e (c) 14 dias, após a administração de CS-ZPV2.............................................. 125 Figura 67 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vpca)2] (preto) [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm -1 ........................................................................................ 126 Figura 68 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos 13 [Zn(phen)(vpca)2] (preto) e [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) na região de 1750 a 500 cm -1 ........................................................................................ 127 Figura 69 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos (a) [Cu(phen)(van)2] (preto), [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) e pca (azul) e (b) [Zn(phen)(van)2] (preto), [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho) e pca (azul) na região de 1750 a 700 cm -1 ......................................................................... 128 Figura 70 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] (preto) e [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho) em meio aquoso com ampliação da região do visível............................................. 130 Figura 71 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos compostos (a) [Cu(phen)(vpca)2] (preto), [Cu(phen)(van)2] (vermelho) e 2- picolilamina (verde) e (b) [Zn(phen)(vpca)2] (preto), [Zn(phen)(van)2] (vermelho) e 2-picolilamina (verde)......................................................... 131 Figura 72 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho) dos complexos (a) [Cu(phen)(vpca)2] e (b) [Zn(phen)(vpca)2]..................................................................................... 132 Figura 73 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vpca de -1000 a 1200 mV,e do complexo [Cu(phen)(vpca)2] de (b) -500 a 250 mV e (c) -450 a 1100 mV................................................................................... 134 Figura 74 - Voltamogramas de pulso diferencial do [Cu(phen)(vpca)2] em KCl 0,1 mol L -1 pH 7,0 dos processos de (a) oxidação e (b) redução..................... 136 Figura 75 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo [Cu(phen)(vpca)2] em diferentes velocidades de varredura, na região de -420 a 160 mV.......................................................................................... 137 Figura 76 - Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente dos processos de oxidação do complexo [Cu(phen)(vpca)2]........................................... 138 Figura 77 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm -1 .................................................................... 139 Figura 78 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (vermelho) na região de 1780 a 500 cm -1 .................................................................... 139 Figura 79 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos (a) [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto), [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) e (b) [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto), [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho) na região de 1780 a 500 cm -1 ......................................................................... 140 Figura 80 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto), 1,15 x 10 -5 mol L -1 , e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (vermelho), 7,0 x 10 -6 mol L -1 , em meio aquoso....................................................................................................... 143 Figura 81 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos (a) [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) e (b) [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho), obtidos em meio aquoso........................................................................... 145 Figura 82 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos (a) [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] em meio aquoso (preto), metanol (vermelho) e acetonitrila (verde), e (b) [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho).................................................................... 147 Figura 83 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vpca de -1000 a 1200 mV,e do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] de (b) -700 a 300 14 mV e (c) -700 a 1100 mV......................................................................... 149 Figura 84 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] em diferentes velocidades de varredura, na região de -650 a 300 mV.......................................................................... 151 Figura 85 - Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente dos processos de redução do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]................................... 151 Figura 86 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos em KCl 0,1 mol L -1 , pH 7,0, dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2], (b) [Cu(phen)(vglu)2], (c) [Cu(phen)(vpca)2] e (d) [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2].................................... 153 Figura 87 - Espectro de RMN 1 H para 2-picolilamina, obtido em MeOD, 300 MHz, na região de 3,2 a 8,9 ppm........................................................................ 155 Figura 88 - Espectro de RMN 1 H para 2-picolilamina, obtido em MeOD, 300 MHz na região de 4,5 a 8,75 ppm...................................................................... 156 Figura 89 - Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação homonuclear para a molécula 2-picolilamina, em MeOD, 300 MHz....... 157 Figura 90 - Espectro de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], obtido em MeOD, 300 MHz na região de 0 a 10,0 ppm...................................... 158 Figura 91 - Espectro de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], obtido em MeOD, 300 MHz na região de 6,5 a 10,0 ppm................................... 159 Figura 92 - Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação homonuclear para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], em MeOD, 300 MHz................................................................................................... 161 15 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Reagentes utilizados no presente trabalho................................................ 42 Tabela 2 - Dados cristalográficos e refinamento estrutural para os complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2]....................................................... 56 Tabela 3 - Distâncias (Å) e ângulos (°) selecionados em torno dos átomos de cobre para o complexo [Cu(phen)(van)2]................................................. 57 Tabela 4 - Distâncias (Å) e ângulos (°) selecionados em torno dos átomos de zinco para o complexo [Zn(phen)(van)2]................................................. 58 Tabela 5 - Parâmetros de EPR para o complexo [Cu(phen)(van)2]........................... 67 Tabela 6 - Parâmetros de EPR para o complexo [Cu(phen)(van)2], em comparativo com a literatura (GAJEWSKA, et al., 2014)....................... 68 Tabela 7 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2]..................................... 73 Tabela 8 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] em meio aquoso.......... 75 Tabela 9 - Dados comparativos entre as bandas de absorção dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2], utilizando água e metanol como solventes................................................................................................... 78 Tabela 10 - Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos de oxirredução do Cu 2+/1+ / Cu 1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(van)2].... 82 Tabela 11 - Dados de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)Cl2]................................ 85 Tabela 12 - Dados de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)(van)2]............................ 88 Tabela 13 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos complexos [Cu(phen)(vglu)2], e [Zn(phen)(vglu)2]................................. 105 Tabela 14 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2] em meio aquoso....... 107 Tabela 15 - Dados comparativos entre as bandas de absorção dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2], utilizando água e metanol como solventes................................................................................................... 110 Tabela 16 - Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos de oxirredução do Cu 2+/1+ / Cu 1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(vglu)2].. 112 Tabela 17 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2].................................. 129 Tabela 18 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2] em meio aquoso...... 130 Tabela 19 - Dados comparativos entre as bandas de absorção dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2], utilizando água e metanol como solventes......................................................................................... 133 Tabela 20 - Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos de oxirredução do Cu 2+/1+ / Cu 1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(vpca)2].. 136 Tabela 21 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2].............. 142 Tabela 22 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] em meio aquoso....................................................................................................... 144 Tabela 23 - Dados comparativos entre as bandas de absorção do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2], utilizando água, metanol e acetonitrila como solventes, e do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], utilizando água e 16 metanol como solventes........................................................................... 148 Tabela 24 - Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos de oxirredução do Cu 2+/1+ e Cu 1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]........................................................................... 150 Tabela 25 - Potenciais de oxidação dos ligantes vanilóides nos voltamogramas dos complexos [Cu(phen)(van)2], [Cu(phen)(vglu)2], [Cu(phen)(vpca)2] e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]........................................................................... 152 Tabela 26 - Potenciais de oxidação e redução dos voltamogramas dos complexos [Cu(phen)(van)2], [Cu(phen)(vglu)2], [Cu(phen)(vpca)2] e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]........................................................................... 154 Tabela 27 - Dados de RMN 1 H para o composto 2-picolilamina................................ 157 Tabela 28 - Dados de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2]................ 160 17 LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS 4-NQO 4-nitroquinolina 1-oxide 786-0 Células de carcinoma renal humano Abs Absorbância ATP Adenosina Trifosfato B16-F10 Células de melanoma de rato CCDC Cambridge Crystallographic Data Centre CS quitosana CS-CPV quitosana modicicada com [Cu(phen)(van)2] CS-ZPV quitosana modicicada com [Zn(phen)(van)2] CV Voltametria Cíclica DMEM Dulbecco modification of Minimum Essential Media DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico DP Pulso diferencial EPR Ressonância Paramagnética de Elétrons FITC Isotiocianato de fluoresceína GSH Glutationa HUH-7 Células de hepatocarcinoma humano IC50 concentração para 50% de inibição de um composto I.L. Intraligante IP Imidazo-fenantrolina IV Infravermelho LMCT Transferência de Carga do Ligante para o Metal MEOD Metanol deuterado MLCT Transferência de Carga do Metal para o Ligante MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetra-brometo de zinco NBT Nitroazul de tetrazólio ORTEP Oak Ridge Thermal Ellipsoid Plot Phen 1,10-fenantrolina RMN Ressonância Magnética Nuclear ROS Espécies Reativas de Oxigênio RPMI Roswell Park Memorial Institute SOD Superóxido desmutase TEMPO N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina UV-Vis Ultravioleta e Visível Van Vanilina Vglu 2-Deoxy-2-[(E)-(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene)amino]hexopyranose Vpca 2-metóxi-4-{(E)-[(piridin-2-ilmetil)imina]metil}fenol 18 LISTA DE SÍMBOLOS  Deformação Angular  Frequência de estiramento g// Fator-g paralelo g Fator-g perpendicular  Variação 19 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 22 2 OBJETIVOS....................................................................................................... 25 2.1 OBJETIVOS GERAIS......................................................................................... 25 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................... 25 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................... 27 3.1 QUÍMICA BIOINORGÂNICA........................................................................... 27 3.2 BASES DE SCHIFF............................................................................................ 30 3.3 VANILINA.......................................................................................................... 32 3.4 GLUCOSAMINA E QUITOSANA.................................................................... 35 3.5 2-PICOLILAMINA............................................................................................. 37 3.6 BIOQUÍMICA DO COBRE (II)......................................................................... 38 3.7 BIOQUÍMICA DO ZINCO (II).......................................................................... 39 4 PARTE EXPERIMENTAL.............................................................................. 42 4.1 REAGENTES UTILIZADOS............................................................................ 42 4.2 PROCEDIMENTOS DE SÍNTESES................................................................. 43 4.2.1. Síntese do sistema [M(phen)Cl2], com M = Cu 2+ e Zn 2+ ................................. 43 4.2.2. Síntese do sistema [M(phen)(van)2] , com M = Cu 2+ (1) e Zn 2+ (2)................ 43 4.2.3. Síntese da base de Schiff vglu (2-Deoxy-2-[(E)-(4-hydroxy-3- methoxybenzylidene)amino]hexopyranose)..................................................... 44 4.2.4. Síntese do sistema [M(phen)(vglu)2], onde vglu = 2-Deoxy-2-[(E)-(4- hydroxy-3-methoxybenzylidene)amino]hexopyranose e M = Cu 2+ (3) e Zn 2+ (4)................................................................................................................ 44 4.2.5. Preparação dos filmes de quitosana................................................................. 45 4.2.6. Síntese do sistema CS-MPV, com M = Cu 2+ (5) ou Zn 2+ (6)........................... 46 4.2.7.. Síntese do sistema [M(phen)(vpca)2], onde vpca = 2-metóxi-4-{(E)- [(piridin-2-ilmetil)imina]metil}fenol e M = Cu 2+ (7) e Zn 2+ (8)...................... 47 4.2.8. Síntese do sistema [M(phen)(vpca-ZnCl2)2], com M = Cu 2+ (9) e Zn 2+ (10).. 48 4.3 METODOS DE CARACTERIZAÇÃO............................................................... 48 4.3.1. Difração de Raio-X............................................................................................. 49 4.3.2. Ressonância Paramagnética de Elétrons (EPR).............................................. 49 4.3.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN - 1 H).................. 49 4.3.4. Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho (IV)..................... 50 4.3.5. Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível.................... 50 4.3.6. Eletroquímica..................................................................................................... 50 4.3.7. Análise de clivagem de DNA plasmidial por eletroforese em gel.................. 51 4.3.8. Análise do superóxido: redução com NBT...................................................... 51 4.3.9. Cultura celular................................................................................................... 51 4.3.10. Ensaio de viabilidade celular (MTT)............................................................... 52 4.3.11. Anexina V-FITC/PI Dupla Coloração e Análise por Citometria de Fluxo.. 52 4.3.12. Ensaio de Ciclo celular...................................................................................... 53 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................... 55 5.1 SISTEMA [M(phen)(van)2], M = Cu 2+ (1) e Zn 2+ (2)......................................... 55 5.1.1. Estrutura Cristalina do sistema [M(phen)(van)2]........................................... 55 5.1.2. Ressonância Paramagnética de Elétrons do complexo [Cu(phen)(van)2]..... 64 5.1.3. Espectros Vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(van)2].................................................................................................. 68 5.1.4. Espectros de absorção eletrônica na região do ultravioleta e visível do 20 sistema [M(phen)(van)2].................................................................................... 74 5.1.5. Voltamogramas dos compostos Vanilina e [Cu(phen)(van)2]........................ 79 5.1.6. Ressonância Magnética Nuclear de 1 H dos complexos [Zn(phen)Cl2] e [Zn(phen)(van)2]................................................................................................. 84 5.1.7. Ensaios biológicos do complexo [Cu(phen)(van)2].......................................... 90 a) Atividade de Nuclease.................................................................................. 90 b) Ensaio de geração de superóxido................................................................. 95 c) Investigações de citotoxicidade.... ................................................................ 96 d) Medições de citometria de fluxo.................................................................. 98 e) Análise do ciclo celular................................................................................. 99 5.2 SISTEMA [M(phen)(vglu)2], M = Cu 2+ (3) e Zn 2+ (4)........................................ 101 5.2.1. Espectros Vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(vglu)2]................................................................................................. 101 5.2.2. Espectros de absorção eletrônica na região do Ultravioleta e Visível do sistema [M(phen)(vglu)2]................................................................................... 105 5.2.3. Voltamogramas do ligante vglu e do complexo [Cu(phen)(vglu)2] ............... 110 5.2.4. Ressonância Magnética Nuclear de 1 H do complexo [Zn(phen)(vglu)2]....... 114 5.3 SISTEMA CS-MPV, M = Cu 2+ (5) e Zn 2+ (6)..................................................... 115 5.3.1. Espectros Vibracionais na região do Infravermelho do sistema CS-MPV... 115 5.3.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) acoplado ao Sistema de Dispersão de Energia (EDS) para o sistema CS-MPV.................................... 118 5.3.3. Avaliação da liberação e quantificação do teor de [M(phen)(van)2] nos filmes de quitosanas modificadas..................................................................... 120 5.3.4. Aplicação do filme CS-ZPV na cicatrização de feridas cutâneas.................. 124 5.4 SISTEMA [M(phen)(vpca)2], M = Cu 2+ (7) e Zn 2+ (8)........................................ 126 5.4.1. Espectros vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(vpca)2]................................................................................................ 126 5.4.2. Espectros de absorção eletrônica na região do Ultravioleta e Visível do sistema [M(phen)(vpca)2].................................................................................. 129 5.4.3. Voltamogramas do ligande vpca e do complexo [Cu(phen)(vpca)2].............. 134 5.5 SISTEMA [M(phen)(vpcaZnCl2)2], M= Cu 2+ (9) e Zn 2+ (10)............................. 138 5.5.1. Espectros vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(vpcaZnCl2)2]...................................................................................... 138 5.5.2. Espectros de absorção eletrônica na região do Ultravioleta e Visível do sistema [M(phen)(vpcaZnCl2)2]........................................................................ 142 5.5.3. Voltamogramas do ligante vpca e do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2].... 148 5.5.3.1 Comparativo entre os complexos [Cu(phen)(L)2], com L = van, vglu, vpca e vpcaZnCl2............................................................................................................. 152 5.5.4. Ressonância Magnética Nuclear de 1 H do ligante 2-picolilamina e do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2].................................................................... 155 6 CONCLUSÃO................................................................................................... 163 REFERÊNCIAS.................................................................................................. 166 21 Introdução 22 1 INTRODUÇÃO A química bioinorgânica visa investigar e influenciar os processos biológicos, a partir do desenvolvimento de complexos metálicos biologicamente ativos (DAVID e MEGGERS, 2008). Esta área vem se ampliando desde a década de 70, despertando o interesse de muitos pesquisadores que objetivam produzir novos fármacos, associando as propriedades dos metais a medicamentos, tornando-os mais eficazes, com menos efeitos colaterais e menores resistências no organismo. Muitas descobertas relevantes vêm sendo realizadas na área da bioinorgânica, como, por exemplo, desenvolvimentos de novos complexos metálicos e agentes organometálicos com atividade anticancerígena, os quais possuem fortes interações com o DNA, como é o caso da cisplatina, um complexo de platina descoberto em 1978, utilizado no tratamento de diferentes tipos de câncer (DAVID e MEGGERS, 2008). A cisplatina, embora eficiente para alguns tipos de câncer, apresenta uma série de limitações quanto ao seu uso, devido em parte à sua baixa seletividade, causando danos tanto a células tumorais quanto a células saudáveis, o que gera efeitos colaterais adversos. Com isso, novos compostos de coordenação vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de fornecer novas alternativas para tratamentos de câncer, utilizando para isso centros metálicos essenciais para o organismo, tais como ferro, cobre, zinco e molibdênio. Dentre esses, complexos de cobre se destacam por apresentarem aplicações biológicas relevantes, estando a maioria delas diretamente relacionadas aos danos causados em moléculas celulares, modificando suas estruturas e induzindo processos tais como fragmentação de DNA, mutações e apoptose. Particularmente, sistemas de cobre(II) com o ligante o-fenantrolina têm sido potencialmente investigados por causar danos oxidativos ao DNA, apresentando alta eficiência nucleolítica, acarretando em atividade antitumoral, antibacteriana e antifúngica (LINDER, 2001). De maneira semelhante, compostos de zinco são reconhecidos como sistemas biologicamente ativos, recebendo especial atenção por atuar na fragmentação do DNA através de processos hidrolíticos, acarretando na morte de células tumorais (ANBU, et al., 2012). No entanto, não são encontrados na literatura dados de complexos contendo cobre ou zinco ligados a moléculas dipiridínicas ou derivados e, tendo ainda a presença de dois ligantes vanilóides, originando uma estrutura octaédrica. 23 Compostos contendo grupos vanilóides são substâncias orgânicas que apresentam o grupo 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeido substituídos na posição 1 em sua estrutura. Estão incluídos nesta classe a vanilina, o ácido vanílico, eugenol e a capsaicina. A vanilina, 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído, é uma substância bastante utilizada na indústria alimentícia e de cosméticos, por ser o ingrediente ativo responsável pelo aroma de baunilha (WU, et al., 2009). Além da sua importância industrial e econômica, a vanilina também tem sido reconhecida como um composto bioativo, apresentando atividade antioxidante (TAI, et al., 2011), antimutagênica (SHAUGHNESSYA; SETZER e DEMARINIC, 2001), anti-inflamatória (MAKNI, et al., 2011) e potencial efeito de proteção contra o câncer (DURANT e KARRAN, 2003). Tendo em vista a relevância dos complexos metálicos com vanilinas, bem como das aplicações biológicas de compostos com sistemas zinco (II) e cobre (II) – diiminas, o desenvolvimento deste trabalho tem como objetivo a síntese e caracterização dos novos sistemas vanilóides [M(phen)(van)2], [M(phen)(vglu)2], [M(phen)(vpca)2] e [M(phen)(vpcaZnCl2)2], com M = Cu 2+ e Zn 2+ , e posterior avaliação da sua atividade biológica, visando a obtenção de resultados relevantes frente às dificuldades encontradas no desenvolvimento de fármacos eficazes. 24 Objetivos 25 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVOS GERAIS O objetivo para este trabalho foi gerar novos conhecimentos sobre a química de coordenação dos vanilóides, sintetizando e caracterizando novos complexos de cobre(II) e zinco(II) com esses ligantes, a fim de obter compostos com potencialidade para atuar como bioativos no tratamento do câncer. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Sintetizar novos complexos de cobre(II) e zinco(II) com fenantrolina, associados ao ligante vanilina, [M(phen)(van)2], bem como bases de Schiff derivadas da vanilina, [M(phen)(vglu)2], e [M(phen)(vpca)2], além de sintetizar complexos trinucleares, [M(phen)(vpcaZnCl2)2], e poliméricos, CS-MPV;  Caracterizar os complexos obtidos através das técnicas de difração de Raio X de monocristal, Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho (IV), Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível (UV-Vis), Espectroscopia de Ressonância Paramagnética de Elétrons (EPR), Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1 H) e Eletroquímica (voltametria cíclica).  Avaliar a atividade antitumoral dos novos complexos sintetizados, através de ensaios de atividade de nuclease, geração de superóxido, citotoxicidade, citometria de fluxo e análise do ciclo celular. 26 Revisão Bibliográfica 27 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 QUÍMICA BIOINORGÂNICA As características funcionais dos metais em sistemas biológicos são fundamentais para a manutenção da vida. Metais como V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn e Mo representam menos de 0,05% da biomassa presente nos meios biológicos, entretanto, mesmo em baixas concentrações, são essenciais para as funções vitais de diferentes organismos. As funções biológicas desempenhadas por elementos e compostos inorgânicos são diversificadas, podendo atuar como mensageiros, transportadores de elétrons e oxigênio, catalizadores de reações de oxirredução e ácido-base, entre outras (DEMICHELI, 2003). Cerca de um terço de todas as proteínas presentes no organismo possuem metais em suas estruturas, os quais são fundamentais para seu desempenho funcional. Dentre eles, pode-se citar o ferro e o cobre, que são centro-ativos de várias metaloenzimas e também de proteínas transportadoras de oxigênio, como a hemoglobina e a hemocianina; o magnésio ligado a grupos fosfatos, participando de reações enzimáticas envolvendo o ATP e outros compostos que contêm fosfato; o manganês, o cobalto e o zinco, atuando como constituintes de sítios ativos de enzimas que catalisam diversas reações importantes para o metabolismo, tais como hidrólise e descarboxilação de vários compostos; e a atuação do zinco em várias proteínas que regulam a expressão dos genes no núcleo celular (ORVIG e ABRAMS, 1999). Dentre essa variedade de funções, a bioinorgânica se destaca no desenvolvimento de novos complexos metálicos com atividade anticancerígena, fator que provém das suas interações com o DNA. A interação entre o DNA e centros metálicos catiônicos é favorecida pela substituição nucleofílica, fato que se deve à presença de pares de elétrons na estrutura do ácido em questão. A Figura 1 apresenta os três tipos de interação que podem ocorrer entre o DNA e o complexo metálico. 28 Figura 1–Formação de adutos através da reação de substituição nucleofílica entre DNA e complexos metálicos, que resultam em coordenações de esfera (a) interna e (b) externa. (c) Interação de esfera externa envolvendo ligações não covalentes. Fonte: Adaptado de http://heritagetrackers.com/services/genetic-genealogy/. No primeiro tipo, Figura 1a, o ataque nucleofílico do DNA ocorre sobre o centro metálico, e, nesse caso, o nucleófilo se coordena diretamente a ele, fazendo parte da esfera de coordenação interna; no segundo, Figura 1b, o ataque nucleofílico é direcionado ao átomo do ligante, estabelecendo uma interação de esfera externa; no terceiro, Figura 1c, também de esfera externa, a coordenação ocorre através de ligações não covalentes, como é o caso das ligações de hidrogênio, entre o DNA e o ligante. Para esse ultimo caso, a interação não é classificada como substituição nucleofílica. Pesquisas sobre compostos de coordenação que pudessem ser utilizados no tratamento do câncer tiveram início com o desenvolvimento da cisplatina, um complexo de platina descoberto em 1978, utilizado no tratamento de diferentes tipos de câncer (DAVID e MEGGERS, 2008). Sugere-se que a base da ação quimioterápica da cisplatina e dos complexos correlatos para esse fim seja a formação de complexos estáveis entre a Pt(II) e o DNA (DAVIS; TINKER; FRIEDLANDER, 2014). A cisplatina quando administrada permanece como espécie dicloro neutra até ser introduzida no interior da célula, onde ocorre a liberação dos cloretos (ligantes) e as espécies catiônicas resultantes são atraídas eletrostaticamente pelo DNA, ocorrendo a complexação aos átomos de N das bases nucleicas, conforme ilustrado na Figura 2. A complexação da platina leva à curvatura da hélice, sugerindo que o DNA se torne incapaz de se reproduzir ou se reparar, dessa forma, a célula torna-se marcada para morrer num processo conhecido por apoptose. 29 Figura 2–Interação da cisplatina com o DNA Fonte: Adaptado de Naik (2014). Apesar da eficiência, a cisplatina possui efeitos colaterais altamente indesejáveis, como diminuição da função renal, anemia e infertilidade, por isso, grandes esforços vêm sendo realizados para obter complexos que sejam eficientes, mais seletivos no organismo e que apresentem poucos efeitos colaterais. Assim, diferentes compostos de coordenação vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de fornecer novas alternativas para o tratamento de câncer, utilizando para isso centros metálicos essenciais para o organismo, tais como ferro, cobre, zinco e molibdênio, uma vez que a platina não é um elemento essencial para o organismo e que, também por isso, pode causar efeitos adversos. No que diz respeito à seletividade de moléculas citotóxicas em relação a células alvo, os açúcares, especificamente a glicose, tem sido alvo de muitos estudos, tendo em vista que as células cancerígenas capturam maior quantidade de glicose do que as células normais (NASCIMENTO, et al., 2016). De modo geral, todas as células requerem glicose para a sobrevivência, mas, devido ao seu rápido crescimento e proliferação, as células tumorais têm atividade metabólica aumentada, em comparação com células não proliferantes, com consumo de glicose ainda maior. As células cancerosas são conhecidas por alterar as suas vias metabólicas, deslocando de fosforilação oxidativa mitocondrial para glicólise anaeróbia em baixas concentrações de oxigênio. O último é um processo energeticamente ineficiente que requer uma quantidade em excesso de glicose (NASCIMENTO, et al., 2016). Por isso a importância em utilizar complexos metálicos com açúcares, tendo em vista que as células cancerígenas deverão capturar essas moléculas com maior eficiência, em comparativo às células normais no organismo. Além da atividade antimutagênica, os complexos metálicos atuam na redução de radicais livres que estão muitas vezes presentes em excesso no organismo, tendo em vista que a reatividade dos metais e a capacidade em variar os seus estados de oxidação influenciam de 30 forma direta muitos processos de oxirredução que ocorrem no meio biológico (FRANZ e HAAS, 2009). Além disso, há um crescente interesse na utilização de metais de transição em processos neurológicos, com destaque a alguns estudos envolvendo a participação de metais em doenças de Alzheimer e de Parkinson (DAVID e MEGGERS, 2008). Outra aplicação importante para os compostos de coordenação está associada à catálise bioinorgânica. Nos últimos anos, diversas discussões vêm sendo geradas acerca da formação de novos complexos metálicos capazes de catalisar transformações químicas em organismos vivos, resultando na produção de novos fármacos catalíticos, os quais podem ser utilizados em doses reduzidas quando comparados aos não-catalíticos (MEGGERS; SASMAL e STREU, 2013). Assim, através de estudos e desenvolvimento de novos complexos bioativos, a química de coordenação tem contribuído de forma singular para ampliar os conhecimentos acerca dos processos biológicos que ocorrem no organismo e, com isso, possibilita a obtenção de fármacos mais eficazes. 3.2. BASES DE SCHIFF As bases de Schiff são moléculas constituídas pelo grupo imina (C=N), com o átomo de nitrogênio ligado a um grupo arila ou alquila, mas não a um hidrogênio. Essas moléculas são formadas a partir da reação de condensação entre aminas primárias e compostos carbonilados, podendo ser carbonilas de aldeídos ou de cetonas. Durante a reação, o par de elétrons isolados do nitrogênio ataca a carbonila formando um intermediário hemiaminal, em seguida ocorre desidratação, ao mesmo tempo em que a imina é formada, conforme esquematizado na Figura 3. 31 Figura 3–Reação esquematizada da condensação entre amina primária e aldeído catalisada por ácido. Fonte: Araújo (2011). As primeiras bases de Schiff foram sintetizadas por Hugo Schiff, em 1864, através de reações da anilina com aldeídos, como acetaldeído, valeraldeído, benzaldeído e cinamaldeído, e, a partir daí, seguiram-se outros trabalhos com resultados semelhantes, gerando uma nova classe de compostos: as iminas, que posteriormente ficaram conhecidas como bases de Schiff (TIDWELL, 2008). As bases de Schiff têm se destacado no campo da bioinorgânica, por apresentarem propriedades químicas e biológicas relevantes, tais como, biocompatibilidade e variabilidade estrutural (KAZEMI, et al., 2015). As importantes propriedades físicas e biológicas das bases de Schiff estão diretamente relacionadas às ligações de hidrogênio intermoleculares e equilíbrios na transferência de prótons (SAHU; THAKUR e KASHYAP, 2012). Essa classe de compostos desempenha um importante papel nos sistemas biológicos, presentes em diversas enzimas e proteínas que atuam no organismo, tais como, sintase triptofano, transaminases, transcetolases, entre outras (SAHU; THAKUR e KASHYAP, 2012). Esses compostos apresentam propriedades relevantes, como a capacidade em ligar-se reversivelmente ao oxigênio, atividade catalítica em reações de hidrogenação de olefinas e capacidade de formar complexos com metais de transição (DEDE; KARIPCIN e CENGIZ, 2009). Características como a doação moderada de elétrons do átomo de nitrogênio, atuando como base de Lewis, bem como os efeitos estéricos e eletrônicos facilmente ajustáveis tornam as bases de Schiff ligantes versáteis, capazes de formar complexos estáveis com diferentes metais de transição, além de estabilizá-los em diferentes geometrias e estados de oxidação. 32 Estudos de complexos com bases de Schiff utilizados no desenvolvimento de novas moléculas farmacêuticas são relatados na literatura, por apresentarem aplicações biológicas relevantes, como a atividade antitumoral (KARTHIKEYAN et al., 2006); (ABDALLAH et al., 2009), a qual está associada à sua propriedade em interagir com o DNA, tendo em vista que o DNA é conhecido como um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas anticancerígenas. Além disso, esses sistemas imínicos também apresentam atividade antifúngica (KARTHIKEYAN et al., 2006); (ABDALLAH et al., 2009), antiviral, antituberculosa, antimalárica, vasorrelaxante, analgésica (BHARTI et al., 2010), anticonvulsivante (KARTHIKEYAN et al., 2006) e antibacteriana (ABDALLAH et al., 2009); (BHARTI et al., 2010). 3.3.VANILINA A vanilina, 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído, cuja fórmula estrutural é apresentada na Figura 4, é uma substância bastante utilizada na indústria alimentícia e de cosméticos, por ser o ingrediente ativo responsável pelo aroma de baunilha (WU, et al., 2009). Além da sua importância industrial e econômica, a vanilina também tem sido reconhecida como um composto bioativo, apresentando atividade antioxidante (TAI, et al., 2011), antimutagênica (SHAUGHNESSYA; SETZER e DEMARINIC, 2001), anti-inflamatória (MAKNI, et al.,2011) e potencial efeito de proteção contra o câncer (DURANT e KARRAN, 2003). Figura 4 – Fórmula estrutural do composto 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído OH OH O CH3 Fonte: Autora (2018). Ohta foi o primeiro pesquisador a descobrir, em 1986, que a vanilina tem a capacidade de reduzir as mutações causadas pelos agentes químicos 4-nitroquinolina 1-oxide (4-NQO) e furilfuramida (AF-2) em bactérias (OHTA, et al.,1986). Posteriormente, foi descoberto que a 33 vanilina era capaz de inibir também mutações espontâneas em bactérias (FLORA, et al.,1994), (SHAUGHNESSY; SETZER e DEMARINI, 2001). Imanishi e colaboradores constataram que a vanilina reduz significativamente as mutações causadas por radiação ultravioleta, raio-X e etilnitrosoureia também em células de mamíferos (células pulmonares de hamster: V79) (IMANISHI, et al.,1990). Adicionalmente, a vanilina tem a capacidade de suprimir a metástase de células de câncer de mama em ratos (LIRDPRAPAMONGKOL, et al.,2005) e atenua a expressão dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, IL-1β e IL-6, em ensaios com ratos (MAKNI, et al., 2011). O grupo aldeído presente na estrutura da vanilina possui elevada reatividade e, como consequência, muitos derivados da vanilina são originados por reações que têm este grupo como centro reativo. Dentre os derivados, as bases de Schiff, formadas pela condensação da amina primária com o aldeído vanilina, se destacam nesse trabalho. Reações com a vanilina para a formação de bases de Schiff possibilitam diversas aplicações na área da química e da biologia (SABAA; MOHAMED e ORABY, 2009), com elevado potencial em atividades antibacterianas e antitumorais (ZHANG; WANG e DING, 2010). A vanilina também possui em sua estrutura o grupo vanilóide – constituído pelo anel aromático e os grupos substituintes metóxi e fenol – o qual apresenta importantes atividades em sistemas biológicos. Compostos que, semelhantemente à vanilina, possuem o grupo vanilóide em suas estruturas, normalmente favorecem a apoptose, além de apresentarem importantes características antioxidantes e antimicrobianas (MEDEIROS, 2014). Alguns exemplos de derivados vanilóides que possuem importantes aplicações biológicas como a capsaicina, o eugenol e o ácido ferúlico são apresentados na Figura 5. Tendo como base esses exemplos de vanilóides apresentados, pode-se destacar a importância que este grupo possui para diversas atividades biológicas no organismo. 34 Figura 5– Fórmulas estruturais dos compostos vanilina, capsaicina, eugenol e ácido ferúlico, com destaque ao grupo vanilóide em vermelho Fonte: Autora (2018). As características estruturais dos vanilóides possibilitam a utilização destes como ligantes, uma vez que cada um dos seus grupos funcionais, éter e fenol, dispõem de um par de elétrons não ligante, disponível para interagir com centros metálicos, coordenando-se preferencialmente de forma bidentada. O ambiente de coordenação bidentado assimétrico dos ligantes vanilóides, no qual um dos átomos de oxigênio doadores é um grupo metóxido enquanto o outro é um fenol, possibilita a obtenção de compostos com diferentes arranjos estruturais. Complexos octaédricos contendo dois ligantes vanilóides na esfera de coordenação em cis, em conjunto com um ligante bidentado adicional ou ainda dois ligantes monodentados, normalmente originam compostos onde os grupos metóxidos estão posicionados trans aos átomos doadores dos ligantes adicionais. (Esta organização estrutural é identificada no presente trabalho como cis-I). No entanto, também é possível se obter complexos octaédricos com os grupos metóxidos posicionados trans um ao outro e, consequentemente, tendo os oxigênios fenólicos trans aos ligantes adicionais (denominado nesse trabalho de cis-III). Esses complexos são extremamente raros, devido à dificuldade em se direcionar a posição dos ligantes na etapa de síntese (MEDEIROS, et al., 2018). É importante destacar que o posicionamento dos átomos de oxigênio nos ligantes vanilóides tem uma influência direta sobre as propriedades estruturais e químicas dos complexos. A estrutura cis-I ocasiona um encurtamento das ligações do eixo z (Ofenol-M- Ofenol), enquanto que os compostos cis-III apresentam alongamento do eixo z, agora composto 35 por Ometóxido-M-Ometóxido. Essas variações estruturais dos complexos representam alterações químicas significativas, tendo consequências sobre a reatividade, labilidade dos ligantes e potencial redox. 3.4.GLUCOSAMINA E QUITOSANA A molécula 2-amino-2-deoxi-D-glucose, também chamada de glucosamina, é um aminomonossacarídeo derivado principalmente da quitina – um polissacarídeo natural. A Figura 6 apresentada a fórmula estrutural da glucosamina. Figura 6– Fórmula estrutural da 2-amino-2-deoxi-D-glucose Fonte: Autora (2018). A glucosamina é uma molécula bioativa, conhecida por ser o componente essencial dos tecidos conjuntivos, cartilagens e ligamentos, e, assim, contribui para a flexibilidade, resistência e elasticidade desses tecidos no corpo humano (SALAZAR, et al., 2014). Esse monossacarídeo também desempenha importantes funções na formação de fluidos sinoviais, pele, osso, unhas, válvulas do coração, vasos sanguíneos e secreções mucosas dentro dos sistemas digestivo, respiratório e urinário (CARTER, 2001). Na Figura 7 é apresentada a atuação da glucosamina em alguns tecidos do corpo humano. Figura 7– Atuação esquemática da glucosamina em tecidos do corpo humano Fonte: Adaptado de Salazar (2014). 36 As glucosaminas possuem importância biológica e farmacêutica, atuando como inibidores reversíveis de glicosidase e agentes antidiabéticos (SAH, et al., 2001). A D- glucosamina, especificamente, também promove a formação e reparação de cartilagem, além de ser utilizada como suplemento no tratamento de osteoartrite (PESSOA; TOMAZ e HENRIQUES, 2003), tendo em vista seu papel importante na formação de vários tecidos do corpo humano. Atualmente, a glucosamina tem ganhado destaque devido suas características de rápida absorção, além de apresentar várias hidroxilas e o grupamento amino, o que a torna uma molécula de fácil modificação (SANTOS, 2010). O grupamento amino presente na estrutura da glucosamina possibilita a formação de bases de Schiff com aldeídos ou cetonas, as quais possuem importantes atividades biológicas e catalíticas. As primeiras bases de Schiff formadas por reações entre glucosaminas e salicilaldeídos foram preparadas por Irvine e Hynd, em 1913. Tais sínteses foram realizadas por meio de reações entre cloridrato de glucosamina e salicilaldeído, em solução aquosa de bicarbonato de sódio, com formação de produto insolúvel em água (NGUYEN, et al., 2011). Dentre os derivados da glucosamina, destaca-se a quitosana (Figura 8), um polissacarídeo catiônico produzido através da desacetilação parcial da quitina, que consiste em monômeros de D-glucosamina e N-acetil-D-glicosamina. É encontrada principalmente no exoesqueleto de artrópodes, especialmente crustáceos, através de um processo de alcalinização sob altas temperaturas (ZHANG, et al., 2015). Figura 8 - Fórmula estrutural da quitosana Fonte: Autora (2018). A quitosana apresenta potenciais aplicações em sistemas biológicos, tais como transportadores catalíticos, membrana de separação (PAGNONCELLI, 2008), adsorção de proteínas e liberação controlada de fármacos. Pode ser utilizada sob a forma de fibras, membranas, hidrogéis, filmes, microesferas ou cápsulas (ZOU; LI e LI, 2015). As propriedades mais relevantes da quitosana estão relacionadas à sua biodegradabilidade, 37 biocompatibilidade, não toxicidade, disponibilidade comercial e insolubilidade em soluções aquosas neutras e alcalinas, além de apresentar atividade antifúngica e antibacteriana, o que faz com que esse biopolímero seja alvo de estudos que envolvam regeneração de tecidos vivos, cicatrização de feridas e administração de medicamentos, particularmente, através do desenvolvimento de filmes como sistemas de transporte. Filmes de quitosana tem despertado interesse na área farmacêutica visto que são flexíveis, difíceis de quebrar, duráveis, possuem valores moderados de permeabilidade à água e oxigênio e inibem o crescimento microbiano (MARTÍNEZ-CAMACHO, et al., 2010). Essas características, combinadas com certa bioadesividade (HE; DAVIS e ILLUM, 1998) favorecem a aplicação tópica de filmes de quitosana como transportadores do composto ativo, que deverá ser liberado sob condições específicas, de forma controlada. O grupo aldeído da vanilina pode sofrer uma reação de base de Schiff com aminas da quitosana e formar uma estrutura de rede que favorece a estabilização e liberação controlada do composto ativo (ZOU; LI e LI, 2015). 3.5.2-PICOLILAMINA A 2-picolilamina, 2-(aminometil)piridina, é constituída por um anel piridínico e uma amina como substituinte, conforme fórmula estrutural apresentada na Figura 9. Figura 9 – Fórmula estrutural da molécula 2-picolilamina Fonte: Autora (2018). O grupo amina presente na molécula picolilamina possui grande reatividade e, com isso, possibilita uma série de modificações estruturais gerando novos derivados, como é o caso das bases de Schiff, que possuem atividades biológicas relevantes, além de favorecer diferentes interações com o DNA, o qual é um alvo importante para moléculas com atividade anticancerígena (KAZEMI, et al., 2015). Complexos contendo bases de Schiff derivadas da 2-picolilamina vem sendo investigados por apresentarem atividade de clivagem do DNA, devido à elevada afinidade 38 entre eles. No entanto, para estes complexos sintetizados, são apresentados apenas estudos de caracterização estrutural e de ligação ao DNA (ENGIN, et al., 2016). A molécula 2-picolilamina (pca) tem sido utilizada como ligante em muitos compostos biologicamente ativos, se coordenando a íons metálicos através dos átomos doadores de nitrogênio piridínico e da amina, de forma bidentada. Muitos complexos metálicos que possuem derivados da picolilamina são usados como modelos que mimetizam tanto a estrutura quanto a reatividade dos sítios metálicos em sistemas biológicos e, com isso, torna- se possível compreender mecanismos mais complexos presentes no organismo, além de mostrar que a picolilamina possui um amplo espectro de atividades biológicas (RAFIQUE, et al., 2015). 3.6.BIOQUÍMICA DO COBRE (II) O cobre é um dos poucos metais que pode ser encontrado na sua forma elementar na natureza. Possui massa atômica igual a 63,6u e está localizado no grupo 11 da tabela periódica, sendo, portanto, um metal de transição. A configuração eletrônica da camada de valência deste metal é 3d 10 , 4s 1 , apresentando como principais estados de oxidação os valores +1 e +2. O cobre é essencial para muitas formas de vida, sendo o elemento principal em mais de 300 proteínas em humanos (CRISPONI, et al., 2010). Seu caráter bioessencial foi descoberto em 1925 (LINDER,1991), porém, sua importância biológica foi reconhecida apenas nas últimas décadas, com os avanços no estudo da química bioinorgânica deste metal (LIPPARD e BERG, 1994). Por se tratar de um elemento biologicamente ativo, o cobre possui aplicações biológicas relevantes, estando à maioria delas diretamente relacionadas com a facilidade de interconversão entre os seus estados de oxidação (I) e (II). A propriedade redox do cobre é essencial para várias vias metabólicas, como a respiração mitocondrial, eliminação de radicais livres e a absorção de ferro onde atua como um cofator catalítico. Ao mesmo tempo, o cobre é um elemento de fundamental importância nos mecanismos de reações de várias enzimas, como, por exemplo, no transporte de elétrons (citocromo c oxidase), na produção de melanina (tirosinase) e na inativação de radicais como o íon superóxido (superóxido dismutase). 39 O cobre, na forma atômica, catiônica ou complexada, pode causar danos a moléculas constituintes de células, modificando suas estruturas em processos como fragmentação de DNA, induzindo mutações ou apoptose. Isso ocorre porque o cobre livre pode reagir com moléculas de oxigênio, gerando radicais livres ou íons superóxidos, tais como o OH • e o O2 - , que prejudicam o funcionamento celular dos organismos vivos. Para alguns complexos de cobre este processo se intensifica, pois além do cobre formar radicais livres, determinados ligantes conseguem aumentar a interação com as estruturas celulares, produzindo encaixes perfeitos entre eles durante as modificações celulares. Complexos de cobre (II) com o ligante o-fenantrolina e seus derivados têm sido bastante utilizados para provocar dano oxidativo ao DNA (LINDER, 2001), tendo em vista as características oxidativas do cobre, aliadas à facilidade de intercalação da fenantrolina entre as bases nitrogenadas do DNA (KUMAR, et al., 2008). O complexo [Cu(phen)2] + , por exemplo, apresenta excelente atividade de clivagem do DNA, e por isso, é considerado um importante modelo biológico no estudo de fármacos anticancerígenos, uma vez que a clivagem pode causar danos ao DNA de células cancerosas, bloqueando sua replicação (SANTHAKUMAR e ARUMUGHAM, 2012). Estudos mostram que esse complexo possui alta citotoxicidade com relação às células leucêmicas humanas, podendo inibir até 90% do crescimento destas células (TISATO, et al., 2010). Dessa forma, os complexos de cobre possuem um modo diferente de ação com o DNA (não covalente), se comparados com a cisplatina (covalente), possibilitando maior potência anticancerígena com relação ao carcinoma do ovário humano (CH1), leucemia murina (L1210) e vários carcinomas cervicouterino (TABASSUM, et al., 2013). 3.7.BIOQUÍMICA DO ZINCO (II) O zinco é um metal de transição de massa atômica 65,4u, situado no grupo 12 da Tabela Periódica, com configuração eletrônica da camada de valência 3d 10 4s 2 . O zinco é um elemento essencial para o crescimento e desenvolvimento de todas as formas de vida, o qual apresenta efeitos benéficos, terapêuticos e de prevenção em doenças infecciosas, sendo o segundo metal traço mais abundante no corpo humano. O zinco atua como cofator essencial, desempenhando papel catalítico, estrutural ou regulador em uma infinidade de enzimas, tais como superóxido dismutase, carboxipeptidase e anidrase carbônica, além de ser encontrado na insulina e em proteínas importantes para o organismo, 40 como os dedos de zinco (zinc finger), que são pequenas proteínas caracterizadas pela coordenação de íons metálicos de zinco, com propriedade de se ligarem ao DNA. Em bactérias, o zinco desempenha um papel importante para os catalisadores e nas estruturas de proteínas (ALI; DARAWSHEH e RAPPOCCIOLO, 2013). Nesse sentido, estudos que envolvem complexos de Zn(II) e suas propriedades biológicas tais como atividade antimicrobiana e antitumoral tem atraído atenção no campo da medicina. Kazemi e colaboradores relatam que a ligação do zinco com o DNA possui maior força de ligação, comparativamente a outros metais como cobre e níquel. Além disso, os complexos bimetálicos de zinco tem uma maior afinidade com o DNA, em contraste com o seu análogo complexo mononuclear (KAZEMI, et al., 2015). Os complexos de zinco (II) são muitas vezes alvos de estudos para formação de possíveis metalodrogas, tendo em vista suas atividades biológicas relevantes, tais como atividade bactericida, anticonvulsivantes, antidiabético, anti-inflamatórios, antimicrobianos, antioxidantes, bem como atividade citotóxica (MRKALIĆ, et al., 2014). Adicionalmente, o zinco (II) é também utilizado para reduzir a cardiotoxicidade e hepatotoxicidade induzida por algumas drogas anticancerígenas (ANBU, et al., 2012). Além disso, certos complexos de Zn (II) tem a capacidade de interagir fortemente com o DNA, exibindo atividades anticancerígenas proeminentes e regulando a apoptose. Os complexos de Zn (II) possuem tendência em promover eficazmente a clivagem do DNA por hidrólise da ligação éster de fosfato. Sheng e colaboradores mostraram que o centro metálico é o sítio ativo do processo de clivagem hidrolítica do DNA, cujo íon metálico contribui para a elevada eficiência nucleolítica (ANBU, et al., 2012). Muitos processos hidrolíticos em catálises enzimáticas envolvem íons metálicos que têm a função de ativar uma molécula de água, a qual irá formar facilmente um grupo hidroxila como um nucleófilo no sistema reacional, que irá interagir com o grupo fosfato do DNA, clivando-o. Nesse sentido, muitos complexos de zinco (II) que possuem propriedades de fragmentação de DNA apresentam a água como um dos ligantes em sua esfera de coordenação, ou ainda uma posição de coordenação livre, a qual irá facilmente ser ocupada pela água em meio aquoso, podendo assim interagir com o DNA em um processo hidrolítico. 41 Parte Experimental 42 4 PARTE EXPERIMENTAL 4.1 REAGENTES UTILIZADOS Todos os reagentes químicos empregados no presente trabalho são de grau analítico e utilizados sem prévia purificação. Na Tabela 1 são apresentados os reagentes utilizados na síntese e caracterização dos compostos. Tabela 1 – Reagentes utilizados no presente trabalho Reagentes F.M. Pureza Fabricante 1,10-fenantrolina 2-picolilamina Acetonitrila Ácido Clorídrico P.A. Água destilada Álcool Metílico P.A. Brometo de Potássio espectroscópico Cloreto de Cobre (II) P.A. Dihidratado Cloreto de Potássio P.A. Cristal Cloreto de Zinco (II) P.A. Cloridrato de D-Glicosamina Hidróxido de Sódio P.A. Mercúrio Metálico P.A. Quitosana Tetraidrofurano (THF) Vanilina Zinco Granulado P.A. C12H8N2 C6H8N2 CH3CN HCl H2O CH4O KBr CuCl2.2H2O KCl ZnCl2 C6H13NO5·HCl NaOH Hg C14H24N2O9 C4H8O C8H8O3 Zn 99,5% 99,0% 99,9% 37,0% --- 99,5% --- 99,0% 99,5% 97,0% 99,0% 98,0% 99,9% --- 99,5% 99,8% 99,9% Vetec Química Fina Sigma-Aldrich Panreac Cromato Produtos Químicos --- Vetec Química Fina Shimadzu Corporation Vetec Química Fina Dinâmica – Química Contemporânea Ltda. Dinâmica – Química Contemporânea Ltda. Sigma-Aldrich Vetec Química Fina Vetec Química Fina Polymar Proquímios Vetec Química Fina Cromato Produtos Químicos Fonte: Autora (2018). 43 3.2.PROCEDIMENTOS DE SÍNTESES No presente trabalho foram realizadas sínteses de compostos de coordenação de cobre(II) e zinco(II), contendo em sua estrutura ligantes diiminas, como 1,10-fenantrolina, além de ligantes como vanilina e seus derivados (bases de Schiff) utilizando a glucosamina, quitosana e 2,2-picolilamina. Além disso, também foram realizadas as sínteses de complexos polinucleares, a partir dos complexos com bases de Schiff. 4.2.1. Síntese do sistema [M(phen)Cl2], com M = Cu 2+ e Zn 2+ Os compostos foram sintetizados dissolvendo 1,76 mmol de sal (CuCl2.2H2O ou ZnCl2) e 1,76 mmol de fenantrolina em metanol. A solução foi mantida sob agitação por 2 horas a 50ºC e o sólido formado, de coloração verde para o complexo de cobre e branco para o complexo de zinco, foi filtrado e lavado com metanol. O rendimento obtido foi 92% (cis- [Cu(phen)Cl2]) e 97% ([Zn(phen)Cl2]). Figura 10 – Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) cis-[Cu(phen)Cl2] e (b) [Zn(phen)Cl2]. (a) (b) Fonte: Autora (2018). 4.2.2. Síntese do sistema [M(phen)(van)2], com M = Cu 2+ (1) e Zn 2+ (2) Os compostos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] foram sintetizados seguindo o procedimento relatado pelo nosso grupo para o complexo com cobre (II) (MEDEIROS, et al., 2018). 44 Figura 11 – Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Zn(phen)(van)2] (a) (b) Fonte: Autora (2018). 4.2.3. Síntese da base de Schiff vglu (2-Deoxy-2-[(E)-(4-hydroxy-3- methoxybenzylidene)amino]hexopyranose) A base de Schiff foi sintetizada, segundo dados da literatura referentes à síntese de composto semelhante (PESSOA; TOMAZ e HENRIQUES, 2003), dissolvendo D- glucosamina·HCl (709,0 mg, 3,29 mmol) e NaOH sólido (132,0 mg, 3,29 mmol) em metanol. Após 5 minutos, filtrou-se o NaCl e adicionou-se vanilina (500,0 mg, 3,29 mmol) à solução. O sistema foi submetido à agitação a 45°C durante 2 horas. O precipitado amarelo foi filtrado e lavado com metanol. Teve-se um rendimento de 886,5 mg (86%). Figura 12 – Fórmula estrutural proposta para a base de Schiff vglu Fonte: Autora (2018). 4.2.4. Síntese do sistema [M(phen)(vglu)2], onde vglu = 2-Deoxy-2-[(E)-(4- hydroxy-3-methoxybenzylidene)amino]hexopyranose e M = Cu 2+ (3) e Zn 2+ (4) D-glucosamina·HCl (0,36 mmol) foi suspensa em metanol com 1 equivalente de NaOH sólido. Após 5 minutos, o NaCl foi filtrado e adicionou-se [M(phen)(van)2] (0,18 mmol) à solução. O meio reacional foi submetido à agitação constante por 2 horas a 60 o C. 45 Em seguida, evaporou-se a solução e o material obtido foi recristalizado em THF. O rendimento obtido foi de 128,0 mg (76%) (complexo de cobre) e de 120 mg (71%) (complexo de zinco). Figura 13 – Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) [Cu(phen)(vglu)2] e (b) [Zn(phen)(vglu)2] (a) (b) Fonte: Autora (2018). 4.2.5. Síntese dos filmes de quitosana O procedimento para purificação e da quitosana foi realizado conforme metodologia descrita na literatura (CAMPANA-FILHO e SIGNINI, 2001), onde a quitosana foi dissolvida em ácido acético, com posterior adição de acetato de sódio 0,2 mol L -1 . A solução foi agitada durante 24 horas, com posterior separação da parte insolúvel por filtração em funil de placa porosa. Foi adicionado etanol à solução filtrada e o precipitado formado foi posteriormente filtrado e lavado com álcool etílico e acetona. O grau de desacetilação da quitosana foi de 52,06% e a massa molar viscosimétrica obtida foi de 4,1. 10 4 g mol -1 . Para a preparação dos filmes, 1,0 g de quitosana purificada foi solubilizada em 50 mL de uma solução aquosa de ácido acético 1% (v/v). A solução foi mantida sob agitação durante 24 horas. Após este período, 12,5 mL da solução de quitosana foram adicionadas a placas de petri de 50 mL. O filme formado após a completa evaporação do solvente à temperatura ambiente (25 o C) foi lavado com solução aquosa de NaOH 1% (m/v) e água destilada, e novamente seco. 46 4.2.6. Síntese do sistema CS-MPV, com M = Cu2+ (5) ou Zn2+ (6) Os filmes de quitosana com dimensões de 2,5 cm x 2,5 cm foram imersos em 5 mL de soluções de [M(phen)(van)2] 0,01 mol L -1 . Para obtenção dos filmes com cobre foi utilizado metanol como solvente, enquanto para os filmes com zinco foi utilizada uma solução 50:50 (v/v) de metanol e DMSO. O sistema reacional foi mantido em repouso à temperatura ambiente durante 14 e 20 dias, para obter filmes com diferentes concentrações dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2], sendo 0,483 mg cm -2 e 0,403 mg cm -2 para 14 dias, e 0,686 mg cm -2 e 0,671 mg cm -2 , para 20 dias, respectivamente. Os filmes foram exaustivamente lavados com metanol e DMSO, e secos em dessecador. Por se tratar de um polímero com vários grupos amino livres, a adição do complexo [M(phen)(van)2] à estrutura da quitosana pode ocorrer de diferentes formas ao longo da cadeia polimérica. A Figura 14 apresenta as três possibilidades estruturais para a formação do complexo CS-ZPV. Na primeira condição (Figura 14a), a modificação ocorre em uma reação intracadeia, na qual os dois aldeídos do complexo [M(phen)(van)2] reagem com aminas de D- glucosaminas de uma mesma cadeia polimérica. Já na segunda possibilidade de modificação (Figura 14b), ocorre uma reação intercadeias, onde os dois aldeídos do complexo precursor reagem com aminas primárias de monômeros D-glucosamina de cadeias poliméricas diferentes. Por fim, tem-se a terceira possibilidade de modificação (Figura 14c), onde apenas um dos aldeídos do complexo [Zn(phen)(van)2] reage com a amina primária –NH2 do monômero D-glucosamina, originando o grupo imina. Nesse caso, tem-se ainda um aldeído livre na molécula, o que possibilitaria a reação deste sítio ativo com substâncias adicionais. Figura 14 – Possíveis fórmulas estruturais resultantes das modificações da quitosana com [M(phen)(van)2], (a) originadas de uma reação intracadeia envolvendo ambos os aldeídos presentes no complexo precursor, (b) estrutura resultante de uma reação de reticulação inter-cadeias e/ou (c) originadas pela reação de apenas um dos grupos aldeídos disponíveis no complexo. Fonte: Autora (2018). 47 4.2.7. Síntese do sistema [M(phen)(vpca)2], onde vpca = 2-metóxi-4-{(E)- [(piridin-2-ilmetil)imina]metil}fenol e M = Cu 2+ (7) e Zn 2+ (8) Os compostos foram sintetizados dissolvendo [M(phen)(van)2] (0,092 mmol) e 2- picolilamina (0,18 mmol) em metanol. Após 2 horas de constante agitação a 60 o C, evaporou- se a solução. A recristalização do material obtido foi realizada em metanol. Teve-se um rendimento de 84% para o complexo de cobre e 90% para o complexo de zinco, aproximadamente. Figura 15 – Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) [Cu(phen)(vpca)2] e (b) [M(phen)(vpca)2] (a) (b) Fonte: Autora (2018). 4.2.8. Síntese do sistema [M(phen)(vpca-ZnCl2)2], com M = Cu 2+ (9) e Zn 2+ (10) Os compostos foram sintetizados dissolvendo [M(phen)(vpca)2] (0,14 mmol) e cloreto de zinco (0,28 mmol) em metanol. O meio reacional foi mantido sob agitação por 2 horas a 60ºC e o sólido formado marrom (para ambos os complexos) foi filtrado e lavado com metanol. Teve-se um rendimento de 120,0 mg (86%) (complexo de cobre) e de 107,0 mg (76%) (complexo de zinco). 48 Figura 16 – Fórmulas estruturais propostas para (a) [Cu(phen)(vpca-ZnCl2)2] e (b) [Zn(phen)(vpca-ZnCl2)2] (a) (b) Fonte: Autora (2018). 4.3. MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO A caracterização dos complexos sintetizados no presente trabalho foi realizada utilizando-se técnicas espectroscópicas de IV e UV-Vis. Além dessas técnicas, os complexos de zinco também foram caracterizados por RMN, por se tratarem de compostos diamagnéticos, enquanto que os complexos de cobre foram caracterizados por eletroquímica (voltametria cíclica), tendo em vista que os potenciais redox do cobre estão dentro da faixa utilizada para a análise. Os complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] foram caracterizados ainda pela difração de Raio X de monocristal, e análise de EPR para o complexo de cobre. O complexo [Cu(phen)(van)2] foi submetido a ensaios biológicos de atividade de nuclease, geração de superóxido, citotoxicidade, citometria de fluxo e análise do ciclo celular. 4.3.1. Difração de Raio-X Os cristais do complexo [Cu(phen)(van)2] foram analisados pelo professor Javier Alcides Ellena, do Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo (IFSC- USP), através de um difratômetro Enraf-Nonius Kappa-CCD, utilizando radiação de Mo K (λ = 0.71073 Å). Os dados coletados foram obtidos a partir do programa COLLECT (Enraf- 49 Nonius, 1997-2000. COLLECT. Nonius BV. Delft, The Netherlands). A integração e o dimensionamento das reflexões foram realizados com o sistema de programas HKL Denzo- Scalepack (Otwinowski, Z. and Minor, W, (1997). HKL Denzo and Scalepack. In Methods in Enzymology, 276, edited by C.W. Carter, Jr. & R.M. Sweet pp. 307-326, New York: Academic Press). Os cristais do complexo [Zn(phen)(van)2] foram analisados pelo professor Alejandro Ayala, do Laboratório de Cristalografia Estrutural, da Universidade Federal do Ceará, através de um difratômetro BRUKER D8 ADVANCE, utilizando fonte de molibdênio. 4.3.2. Ressonância Paramagnética de Elétrons (EPR) A análise de Ressonância Paramagnética de Elétrons foi realizada no Laboratório de Bioinorgânica e Catálise da Universidade Federal do Paraná, na pessoa da professora Dra. Shirley Nakagaki. Os espectros de ressonância paramagnética de elétrons (EPR) foram obtidos em estado sólido e em solução (DMF), em um espectrômetro Bruker 200D-SRC X-Band, equipado com um Oxford ESR 9 Cryostat, operando a 9,412GHz, 10dB. 4.3.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN - 1H) Os experimentos de Ressonância Magnética Nuclear foram obtidos em colaboração com o professor Eduardo Henrique Silva de Sousa do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, CENAUREMN, com uso de um espectrômetro BRUKER modelo AVANCE DRX 500, 300 MHz, sob temperatura de 303 K. O deslocamento químico dos sinais de RMN foi retirado dos espectros nos experimentos unidimensionais e bidimensionais, utilizando para esse ultimo a espectroscopia de correlação homonuclear, COSY, a qual possibilita estabelecer as correlacões entre os átomos de hidrogênio que estão acoplados por 2-3 JH,H (acoplamentos geminais e vicinais, os quais podem ser medidos em espectros unidimensionais) e assim discernir a multiplicidade dos sinais observados no espectro de RMN 1 H. 4.3.4. Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho (IV) Os espectros vibracionais na região do infravermelho (IV) foram obtidos no estado sólido, na forma de pastilhas de KBr, utilizando o espectrofotômetro Shimadzu FTIR-8400S, série IRAFFINITY-1, da Central Analítica no Instituto de Química da Universidade Federal 50 do Rio Grande do Norte. Os espectros foram registrados em transmitância, utilizando uma faixa espectral de 400 a 4000 cm -1 , com número de varredura de 32 e resolução 4. 4.3.5. Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível As medidas dos espectros eletrônicos foram obtidas em solução (água, metanol e acetonitrila), à temperatura ambiente, em cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 cm, com posterior leitura no espectrofotômetro de UV-Vis do Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Agilent, photodiode-array, modelo 845. Os espectros foram obtidos na região de 190 a 1100 nm e os coeficientes de absortividade molar foram determinados a partir da lei de Lambert-Beer. A espectroscopia eletrônica foi também utilizada para estudo de pH do ligante vanilina, a fim de determinar seu pKa e analisar seu comportamento após possíveis desprotonações. Para monitorar a variação de pH, foi preparada 500 mL de solução aquosa de vanilina, com concentração 1,06.10 -4 mol L -1 . As análises das amostras foram realizadas em várias faixas de pH, em intervalos entre 3,0 a 9,5, através do espectrofotômetro UV-Vis. Para cada leitura realizada, foram adicionados pequenos volumes (μL) de uma solução de hidróxido de sódio 2,5 mol L -1 , seguido da determinação do pH com o auxílio do pHmetro de bancada (modelo EEQ-9025). Após atingir o pH alcalino em 9,5, foi adicionado 1 mL de ácido clorídrico 2,5 mol L -1 , a fim de avaliar o comportamento desta molécula em meio ácido e comprovar que após a desprotonação do grupo fenólico, não houve degradação desta substância. 4.3.6. Eletroquímica Para os estudos de voltametria cíclica, utilizou-se um potenciostato Epsilon (BASi - Bioanalytical Systems Inc.) da Central Analítica do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os experimentos foram realizados utilizando o eletrodo de referência Ag/AgCl saturado com KCl (3,5 mol L -1 ), o eletrodo de trabalho de carbono vítreo e o eletrodo auxiliar de platina. As medições voltamétricas foram realizadas à temperatura ambiente, em solução de KCl 0,1 mol L -1, pH 7,0, com ν = 100 mV s−1, sob atmosfera de argônio. 51 4.3.7. Análise de clivagem de DNA plasmidial por eletroforese em gel Géis de agarose, 0,8% (m/v), foram preparados pela dissolução de 0,4 g de agarose em 50 mL de tampão TAE (base Tris 89 mmol L -1 , acetato 89 mmol L -1 , EDTA 2 mmol L -1 ), em forno de microondas e obtido no resfriamento. Conforme descrito em (MEDEIROS, et al., 2018), as reações foram realizadas sob condições aeróbicas por incubação de diferentes concentrações do complexo (40, 20, 10, 5, 1 e 0,5 µmol L -1 ), H2O2 (1 mmol L -1 ), glutationa (GSH, 10 mmol L -1 ), 50 µmol L -1 de DTPA e plasmídeo pBR322 de DNA (8,3 ng µL -1 ). As eletroforeses foram realizadas com e sem H2O2 e GSH após 90 minutos de reação. Todas as amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose por aproximadamente 60 minutos sob 70 V e corrente variável de 53-64 mA. A banda de DNA foi visualizada e analisada, após 1 hora de incubação com GelRed™, usando um sistema de bioimagem (GelDOC + XR, Bio-Rad). O mecanismo de clivagem mediado pelo complexo (40 μmol L-1) na presença de GSH (1,5 mmol L -1 ) foi investigado pela adição de diferentes sequestrantes de radicais livres, como histidina (13 mmol L -1 ), manitol (13 mmol L -1 ), superóxido dismutase (4U µL -1 ), N-oxil- 2,2,6,6-tetrametilpiperidina - TEMPO (2,6 mmol L -1 ) e catalase (3,9 µmol L -1 ). A reacção foi mantida durante 30 minutos na presença e ausência de oxigênio, aplicando o método acima. 4.3.8. Análise do superóxido: redução com NBT A capacidade do complexo [Cu(phen)(van)2] de gerar o ânion superóxido foi avaliada utilizando o ensaio de nitroazul de tetrazólio (NBT). Os experimentos foram conduzidos em tampão fosfato 0,1 mol L -1 , pH 7,4 e 37 °C. A produção de superóxido foi monitorada por mudanças na absorbância a 560 nm, o que é característico de formazan originado pela reação de NBT com O2 - . Estes experimentos foram realizados utilizando-se 100 µmol L -1 de NBT e 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 75 µmol L -1 do complexo. Para avaliar o papel do estado de oxidação do cobre na geração de superóxido, os experimentos foram conduzidos com e sem o agente redutor biológico glutationa (1,5 mmol L -1 ). 4.3.9. Cultura celular Células de adenocarcinoma renal humano (786-0) (ATCC CRL-1932), células de melanoma murino (B16-F10) (ATCC CRL-6475) e células de hepatocarcinoma humano (HUH-7) (JCRB-0403) foram gentilmente doadas pelo Dr. Hugo Rocha (Departamento de Bioquímica, UFRN, Brasil). As células foram cultivadas em meio RPMI (células 786-0) ou 52 DMEM (todos os outros) suplementado com 10% de soro de bezerro recém-nascido (Cutilab, Campinas-SP, Brasil) e penicilina-estreptomicina (1 mg mL -1 ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), e eles foram incubados a 37 °C em 5% de CO2. 4.3.10. Ensaio de viabilidade celular (MTT) A citotoxicidade do complexo [Cu(phen)(van)2] foi avaliada em três linhagens celulares diferentes, B16-F10 (melanoma de camundongo), HUH-7 (células hepatocarcinoma humano) e 786-0 (células de adenocarcinoma renal humano), utilizando o 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetra-brometo de zinco (MTT). O ensaio foi conduzido para investigar a capacidade da enzima celular em reduzir o MTT para formazan em células com um metabolismo ativo. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5x10 3 células/poço (100 μl) e deixadas por 12 h em 100 μL de meio incubado a 37°C, 5% de CO2. As células retidas pelo crescimento foram libertadas da fase G0 pela adição de 10% de FCS na ausência (controle) ou na presença de diferentes concentrações do complexo (0,001 a 300 µmol L -1 ) dissolvido em meio de cultura celular (DMEM para B16-F10, HUH-7 e RPMI 1640 para 786-0) durante 24 h a 37ºC e 5% de CO2. O meio foi removido e foram adicionados MTT (1 mg mL -1 ) em DMEM ou RPMI. A absorvância foi lida num leitor de microplacas (Epoch Biotek Instruments, Winooski, EUA) a 570 nm. O número de células viáveis foi expresso como percentagem em relação aos controles não tratados, e as concentrações necessárias para 50% de inibição da viabilidade celular (IC50) foram calculadas a partir das curvas sigmoidais de resposta à dose. 4.3.11. Anexina V-FITC/PI Dupla Coloração e Análise por Citometria de Fluxo A análise por citometria de fluxo foi realizada para avaliar os efeitos do complexo [Cu(phen)(van)2] com relação à morte celular. Para tanto, utilizou-se um kit de marcadores com Anexina V-FITC para marcar a morte celular por apoptose e iodeto de propídio (PI) para marcar a necrose. O procedimento dessa análise é descrito na literatura (MEDEIROS, et al., 2018). Foi utilizado o citômetro de fluxo FASCANTO II, BD Biosciences, San Diego, CA, EUA, medindo emissão de fluorescência a 530-575 nm para Anexina V e 630/22 nm para PI. Para análise de dados, foi utilizado o software de análise FlowJo® versão 10.0.7 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, EUA). 53 4.3.12. Ensaio de Ciclo celular A análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo, onde 2 × 10 5 células 786-0 foram incubadas com o complexo [Cu(phen)(van)2] a 5, 10 e 20 μmol L -1 por 24 horas a 37 ° C em atmosfera com 5% de CO2. As células suspensas foram colhidas em PBS frio, centrifugadas, ressuspensas e fixadas em etanol a 70% e incubadas durante 1 h a 4ºC. Após as etapas de lavagem com PBS frio, as células foram digeridas por RNase (4,0 mg mL -1 ) a 37°C por 30 min e coradas com PI (1,0 mg mL − 1) no escuro à temperatura ambiente por 20 min. A distribuição do ciclo celular tratado foi medida pelo citômetro de fluxo FASCANTO II, e a análise dos dados foi realizada com o software FlowJo (Tree Star, Inc., CA, EUA). 54 Resultados e Discussão 55 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 SISTEMA [M(phen)(van)2], M = Cu 2+ (1) e Zn 2+ (2) 5.1.1. Estrutura Cristalina do sistema [M(phen)(van)2] A caracterização estrutural é uma etapa determinante na química de coordenação. Embora existam diferentes técnicas instrumentais que fornecem informações primordiais sobre a composição, energia dos orbitais e posicionamento dos ligantes na estrutura, em alguns casos estes dados são ainda insuficientes para o completo entendimento da estrutura de um composto. Nesse sentido, a difração de raios X de monocristal se apresenta como a técnica efetiva para a elucidação da estrutura de um composto, podendo-se determinar as posições relativas de todos os átomos que constituem a molécula e a posição relativa de todas as moléculas na cela unitária do cristal, de modo a verificar como a estrutura molecular está arranjada no espaço. Além disso, essa técnica oferece informações precisas a respeito de distâncias e ângulos de ligação dentro da estrutura cristalina, assim como distâncias de van der Waals entre átomos de diferentes moléculas, ou ainda permite estudar as ligações de hidrogênio e forças inter e intramoleculares. No presente trabalho, são apresentadas as estruturas cristalográficas dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2], bem como seus dados cristalográficos, os quais são discutidos e comparados com sistemas semelhantes na literatura. Os dados obtidos por raios X indicam que o composto cristalizado [Cu(phen)(van)2] apresenta fórmula empírica [C28H22N2O6Cu].3H2O, sistema triclínico e grupo espacial P-1, onde a = 12,8200(16) Å, b = 14,9120(16) Å, c = 15,1150(12) Å, enquanto que o complexo [Zn(phen)(van)2] apresenta fórmula empírica [C28H22N2O6Zn].2(CH4O), sistema monoclínico e grupo espacial P21/c, onde a = 14,6457(6) Å, b = 13,0090(6) Å, c = 16,0830(6) Å, e = 90º, = 113,5230(10)º,  = 90º. Os principais dados cristalográficos estão listados na Tabela 2. 56 Tabela 2– Dados cristalográficos e refinamento estrutural para os complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] Fórmula empírica C28H28N2O9Cu C30H30N2O8Zn Massa Molecular 600,06 611,95 Temperatura 293(2) K 273 K Comprimento 0,71073 Å 0,71073 Å Sistema cristalino Triclínico Monoclínico Grupo espacial P-1 P 21/c Dimensões da célula unitária a = 12,8200(16) Å a = 14,6457(6) Å b = 14,9120(16) Å b = 13,0090(6) Å c = 15,1150(12) Å c = 16,0830(6) Å = 104,639(6)° = 90º = 92,409(6)° = 113,5230(10)º  = 103,251(6)°  = 90º Volume 2705,9(5) Å 3 2809,6(2) Å 3 Z 4 4 Densidade (calculada) 1,473 Mg/m 3 1,447 g/cm 3 Coeficiente de absorção 0,865 mm -1 0,929 mm -1 F(000) 1244 1272 Tamanho do cristal 0,4 x 0,2 x 0,1 mm 3 - Theta (máx) 27,532° 30,539º Correção de absorção Semi-emp. de equiv. NUMERICAL Transmissão máx. e mín. 0,743 e 0,625 0,746 e 0,557 Informática a COLLECT 2 , HKL - Denzo e Scalepack 3 SHELXS 4 , SHELXL 4 R (reflexões) R = 0,0566 R = 0,0449 wR2 = 0,1028 wR2 = 0,1274 a Dados coletados, dados processados, solução estrutural e refinamento estrutural, respectivamente. Fonte: Adaptado de Medeiros (2018). Os diagramas ORTEP dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] são apresentados na Figura 17, e os comprimentos e ângulos de ligação selecionados estão listados nas Tabelas 3 e 4. 57 Figura 17 – Exibição ORTEP dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Cu(phen)(van)2], com átomos elipsoides e probabilidade de 50%. (a) (b) Fonte: Autora (2018). Tabela 3 - Distâncias (Å) e ângulos (°) selecionados em torno dos átomos de cobre para o complexo [Cu(phen)(van)2]. Fonte: Medeiros (2018). Distâncias (Å) Ângulos (º) Cu(1)-O(11):1,945(2) O(11)-Cu(1)-O(12): 76,03(9) O(21)-Cu(2)-O(22): 74,79(9) Cu(1)-O(12): 2,377(3) O(11)-Cu(1)-O(14): 94,9(1) O(21)-Cu(2)-O(24): 97,6(1) Cu(1)-O(14): 1,935(2) O(11)-Cu(1)-O(15): 88,85(9) O(21)-Cu(2)-O(25): 86,20(9) Cu(1)-O(15): 2,419(3) O(11)-Cu(1)-N(11): 92,6(1) O(21)-Cu(2)-N(21): 91,1(1) Cu(1)-N(11): 2,017(2) O(11)-Cu(1)-N(12): 170,5(1) O(21)-Cu(2)-N(22): 167,2(1) Cu(1)-N(12): 2,023(3) O(12)-Cu(1)-O(14): 90,42(9) O(22)-Cu(2)-O(24): 91,00(9) Cu(2)-O(21): 1,923(3) O(12)-Cu(1)-O(15): 158,24(8) O(22)-Cu(2)-O(25): 153,98(8) Cu(2)-O(22): 2,425(2) O(12)-Cu(1)-N(11): 94,08(9) O(22)-Cu(2)-N(21): 98,69(9) Cu(2)-O(24): 1,926(2) O(12)-Cu(1)-N(12): 97,9(1) O(22)-Cu(2)-N(22): 96,1(1) Cu(2)-O(25): 2,454(2) O(14)-Cu(1)-O(15): 75,18(9) O(24)-Cu(2)-O(25): 73,80(9) Cu(2)-N(21): 2,015(2) O(14)-Cu(1)-N(11): 172,0(1) O(24)-Cu(2)-N(21): 168,4(1) Cu(2)-N(22): 2,022(4) O(14)-Cu(1)-N(12): 92,4(1) O(24)-Cu(2)-N(22): 91,4(1) O(15)-Cu(1)-N(11): 102,25(9) O(25)-Cu(2)-N(21): 99,3(1) O(15)-Cu(1)-N(12): 98,9(1) O(25)-Cu(2)-N(22): 105,1(1) N(11)-Cu(1)-N(12): 80,5(1) N(21)-Cu(2)-N(22): 81,3(1) 58 Tabela 4 - Distâncias (Å) e ângulos (°) selecionados em torno dos átomos de zinco para o complexo [Zn(phen)(van)2]. Fonte: Autora (2018). A análise do cristal obtido para o complexo [Cu(phen)(van)2] indicou que existem duas estruturas moleculares independentes na unidade assimétrica do complexo com grupos doadores N2O4. Cada átomo de cobre(II) está coordenado aos dois átomos de nitrogênio do ligante 1,10-fenantrolina, tendo distâncias médias de 2,020 Å. Este valor é semelhante a outras distâncias da ligação Cu(II)-N(phen) relatadas na literatura para complexos hexacoordenados de cobre(II) também com ambientes N2O4, tais como 2,016 Å para [Cu(phen)(2-bromoacetato)2] (HE, et al., 2009), e 1,999 Å para [Cu(phen)(naproxanato)2] (DIMIZA, et al., 2011). Já no cristal do complexo [Zn(phen)(van)2], verificou-se apenas uma estrutura molecular na célula unitária, também com grupos doadores N2O4, e distância média de 2,126 Å para as ligações Zn(II)-N(phen). Os ambientes octaédricos distorcidos dos complexos são compostos ainda por duas moléculas de vanilina desprotonadas, que estão coordenados aos metais cobre(II) ou zinco(II) em posições cis, devido a característica bidentada dos ligantes envolvidos. Para o complexo de cobre(II), os íons vanilatos estão dispostos de uma maneira em que os grupos metóxidos estão localizados em lados opostos do mesmo eixo molecular enquanto que os átomos de oxigênio fenólicos estão posicionados trans aos átomos de nitrogênio da phen. Este arranjo de átomos doadores em volta do metal dá origem a um eixo axial simétrico (O(metoxi)-Cu-O(metoxi)) e dois eixos assimétricos (N(phen)-Cu-O(fenol)). Comparativamente, no complexo [Zn(phen)(van)2] os átomos de oxigênio fenólicos estão localizados em lados opostos do Distâncias (Å) Ângulos (º) Zn(01)-O(02):1,955(2) O(02)-Zn(01)-O(03):153,29(7) O(04)-Zn(01)-O(05): 91,66(6) Zn(01)-O(03): 1,958(2) O(02)-Zn(01)-O(04): 85,59(7) O(04)-Zn(01)-N(06): 168,75(7) Zn(01)-O(04): 2,368(2) O(02)-Zn(01)-O(05): 74,84(7) O(04)-Zn(01)-N(07): 96,32(7) Zn(01)-O(05): 2,326(2) O(02)-Zn(01)-N(06):105,20(7) O(05)-Zn(01)-N(06): 94,20(7) Zn(01)-N(06): 2,128(2) O(02)-Zn(01)-N(07): 99,85(7) O(05)-Zn(01)-N(07):170,08(7) Zn(01)-N(07): 2,124(2) O(03)-Zn(01)-O(04): 74,08(7) N(06)-Zn(01)-N(07): 78,96(8) O(03)-Zn(01)-O(05): 88,39(7) Zn(01)-O(02)-C(08): 119,4(1) O(03)-Zn(01)-N(06): 96,48(7) Zn(01)-O(03)-C(0B): 122,6(2) O(03)-Zn(01)-N(07): 99,45(8) Zn(01)-O(04)-C(0A): 109,9(1) Zn(01)-O(04)-C(0Y): 131,6(2) 59 mesmo eixo molecular (eixo axial simétrico), enquanto que os átomos de oxigênio dos metóxidos estão posicionados trans aos átomos de nitrogênio da phen (eixos assimétricos). Os dados de cristalografia revelaram que as distâncias médias das ligações Cu-O(metoxi) (2,418 Å) no complexo (1) são significativamente maiores do que os valores médios das ligações Cu-O(fenol) (1,932Å), representando uma variação de comprimento de ligação de 0,486 Å. De forma semelhante, no complexo (2) observou-se que as distâncias médias das ligações Zn-O(metóxi) são de 2,347 Å, maiores do que os valores médios das ligações Zn- O(fenol), 1,957Å, com variação de comprimento de ligação de 0,390 Å. Estas diferenças substanciais podem ser atribuídas à maior densidade eletrônica presente nos oxigênios fenólicos, os quais são responsáveis por doações eletrônicas mais favoráveis para os metais, quando comparados aos átomos doadores neutros dos grupos metóxidos. Este comportamento também é observado em outros complexos com sistema metal-N2O4, tais como, [Fe(van)2(H2O)2] (Fe-O(metóxi) = 2,345 Å, Fe-O(fenol) = 2,088 Å,  = 0,257 Å) (ZHANG, 2006) e [Cu(van)2(H2O)2] (Cu-O(metóxi) = 2,260 Å, Cu-O(fenol) = 1,909 Å,  = 0,351 Å) (KOZLEVČAR, et al., 2005). Analisando os dados do complexo (1), verifica-se que as ligações Cu-O(fenol) e Cu- N(phen) nos dois eixos assimétricos tem comprimentos semelhantes, no entanto, são menores do que as do eixo axial simétrico. Tal arranjo indica que a estrutura possui uma distorção tetragonal com alongamento no eixo z, que corresponde ao eixo formado pelas ligações O(metóxi)-Cu-O(metóxi), para o qual o efeito Jahn-Teller, tipicamente observado em complexos de cobre(II), possui importante contribuição (HALCROW, 2013). No complexo (2), entretanto, as ligações Zn-O(fenol), Zn-O(metóxi) e Zn-N(phen) apresentam comprimentos diferentes, com as ligações no eixo axial menores do que as ligações assimétricas no eixo equatorial, indicando uma estrutura com distorção tetragonal com compressão no eixo z, que corresponde ao eixo formado pelas ligações O(fenol)-Cu-O(fenol). Nos complexos em estudo, os ângulos nos planos equatoriais estão consideravelmente distorcidos frente ao ângulo de 90º esperado para um octaédrico ideal, onde, no complexo (1) observa-se um pequeno ângulo de 80,51º entre as ligações Cu-N(phen) com relação ao plano equatorial, e ângulos elevados de 94,92º (O11-Cu1-O14) entre os átomos de oxigênios para diferentes íons vanilatos, ou valores intermediários de 92,33 e 92,59º referentes ao ângulo N(phen)-Cu-O(fenol). No complexo (2), há um ângulo de apenas 78,96º entre as ligações N(phen)- Zn-N(phen), além de ângulos elevados de 91,66º (O(metóxi)-Zn-O(metóxi)), 94,20º (N(phen)-Zn- O(metóxi)) e 96,32º (N(phen)-Zn-O(metóxi)). A deformação octaédrica é também evidenciada pela 60 soma dos ângulos diferente de 360º, o valor esperado para um octaédrico perfeito. No complexo de cobre(II), tem-se a soma N11–Cu1–N12 (80.51) + O11–Cu1–N11 (92.59) + O11-Cu1-O14 (94.92) + O14–Cu1–N12 (92.33) = 360.35o, enquanto no complexo de zinco(II) verifica-se N07-Zn-N06 (78,96) + N06-Zn-O05 (94,20) + O05-Zn-O04 (91,66) + O04-Zn-N07 (96,32) = 361,14º. As coordenações dos íons vanilatos ao cobre(II) e ao zinco(II) conduziram a ligeiros aumentos nos comprimentos das ligações C=O dos aldeídos, apresentando 1,209(5) Å e 1,211(4) Å, respectivamente, comparados à vanilina livre (1,199(8) Å) (LEE, et al., 2012). Efeitos semelhantes foram relatados para outros complexos metálicos com vanilina, como, [Cu(van)2(H2O)2], onde a ligação C=O do aldeído foi aumentada para 1,217 Å (KOZLEVČAR, et al., 2005). A caracterização estrutural dos complexos octaédricos com dois íons vanilatos e um ligante bidentado ou dois ligantes monodentados adicionais, em arranjos estruturais cis ou trans, já são conhecidas para diferentes metais de transição (LIN e XU, 2005; ZHANG, 2006; GAO e LIU, 2005; KOZLEVCAR, et al., 2012). O ambiente de coordenação assimétrica proporcionado pelos átomos de oxigênio vanilóides torna possível até cinco arranjos diferentes dos ligantes, conforme apresentado na Figura 18. Três deles referentes a estruturas cis, e dois a isômeros trans, identificados neste trabalho como cis - I, II ou III e trans - I ou II. 61 Figura 18 – Estruturas possíveis para complexo metálico octaédrico com dois ligantes vanilóides Fonte: Medeiros (2018). As estruturas podem ser diferenciadas pelo posicionamento dos átomos trans aos grupos metóxi, de maneira que, ambos podem ser átomos doadores adicionais L (cis-I), ou pode haver uma distribuição assimétrica tendo um átomo de oxigênio fenólico e um átomo de L trans ao metóxi na mesma estrutura (cis-II), ou ainda, os grupos metóxi podem ser posicionados trans um ao outro (cis- III e trans-I) ou trans aos oxigênios fenólicos (trans-II). Apesar do número de possibilidades estruturais, uma pesquisa desta classe de compostos efetuada no Centro de Dados Cristalográficos de Cambridge, base de dados CCDC (ALLEN, 2002), revelou que a maior parte dos complexos com duas vanilinas coordenadas em cis são organizados preferencialmente em um arranjo cis - I (7 compostos de um total de 8), com ligantes bidentados ou monodentados adicionais que completam a esfera de coordenação. Alguns exemplos podem ser citados: [Cu(van2(H2O)2], [Fe(van)2(H2O)2] e [Cu(van)2(tetrametilenodiamino)]. No entanto, somente um complexo com arranjo cis - III foi encontrado: [Cu(van)2(tetrametileno)]. Portanto, o composto [Cu(phen)(van)2] descrito no presente trabalho é parte do grupo de complexos de vanilina com o arranjo cis – III, enquanto cis - I cis - II cis - III trans-I trans-II trans-II 62 o complexo [Zn(phen)(van)2] possui seus átomos organizados em um arranjo mais comumente observado, cis-I. Nenhum composto foi encontrado com arranjo cis - II. Além disso, todos os isômeros trans, tem apenas a estrutura trans - I, indicando assim que a disposição em que o grupo metóxido esteja trans em relação a um átomo de oxigênio fenólico deve ser termodinamicamente desfavorável (MEDEIROS, et al., 2018). Estendendo a busca de ligantes com ambiente de coordenação semelhante à vanilina, foram encontrados quatro composto com guaiacol, metoxiacético e 4-nitroguaiacol. Apenas um desses é cis-III, um complexo de níquel (II) com 4-nitroguaiacol, enquanto os outros têm arranjo cis-I (MEDEIROS, et al., 2018). A diferenciação das estruturas é acompanhada por alterações consideráveis nos comprimentos de ligação e na distorção tetragonal, como pode ser visto na Figura 19 para alguns complexos de cobre(II). Para estruturas cis – I, observa-se que as ligações em dois dos eixos (ligações L-M-OCH3) têm o mesmo comprimento e por isso podem ser identificadas como eixos x e y, enquanto que o eixo z apresenta menor comprimento (ligações O(fenol)-M- O(fenol)). Por outro lado, os arranjos cis - III possuem grupos metóxi trans um ao outro, tornando possível que esta ligação seja maior em comparação com as duas ligações L-M-O, com semelhantes distâncias de comprimento. Portanto, os diferentes arranjos têm uma relação estreita com a distorção tetragonal, onde complexos com metal(II) e ligante vanilóide com arranjo cis – I apresentam as ligações sobre o eixo z encurtadas enquanto compostos com arranjo cis – III apresentam alongamento do eixo z. 63 Figura 19 – Comprimentos das ligações de complexos de cobre (II) com íons N2O4 (R = aldeído). (a) L,L = N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina; (b) L = H2O; (c) L,L = N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina; (d) [Cu(phen)(van)2] (presente trabalho) Fonte: Medeiros (2018). A distorção molecular para um complexo octaédrico pode ser avaliada através do parâmetro de tetragonalidade, T, tomando a razão entre a média dos comprimentos das ligações equatoriais (Requatorial) e os comprimentos médios de M-O das ligações axiais (Raxial). O gráfico do parâmetro T versus comprimento médio das ligações M-Oaxial, Figura 20, abrange o conjunto de dados relatados na literatura, incluindo oito complexos cis divanilina, além de quatro compostos com o ambiente de coordenação semelhante à vanilina (guaiacol, metoxiacético e 4-nitroguaiacol), o os novos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] sintetizados neste trabalho. O gráfico mostra a correlação significativa dos dados, com R 2 = 0,9784. Além disso, os compostos com a mesma disposição podem ser agrupados no gráfico e o grau de distorção tetragonal altera drasticamente dependendo do arranjo do complexo, sendo esse alongado, cis-III, ou comprimido, cis-I. (a) (b) (c) (d) 64 Figura 20 – Gráfico do parâmetro T versus a media do comprimento de ligação Cu–Oaxial (Raxial). Compostos: (1) [Cu(van-NO2)2(tetrametileno)]; (2) [Cu(van)2(tetrametileno)]; (3) [Cu(phen)(van)2]; (4) [V(guaicol)2(tetrametileno)]; (5) [Mn(van)2(H2O)2]; (6) [Fe(van)2(H2O)2]; (7) [Ni(van)2(H2O)2]; (8) [Co(van)2(H2O)2]; (9) [Zn(metoxiacético)2(H2O)2]; (10) [Zn(van)2(H2O)2]; (11) [Cu(van)2(H2O)2]; (12) [Ti(guaiacol)2(Cl)2]; (13) [Cu(van)2(tetrametileno)2]; (14) [Zn(phen)(van)2]. Fonte: Medeiros (2018). A distorção tetragonal é observada para todos os complexos de cobre(II) avaliados, cujo efeito Jahn-Teller é usual quando T < 1 (YOUNGME, et al., 2007), mas também em complexos com centros metálicos em que o efeito Jahn-Teller não é esperado, como níquel (II) e zinco (II). Isto indica que a distorção tem uma maior contribuição a partir das diferentes doações de elétrons dos átomos de oxigênio no ligante assimétrico. 5.1.2 Ressonância Paramagnética de Elétrons do complexo [Cu(phen)(van)2] A Ressonância Paramagnética de Elétrons (EPR) é uma técnica bastante utilizada na identificação e caracterização de espécies químicas que possuem elétrons desemparelhados, sejam estas complexos com metais dos blocos d e f, ou espécies radicalares. Para compostos de coordenação, por exemplo, é possível detectar a presença de um metal na amostra analisada, desde que ele seja paramagnético. Este procedimento decorre da especialidade da técnica em gerar um sinal com intensidade proporcional ao número de elétrons com spins desemparelhados, à medida que um campo magnético externo é aplicado sobre a amostra. 65 Como os complexos de cobre apresentam configuração eletrônica d 9 , ou seja, possuem elétrons desemparelhados, a técnica de EPR surge como uma ferramenta útil na caracterização destes compostos. Dessa forma, no presente trabalho será apresentada a caracterização do complexo [Cu(phen)(van)2] por EPR. Os espectros de EPR do complexo [Cu(phen)(van)2], obtidos em solução de DMF à temperatura de 77 K e em estado sólido à temperatura ambiente, são apresentados na Figura 21. Figura 21 – Espectros de EPR do [Cu(phen)(van)2] (a) em solução congelada de DMF e (b) em estado sólido (a) (b) Fonte: Autora (2018). O espectro de EPR do complexo [Cu(phen)(van)2], obtido em solução de dimetilformamida (DMF) a 77 K, exibe um perfil anisotrópico típico de complexos monoméricos de cobre(II), com linhas hiperfinas bem definidas, divididas em quatro sinais na região de g//, que ocorrem devido a interação entre o spin do elétron, S = 1/2, com o spin núclear do cobre, I = 3/2. O espectro de EPR apresenta simetria axial com parâmetros geométricos de g// (2,30) >g(2,06) > 2,0023. Estes valores de g sugerem que o complexo [Cu(phen)(van)2] apresenta geometria octaédrica com distorção tetragonal, simetria D4h, com alongamento das ligações metal ligante sobre o eixo z, tal como evidenciado nos resultados cristalográficos. Com isso, ocorre a quebra da degenerescência dos orbitais t2g e eg do Cu(II), onde os orbitais dz 2, dxz e dyz, que possuem componente geométrica em z, irão interagir menos com os átomos de oxigênio metóxidos e suas energias são diminuídas, enquanto os orbitais dx 2 -y 2 e dxy têm suas 66 energias aumentadas na mesma proporção, de forma a manter o equilíbrio energético do sistema, conforme ilustrado na Figura 22. Com isso, observa-se que o elétron desemparelhado do cobre (II) está localizado em um estado do orbital dx2-y2 ( 2 B1g). Figura 22–Desdobramento do campo cristalino para um complexo de Cu2+ com distorção tetragonal com alongamento axial Fonte: Autora (2018). Os parâmetros obtidos no espectro de EPR foram comparados com dados relatados na literatura para complexos octaédricos de cobre (II) com sistemas vanilóides semelhantes (GAJEWSKA, et al., 2014). Observou-se certa tendência nesses complexos em apresentar simetria axial com o fator g perpendicular maior que o g paralelo, indicando distorção octaédrica com compressão axial para a geometria desses compostos. Como exemplo, o EPR do complexo [Cu(van)2(H2O)2], obtido em estado sólido à temperatura ambiente, organizado em um arranjo do tipo cis – I, apresenta simetria axial com g(2,302) > g// (2,005) ~ 2,0023, indicando uma geometria octaédrica com compressão axial (KOZLEVČAR; GOLOBIČ e STRAUCH, 2006). Esses valores de g corroboram com os dados de raios-X obtidos para sistemas cobre(II)–divanilato, os quais mostram tendência contrária ao complexo [Cu(phen)(van)2], ao apresentarem, em sua maioria, isomeria cis-I, caracterizada pela distorção tetragonal com compressão do eixo axial. Adicionalmente, na região perpendicular do espectro, são observadas cinco linhas de divisões superhiperfinas (2nIN + 1), com valor de acoplamento de 13,85 G, que ocorrem devido a interação dos dois átomos de 14 N (I = 1) presentes na fenantrolina, com o átomo de cobre (II). 67 Em contraste, o espectro do complexo [Cu(phen)(van)2], obtido em estado sólido à temperatura ambiente, não apresentou separação hiperfina claramente resolvida em paralelo nem divisões superhiperfinas na região perpendicular. Esta diferenciação se deve à possibilidade de orientação aleatória das moléculas do complexo quando previamente dissolvido em DMF e posteriormente congelado. Tal aleatoriedade não é facilitada quando o espectro é obtido do material ainda no estado sólido (MABBS, 1993). Em compostos com simetria axial, o parâmetro geométrico G mede a interação de troca entre os centros de cobre(II) no estado policristalino. Se G > 4,0 a interação de troca é negligenciável e caso seja inferior a 4,0 a interação de trocas é consideravelmente significativa. No presente estudo, o valor do parâmetro G é 5,16, indicando que a interação de trocas é negligenciável. O fator empírico f é dado pela razão g/// A//, o qual foi utilizado para avaliar a distorção tetragonal no complexo de cobre, em que os valores entre 110 e 120 são característicos para complexos planares (sem distorção) enquanto que a faixa de 130 a 150 são típicos de estruturas com ligeira a moderada distorção, e valores 180-250 indicam a distorção considerável. O valor calculado para o composto [Cu(phen)(van)2] foi de 155, e embora não esteja exatamente localizado entre as faixas estabelecidas, indica que está perto de uma geometria moderadamente distorcida (MEDEIROS, et al., 2018). Os parâmetros obtidos a partir dos espectros de EPR para o complexo [Cu(phen)(van)2] são sumarizados na Tabela 5. Tabela 5 – Parâmetros de EPR para o complexo [Cu(phen)(van)2] Complexo g g// A(G) A// (G) g// /A// (cm) (a) G (b) [Cu(phen)(van)2] 2,06 2,30 13,85 158 155 5,16 (a) A//(10 -4 cm -1 ) = g  A(G) = 0,46686 g A(G); (b) G = (g// - 2,0023)/(g- 2,0023) Fonte: Medeiros (2018). A Tabela 6 apresenta um comparativo dos parâmetros de EPR apresentados para o complexo [Cu(phen)(van)2] com dados da literatura (GAJEWSKA, et al., 2014). 68 Tabela 6 – Parâmetros de EPR para o complexo [Cu(phen)(van)2], em comparativo com a literatura (GAJEWSKA, et al., 2014). [Cu(phen)(van)2] trans- [Cu(bdtbpza)2(pym)(CH3OH)2] cis- [Cu(bdtbpza)2(tmeda)(H2O)2] Geometria Octaédrica (N2O4) Octaédrica (N2O4) Octaédrica (N2O4) g// 2,30 2,316 2,260 g 2,06 2,057 2,039 A// (G) 158 - - A// (10 -4 cm -1 ) 148 169 171 A(G) 13.85 - - A (10 -4 cm -1 ) 13 19 21 g// /A// (cm) (a) 155 137 132 G (b) 5,16 5,54 6,67 Fonte: Medeiros (2018). 5.1.3 Espectros Vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(van)2] A espectroscopia vibracional na região do infravermelho (IV) possui vasta aplicação na identificação dos compostos de coordenação, por se tratar de uma técnica de absorção que permite a obtenção de informações sobre as estruturas moleculares destes compostos, como, por exemplo, identificar os grupos funcionais presentes em uma dada molécula, assim como sua simetria. Essa técnica foi também utilizada na caracterização dos complexos [M(phen)(van)2], tendo o cobre e o zinco como centros metálicos. A sobreposição dos espectros de infravermelho do sistema [M(phen)(van)2], com M = Cu 2+ e Zn 2+ , obtidos em pastilhas de KBr, abrangendo a região de 4000 a 400 cm -1 , é apresentada na Figura 23, enquanto que os cortes dos espectros na região de 1700 a 500 cm -1 são apresentados na Figura 24. 69 Figura 23 – Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(van)2] (preto) e [Cu(phen)(van)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm -1 Fonte: Autora (2018). Figura 24 - Sobreposição dos espectros vibracionais do [Zn(phen)(van)2] (preto) e [Cu(phen)(van)2] (vermelho) na região de 1700 a 500 cm -1 Fonte: Autora (2018). Ao analisar os espectros da Figura 23, observam-se bandas próximas a 3060 e 2830 cm -1 , as quais são características de estiramento C-H do anel aromático e C-H alifático, 70 respectivamente (SILVERSTEIN, et al., 2007). A banda larga próxima a 3400 cm -1 em ambos os espectros, é referente ao estiramento O-H, e provavelmente se deve à presença de água no KBr utilizado para as análises. A região de 1750 a 400 cm -1 dos espectros, Figura 24, possui bandas características de estiramentos e deformações angulares dos ligantes fenantronila e vanilina, as quais serão posteriormente discutidas. Ao comparar os espectros dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2], verifica-se pequenas diferenças e deslocamentos nas bandas, dentre os quais, destaca-se os modos vibracionais referentes ao estiramento C=O de aldeído em 1652 cm -1 e 1660 cm -1 , respectivamente, apresentam um pequeno deslocamento de 8 cm -1 , justificado pela variação dos arranjos dos complexos (cis-III e cis-I). Com o objetivo de confirmar importantes bandas da phen no sistema [M(phen)(van)2], além de caracterizar os novos modos vibracionais observados após a coordenação da vanilina aos complexos precursores, os espectros dos compostos [M(phen)(van)2], cis-[M(phen)Cl2] e da vanilina não coordenada foram sobrepostos na região de 1750 a 500 cm -1 , como apresentado na Figura 25. Figura 25 – Sobreposição dos espectros vibracionais do (a) cis-[Cu(phen)Cl2] (preto), [Cu(phen)(van)2] (vermelho) e vanilina (azul) e (b) [Zn(phen)Cl2] (preto), [Zn(phen)(van)2] (vermelho) e vanilina (azul) na região de 1750 a 500 cm -1 (a) (b) Fonte: Autora (2018). Os espectros dos complexos precursores [M(phen)Cl2] possuem uma banda intensa próxima a 1424 cm -1 , referente ao estiramento C=N aromático da fenantrolina. Os complexos 71 [M(phen)(van)2] apresentam bandas em 1428 (1) e 1426 cm -1 (2), que podem ser referentes aos estiramentos C=N da fenantrolina e/ou CH3 do grupo metóxido da vanilina, ambos presentes na estrutura do sistema e com modos vibracionais em regiões próximas nos espectros. Os complexos com a vanilina apresentam ainda bandas referentes aos estiramentos C=C aromáticos da phen e da vanilina, em 1580 e 1547 cm -1 para o composto de cobre e 1586 e 1552 cm -1 para o composto de zinco. De forma comparativa, os complexos precursores possuem modos vibracionais localizados próximos a 1585 e 1514 cm -1 , assim como a vanilina apresenta bandas intensas em 1590 e 1507 cm -1 . Tais bandas possuem deslocamentos pouco significativos, os quais podem ser justificados pela coordenação da vanilina a cada centro metálico. Analisando a sobreposição dos espectros desses compostos, observa-se que o sistema [M(phen)(van)2] apresenta uma banda em 1154 cm -1 . Nesta região, pode ocorrer tanto o estiramento C-O fenólico da vanilina ou deformação angular C-H no plano do ligante fenantrolina. Como a coordenação da vanilina a cada metal se processa através do grupo fenol, e este se encontra na forma desprotonada, conforme evidenciado pela cristalografia dos complexos, o grupo O-H já não existe no composto, e, portanto, pode-se indicar a banda citada como sendo pertinente à deformação angular C-H da fenantrolina. Os complexos [M(phen)Cl2] apresentam este modo vibracional em 1146 cm -1 sendo observado, portanto, um pequeno deslocamento de 8 cm -1 , o qual pode ser atribuído à alteração na esfera de coordenação do íon metálico central. Verifica-se nos espectros dos complexos [M(phen)(van)2] duas bandas em 851 e 722 cm -1 para o complexo de cobre e 849 e 727 cm -1 para o complexo de zinco, as quais são características de deformação angular C-H fora do plano do ligante fenantrolina. Ao comparar com os respectivos complexos precursores, que possuem essas bandas localizadas em 854 e 721 cm -1 (M= Cu 2+ ) e 853 e 724 cm -1 (M= Zn 2+ ), verifica-se a ocorrência de deslocamentos pouco significativos após a mudança dos ligantes cloretos pela vanilina. O espectro da vanilina livre também apresenta modos vibracionais em 858 e 733 cm -1 , referentes à deformação angular C-H fora do plano, os quais estão possivelmente sobrepostos às bandas da fenantrolina nos espectros de cada novo complexo. Conforme observado, foram evidenciadas várias semelhanças entre os espectros do novo sistema vanilóide e seus complexos precursores. No entanto, é importante destacar as novas bandas presentes no [M(phen)(van)2] pertencentes ao ligante vanilina, as quais serão discutidas a seguir. 72 As bandas em 1652 e 1262 cm -1 (1), bem como em 1660 e 1261 cm -1 (2), são características dos estiramentos C=O e C-CHO de aldeído, respectivamente. Comparativamente, a vanilina livre possui esses estiramentos em 1666 e 1266 cm -1 , o que resulta em deslocamentos para menores números de onda nos complexos. Tais deslocamentos estão em conformidade com os dados cristalográficos para os complexos de cobre e zinco, onde se verifica que as coordenações dos metais(II) à vanilina causam pequenos aumentos nos comprimentos das ligações das carbonilas de 1,199(8) para 1,209(5) e 1,211(4)Å, respectivamente. Essas alterações podem ser justificadas pela coordenação de cada centro metálico aos átomos de oxigênio dos grupos metóxido e fenólico, visto que esses átomos ricos em elétrons doam densidade eletrônica ao Cu 2+ em (1) e ao Zn 2+ em (2), e a carbonila retira densidade eletrônica do anel aromático, que agora estará mais deficiente eletronicamente. Como a densidade eletrônica que a carbonila recebe é menor, a energia necessária para que ocorra a excitação para um estado vibracional mais elevado nas ligações C=O e C-CHO também será menor e, consequentemente, maior será o comprimento das ligações. Os espectros do sistema [M(phen)(van)2] apresentam uma banda próxima a 1194 cm -1 , referente ao estiramento C-O do grupo éter. Comparativamente, o espectro vibracional da vanilina livre apresenta esta banda em 1200 cm -1 , gerando um pequeno deslocamento para menores números de onda quando o ligante está coordenado. Tal resultado corrobora com os dados cristalográficos do sistema [M(phen)(van)2], que evidenciam maiores comprimentos nas ligações O-CH3 no complexo de cobre (1,420 Å) e no complexo de zinco (1,422 Å), comparados ao ligante livre (1,361 Å) (GUNASEKARAN e PONNUSAMY, 2005). Assim, quanto maior o comprimento da ligação, mais fraca é a ligação e menor a energia necessária para que ocorra a excitação para um estado vibracional mais elevado. As bandas em 1465 e 1428 cm -1 (1) e 1463 e 1426 cm -1 (2) também estão presentes no espectro da vanilina livre, sem nenhum deslocamento significativo. Tais bandas se referem ao estiramento assimétrico CH3 do grupo metóxido (GUNASEKARAN e PONNUSAMY, 2005), podendo a banda de menor número de onda representar a sobreposição dos estiramentos da vanilina com a fenantrolina, ambos presentes nessa região. O estiramento O-CH3 da vanilina localiza-se na região de 1024 cm -1 no complexo [Cu(phen)(van)2] e em 1021 cm -1 no complexo [Zn(phen)(van)2]. O espectro da vanilina, no entanto, apresenta este modo vibracional em 1028 cm -1 , resultando em um pequeno deslocamento para maiores números de onda. 73 É de se esperar que os modos vibracionais dos grupos metóxido e fenol possuam deslocamentos significativos após a coordenação ao metal, uma vez que esta se processa via átomos de oxigênio destes grupos. Porém, ao analisar tais bandas, observam-se deslocamentos pouco significativos, indicando que estes substituintes sofrem poucas alterações em suas ligações após a coordenação da vanilina ao centro metálico. Estes dados estão de acordo com a literatura (KOZLEVČAR, et al., 2005), a qual caracteriza um complexo de cobre com o ligante vanilina, e descreve os principais estiramentos desse ligante nas regiões de 1658, 1582, 1557, 1494, 1468 e 1432 cm -1 . Este complexo de referência possui duas vanilinas coordenadas ao metal, através dos átomos de oxigênio dos grupos metóxido e fenol, e também possuem pequenos deslocamentos em seus estiramentos, se assemelhando, portanto, aos complexos de cobre e zinco sintetizados neste trabalho. Na Tabela 7, são informadas as frequências de estiramentos e as atribuições das principais bandas presentes no espectro de infravermelho dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2]. Ao fazer uma comparação entre estes valores descritos, indica-se a coordenação dos sistemas cobre-fenantrolina e zinco-fenantrolina ao ligante vanilina. Tabela 7 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] Atribuições [Cu(phen)(van2)] [Zn(phen)(van)2] C-H aromático 3060 3059 C-H alifático 2830 2831 C=O aldeído aromático 1652 1660 C=C aromático 1580, 1547 1586, 1552 assCH3 metóxido e/ou C=N aromático 1465 e 1428 1463, 1426 C-CHO aldeído 1262 1261 C-O éter 1193 1196 C-H dentro do plano 1154 1154 O-CH3 1024 1021  C-H fora do plano 851 849  C-H fora do plano e/ou  CC(CHO) fora do plano (aldeído) 722 727  C-C=O no plano (aldeído) 584 584 Fonte: Autora (2018). 74 5.1.4. Espectros de absorção eletrônica na região do ultravioleta e visível do sistema [M(phen)(van)2] A absorção da radiação eletromagnética na região do ultravioleta (UV) (100-400 nm) e visível (Vis) (400-800 nm) está normalamente associada a transições eletrônicas, as quais ocorrem quando, por interação da radiação eletromagnética com o meio absorvente, um elétron é promovido de um estado eletrônico de baixa energia para outro de energia mais elevada. Esta técnica pode ser utilizada em estudos tanto de compostos orgânicos quanto inorgânicos, estando entre as mais presentes em investigações sobre compostos de coordenação. Partindo desse princípio, a espectroscopia de absorção na região do ultravioleta e visível é apresentada nesse capítulo para complementar a caracterização dos complexos de cobre(II) e zinco(II) com ligantes fenantrolina, associados ao ligante vanilina. Os espectros do sistema [M(phen)(van)2], obtidos em meio aquoso, possuem um elevado número de bandas na região do ultravioleta, presentes em 205, 227, 273, 294, 312 e 345 nm para o complexo de cobre, e 201, 228, 271, 292, 312 e 345 nm para o complexo de zinco, como pode ser observado na sobreposição da Figura 26. Além dessas, o espectro eletrônico de cobre apresenta bandas de menor intensidade, abrangendo quase toda a região do visível, em 469, 650 e 775 nm, fato que justifica a cor quase preta desse complexo. As atribuições das bandas observadas no espectro dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] são apresentadas na Tabela 8. Figura 26 – Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos complexos [Cu(phen)(van)2] (preto), concentrações 1,7 x 10 -5 mol L -1 e 3,6 x 10 -3 mol L -1 para a ampliação na região das bandas d-d, e [Zn(phen)(van)2] (vermelho), 1,7 x 10 -5 mol L -1 . Fonte: Autora (2018). 75 Tabela 8 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] em meio aquoso. [Cu(phen)(van)2] [Zn(phen)(van)2] Atribuição das Transições Comprimento de Onda (nm) ε (L mol-1 cm-1) Comprimento de Onda (nm) ε (L mol-1 cm-1) I.L. phen (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. van (π → π*) I.L. van (π → π*) d-d d-d d-d 205 227 273 294 312 345 469 650 775 5,43 10 4 4,24. 10 4 4,04. 10 4 2,08. 10 4 1,71. 10 4 1,45. 10 4 1,25. 10 2 5,53. 10 1 4,78.10 1 201 228 271 292 312 345 - - - 5,56 10 4 5,62. 10 4 4,59. 10 4 2,40. 10 4 1,72. 10 4 1,60. 10 4 - - - Fonte: Autora (2018). O espectro eletrônico do ligante livre 1,10-fenantrolina em solução aquosa é caracterizado por três bandas na região do ultravioleta, características de transições permitidas de natureza -*, em 200, 227 e 265 nm (ARMAROLI, et al., 1992 e HENRY e HOFFMAN, 1979). Para o complexo [Cu(phen)(van)2], as transições intraligantes da fenantrolina são observadas em 205, 227, 273 e 294 nm, apresentando deslocamentos de 5 e 8 nm para maiores comprimentos de onda nas transições em 205 e 273 nm, respectivamente, quando comparado ao ligante livre. O complexo [Zn(phen)(van)2], no entanto, apresenta transições intraligantes da phen em 201, 228, 271 e 292 nm, obtendo, portanto, um pequeno deslocamento de 6 nm para maiores comprimentos de onda na banda em 271 nm, comparativamente à fenantrolina livre. Tais comportamentos indicam que as coordenações do Cu 2+ e do Zn 2+ provocam pequena redução de energia nas transições -* da phen. O espectro eletrônico da vanilina em meio aquoso apresenta quatro bandas referentes a transições -* com máximos de absorção em 204, 229, 279 e 309 nm. O perfil de tal espectro é consequência dos efeitos eletrônicos causados pelos três diferentes substituintes presentes no anel aromático: aldeído, éter e fenol. O aumento do pH na solução de vanilina por adição de NaOH causa deslocamento significativo para a região do vermelho para todas as bandas, enquanto vários pontos isosbésticos são mantidos, como pode ser visto na Figura 27. O espectro do íon vanilato é 76 marcado por uma intensa banda em 347 nm e as mudanças reversíveis são devidas ao equilíbrio de protonação (pKa = 7,4). Figura 27 - (a) Espectro eletrônico da vanilina (1,1 x 10-4 mol L-1) obtido em solução aquosa com diferentes pH (3,0 a 9,5) (b) Sobreposição dos espectros da vanilina (preto) e íon vanilato (vermelho) Fonte: Autora (2018). Além das transições intraligantes da phen, os espectros dos complexos de cobre(II) e zinco(II) também apresentam duas bandas referentes ao íon vanilato em 312 e 345 nm. A presença destas bandas é explicada pela desprotonação da vanilina com a coordenação aos metais, como identificado pelas estruturas cristalográficas. Assim, conforme observado na figura acima, ao atingir o pKa (pH 7,5), o espectro apresenta duas bandas em 309 e 347 nm, também observadas nos espectros dos complexos com deslocamentos pouco significativos. Tipicamente, os espectros eletrônicos dos complexos de cobre(II) são caracterizados pela presença de transições d-d, que são geralmente dependentes da simetria do complexo e das suas distorções. O espectro de UV-Vis do complexo precursor cis-[Cu(phen)(Cl2] tem uma banda d-d larga em 714 nm que é substancialmente alterada mediante a coordenação dos íons vanilatos, dando origem a três bandas d-d em 469, 650 e 775 nm. Considerando a aproximação para a simetria D4h para o complexo [Cu(phen)(van)2], essas bandas correspondem, respectivamente, a transições 2 B1g 2 Eg (dxz,dyz dx2- y2), 2 B1g  2 B2g (dxy dx2- y2) e 2 B1g 2 A1g (dz 2  dx2 - y2). 77 Um complexo octaédrico com configuração d 9 , apresenta uma única banda d-d no espectro de UV-Vis, responsável pela transição 2 Eg 2 T2g. A presença de três bandas d-d no complexo [Cu(phen)(van)2], no entanto, indica que esse composto não é octaédrico perfeito. Alguns aspectos podem ter contribuído para a diminuição da degenerescência dos orbitais, tais como o ambiente de coordenação octaédrico distorcido e a presença de ligantes inequivalentes, ocasionando a distorção tetragonal desse complexo com uma estrutura eletrônica energeticamente mais favorável. O complexo [Zn(phen)(van)2] não apresenta bandas d-d, uma vez que o zinco(II) possui configuração eletrônica d 10 em sua camada de valência, e, portanto, não permite transições eletrônicas em seus orbitais d preenchidos. Na Figura 28 é apresentada a sobreposição dos espectros do sistema [M(phen)(van)2] obtidos em meio aquoso e metanol. Figura 28 – Sobreposição dos espectros eletrônicos em água (preto) e metanol (vermelho) dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Zn(phen)(van)2]. (a) (b) Fonte: Autora (2018). Nos espectros obtidos em metanol, as bandas intraligantes da fenantrolina aparecem em 227, 272 e 293 nm (complexo de cobre) e 229, 271 e 292 nm (complexo de zinco), e as bandas das transições intraligantes da vanilina em 308 e 348 nm (1) e em 311 nm e um ombro pouco definido em 340 nm (2), sem deslocamentos significativos, se comparadas às dos espectros em água. 78 No que se refere às transições d-d, o espectro do complexo de cobre em metanol apresenta três bandas com baixa intensidade em 473, 665 e 785 nm, sendo as duas últimas bandas melhor definidas em solventes orgânicos como metanol, DMF e acetonitrila, comparativamente à água, conforme apresentado na Figura 29. Figura 29– Sobreposição dos espectros eletrônicos do complexo [Cu(phen)(van)2] em água (preto), metanol (vermelho), DMF (verde) e acetonitrila (azul) Fonte: Autora (2018). Na Tabela 9 são apresentadas as bandas de absorção dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] obtidos em água e metanol. Tabela 9– Dados comparativos entre as bandas de absorção dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2], utilizando água e metanol como solventes [Cu(phen)(van)2] [Zn(phen)(van)2] Atribuição Água Metanol Água Metanol I.L. phen (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. van (π → π*) I.L. van (π → π*) d-d d-d d-d 205 227 273 294 312 345 469 650 775 - a 227 272 293 308 348 473 665 785 201 228 271 292 312 345 - - - - a 229 271 292 311 340 - - - a região não verificada, pois metanol absorve nesta região. Fonte: Autora (2018). 79 5.1.5 Voltamogramas dos compostos Vanilina e [Cu(phen)(van)2] A determinação de potenciais de oxidação (Eoxi) e redução (Ered) dos compostos de coordenação é amplamente realizada a partir de medidas potenciométricas, desde que as espécies envolvidas sejam relativamente inertes em solução. Dentre as técnicas eletroquímicas que se destacam, pode-se citar a voltametria cíclica, a qual é amplamente empregada para a medição desses potenciais redox. As medidas eletroquímicas estão associadas a diversos fatores que podem estabilizar determinado estado redox, como, por exemplo, interações de retrodoação π, as quais são responsáveis pela estabilização dos metais na forma reduzida, além de interações com o solvente, contra íons e presença de reações secundárias, gerando intermediários ao longo da reação de oxirredução. A Figura 30 apresenta a sobreposição dos voltamogramas cíclicos do ligante vanilina na região de -1000 a 1000 mV e do complexo [Cu(phen)(van)2], nas regiões de -500 a 1000 mV e -450 a 400 mV, sendo essa ultima região responsável apenas pelo processo de oxirredução do metal, obtidos em eletrólito aquoso, KCl 0,1 mol L -1 , pH 7,0, com velocidade de varredura 100 mV s -1 . Figura 30 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vanilina de -1000 a 1000 mV,e do complexo [Cu(phen)(van)2] de (b) -450 a 400 mV e (c) -500 a 1000 mV (a) (b) (c) Fonte: Autora (2018). 80 A vanilina, assim como muitos outros compostos fenólicos, tem sua relevância biológica normalmente associada à sua capacidade antioxidante, que é uma consequência do seu perfil eletroquímico. O voltamograma cíclico da vanilina revela um par redox irreversível, com pico intenso em 720 mV (versus Ag/AgCl), referente à oxidação da molécula, e um pico de baixa intensidade em -315 mV (versus Ag/AgCl), referente à sua redução (Figura 30a). Tais processos apresentados por esse ligante geram um potencial de meia onda de 202,5 mV (versus Ag/AgCl). Cada pico eletroquímico é equivalente ao processo de dois elétrons, como apontado por alguns autores (DENG, et al., 2015 e LEE; LAUW e WEBSTER, 2016) e previsto no mecanismo proposto, apresentado na Figura 31. Em meio aquoso, as duas etapas de oxidação são observadas no mesmo potencial. O mesmo vale para as etapas de redução. Figura 31 – Mecanismo de oxirredução da Vanilina Fonte: Adaptado de Lee, 2016. O perfil irreversível observado no voltamograma indica que a molécula, após sofrer oxidação, sofre modificações em sua estrutura e, assim, a redução do composto não ocorre no mesmo potencial da oxidação, por se tratar de uma estrutura diferente da vanilina apresentada inicialmente, conforme proposto no mecanismo. Ao analisar o voltamograma da vanilina, verifica-se que as correntes dos picos de oxidação e redução diminuem consideravelmente na segunda varredura cíclica realizada. Esse comportamento segue nas demais varreduras, até chegar à sétima varredura cíclica, onde o pico de oxidação apresenta corrente ínfima, quando comparada à primeira varredura, além do pico de redução não ser mais visualizado. Tal comportamento é característico de adsorção do composto na superfície do eletrodo, após este sofrer processo redox e, com isso, as próximas ciclizações vão perdendo sua intensidade, até não serem mais visualizadas. Isso ocorre porque o eletrodo, por estar com a superfície preenchida, não interage mais com a solução em análise. 81 Ao observar o voltamograma do complexo [Cu(phen)(van)2] na Figura 30c, verifica-se um par redox, com pico catódico em -127 mV (versus Ag/AgCl), referente à redução Cu +2/+1 , e pico anódico em -41 mV (versus Ag/AgCl), característico da oxidação Cu +1/+2 , gerando um potencial de meia onda de -84 mV (versus Ag/AgCl). Esse processo de oxirredução do centro metálico corrobora com dados da literatura (SANTRA, et al., 2016) para um estudo realizado com complexo de cobre (II) em meio metanólico. Os potenciais negativos apresentados sugerem que o centro metálico está rico eletronicamente e, portanto, pode se oxidar facilmente, e, consequentemente, ter maior dificuldade para reduzir. Esse comportamento, aliado ao caráter receptor da fenantrolina, indicam a forte capacidade doadora do ligante vanilina, podendo doar densidade eletrônica para o metal, tornando-o mais rico eletronicamente. O voltamograma do complexo [Cu(phen)(van)2] apresenta ainda três processos de oxidação em 516, 610 e 760 mV (versus Ag/AgCl), referentes à oxidação do ligante vanilina. Comparativamente, o voltamograma da vanilina apresenta apenas um processo em 720 mV (versus Ag/AgCl), referente à perda de dois elétrons. À medida que as varreduras são realizadas no voltamograma cíclico do complexo, as correntes dos processos são reduzidas até desaparecerem ou diminuírem significativamente, assim como ocorre no voltamograma da vanilina livre. Esse comportamento é característica da adsorção do material na superfície do eletrodo e afeta toda a região de varredura, sendo observado na região de oxidação da vanilina e de oxirredução do centro metálico. No entanto, quando a janela de potencial é fechada no intervalo de -450 a 400 mV (fora do potencial de oxidação da vanilina) e, à medida que vários ciclos são varridos, não ocorre variação significativa de corrente para os processos de oxirredução do metal, conforme observado na Figura 30b. Esse comportamento indica que a oxidação do ligante vanilina é indispensável para a adsorção do material na superfície do eletrodo. Analisando esse mesmo voltamograma, observa-se que o pico catódico possui potencial de -141 mV (versus Ag/AgCl), enquanto que o pico anódico possui potencial de 49 mV (versus Ag/AgCl), apresentando deslocamentos significativos de 14 mV (versus Ag/AgCl) para menores potenciais e 90 mV (versus Ag/AgCl) para maiores potenciais, respectivamente, quando comparados ao voltamograma do [Cu(phen)(van)2] na região de - 500 a 1000 mV. Esses deslocamentos diminuem a reversibilidade do par redox do centro metálico, e são explicados pela influência dos processos de oxidação da vanilina sobre o metal. 82 A reversibilidade do par redox do metal foi determinada a partir da diferença de potencial (ΔEp) e da razão ipa/ ipc, conforme apresentado na Tabela 10. Para isso, foi utilizado o voltamograma do complexo [Cu(phen)(van)2] com varredura na região de -450 a 400 mV, o qual apresenta apenas os processos redox do centro metálico. Tabela 10 – Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos de oxirredução do Cu2+/1+/ Cu 1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(van)2]. Complexo Cu 2+/1+ / Cu 1+/2+ Epc(mV) Epa(mV) ΔEp ipc (µA) ipa (µA) ipa/ipc [Cu(phen)(van)2] -141 49 190 4 7,5 1,9 Fonte: Autora (2018). O processo é caracterizado como reversível quando a diferença de potencial obedece a uma faixa de até 59 mV para um elétron, segundo dados da literatura (ZANELLO, 2003). A diferença de potencial entre os picos anódico e catódico obtida para esse sistema foi de 190 mV. Adicionalmente, a razão entre as correntes de pico anódico e catódico, medida experimentalmente, é superior a 1,0. Tais fatores indicam a quase reversibilidade do processo redox do centro metálico presente no complexo [Cu(phen)(van)2]. Ainda avaliando a reversibilidade desse par redox, foi realizado um estudo utilizando voltamogramas do complexo [Cu(phen)(van)2] com diferentes velocidades de varredura, apenas na região que ocorre os processos redox do centro metálico, conforme Figura 32. Figura 32–Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo [Cu(phen)(van)2] em diferentes velocidades de varredura Fonte: Autora (2018). 83 Ao analisar a sobreposição acima, observa-se que houve uma pequena variação no potencial de oxidação do Cu +1/+2 , de maneira que, ao utilizar velocidade acima de 100 mV s -1 , nota-se uma diminuição no potencial e, consequentemente, um aumento na reversibilidade do par redox. Essas alterações nos valores de potenciais indicam certa instabilidade na estrutura do composto mediante a oxidação do metal. Através dos valores das correntes obtidas para os processos de redução nas diferentes velocidades, foi construído um gráfico de corrente versus raiz quadrada da velocidade, conforme Figura 33, com o objetivo de verificar sua linearidade e avaliar a reversibilidade do processo e, consequentemente, sua estabilidade frente à perda e ganho de elétrons do metal. Figura 33 – Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente do pico catódico do complexo [Cu(phen)(van)2] Fonte: Autora (2018). O gráfico do pico catódico apresenta R = 0,99149. Tal valor mostra elevada linearidade, indicando um perfil quase reversível para o complexo, tendo em vista que em processos reversíveis os valores das correntes são diretamente proporcionais à raiz quadrada da velocidade. Esse resultado corrobora com os demais parâmetros utilizados, e, juntos, indicam que o complexo [Cu(phen)(van)2] apresenta um perfil quase reversível. A janela de potencial redox acessível em sistemas biológicos varia de cerca de -605 a +595 mV versus Ag/AgCl. O agente redutor mais forte em células é o Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADP + + 2e - +H +  4NADPH), com aproximadamente -585 mV versus Ag/AgCl. Por outro lado, o agente oxidante mais forte é o oxigênio, de acordo com O2 + 4H + + 4e - 2H2O com + 610 mV versus Ag/AgCl em pH 7,0 (JUNGWIRTH, et al., 2011). Adicionalmente, Betanzos-Lara et al relataram que o Cu + possui capacidade de gerar radicais 84 hidroxila em sistemas biológicos se os potenciais redox do metal estiverem entre -529 a 255mV versus Ag/AgCl (BETANZOS-LARA, et al., 2015). O potencial redox obtido para o centro metálico de cobre no complexo em estudo está dentro da gama descrita como acessível para sistemas biológicos, indicando assim que o composto pode estar presente dentro da célula como um complexo de cobre(I) e permanecer razoavelmente estável. Além disso, o complexo também é reconhecido como apropriado para a transferência de elétrons a partir de cobre(I) para originar o radical hidroxila (HO • ), o mais reativo dentro das espécies de radicais de oxigênio e apontado como uma causa potencial para danos no DNA. 5.1.6. Ressonância Magnética Nuclear de 1H dos complexos [Zn(phen)Cl2] e [Zn(phen)(van)2] Complexos contendo o zinco(II) como centro metálico são potencialmente caracterizados pela Ressonância Magnética Nuclear (RMN), tendo em vista que esse metal de transição não apresenta elétrons desemparelhados em sua camada de valência. O espectro de RMN unidimensional possui elevada complexidade, tendo em vista o grande número de informações que ele apresenta. Em compostos com muitos prótons envolvidos, pode haver a sobreposição de diferentes grupos de linhas, o que dificulta ainda mais a análise. Nesse caso, faz-se importante o uso de RMN bidimensional, como o COSY, o qual observa o acoplamento entre hidrogênios distantes em até três ligações químicas. O complexo [Zn(phen)(van)2] foi caracterizado pela Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1 H), fazendo uso dos espectros unidimensional e do COSY. Para tanto, utilizou-se também o espectro do complexo precursor [Zn(phen)Cl2] para auxiliar na caracterização do sistema com vanilina. O espectro unidimensional de RMN de 1 H do complexo [Zn(phen)Cl2], obtido em D2O, sob temperatura de 303 K e frequência de 300 MHz, é apresentado na Figura 34. Os dados de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)Cl2] são apresentados na Tabela 11. 85 Figura 34–Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)Cl2], obtido em D2O, 300 MHz Fonte: Autora (2018). Tabela 11 – Dados de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)Cl2] H(a) H(b) H(c) H(d) [Zn(phen)Cl2] 9,05 (d) 8,06 (t) 8,01 7,97 8,67 (t) 8,65 7,84 (d) (d) dubleto; (t) tripleto Fonte: Autora (2018). Os sinais de hidrogênio apresentados no espectro acima são referentes ao ligante fenantrolina, presente no complexo [Zn(phen)Cl2]. A fenantrolina possui uma estrutura simétrica e, portanto, é de se esperar o aparecimento de sinais referentes a quatro átomos de hidrogênio – Ha, Hb, Hc e Hd – os quais estão acoplados entre si. O Ha possui deslocamento químico de 9,05 ppm e, portanto, é o hidrogênio mais fortemente desprotegido na estrutura. Tal efeito ocorre devido esse próton estar vizinho ao átomo de nitrogênio, o qual possui elevada eletronegatividade e retira densidade eletrônica do hidrogênio, desprotegendo-o para interagir mais fortemente com o campo externo. Esse sinal, mesmo não estando bem resolvido nesse espectro, corresponde a um dubleto, característico do acoplamento entre Ha e seu próton vizinho, Hb. a c b d 86 O espectro apresenta um tripleto em 8,67 e 8,65 ppm referente ao próton Hc, o qual se apresenta levemente desprotegido devido sua posição para com relação ao átomo eletronegativo de nitrogênio. Tal próton interage fortemente com o Hb e interage fracamente com o Hd, tendo em vista sua distância relativa. Essa fraca interação não é observada em uma análise unidimensional, o que justifica a presença de apenas dois picos para esse próton. Segue-se no espectro o tripleto em 8,06, 8,01 e 7,97 ppm, referente ao Hb, cujo próton interage com os átomos de hidrogênio a e c. Além disso, o espectro de RMN apresenta um sinal em 7,84 ppm, referente ao hidrogênio Hd. Tal próton interage fracamente com o Hc, como já discutido anteriormente, no entanto, essa interação não é observada nesse espectro. Com o objetivo de confirmar as atribuições realizadas e verificar novas interações que não podem ser observadas em uma análise unidimensional, foi utilizado o COSY para complementar a caracterização desse complexo, conforme apresentado na Figura 35. Figura 35– Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação homonuclear para o composto [Zn(phen)Cl2], em D2O, 300 MHz Fonte: Autora (2018). Ao observar o COSY do complexo precursor, verificam-se alguns acoplamentos importantes que ocorrem entre os prótons desse composto, tais como, Ha e Hb, bem como Hc e Hb. Através dessa técnica bidimencinal, é possível verificar o acoplamento mais fraco entre os prótons Hc e Hd, distantes em até duas ligações químicas. Tais acoplamentos estão de acordo com a caracterização dos prótons realizada a partir do espectro de RMN 1 H. 87 Foi realizada a análise unidimensional do espectro de RMN de 1 H do complexo [Zn(phen)(van)2], obtido em D2O, à temperatura de 303 K e frequência de 300 MHz, conforme apresentado na Figura 36. Figura 36–Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(van)2], obtido em D2O, 300 MHz Fonte: Autora (2018). O espectro acima apresenta um sinal intenso em 3,71 ppm, referente ao próton do grupo metóxido da vanilina, H1V. Os átomos de hidrogênio de um grupo metila ligado diretamente a um carbono sp 3 absorvem em 0,90 ppm, no entanto, se o grupo metila estiver ligado a um átomo de oxigênio, como ocorre na metoxila, o valor do deslocamento químico irá aumentar para 3,60 ppm, aproximadamente, tendo em vista que a eletronegatividade do oxigênio diminui a densidade eletrônica sobre os hidrogênios, reduzindo a blindagem desses. A Figura 37 apresenta o espectro de RMN 1 H do complexo [Zn(phen)(van)2], com ampliação da região de 6,5 a 10 ppm, a fim de melhor visualizar os demais sinais dos prótons, os quais apresentam baixa intensidade devido à baixa solubilidade do composto no solvente em análise. 88 Figura 37–Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(van)2], obtido em D2O, 300 MHz, na região de 6,5 a 10 ppm Fonte: Autora (2018). Os dados de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)(van)2] são apresentados na Tabela 12. Tabela 12 – Dados de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(van)2] H(b) H(c) H(d) H1V H2V H3V H4V H6V [Zn(phen)(van)2] 8,13 (t) 8,71 (t) 8,69 7,88 (d) 3,71 6,74 (d) 6,71 7,28 7,41 (d) 7,39 9,40 (t) tripleto; (d) dubleto. Fonte: Autora (2018). A caracterização do ligante vanilina presente no complexo [Zn(phen)(van)2] está de acordo com dados da literatura também obtidos em solvente D2O (JUNG; ROPP e EBELER, 2000). Como observado na Figura 37, o espectro de RMN 1 H apresenta um dubleto em 6,71 e 6,74 ppm, referente ao próton H2V da vanilina, o qual é desdobrado pelo átomo de hidrogênio vizinho, H4V, com sinal de dubleto em 7,39 e 7,41 ppm, visto que ambos possuem ambientes químicos diferentes. Verifica-se ainda dois singletos em 7,28 e 9,40 ppm, referentes aos prótons H3V e H6V, respectivamente. Esse ultimo próton apresenta maior deslocamento químico, devido o efeito de desproteção causado pela carbonila do aldeído. 89 Os demais sinais presentes no espectro de RMN 1 H são referentes ao ligante fenantrolina. Tais sinais são menos definidos frente aos sinais da vanilina, devido à proporção estequiométrica desses ligantes de 2:1 para van e phen. O espectro apresenta dois sinais isolados de baixa intensidade em 7,88 e 8,13 ppm, referentes aos prótons Hd e Hb, respectivamente. O primeiro próton se refere a um dubleto fraco, enquanto que o segundo próton corresponde a um tripleto, conforme apresentado no espectro do complexo precursor. No entanto, devido à baixa solubilidade do composto, esses sinais não apresentaram boa resolução, sendo visualizado um pico para cada próton. Observa-se ainda dois sinais com baixa resolução em 8,69 e 8,71 ppm, referentes ao próton Hc, o qual acopla com Hb e Hd. Esse ultimo acoplamento não é definido no espectro devido à fraca interação entre esses átomos de hidrogênio. A Figura 38 apresenta o COSY do [Zn(phen)(van)2], utilizado com o objetivo de analisar alguns dos acoplamentos apresentados pelos prótons desse complexo. O COSY apresentou dois acoplamentos bem definidos, sendo um referente aos prótons vizinhos H2V e H4V do ligante vanilina, e um referente aos tripletos vizinhos Hb e Hc da fenantrolina. Os acoplamentos entre Ha e Hb, bem como entre Hc e Hd não são observados, tendo em vista a baixa resolução desses sinais. Os acoplamentos apresentados no COZY corroboram com os sinais verificados no espectro de RMN 1 H, obtidos para o complexo [Zn(phen)(van)2], e indicam a presença dos ligantes vanilina e fenantrolina no complexo sintetizado. 90 Figura 38– Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação homonuclear para o composto [Zn(phen)(van)2], em D2O, 300 MHz Fonte: Autora (2018). 5.1.7. Ensaios biológicos do complexo [Cu(phen)(van)2] a) Atividade de Nuclease A atividade de nuclease sintética do complexo [Cu(phen)(van)2] foi avaliada no presente trabalho, visto que o DNA geralmente é relatado como um alvo importante para compostos de cobre (II) que exibem potenciais propriedades antitumorais. A capacidade do complexo de cobre (II) em promover a clivagem de DNA foi investigada usando o plasmídeo superenovelado pBR322 de DNA, por meio de eletroforese em gel de agarose (Figura 39). A clivagem de DNA foi monitorada seguindo a conversão do plasmídeo circular superenovelado de DNA (Forma I) na forma circular relaxada ou cortada devido a uma quebra de fita simples (Forma II), ou na forma linear devido a uma quebra de fita dupla (Forma III). Essas características foram investigadas avaliando a atividade direta do complexo metálico e após estimulação com glutationa e peróxido de hidrogênio. A eficiência da nuclease dos complexos de cobre (II) é geralmente dependente do tipo de ativador utilizado durante a clivagem do DNA. Ativadores redox como os tióis (glutationa, ácido 3-mercaptopropiónico), ácido ascórbico, peróxido de hidrogênio ou a mistura destes são geralmente utilizados para esses estudos, por serem compostos que imitam o ambiente químico encontrado no citosol das células. 91 Figura 39 - Ensaio de clivagem de DNA empregando o DNA do plasmídeo pBR322 (8,3 ng µL -1 por poço) com (a) o complexo metálico [Cu(phen)(van)2], e também com (b) 10 mmol L -1 de glutationa (GSH) ou (c) 1 mmol L - 1 de H2O2. Todas as incubações foram realizadas durante 90 minutos no escuro. Fonte: Medeiros (2018). O ensaio de DNA realizado sem nenhum ativador mostrou que o complexo de cobre não promoveu qualquer clivagem de DNA, mesmo variando a concentração do complexo de 0,5 a 40 μmol L-1 (Figura 39a). Este resultado sugere que o complexo não pode causar clivagem de DNA por uma via hidrolítica sob estas condições experimentais. 92 No entanto, existe um aumento notável da clivagem de DNA na presença de 10 mmol L -1 de glutationa, conforme observado pela forma relaxada do plasmídeo (FII), que mostrou um perfil de dose-dependência (Figura 39b). Utilizando 20 μmol L-1 do complexo de cobre foi observado 50% de clivagem do DNA, enquanto na concentração mais elevada, 40 μmol L-1, foi verificado predominantemente o DNA na forma relaxada (FII, 76%) e DNA linear (FIII, 9%). Esses resultados indicam claramente que a atividade de clivagem de DNA do complexo é dependente do estado de oxidação do cobre, onde a geração de cobre (I) parece melhorar muito a eficiência da clivagem. Além disso, é importante destacar que a glutationa é encontrada em concentração milimolar dentro das células, o que poderia conceder a este complexo uma atividade de nuclease que impulsiona a relevância desta investigação. No presente trabalho, utilizou-se 1 mmol L -1 de peróxido de hidrogênio como ativador, o qual também é capaz de originar ROS, e observou-se uma atividade de clivagem expressiva, onde foi gerado DNA na forma relaxada (FII) na presença de concentração muito menor do complexo, 5 μmol L-1 (Figura 39c), comparado com a glutationa, 20 μmol L-1. Para concentrações acima de 10 μmol L-1, não foi observado nenhum DNA intacto, demonstrando que foi inteiramente clivado em DNA relaxado (FII) e linear (FIII). Esta última forma foi detectada de maneira mais expressiva a 20 μmol L-1, o que ainda é uma concentração razoavelmente modesta. Foi realizada uma tentativa de comparar estes resultados com o complexo precursor [Cu(phen)Cl2] (M1), onde observou-se que o ligante vanilina melhorou a atividade geral de clivagem de DNA (Figura 40). Figura 40 - Estudo de clivagem de DNA do complexo precursor de cobre. Foi utilizado DNA plasmídico (8,3 ng L-1 por poço) e complexo [Cu(phen)(Cl)2] (M1) em diferentes concentrações (40, 20, 10, 5 e 1 μM). A reação ocorreu na presença de GSH 10 mM e H2O2 1 mM, no escuro durante 90 minutos a 25 °C. O controle de DNA (ctrl1) contém apenas DNA; O controle de DNA 2 (ctrl2) contém DNA com complexo [Cu(phen)(van)2]; O controle de DNA 3 (ctrl3) contém DNA com GSH; O controle de DNA 4 (ctrl4) contém DNA com H2O2. Fonte: Medeiros (2018). 93 Os resultados indicam que a atividade de clivagem de DNA do complexo com vanilina é, obviamente, dependente da concentração e também induzida pelo ativador. O dano de DNA mais extenso foi observado quando o peróxido de hidrogênio foi adicionado. O monitoramento espectrofotométrico da reatividade do complexo com H2O2, numa proporção (1:25) mais elevada do que a aplicada no ensaio de atividade de nuclease, nas mesmas condições experimentais, não revelou alterações espectrais significativas. Este resultado sugere uma integridade estrutural do composto após a adição de H2O2 como avaliado no experimento. O mecanismo de clivagem de DNA mediado por [Cu(phen)(van)2] é consistente com a quebra de DNA induzida por complexos de cobre polipiridil (MEDEIROS, et al., 2018). A maioria dos complexos de cobre possui atividade de nuclease sintética com eficácea a partir de sua ação oxidativa ou hidrolítica. A via oxidativa está relacionada ao processo redox de Cu (II/I) que leva à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por uma reação de Haber-Weiss, na presença de um agente redutor (reações 1 e 2) ou através de uma reação do tipo Fenton, na presença de H2O2 (reações 3 e 4). Curiosamente, esses dois mecanismos levam a espécies distintas de ROS. Cu II L + GSH  CuIL + ½ GSSG (1) Cu I L + O2 Cu II L + O2 - (2) Cu II L + H2O2  Cu I L + HOO + H + (3) Cu I L + H2O2  Cu II L + HO - + HO (4) Com o objetivo de tentar compreender o mecanismo de danos causados ao DNA, promovidos pelo complexo com vanilina e desencadeado pela glutationa, foi realizada uma série de medidas com e sem oxigênio, juntamente com agentes de eliminação de radicais. Para este estudo, foram misturados 40 μmol L-1 do complexo metálico, 1,5 mmol L-1 de GSH e DNA plasmídico com e sem oxigênio juntamente com inibidores de radicais (histidina e manitol a 13 mmol L -1 , superóxido dismutase - SOD em 4 UL-1, N-oxil-2,2,6,6- tetrametilpiperidina - TEMPO a 2,6 mmol L -1 e catalase a 3,9 μmol L-1), que foram incubadas durante 30 minutos a 25 ºC. A histidina é um supressor de oxigênio singleto ( 1 O2) e radical hidroxílico (•OH), manitol suprime •OH, o TEMPO é conhecido por inibir a formação de radicais metálicos e centrados em carbono, enquanto a enzima superóxido dismutase (SOD) é conhecida como a supressora direta do ânion superóxido (O2 •- ), e catalase tem a capacidade de catalisar a decomposição de peróxido de hidrogênio, H2O2. 94 Na Figura 41, observa-se que em condições aeróbicas há dano de DNA, gerando DNA na forma relaxada, enquanto que nenhum outro eliminador de radicais foi capaz de inibir a clivagem, porém, a catalase tem desempenhado um papel significativo na proteção do DNA. Em condições anaeróbicas nenhuma clivagem de DNA foi observada, apoiando uma dependência completa de O2 na geração de espécies prejudiciais ao DNA. Figura 41 - Estudo mecanicista das espécies oxidantes envolvidas na clivagem de DNA. Foi utilizado DNA de plasmídeo (8,3 ng / L por poço), GSH (1,5 mmol L-1), [Cu(phen)(van)2] (40 μmol L -1 ) juntamente com inibidores de radicais livres: histidina (histologia, 13 mmol L -1 ), manitol (man., 13 mmol L -1 ), SOD (4 U L-1), TEMPO (3,9 mmol L-1) e catalase (cat., 3, 9 μmol L-1) incubados durante 60 minutos a 25 ºC. Reações realizadas sob condições aeróbicas (gel superior) e anaeróbicas (gel inferior). Fonte: Medeiros (2018). Estes ensaios mostraram que ocorre apenas a clivagem oxidativa do DNA, promovida pela redução de Cu(II) por meio de reação com GSH e redução de O2 a O2 •- . O H2O2 foi identificado como uma das principais espécies intermediárias envolvidas no mecanismo de clivagem, com base na forte inibição causada pela catalase. Além disso, a adição direta de peróxido de hidrogênio mostrou atividade de clivagem somente em combinação com o complexo de cobre. Este agente também pode atuar como um agente redutor durante um ciclo catalítico de reação com cobre, onde pode gerar Cu(I) e O2 •- . O complexo de cobre ainda pode produzir HO • em uma reação de Cu (I) com H2O2 que pode levar a um forte dano no DNA. O fato de que a catalase é o único inibidor que tem uma ação eficiente que evita a clivagem do DNA reforça a hipótese de que os agentes de clivagem são gerados após a reação do peróxido de hidrogênio com o complexo de cobre (I). Uma pequena proposta mecanicista para essas espécies é apresentada na Figura 42. 95 Figura 42 - Ciclo catalítico proposto para oxidação e redução do complexo [Cu(phen)(van)2] pela GSH com produção de superóxido: (I) redução de Cu (II) por GSH; (II) produção de O2 •- via reoxidação de Cu (I); (III) produção de H2O2 por oxidação de Cu (I); e (IV) produção final de HO • . Fonte: Medeiros (2018). b) Ensaio de geração de superóxido A produção de superóxido mediada pelo complexo [Cu(phen)(van)2] foi investigada utilizando o nitroazul de tetrazólio (NBT), com base na alteração da absorbância em 560 nm. O experimento foi realizado usando NBT a 50 μmol L-1 e o complexo [Cu(phen)(van)2] a 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 75 μmol L-1. Para avaliar a influência do estado de oxidação de cobre na geração de superóxido, os experimentos foram realizados com e sem o agente redutor biológico glutationa (1,5 mmol L -1 ). Os resultados obtidos são mostrados na Figura 43, onde apenas uma combinação de complexo de cobre e GSH levou a uma produção intensa de íon superóxido, detectada pelo aumento gradual da absorvância a 560 nm e mudança visual da cor. Além disso, houve uma dependência de concentração durante esta reação desencadeada pela adição de GSH. 96 Figura 43 - Detecção de superóxido utilizando a reação NBT a 37 ºC. (A) Alteração de cor após 60 minutos de reação de GSH (1,5 mmol L -1 ) com [Cu(phen)(van)2] a 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 75 μmol L -1 . (B) Curvas cinéticas para a reação de GSH (1,5 mmol L -1) e complexo (75, 60, 50, 40, 30, 20 e 10 μmol L-1) usando NBT (50 μmol L- 1 ) como seletivo. Esta reação foi monitorada durante 60 minutos a 37 ºC. Fonte: Medeiros (2018). Este resultado indicou que a formação de O2 - ocorre durante o processo redox de cobre como indicado pelas equações 1 e 2 e proposto no ciclo catalítico representado na Figura 42. Apesar de muitos autores preferirem usar o ácido ascórbico como co-ativador, sua concentração fisiológica é muito menor do que a glutationa, que atinge até 15 mmol L -1 , enquanto o ácido ascórbico atinge apenas até 0,2 mmol L -1 . Na verdade, a glutationa é um agente de redução biológica bem conhecido encontrado nas concentrações milimolares dentro das células, sendo o agente mais provável para promover a geração de ROS quando o complexo vanilínico atinge o citossol, o que poderia ser benéfico para a morte celular na terapia do câncer (MEDEIROS, et al., 2018). c) Investigações de citotoxicidade A citotoxicidade do complexo foi avaliada contra três linhagens de células tumorais diferentes, melanoma de rato (B16-F10), carcinoma hepatocelular humano (HUH-7) e adenocarcinoma renal humano (786-0) por meio de ensaio MTT. A viabilidade celular foi medida após 24 h de incubação com [Cu(phen)(van)2] de 0,001 a 300 μmol L -1 . A fim de avaliar possíveis contribuições individuais de vanilina, 1,10-fenantrolina e CuCl2, esses compostos também foram analisados usando a linha celular 786-0. Os valores de IC50 foram calculados a partir de uma curva dose-resposta (Figuras 44 e 45). 97 Figura 44 – Viabilidade celular de [Cu(phen)(van)2] para (a) 786-0 (b) HUH-7, (c) B16-F10 Fonte: Medeiros (2018). Figura 45 - Viabilidade celular de (a) CuCl2 (b) o-fenantrolina e (c) vanilina contra linha celular 786-0 Fonte: Medeiros (2018). O complexo [Cu(phen)(van)2] mostrou um comportamento dependente da dose e uma citotoxicidade extensa contra todas as linhas celulares investigadas sugerindo sua atividade anticancerígena. Este complexo demonstrou ser eficaz contra células de melanoma com IC50 de 3,39  0,61 μmol L-1, bem como para hepatocarcinoma, IC50 = 4,22  0,31 μmol L -1 , enquanto que apresentou menor potência para células de carcinoma renal, IC50 = 10,38  0,91 μmol L-1. O valor de IC50 para os ligantes livres e até mesmo para CuCl2 em células 786-0 foram superiores a 150 μmol L-1, suportando o efeito não citotóxico dessas espécies isoladas. Este resultado sugeriu que a atividade citotóxica apresentada pelo complexo [Cu(phen)(van)2] é efetivamente devido a mudanças na reatividade cobre/ligante após a formação do complexo e não para qualquer propriedade individual particular (MEDEIROS, et al., 2018). Houve apenas alguns relatos de atividade anticancerígena in vitro de complexos de cobre para células B16-F10, HUH-7 e 786-0. Os valores de IC50 são de fato semelhantes aos outros complexos de cobre-fenantrolina relatados recentemente em diferentes células cancerosas. (a) 786-0 (b) HUH-7 (c) B16-F10 (a) CuCl2 (b) o-phen (c) van Concentração Concentração Concentração Concentração Concentração Concentração % v ia b il id ad e ce lu la r % v ia b il id ad e ce lu la r % v ia b il id ad e ce lu la r % v ia b il id ad e ce lu la r % v ia b il id ad e ce lu la r % v ia b il id ad e ce lu la r 98 Nagababu et al avaliaram a citotoxicidade de quatro complexos de cobre (II) com ligantes de derivados de imidazo-fenantrolina (IP) após 48 h de incubação com células B16- F10. Os ligantes IP têm uma estrutura  estendida que geralmente aumenta a citotoxicidade quando comparada a bpy ou phen. Mesmo utilizando duas vezes o tempo de incubação do experimento realizado no presente trabalho, o IC50 para dois dos complexos avaliados foi superior a 25 μmol L-1, mais de sete vezes maior que o valor apresentado por [Cu(phen)(van)2]. Os outros dois complexos apresentaram IC50 de 2,1 μmol L -1 , próximo do valor apresentado pelo complexo [Cu(phen)(van)2], e a melhor atividade alcançada teve IC50 = 0,5 μmol L-1. d) Medições de citometria de fluxo Os estudos de apoptose celular foram conduzidos usando a coloração de anexina V- FITC/iodeto de propídio em uma citometria de fluxo. Neste ensaio, quatro populações de células diferentes podem ser identificadas após a exposição ao complexo de cobre: células viáveis (Q4), células na apoptose precoce (Q3), na apoptose tardia (Q2) e também na necrose (Q1). As células coradas apenas com anexina V-FITC demonstram a presença de apoptose precoce, enquanto as células marcadas duas vezes com anexina V-FITC e iodeto de propídio representam a apoptose tardia e as células rotuladas apenas com iodeto de propídio estão em necrose. Conforme mostrado na Figura 46, o tratamento de células 786-0 com 10 μmol L-1 ( IC50) de complexo de cobre durante 24 h resultou em 58,95% de células apoptóticas (quadrantes Q2 e Q3) e um valor insignificante de necrose (0,83%). Além disso, avaliou-se o efeito de 50 μmol L-1 do complexo de cobre na via da morte celular, o que corresponde a quase cinco vezes o IC50. Nesse caso, as células apoptóticas atingiram 98,77% com contribuição expressiva de apoptose tardia, 97,40%, e taxa de necrose insignificante de 0,64%. Curiosamente, a eficiência deste composto é significativamente maior que o controle positivo, cisplatina, para o qual foi obtido 34,0 e 47,7% de apoptose para 10 e 50 μmol L-1, respectivamente. Esses resultados sugeriram claramente que o complexo induziu a morte celular principalmente pela via apoptose (MEDEIROS, et al., 2018). 99 Figura 46 - Estudos de citometria de fluxo para (a) células não tratadas (controle negativo), células tratadas com (b) cisplatina 10 μmol L-1 e (d) 50 μmol L-1 (controle positivo), e tratadas com (c) 10 μmol L-1 e (e) 50 μmol L-1 de [Cu(phen)(van)2]. Fonte: Adaptado de Medeiros (2018). González-Álvarez e colegas de trabalho relataram os resultados da citometria de fluxo em células de linfócitos Jurkat T após incubação durante 48 h de 10 μmol L-1 ( 2 x IC50) para quatro complexos de bipy-sulfonamida de cobre (II). Dois destes complexos induziram apoptose apenas cerca de 25%. Os outros dois complexos apresentaram taxa de apoptose entre 40 e 50%. Comparativamente, o complexo [Cu(phen)(van)2] apresentou valores de apoptose mais eficientes (58,95%) considerando uma dose de IC50 em metade do tempo de incubação. e) Análise do ciclo celular A fim de investigar ainda mais o efeito causado pelo complexo [Cu(phen)(van)2] na progressão do ciclo de células 786-0, o conteúdo de DNA foi avaliado por citometria de fluxo após coloração com iodeto de propídio (PI). 100 Conforme mostrado na Figura 47, a distribuição das diferentes fases (G1, S e G2/M) foi significativamente alterada após a incubação das células durante 24 h com 5, 10, 20 ou 50 μmol L-1 de complexo quando comparado ao controle não tratado. As concentrações estudadas permitiram a identificação de dois perfis diferentes. As concentrações de 5 e 10 μmol L-1 resultaram em um claro aumento de células 786-0 na fase G1 com depleção concomitante de G2/M. Os 66,25  2,05% da distribuição de G1 em células não tratadas deram lugar a 84,25  1,06% a 10 μmol L-1. A parada G1 pode ser uma conseqüência do dano do DNA induzido pelo complexo, tornando impossível que as células sejam encaminhadas para as fases S e G2/M pelo mecanismo do ponto de controle. Além disso, o conteúdo sub-G1 tornou-se mais significativo a 10 μmol L-1 (3.72  0,51%), em seguida, o controle (1,90  0,08%). Por outro lado, a progressão do ciclo celular quando incubada com 20 e 50 μmol L-1 de complexo mostrou uma depleção clara nas fases G1, S e G2/M e um aumento expressivo na porcentagem de sub-G1 em comparação com as células de controle não tratadas. A presença de células sub-G1 sugere a ativação da apoptose celular induzida pelo complexo. Este experimento sugere que o complexo induz a prisão do ciclo celular na fase G1, bem como a apoptose observada pela coloração com iodeto de anexina V-FITC / propídio. 101 Figura 47 - Gráfico de histograma 3D da análise de citometria de fluxo em células 786-0 tratadas sem (controle) e com [Cu(phen)(van)2] (5, 10, 20 e 50 μmol L -1 ). Fonte: Medeiros (2018). A cisplatina e a oxaplatina são conhecidas para induzir a parada do ciclo celular na fase S ou G2/M, dependendo da linha celular e do tempo de incubação. A parada na fase diferente implica uma via mecanicista diferente do [Cu(phen)(van)2] (MEDEIROS, et al., 2018). 5.2. SISTEMA [M(phen)(vglu)2], M = Cu 2+ (3) e Zn 2+ (4) 5.2.1. Espectros Vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(vglu)2] A Figura 48 apresenta a sobreposição dos espectros de infravermelho dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2] na região de 4000 a 400 cm -1 , obtidos em pastilha de KBr. As regiões mais energéticas dos espectros apresentam uma banda larga próxima a 3380 cm -1 , referente aos estiramentos das ligações O-H presentes nas estruturas dos 102 compostos, bem como duas bandas em 2940 e 2835 cm -1 (complexo de cobre) e 2932 e 2835 cm -1 (complexo de zinco) características de estiramentos C-H aromático (simétrico e assimétrico). (PESSOA; TOMAZ e HENRIQUES, 2003). Figura 48 – Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vglu)2] (preto) e [Cu(phen)(vglu)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm -1 Fonte: Autora (2018). Na Figura 49 é apresentada a sobreposição dos espectros dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2] na região de 1750 a 500 cm -1 . Em cada espectro verifica-se uma banda referente ao estiramento C=N, em 1670 cm -1 (3) e 1665 cm -1 (4). Além disso, observa-se bandas em 1589 e 1513 cm -1 para o complexo de cobre e em 1584 e 1502 cm -1 para o complexo de zinco, características de estiramentos C=C aromático, bem como modos vibracionais em 1407, 1335 e 1314 cm -1 (3) e 1342 e 1310 cm -1 (4), referentes às deformações angulares C-H e O-H dos aneis glucosamínicos. O [Cu(phen)(vglu)2] possui ainda bandas em 1082 e 1029 cm -1 , enquanto que o complexo [Zn(phen)(vglu)2] apresenta essas bandas em 1080 e 1028 cm -1 , referentes aos estiramentos C-O das piranoses (PESSOA; TOMAZ e HENRIQUES, 2003) e O-CH3 dos grupos vanilóides, respectivamente. A presença do ligante fenantrolina nos complexos é indicada pelas bandas em 839 e 723 cm -1 (3) e 849 e 726 cm -1 (4), características de deformação angular C-H fora do plano dos anéis da phen. Os modos vibracionais em 635 e 639 cm -1 para os complexos de cobre e 103 zinco, respectivamente, são característicos de deformação angular C-H fora do plano do ligante vglu. Figura 49 – Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vglu)2] (preto) e [Cu(phen)(vglu)2] (vermelho) na região de 1720 a 500 cm -1 Fonte: Autora (2018). Na Figura 50 é apresentada a sobreposição dos espectros do [M(phen)(vglu)2], [M(phen)(van)2] e da base de Schiff vglu, formada a partir da condensação da vanilina com o açúcar D-glucosamina, a fim de ressaltar as principais diferenças entre eles, incluindo as novas atribuições que indiquem a formação das bases de Schiff vglu e, consequentemente, dos novos complexos de cobre(II) e zinco(II). Na sobreposição dos espectros da Figura 50, observa-se que [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2] apresentam bandas em 1670 e 1665 cm -1 , respectivamente, correspondentes ao estiramento C=N, e ambos não possuem bandas referentes ao estiramento C=O de aldeído, presente nos complexos precursores em 1652 cm -1 (cobre) e 1660 cm -1 (zinco), indicando, portanto, a formação das bases de Schiff vglu nos complexos (3) e (4). Comparativamente, o espectro da base de Schiff não coordenada apresenta a banda referente ao estiramento C=N em 1632 cm -1 , observando um deslocamento para menores números de onda, quando comparado aos complexos. 104 As bandas presentes no complexo [Cu(phen)(van)2] em 1337 e 1308 cm -1 , e no [Zn(phen)(van)2] em 1343 e 1311 cm -1 , características de deformação angular C-H, são observadas como ombros nos complexos com vglu sem deslocamentos significativos, estando em 1335 e 1314 cm -1 (complexo de cobre) e 1342 e 1310 cm -1 (complexo de zinco). A base de Schiff livre apresenta deformações angulares C-H e O-H em 1298 cm -1 , presente nos complexos de cobre e zinco em 1292 cm -1 , com um pequeno deslocamento que ocorre devido à coordenação de cada íon metálico. Figura 50 – Sobreposição dos espectros vibracionais do (a) [Cu(phen)(van)2] (preto), [Cu(phen)(vglu)2] (vermelho) e vglu (azul) e (b) [Zn(phen)(van)2] (preto), [Zn(phen)(vglu)2] (vermelho) e vglu (azul) na região de 1720 a 500 cm -1 (a) (b) Fonte: Autora (2018). Ao analisar a sobreposição dos espectros na Figura 50, observa-se que a banda referente ao C-O piranose da base de Schiff vglu livre, presente em 1088 cm -1 , não possui deslocamento significativo, estando em 1082 cm -1 no complexo [Cu(phen)(vglu)2] e em 1080 cm -1 no [Zn(phen)(vglu)2]. Nessa região, o ligante livre apresenta várias bandas em 1127, 1116, 1102, 1088, 1078, 1068, 1035 e 1028 cm -1 , características de estiramentos axiais C- Ofenolato, C-C e C-O (PESSOA; TOMAZ e HENRIQUES, 2003), as quais são representadas no espectro de IV do complexo [Cu(phen)(vglu)2] por três bandas largas em 1122, 1082 e 1029 cm -1 , e no complexo [Zn(phen)(vglu)2] em 1123, 1080 e 1028 cm -1 . Destaca-se que os complexos precursores [M(phen)(van)2] apresentam duas bandas em 1121 e 1024 cm -1 (1) e 1154 e 1021 cm -1 (2), características das ligações C-O e C-C na estrutura da vanilina. 105 As bandas em 635 e 639 cm -1 nos espectros dos complexos de cobre e zinco com o vglu, respectivamente, referentes à deformação angular fora do plano dos aneis glucosamínicos, apresentam pequenos deslocamentos quando comparadas ao ligante livre, o qual possui duas bandas em 650 e 626 cm -1 . Tais deslocamentos são também indicativos das bases de Schiff vglu coordenadas ao Cu 2+ e Zn 2+ nos complexos. Na Tabela 13 são apresentadas as atribuições das principais bandas presentes nos espectros de infravermelho dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2]. Os valores obtidos condizem com os dados da literatura (PESSOA; TOMAZ e HENRIQUES, 2003). Tabela 13 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos complexos [Cu(phen)(vglu)2], e [Zn(phen)(vglu)2] Atribuições [Cu(phen)(vglu)2] [Zn(phen)(vglu)2] O-H fenol 3380 3385 C-H aromático 2940, 2835 2932, 2835 C=N 1670 1665 C=C aromático 1589, 1513 1584, 1502 assCH3 metóxido e C=N aromático 1465, 1426 1463, 1427 C-H e O-H 1407, 1335, 1314, 1292, 1267 1342, 1310, 1263, 1292 C-O e C-C 1122, 1082, 1029 1154, 1123, 1080, 1028 C-O piranose 1082 1080 C-H fora do plano (phen) 839, 723 849, 726 C-H fora do plano (glu) 635 639 Fonte: Autora (2018). 5.2.2. Espectros de absorção eletrônica na região do Ultravioleta e Visível do sistema [M(phen)(vglu)2] A Figura 51 apresenta a sobreposição dos espectros eletrônicos de absorção na região do ultravioleta e visível dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2], obtidos em meio aquoso, na região de 190 a 800 nm, com ampliação da região de 440 a 940 nm para visualização das bandas d-d no complexo de cobre. 106 Figura 51 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] (preto), concentrações 9,5 x 10 -6 mol L -1 e 2,2 x 10 -4 mol L -1 para a ampliação na região das bandas d-d, e [Zn(phen)(vglu)2] (vermelho), concentrações 1,49 x 10 -5 mol L -1 e 1,2 x 10 -4 mol L -1 para expansão do espectro Fonte: Autora (2018). Os espectros eletrônicos dos complexos [M(phen)(vglu)2] apresentam bandas intensas na região do ultravioleta, referentes às transições intraligantes da fenantrolina, de natureza - *, em 203, 225, 272 e 294 nm (3) e 201, 227, 271 e 291 nm (4). Além dessas, os complexos possuem duas bandas intraligantes do derivado da vanilina, vglu, em 311 e 344 nm para o compexo de cobre e em 310 e 348 nm para o complexo de zinco, características do grupo vanilóide presente em suas estruturas. A banda de baixa intensidade observada em 398 nm no complexo de cobre e em 397 nm no complexo de zinco é caracterizada como intraligante do vglu, referente à transição n- * do grupo imina, C=N. Tal banda indica a formação das bases de Schiff nos complexos [M(phen)(vglu)2]. O espectro do complexo de cobre apresenta um ombro em 485 nm e uma banda de baixa intensidade em 630 nm, característicos de transições d-d. Como o complexo em questão possivelmente possui distorção tetragonal em sua estrutura e, portanto, simetria D4h, a presença de um orbital d semipreenchido no Cu 2+ pode originar até três transições eletrônicas d-d, porém, no espectro do [Cu(phen)(vglu)2] observam-se apenas duas transições d-d. A 107 outra banda pode estar em uma região com comprimento de onda superior a 1000 nm ou sobreposta a outras bandas com maiores intensidades no espectro. Na Tabela 14 são apresentadas as atribuições das bandas presentes nos espectros dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2], e seus valores de absortividade molar. Tabela 14 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2] em meio aquoso. [Cu(phen)(vglu)2] [Zn(phen)(vglu)2] Atribuição das Transições Comprimento de Onda (nm) ε (L mol-1 cm-1) Comprimento de Onda (nm) ε (L mol-1 cm-1) I.L. phen e/ou vglu (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. vglu (π → π*) I.L. vglu (π → π*) I.L. vglu (n → π*) d-d d-d 203 225 272 294 311 344 398 485 630 9,80. 10 4 7,32. 10 4 6,23. 10 4 3,25. 10 4 2,54. 10 4 2,17. 10 4 4,50. 10 3 1,79. 10 2 8,41.10 1 201 227 271 291 310 348 397 - - 8,92 10 4 5,14. 10 4 4,22. 10 4 2,38. 10 4 1,78. 10 4 8,90. 10 3 1,40. 10 3 - - Fonte: Autora (2018). Na Figura 52 são apresentadas as sobreposições dos espectros em meio aquoso do sistema [M(phen)(vglu)2], dos seus respectivos complexos precursores [M(phen)(van)2], do ligante precursor glucosamina, bem como da base de Schiff vglu. Ao analisar os espectros, observam-se algumas bandas em comum entre esses compostos, que contribuem para melhor caracterização desse sistema. A banda em 345 nm no espectro do complexo de cobre e em 348 nm no espectro do complexo de zinco, presente tanto nos complexos [M(phen)(vglu)2] como nos seus precursores [M(phen)(van)2], é característica do grupo vanilóide desprotonado e, portanto, não está presente na molécula vglu livre, tendo em vista que a desprotonação ocorre com a coordenação dos centros metálicos. As demais bandas presentes no espectro do vglu estão na mesma região das bandas da fenantrolina, que por ter maior absortividade molar, impossibilitam a vizualização das bandas do vanilóide nos espectros dos complexos. 108 Figura 52 – Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos compostos (a) [Cu(phen)(vglu)2] (preto), [Cu(phen)(van)2] (vermelho), D-glucosamina (azul) e base de Schiff vglu (verde) e (b) (a) [Zn(phen)(vglu)2] (preto), [Zn(phen)(van)2] (vermelho), D-glucosamina (azul) e base de Schiff vglu (verde). (a) (b) Fonte: Autora (2018). Na Figura 53 é apresentada a sobreposição dos espectros do [M(phen)(vglu)2], obtidos em meio aquoso e em metanol, a fim de identificar possíveis alterações em suas bandas ao utilizar solventes com diferentes polaridades. Figura 53 – Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos (a) [Cu(phen)(vglu)2] em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho) e (b) [Zn(phen)(vglu)2] em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho) (a) (b) Fonte: Autora (2018). 109 As bandas intraligantes da fenantrolina não possuem alterações significativas com a mudança do solvente, com exceção do ombro em 294 nm no complexo de cobre em água, o qual não se apresenta bem definido em metanol. Com relação às transições intraligantes do vglu desprotonado, as bandas em 307 nm (3) e 310 nm (4) em metanol não possuem alterações significativas quando comparadas ao meio aquoso. O complexo de zinco apresenta ainda uma banda pouco definida em 350 nm, semelhantemente ao espectro em água, no entanto, não é observada essa transição no espectro do complexo de cobre em metanol. Na comparação entre os espectros dos respectivos complexos precursores [M(phen)(van)2] nos dois solventes, é observado um comportamento semelhante com relação a essa ultima banda, o que mostra que essa transição é bem definida apenas em meio aquoso. Adicionalmente, os espectros do complexo [Zn(phen)(vglu)2] em metanol e água apresentam a transição referente ao grupo imina sem deslocamentos significativos. No entanto, o espectro do complexo de cobre em metanol apresenta duas bandas intraligantes n- π* em 398 e 437 nm, enquanto que em meio aquoso apresenta apenas uma banda referente a essa transição. Dados da literatura corroboram com a atribuição dessas bandas (ZAMIAN e DOCKAL, 1996). Além disso, o espectro do complexo de cobre(II) obtido em metanol apresenta apenas uma banda d-d em 530 nm, enquanto que em meio aquoso são verificadas duas bandas d-d. Essa mudança pode ser justificada pela baixa solubilidade do composto em metanol, ou ainda, pela sobreposição das demais transições d-d a outras bandas de maior intensidade no espectro. Tais modificações apresentadas são justificadas pelos diferentes tipos de interações presentes em solventes com polaridades diferentes, as quais influenciaram apenas nas transições eletrônicas intraligantes da base de Schiff vglu e d-d. Na Tabela 15 são apresentadas as bandas presentes nos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2], obtidos em água e metanol. 110 Tabela 15– Dados comparativos entre as bandas de absorção dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2], utilizando água e metanol como solventes [Cu(phen)(vglu)2] [Zn(phen)(vglu)2] Atribuição Água Metanol Água Metanol I.L. phen e/ou vglu (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. vglu (π → π*) I.L. vglu (π → π*) I.L. vglu (n → π*) I.L. vglu (n → π*) d-d d-d 203 225 272 294 311 344 398 - 485 630 - a 226 271 291 307 - 398 437 530 - b 201 227 271 291 310 348 397 - - - a 227 271 292 310 350 398 - - a região não verificada, pois metanol absorve nesta região. b solvente não muito solúvel e, portanto, não é possível visualizar a banda. Fonte: Autora (2018). 5.2.3. Voltamogramas do ligante vglu e do complexo [Cu(phen)(vglu)2] Na Figura 54 é apresentada a sobreposição dos voltamogramas cíclicos em KCl 0,1 mol L -1 , pH 7,0 e velocidade de varredura de 100 mV s -1 , do ligante vglu na região de -1000 a 1200 mV e do complexo [Cu(phen)(vglu)2], nas regiões de -450 a 1100 mV e -350 a 350 mV, sendo esse ultimo responsável apenas pelo processo de oxirredução do metal. 111 Figura 54 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vglu de -1000 a 1200 mV,e do complexo [Cu(phen)(vglu)2] de (b) -350 a 350 mV e (c) -450 a 1100 mV (a) (b) (c) Fonte: Autora (2018). O voltamograma cíclico da base de Schiff vglu apresenta dois processos anódicos em 520 e 930 mV (versus Ag/AgCl), referentes à oxidação de dois elétrons, formando quinona, conforme mecanismo proposto para a vanilina. Esses processos diminuem consideravelmente suas correntes à medida que novos ciclos são gerados. A partir da segunda ciclização realizada, há o aparecimento de um novo processo de oxidação do vglu em 286 mV (versus Ag/AgCl). O voltamograma apresenta ainda um processo catódico referente à redução de dois elétrons, próximo a 0 mV, o qual é deslocado para maiores potenciais à medida que ocorre a varredura de novos ciclos. Ao analisar o voltamograma do complexo na região de -450 a 1100 mV, observa-se a presença de dois picos anódicos referentes aos processos de oxidação do ligante vglu em 518 e 853 mV (versus Ag/AgCl), indicando que a base de Schiff ficou mais rica 112 eletronicamente com a coordenação do centro metálico e, portanto, irá perder elétrons mais facilmente do que o ligante livre. O voltamograma apresenta ainda um par redox do centro metálico com pico catódico em -140 mV (versus Ag/AgCl), referente ao processo de redução do Cu +2/+1 , e pico anódico em 89 mV (versus Ag/AgCl), o qual se refere ao processo de oxidação do Cu +1/+2 , com potencial de meia onda de -25,5 mV (versus Ag/AgCl). À medida que novos ciclos vão sendo gerados, esses processos vão diminuindo sua intensidade, e alguns desaparecem, como observado com o par redox do metal. Vale ressaltar que esse valor obtido está dentro da janela de potencial esperado para o cobre(I) gerar espécies reativas como o radical hidroxila no meio biológico. O voltamograma da Figura 54b apresenta um pico catódico em -101 mV (versus Ag/AgCl), referente ao processo Cu 2+/1+ , e um pico anódico em 97 mV (versus Ag/AgCl), referente ao processo de oxidação Cu 1+/2+ , gerando um potencial de meia onda de -2 mV (versus Ag/AgCl). Ao utilizar essa faixa de potencial, o par redox não apresenta variações em suas correntes, independente da quantidade de varreduras realizadas. Dessa forma, nota-se que a reação de oxidação da base de Schiff se torna essencial para que haja diminuição na intensidade dos processos, ou seja, para que haja adsorção do material na superfície do eletrodo. Os valores dos potenciais de oxidação e redução do metal são modificados com a variação na janela de varredura. Observa-se que, ao diminuir a janela de potencial, a fim de apresentar apenas o par redox do centro metálico, os processos de oxidação e redução deslocam-se para maiores potenciais e o voltamograma apresenta um perfil mais reversível. A fim de avaliar a reversibilidade do processo redox do metal, foram analisados alguns parâmetros, tais como variação de potencial e razão entre as correntes do pico anódico e catódico, conforme apresentado na Tabela 16. Tabela 16 – Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos de oxirredução do Cu2+/1+/ Cu 1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(vglu)2] Complexo Cu 2+/1+ / Cu 1+/2+ Epc(mV) Epa(mV) ΔEp ipc (µA) ipa (µA) ipa/ipc [Cu(phen)(vglu)2] -101 97 198 5,6 8,1 1,4 Fonte: Autora (2018). Ao analisar a tabela acima, percebe-se que a diferença de potencial entre os picos anódico e catódico é superior à 59 mV, e, tendo em vista que a razão entre as correntes de pico anódico e catódico medida experimentalmente é superior a 1,0, verifica-se a quase 113 reversibilidade do processo redox do centro metálico no complexo [Cu(phen)(vglu)2], indicando certa estabilidade do composto quando o metal sofre alteração em seu estado de oxidação. A Figura 55 apresenta a sobreposição dos voltamogramas do complexo [Cu(phen)(vglu)2] em diferentes velocidades de varredura, a fim de avaliar a reversibilidade do par redox do íon metálico. Figura 55 – Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo [Cu(phen)(vglu)2] em diferentes velocidades de varredura, na região de -320 a 320 mV Fonte: Autora (2018). Ao analisar a sobreposição acima, observa-se que o pico catódico diminui a corrente à medida que a velocidade de varredura reduz, sem deslocamento significativo de potencial. Com relação ao pico anódico, houve uma pequena variação no potencial de oxidação do Cu +1/+2 , de maneira que, à medida que diminui a velocidade, nota-se uma diminuição no potencial e, consequentemente, um aumento na reversibilidade do par redox. Através dos valores das correntes obtidas para os processos de redução nas diferentes velocidades, foi construído um gráfico de corrente versus raiz quadrada da velocidade para os picos de redução, Figura 56, a fim de verificar sua linearidade e, com isso, avaliar a reversibilidade do processo. 114 Figura 56–Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente dos processos de redução do complexo [Cu(phen)(vglu)2] Fonte: Autora (2018). O gráfico referente ao pico catódico apresenta R = 0,99949. Tal valor mostra elevada linearidade, indicando que as correntes são diretamente proporcionais à raiz quadrada da velocidade. Esses resultados indicam que o complexo [Cu(phen)(vglu)2] apresenta um perfil quase reversível. 5.2.4. Ressonância Magnética Nuclear de 1H do complexo [Zn(phen)(vglu)2] O espectro de RMN de 1 H do complexo [Zn(phen)(vglu)2], obtido em DMSO, apresenta sinais de hidrogênio presentes nos ligantes fenantrolina e vglu, conforme Figura 57. Figura 57- Espectro de RMN 1 H para o complexo [Zn(phen)(vglu)2] em DMSO, 499,60 MHz. Fonte: Autora (2018). 115 Devido a simetria da estrutura da fenantrolina, são esperados quatro sinais no espectro de RMN, referentes aos hidrogênios Ha, Hb, Hc e Hd. Dentre os sinais observados no espectro, o Ha é o hidrogênio mais fortemente desprotegido da fenantrolina, com deslocamento químico de 8,96 ppm. Esse sinal, mesmo não estando bem resolvido nesse espectro, corresponde a um dubleto, característico do acoplamento entre os prótons Ha e seu próton vizinho, Hb. O espectro apresenta um tripleto com deslocamento químico de 8,73 ppm, referente ao próton Hc, o qual se apresenta levemente desprotegido, devido o hidrogênio ocupar uma posição para com relação ao átomo eletronegativo de nitrogênio. Observa-se ainda um tripleto com 8,15, 8,15 e 8,14 ppm, referente ao Hb, cujo próton interage com os hidrogênios a e c. Além desses, o espectro de RMN apresenta um dubleto em 7,95 e 7,94 ppm, referente ao hidrogênio Hd, o qual acopla fracamente com o Hc. Com relação ao grupo vanilóide do ligante vglu, o espectro apresenta um singleto em 3,72 ppm, referente ao próton do grupo metóxido, H1V, e dois dubletos em 6,79 e 6,76 ppm e 7,27 e 7,26 ppm, referentes aos prótons H2V e H4v da vanilina, respectivamente, os quais se desdobram por serem vizinhos entre si. Verifica-se ainda dois singletos em 7,20 e 9,57 ppm, referentes aos prótons H3V e H6V, respectivamente. Esse ultimo próton apresenta maior deslocamento químico, devido o efeito de desproteção causado pelo nitrogênio do grupo imina e indica a formação da base de Schiff vglu. O anel glicosamínico do ligante vglu apresenta vários sinais de prótons que se acoplam, caracterizados como multipletos, com deslocamentos químicos de 4,38, 3,99, 3,91, 3,90, 3,88, 3,86, 3,84, 3,68, 3,63, 3,61, 3,50 e 3,35 ppm. Tais sinais indicam a presença desse anel no composto formado. 5.3. SISTEMA CS-MPV, M = Cu2+ (5) e Zn2+ (6) 5.3.1. Espectros Vibracionais na região do Infravermelho do sistema CS-MPV O espectro de infravermelho do filme de quitosana não modificado apresenta bandas em 2920 e 2879 cm -1 , referentes aos estiramentos C-H assimétrico e simétrico, bandas características do estiramento C=O de amida secundária em 1652 cm -1 , e estiramento do grupo amino em 1586 cm -1 , bem como bandas em 1420 e 1378 cm -1 , atribuídas à deformação angular C-H, e em 1321 e 898 cm -1 , referentes, respectivamente, ao estiramento CH3 de amida terciária e deformação C-H. 116 Os espectros dos filmes modificados CS-MPV, onde M = Cu 2+ ou Zn 2+ , também apresentaram as mesmas bandas relatadas, típicas da matriz polimérica. Entretanto, as bandas características de estiramentos C=O de amida secundária (1652 cm -1 ) e do grupo amino (1586 cm -1 ) apresentam deslocamentos para maiores energias comparados à quitosana não modificada, sendo de 11 e 7 cm -1 para o complexo de cobre, e 11 e 14 cm -1 para o complexo de zinco, conforme apresentado na Figura 58. Além desses deslocamentos, os espectros dos complexos apresentaram ainda cinco novas bandas, localizadas em 1666, 1626, 1519, 1293 e 753 cm -1 para o complexo de cobre, e em 1662, 1627, 1516, 1292 e 754 cm -1 para o complexo de zinco. A região entre 1218 a 919 cm -1 possui bandas com elevada intensidade, referentes aos estiramentos C-O-C dos aneis glicosídicos e da ponte glicosídica β (1-4) que une as unidades monossacarídicas, e, por isso, foi omitida do espectro para permitir uma melhor visualização das demais bandas com menor intensidade. Figura 58 - Sobreposição dos espectros de infravermelho da quitosana não modificada (vermelho) e (a) CS-CPV (preto) e (b) CS-ZPV (preto). Fonte: Autora (2018). Os espectros de IV dos complexos CS-MPV foram sobrepostos com os espectros da base de Schiff vglu, bem como dos seus novos complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2] (Figura 59), tendo em vista a semelhança entre os sistemas, uma vez que a D-glucosamina corresponde à um dos monômeros da quitosana utilizada no presente trabalho. 117 Figura 59- Sobreposição dos espectros de IV dos compostos (a) vglu (preto), CS-CPV (vermelho) e [Cu(phen)(vglu)2] (azul) e (b) vglu (preto), CS-ZPV (vermelho) e [Zn(phen)(vglu)2] (azul). Fonte: Autora (2018). Os complexos com quitosana apresentam bandas em 1666 cm -1 (CS-CPV) e 1662 cm -1 (CS-ZPV), referentes ao estiramento C=O de aldeído aromático. Tais bandas indicam que ainda há aldeído livre no filme polimérico, mesmo após a modificação, conforme estrutura proposta para esse sistema (Figura 14). A banda em 1626 cm -1 , presente no ligante vglu, é também verificada nos espectros dos complexos CS-CPV e CS-ZPV sem deslocamentos significativos. Tal banda é característica de estiramento C=N e indica que as modificações nos filmes de quitosana ocorreram a partir da formação da base de Schiff nos complexos. Verifica-se ainda que as bandas em 1519 e 1293 cm -1 no filme de cobre e em 1516 e 1292 cm -1 no filme de zinco estão presentes nos espectros do vglu (1526 e 1298 cm -1 ) e dos complexos [Cu(phen)(vglu)2] (1516 e 1290 cm -1 ) e [Zn(phen)(vglu)2] (1504 e 1292 cm -1 ), as quais são referentes, respectivamente, ao estiramento C=C aromático (vanilóides e phen) e deformações angulares C-H e O-H do anel glucosamínico. Essas novas bandas presentes nos filmes indicam a formação da base de Schiff, bem como a presença dos grupos vanilóides nos complexos poliméricos formados. 118 5.3.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) acoplado ao Sistema de Dispersão de Energia (EDS) para o sistema CS-MPV A Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) foi utilizada no estudo da morfologia das superfícies dos filmes CS, CS-CPV e CS-ZPV. A Figura 60 apresenta a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) para o filme de quitosana CS, bem como para os filmes modificados CS-CPV e CS-ZPV, com ampliações de 500 X, 1000 X, 2000 X e 4000 X. O filme CS apresenta uma superfície com estrutura homogênea, lisa e contínua, com ausência de macroporos. Esses resultados caracterizam a membrana como densa e estão de acordo com dados obtidos por outros autores (ZHANG, et al., 2015). São perceptíveis apenas algumas partículas que podem ser referentes ao hidróxido de sódio do processo de lavagem que permaneceu na superfície do filme. As micrografias da superfície do filme CS-CPV mostram uma superfície pouco rugosa, contendo aglomerações de partículas com espaçamentos regulares e morfologias diferentes – aspecto fragmentado ou liso com várias faces – conforme observado na Figura 60. Essas partículas aglomeradas não estão presentes no filme de quitosana pura e, portanto, são indicativos da modificação da membrana polimérica. A análise morfológica do filme CS-ZPV mostra uma superfície lisa, com aglomerações de partículas dispersas. Alguns destes aglomerados intercalam a superfície do filme e, por isso, ficam parcialmente recobertos. Ao observar a ampliação de 4000 X, verifica-se que as partículas apresentam características quebradiças, semelhantes ao complexo do cobre. 119 Figura 60 - MEV dos filmes CS, CS-CPV e CS-ZPV com ampliações de 500, 1000, 2000 e 4000 X. Fonte: Autora (2018). Para caracterização dos filmes também foi utilizado o Sistema de Dispersão de Energia (EDS) acoplado ao MEV, de forma a determinar a composição qualitativa e semiquantitativa dos metais presentes nos filmes de quitosana modificados. O gráfico de EDS do CS-CPV, obtido para a superfície do filme representada na Figura 61a, apresentou picos referentes ao cobre (1 e 8 KeV), ao oxigênio (0,5 KeV), bem como dois picos próximos a 2 KeV referentes ao ouro. Esses últimos não foram identificados 120 no gráfico, visto que são referentes à camada de ouro utilizado no processo de metalização dos filmes. Tais resultados indicam a presença de cobre na membrana modificada. A região do filme CS-ZPV analisada apresentou picos referentes ao oxigênio (0,5 KeV), ao zinco (próximos a 1 e 9 KeV) e ao ouro (próximos a 0 e 2 KeV), conforme apresentado na Figura 61b. Desses elementos, o oxigênio e o zinco estão presentes na estrutura do complexo polimérico e indicam a modificação do filme, enquanto que o ouro se refere à metalização do material. Figura 61 - MEV/EDS dos filmes (a) CS-CPV e (b) CS-ZPV. (a) (b) Fonte: Autora (2018). 5.3.3. Avaliação da liberação e quantificação do teor de [M(phen)(van)2] nos filmes de quitosanas modificadas A espectroscopia de UV-Vis foi utilizada para monitorar a reação de hidrólise das quitosanas modificadas, CS-CPV e CS-ZPV, e conseqüente liberação dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2], respectivamente. A técnica também foi utilizada para 121 determinar as concentrações dos complexos de cobre e zinco presentes nos respectivos filmes. O estudo de liberação foi realizado com duas concentrações diferentes do complexo de cobre, CS-CPV1 e CS-CPV2, e outras duas para o complexo de zinco, CS-ZPV1 e CS-ZPV2, no entanto, no presente trabalho serão apresentados apenas os resultados de CS-CPV2 e CS- ZPV2. Um pedaço quadrado de cada filme CS-CPV2 e CS-ZPV2 com área de 0,08 cm 2 , foram imersos em 3,2 mL de solução de PBS, 0,1 mol L -1 , pH 7,4 a 25ºC. Vários espectros eletrônicos das soluções dos filmes de cobre e zinco foram registrados em diferentes tempos de imersão no intervalo de 0 a 1320 minutos para o complexo de cobre e de 0 a 1305 minutos para o complexo de zinco. Os espectros obtidos apresentaram os mesmos perfis que os espectros dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] e, além disso, houve um aumento gradual nas absorbâncias das bandas em função do tempo de exposição dos filmes às respectivas soluções aquosas, como mostrado na Figura 62. Estes resultados indicam claramente que o método aplicado para modificar os filmes de quitosana foi eficaz, bem como confirmam a capacidade dos filmes em liberarem os complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] quando expostos à água. Após 900 min (CS-CPV2) e 809 min (CS-ZPV2) de monitoramento, as concentrações dos complexos permaneceram praticamente constantes nas soluções. Figura 62 - Espectros das soluções de PBS, obtidos após diferentes tempos de imersão dos filmes modificados (a) CS-CPV (ta = 0 min, tb = 1 min, tc = 5 min, td = 15 min, te = 30 min, tf = 60 min, tg = 120 min, t = 1320 min), com a curva cinética para todos os dados obtidos e (b) CS-ZPV (ta = 0 min, tb = 1 min, tc = 5 min, td = 15 min, te = 30 min, tf = 60 min, tg = 120 min, th = 1305 min), com a curva cinética para todos os dados obtidos. Fonte: Autora (2018). As curvas de calibração (Figura 63) foram construídas para os complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2], nas concentrações 6,0 x 10 -6 M, 8,0 x 10 -6 M, 1,0 x 10 -5 122 M, 1,4 x 10 -5 M e 1,6 x 10 -5 M, em tampão PBS 0,1 mol L -1 , pH 7,4. Essas curvas permitiram a determinação das concentrações de cada composto liberado em solução pelos respectivos filmes nos tempos avaliados, resultando numa concentração de 3,14 x 10 -5 mol L -1 em t = 900 min (complexo de cobre) e 3,06 x 10 -5 mol L -1 em t = 1064 min (complexo de zinco). Figura 63 - Curvas de calibração dos complexos (a) [Zn(phen)(van)2], para λ = 271 nm, e (b) [Zn(phen)(van)2], para λ = 228 nm. Fonte: Autora (2018). Considerando-se as superfícies dos filmes avaliados e as concentrações dos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] liberados nos experimentos de UV-Vis, pode-se representar essas concentrações como 8,84 x 10 -7 mol cm -2 ou 4,83 x 10 -4 g cm -2 (CS-CPV1), 1,26 x 10 -6 mol cm -2 ou 6,86 x 10 -4 g cm -2 (CS-CPV2), 7,36 x 10 -7 mol cm -2 ou 4,03 x 10 -4 g cm -2 (CS-ZPV1) e 1,22 x 10 -6 mol cm -2 ou 6,71 x 10 -4 g cm -2 (CS-ZPV2). A capacidade dos filmes modificados de liberar os complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] em solução aquosa foi monitorada também por técnicas eletroquímicas. Os voltamogramas cíclicos e de pulso diferencial obtidos após diferentes tempos de imersão do filme CS-CPV2 em PBS 0,1 mol L -1 , pH 7,4, apresentam um par redox Cu 2+/1+ com E1/2 = -42,5 mV (versus Ag/AgCl), bem como um processo de oxidação da vanilina em 629 mV (versus Ag/AgCl), enquanto que os voltamogramas do filme CS-ZPV2 obtidos nas mesmas condições, mostram apenas um processo de oxidação do ligante vanilina coordenado em 620 mV (versus Ag/AgCl). Comparativamente, o voltamograma cíclico do complexo precursor [Cu(phen)(van)2], obtido em PBS 0,1 mol L -1 , pH 7,4, apresenta um par redox Cu 2+/1+ com E1/2 = - 50 mV 123 (versus Ag/AgCl) e ainda um processo de oxidação da vanilina em 630 mV (versus Ag/AgCl). Já o voltamograma do complexo precursor [Zn(phen)(van)2] em PBS 0,1 mol L -1 , pH 7,4, apresenta apenas um processo de oxidação referente ao ligante vanilina em 657 mV (versus Ag/AgCl). Adicionalmente, o voltamograma da vanilina, obtido nas mesmas condições, apresenta um processo de oxidação em 675 mV (versus Ag/AgCl). Tais resultados corroboram com a espectroscopia eletrônica de UV-Vis, ao indicarem que as bases de Schiff sofrem hidrólises no meio aquoso e que os compostos liberados são os complexos precursores [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2]. A Figura 64 apresenta a sobreposição dos voltamogramas cíclicos da vanilina livre, dos complexos precursores [M(phen)(van)2] e dos filmes CS-CPV2 e CS-ZPV2, obtidos em Tampão PBS, 0,1 mol L -1 , pH 7,4. Figura 64 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos dos compostos (a) vanilina, 1,6 x 10 -3 mol L -1 , [Cu(phen)(van)2], 9,0 x 10 -4 mol L -1 e do composto liberado no filme de cobre, 1,96 x 10 -4 mol L -1 , e (b) vanilina, 1,6 x 10 -3 mol L -1 , [Zn(phen)(van)2], 9,0 x 10 -4 mol L -1 e do composto liberado no filme de zinco 1,91 x 10 -4 mol L -1 . Fonte: Autora (2018). Similarmente à tendência observada no monitoramento realizado por UV-Vis, a corrente de pico anódica na Voltametria de Pulso Diferencial (DP) também aumentou com o tempo de imersão em ambos os complexos, indicando a liberação de [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] nos respectivos filmes modificados, conforme apresentado na Figura 65. 124 Figura 65 - Sobreposição dos voltamogramas de Pulso Diferencial (DP) dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Zn(phen)(van)2], liberados no meio PBS em diferentes tempos. Fonte: Autora (2018). 5.3.4. Aplicação do filme CS-ZPV na cicatrização de feridas cutâneas Após confirmar que os filmes CS-MPV liberam [M(phen)(van)2] em meio aquoso e, tendo em vista as características biodegradáveis e não tóxicas da própria quitosana, buscou-se aplicar esses filmes poliméricos como sistemas transportadores de fármacos, os quais pudessem ser seletivos quanto à via e a forma de administração do [M(phen)(van)2], proporcionando maior flexibilidade na dosagem e controle cinético de sua liberação no organismo. Sabendo da relevância do zinco no processo de cicatrização de feridas, o complexo [Zn(phen)(van)2] foi avaliado quanto ao seu efeito cicatrizante, a partir de ensaios in vivo, com experimento em animais aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, protocolo (005006/2017), onde o mesmo foi administrado na forma tópica ao aplicar filmes de quitosana modificados CS-ZPV1 e CS-ZPV2 em feridas cutâneas desenvolvidas em ratos. Como as lesões são úmidas, o complexo [Zn(phen)(van)2] é liberado do filme CS-ZPV, tendo ação direta na lesão, sem passar por reações metabólicas em órgãos específicos do rato, evitando assim mecanismos mais complexos e possível degradação do composto de zinco(II). Para os ensaios, foram utilizados seis grupos de ratos: gurpo normal (ratos sem diabetes), grupo diabético, grupo diabético tratado com filme de quitosana pura CS e grupos diabéticos tratados com filmes de quitosana modificada com [Zn(phen)(van)2] nas 125 concentrações 7,36 x 10 -7 mol cm -2 (CS-ZPV1) e 1,22 x 10 -6 mol cm -2 (CS-ZPV2). As análises foram realizadas durante os períodos de 7 e 14 dias. Foram realizados ensaios macroscópicos e histopatológicos, assim como a quantificação de citocina, imuno-histoquímica e qPCR das feridas no 7º e 14º dia após as lesões. Os resultados monstraram que os grupos tratados com os filmes modificados CS- ZPV1 e CS-ZPV2 apresentaram processos de reepitelização mais eficazes, além de apresentarem quantidade de proteínas significativamente maior nas lesões, as quais auxiliam no processo de cicatrização. Dentre esses grupos que se destacaram no estudo, aquele que foi tratado com o filme CS-ZPV2 – filme que tem maior concentração do complexo [Zn(phen)(van)2] liberado na lesão – apresentou melhor efeito cicatrizante. Para exemplificar, a Figura 66 apresenta a análise macroscópica realizada para um rato lesionado e tratado com CS-ZPV2, o qual apresentou melhor resultado de cicatrização frente aos demais grupos analisados. Figura 66 - Análise macroscópica da ferida cutânea com (a) 0 dias, (b) 7 dias e (c) 14 dias, após a administração de CS-ZPV2. Fonte: Autora (2018). Nesta análise macroscópica, as lesões cutâneas no 7º e 14º dia de pós-operatório mostraram diferenças significativas em relação à diminuição da sua área, onde os grupos tratados com os filmes de quitosana modificada apresentaram maior contração da área da lesão quando comparados aos demais grupos e, quanto maior a concentração do complexo [Zn(phen)(van)2] liberado na lesão, mais eficaz foi a cicatrização observada. 126 5.4. SISTEMA [M(phen)(vpca)2], M = Cu 2+ (7) e Zn 2+ (8) 5.4.1. Espectros vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(vpca)2] Os espectros de infravermelho dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2], obtidos em pastilha de KBr, na região de 4000 a 400 cm -1 , são apresentados na Figura 67. As regiões mais energéticas dos espectros possuem uma banda larga característica de estiramento O-H, referente à humidade presente na pastilha de KBr utilizada para análise. Além dessa, são apresentadas nos espectros dos complexos de cobre e zinco bandas em 3062 e 3053 cm -1 , respectivamente, referentes ao estiramento C-H aromático, e bandas em 2942 e 2830 cm -1 (7) e em 2931 e 2824 cm -1 (8) características de estiramento C-H alifático (Al- JIBOURI; MUSA, 2014). Figura 67 – Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vpca)2] (preto) [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm -1 Fonte: Autora (2018). As bandas em 1681 e 1632 cm -1 presentes no espectro de IV do complexo [Cu(phen)(vpca)2], e em 1684 e 1632 cm -1 observadas no espectro do [Zn(phen)(vpca)2], Figura 68, são referentes ao estiramento C=N da base de Schiff, enquanto que as bandas em 127 1589, 1569 e 1506 cm -1 (7) e 1590 e 1515 cm -1 (8) são características de estiramentos C=C aromáticos, presentes tanto na phen, quanto nas bases de Schiff formadas. Os espectros de IV apresentam bandas do ligante vpca em 1384 e 753 cm -1 (7) e 1378 e 755 cm -1 (8), referentes ao estiramento axial H2C-CH e deformação angular C-H fora do plano, respectivamente, as quais são características da picolilamina (AL-JIBOURI; MUSA, 2014). A banda em 1028 cm -1 no complexo de cobre e em 1031 cm -1 no complexo de zinco indica a presença do vanilóide em cada um dos novos complexos formados, tendo em vista que esse modo vibracional se refere ao estiramento O-CH3 desse ligante. Figura 68 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vpca)2] (preto) e [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) na região de 1750 a 500 cm -1 Fonte: Autora (2018). Na Figura 69 é apresentada a sobreposição dos espectros do sistema [M(phen)(vpca)2], do seu precursor [M(phen)(van)2] e do ligante 2-picolilamina, na região de 1750 a 700 cm -1 , a fim de compará-los para obter uma melhor caracterização dos complexos com as bases de Schiff vpca. 128 Figura 69 – Sobreposição dos espectros vibracionais dos (a) [Cu(phen)(van)2] (preto), [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) e pca (azul) e (b) [Zn(phen)(van)2] (preto), [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho) e pca (azul) na região de 1750 a 700 cm -1 (a) (b) Fonte: Autora (2018). O espectro da 2-picolilamina apresenta um ombro em 1632 cm -1 , referente à deformação angular N-H da molécula (RAU; SHOUKRY; ELDIK, 1997), o qual coincide com a banda do estiramento C=N das bases de Schiff nos complexos, também em 1632 cm -1 . Os complexos precursores apresentam uma banda em 1652 cm -1 (complexo de cobre) e 1660 cm -1 (complexo de zinco) característica de estiramento C=O de aldeído, a qual não é observada nos complexos com o ligante vpca. Tais fatos indicam a formação da base de Schiff no sistema [M(phen)(vpca)2]. Observa-se que o espectro do [Cu(phen)(vpca)2] possui duas bandas em 1384 e 753 cm -1 e o [Zn(phen)(vpca)2] apresenta essas bandas em 1378 e 755 cm -1 , as quais estão também presentes no espectro do pca, e não são identificadas nos complexos precursores. Tal comportamento corrobora com a atribuição dessas bandas como sendo referentes ao estiramento H2C-CH e a deformação angular C-H fora do plano do anel da picolilamina, respectivamente, evidenciando a presença do vpca nos complexos. A presença do ligante fenantrolina nos complexos [M(phen)(vpca)2] é indicada pelas bandas em 849 e 727 cm -1 (7) e 848 e 727 cm -1 (8), referentes à deformação angular C-H fora do plano dos anéis aromáticos da phen, as quais também são observadas nos complexos 129 precursores [Cu(phen)(van)2] (851 e 722 cm -1 ) e [Zn(phen)(van)2] (849 e 727 cm -1 ), com deslocamentos pouco significativos. A Tabela 17 apresenta as atribuições das principais bandas presentes nos espectros de infravermelho dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2]. Os valores obtidos para as respectivas atribuições condizem com os dados da literatura. Tabela 17 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2] Atribuições [Cu(phen)(vpca)2] [Zn(phen)(vpca)2] C-H aromático 3062 3053 C-H alifático 2942, 2830 2931, 2824 C=N 1681, 1632 1684, 1632 C=C aromático 1589, 1569, 1506 1590, 1515 assCH3,CH2 e C=N aromático 1466, 1425 1465, 1427 H2C-CH 1384, 1351 1378, 1353 C-O éter 1195 1196 O-CH3 1028 1031 C-H fora do plano (phen) 849, 727 848, 727 C-H fora do plano (pca) 753 755 Fonte: Autora (2018). 5.4.2. Espectros de absorção eletrônica na região do Ultravioleta e Visível do sistema [M(phen)(vpca)2] Os espectros eletrônicos dos complexos [M(phen)(vpca)2] obtidos em meio aquoso (Figura 70), apresentam grande quantidade de bandas na região do ultravioleta, com máximos de absorção em 201, 224, 267, 291, 314 e 355 nm (7) e 200, 226, 268, 290, 315, 355 e 398 nm (8), referentes às transições intraligantes da fenantrolina e da base de Schiff vpca. O espectro do complexo de cobre apresenta ainda duas bandas d-d de baixa intensidade em 446 e 600 nm, as quais ocupam grande parte da região do visível, justificando a coloração marrom escuro do composto. As atribuições das bandas presentes nos espectros dos complexos em meio aquoso são apresentadas na Tabela 18. Os valores de absortividade molar não foram obtidos para os complexos [M(phen)(vpca)2], tendo em vista que não foi gerado material sólido para esse sistema. 130 Figura 70 – Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] (preto) e [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho) em meio aquoso com ampliação da região do visível Fonte: Autora (2018). Tabela 18 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2] em meio aquoso. Atribuições [Cu(phen)(vpca)2] [Zn(phen)(vpca)2] I.L. phen e/ou vpca (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen e/ou vpca (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. vpca (π → π*) I.L. vpca (π → π*) I.L vpca (n → π*) d-d d-d 201 224 267 291 314 355 - 446 600 200 226 268 290 315 355 398 - - Fonte: Autora (2018). Na Figura 71 são apresentadas as sobreposições dos espectros eletrônicos do ligante 2- picolilamina, dos complexos precursores e dos complexos [M(phen)(vpca)2], obtidos em meio aquoso. 131 Figura 71 – Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos compostos (a) [Cu(phen)(vpca)2] (preto), [Cu(phen)(van)2] (vermelho) e 2-picolilamina (verde) e (b) [Zn(phen)(vpca)2] (preto), [Zn(phen)(van)2] (vermelho) e 2-picolilamina (verde) (a) (b) Fonte: Autora (2018). Ao analisar as sobreposições dos espectros, observa-se um ombro com máximo de absorção próximo a 200 nm e uma banda intensa próxima a 267 nm nos complexos [M(phen)(vpca)2], característicos de transições intraligantes da base de Schiff vpca e do ligante fenantrolina, possivelmente sobrepostas. Tais bandas estão presentes no pca em 199 e 260 nm e nos complexos precursores em 205 e 273 nm (complexo de cobre) e 201 e 271 nm (complexo de zinco), respectivamente. O sistema [M(phen)(vpca)2] possui bandas próximas a 225 e 291 nm, as quais também estão presentes nos respectivos complexos precursores, referentes às transições intraligantes da fenantrolina, de natureza -*. Esses espectros apresentam ainda bandas intraligantes -* do vpca próximas a 314 e 355 nm, também presentes nos complexos precursores com pequenos deslocamentos para menores números de onda, indicando que essas transições estão relacionadas ao grupo vanilóide do vpca, comum aos dois sistemas. O espectro eletrônico do complexo de cobre(II) com a base de Schiff apresenta duas bandas d-d em 446 e 600 nm, dentre as três transições possíveis para esse sistema. A outra banda d-d pode estar sobreposta a outras bandas de maior intensidade no espectro. Comparativamente, o complexo precursor possui três bandas d-d, em 469, 650 e 775 nm, apresentando, portanto, deslocamentos significativos de 23 e 50 nm para maiores comprimentos de onda, ou seja, as transições são menos energéticas para o [Cu(phen)(van)2], 132 evidenciando, portanto, que o vpca é um ligante mais forte do que a vanilina e, por isso, causa um maior desdobramento entre os orbitais d do cobre(II). O complexo [Zn(phen)(vpca)2] apresenta uma banda de baixa intensidade em 398 nm, a qual não é observada em nenhum outro espectro sobreposto a ele, visto que se refere à transição n-* do grupo imina do ligante vpca. Para o complexo [Cu(phen)(vpca)2], não é apresentado nenhuma transição intraligante do vpca de natureza n-*, provavelmente devido às bandas em 355 e 446 nm estarem próximas a essa região e, portanto, sobrepõem essa transição. A Figura 72 apresenta as sobreposições dos espectros dos complexos [M(phen)(vpca)2] obtidos em meio aquoso e metanol. Figura 72 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho) dos complexos (a) [Cu(phen)(vpca)2] e (b) [Zn(phen)(vpca)2] (a) (b) Fonte: Autora (2018). Os espectros dos complexos [M(phen)(vpca)2] em metanol não apresentaram alterações significativas nas bandas intraligantes da fenantrolina, comparativamente aos espectros obtidos em meio aquoso. Em metanol, as bandas intraligantes do vpca apresentaram alguns deslocamentos, estando no complexo de cobre em 309 e 360 nm, sendo essa ultima mais larga e melhor definida do que no espectro em água, e em 308, 392 e 470 nm no complexo de zinco, sendo a primeira referente à transição -* e as demais são características de transições n-*. Comparativamente, o complexo de zinco em água apresenta uma banda 133 intraligante do vpca em 355 nm, a qual não é apresentada no espectro em metanol. Além disso, esse complexo em água apresenta apenas uma banda I.L. do vpca de natureza n-*. O complexo [Cu(phen)(vpca)2] em metanol apresenta duas bandas d-d em seu espectro, localizadas em 447 e 497 nm, enquanto que em meio aquoso tais bandas são visualizadas em 446 e 600 nm, resultando em um deslocamento menos energético de 103 nm para essa ultima transição. Tais deslocamentos evidenciados podem ser explicados a partir dos diferentes tipos de interações dos solventes, como polaridade e proticidade, com os complexos, as quais influenciaram energeticamente as transições eletrônicas intraligantes do vpca e as transições d-d. É importante destacar que, para esses complexos, as transições intraligantes da fenantrolina não sofreram influência significativa quanto à alteração do solvente. A Tabela 19 apresenta as transições eletrônicas presentes nos espectros dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2], obtidos em meio aquoso e metanol. Tabela 19– Dados comparativos entre as bandas de absorção dos complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2], utilizando água e metanol como solventes [Cu(phen)(vpca)2] [Zn(phen)(vpca)2] Atribuição Água Metanol Água Metanol I.L. phen e/ou vpca (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen e/ou vpca (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. vpca (π → π*) I.L. vpca (π → π*) I.L. vpca (n → π*) I.L. vpca (n → π*) d-d d-d 201 224 267 291 314 355 - - 446 600 - a 223 265 289 309 360 - - 447 497 200 226 268 290 315 355 398 - - - - a 227 269 293 308 - 392 470 - - a região não verificada, pois metanol absorve nesta região. Fonte: Autora (2018). 134 5.4.3. Voltamogramas do ligante vpca e do complexo [Cu(phen)(vpca)2] Os voltamogramas do ligante vpca e do complexo [Cu(phen)(vpca)2] nas regiões de - 450 a 1100 e -500 a 250 mV, obtidos em eletrólito KCl 0,1 mol L -1 e pH 7,0, com velocidade de varredura 100 mV s -1 , são apresentados na Figura 73. Figura 73 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vpca de -1000 a 1200 mV,e do complexo [Cu(phen)(vpca)2] de (b) -500 a 250 mV e (c) -450 a 1100 mV (a) (b) (c) (c) Fonte: Autora (2018). O voltamograma do vpca apresenta dois processos anódicos em 420 e 679 mV (versus Ag/AgCl), referentes à oxidação de dois elétrons do grupo vanilóide com formação de quinona, além de um processo catódico com redução de dois elétrons em 235 mV (versus Ag/AgCl). Verifica-se que os picos anódicos reduzem suas correntes significativamente à medida que novos ciclos são gerados, enquanto que o processo de redução aumenta sua intensidade. Comparativamente, o voltamograma do complexo [Cu(phen)(vpca)2] (Figura 73c) apresenta três processos de oxidação do vpca em 357, 544 e 792 mV (versus Ag/AgCl), com maiores valores de potenciais, indicando que o composto está mais pobre eletronicamente 135 com a coordenação do centro metálico, e, portanto, precisa-se aplicar maior potencial para oxidar. Com relação ao processo de redução do vpca, o complexo apresenta pico em 212 mV (versus Ag/AgCl), com menor potencial, tendo em vista a sua natureza eletrônica mais pobre devido à coordenação ao metal. Além desses processos do ligante, o complexo apresenta um par redox referente à oxidação e redução do centro metálico de cobre, com pico catódico em -172 mV (versus Ag/AgCl), referente a redução do Cu 2+/1+ , e pico anódico em -80 mV (versus Ag/AgCl), referente à oxidação Cu 1+/2+ , gerando potencial de meia onda de -126 mV (versus Ag/AgCl). Tais processos estão de acordo com dados similares obtidos na literatura (KHOSHRO; ZARE e VAFAZADEH, 2015) para um estudo realizado com complexo de cobre(II) em meio orgânico. Verifica-se que, a partir da segunda varredura, os processos diminuem consideravelmente suas correntes, e alguns desaparecem por completo do voltamograma, enquanto o pico em 357 mV (versus Ag/AgCl) é deslocado para maiores potenciais. O voltamograma do complexo [Cu(phen)(vpca)2] (Figura 73b) apresenta apenas o par redox do Cu 2+/1+ e Cu 1+/2+ , com pico catódico em -174 mV (versus Ag/AgCl) e pico anódico em -13 mV (versus Ag/AgCl), gerando um potencial de meia onda de -93,5 mV (versus Ag/AgCl). Para esse voltamograma, foram realizadas varreduras de vários ciclos, e não foram observadas variações significativas nas correntes do par redox, indicando que, faz-se necessário oxidar o ligante vpca para que ocorra a deposição do material na superfície do eletrodo. Para esse complexo, o pico de oxidação do cobre apresentou uma pequena variação de 67 mV para maiores potenciais, quando comparado com o voltamograma completo (-450 a 1100 mV). Tendo em vista que o processo de redução do cobre 2+/1+ se apresenta pouco definido na voltametria cíclica, com baixa intensidade de corrente, utilizou-se a voltametria de pulso diferencial (DP) para melhor visualização dos processos de oxidação e redução do centro metálico, conforme apresentado na Figura 74. 136 Figura 74–Voltamogramas de pulso diferencial do [Cu(phen)(vpca)2] em KCl 0,1 mol L -1 pH 7,0 dos processos de (a) oxidação e (b) redução (a) (b) Fonte: Autora (2018). O voltamograma (a) apresenta um processo de oxidação com potencial de -94 mV (versus Ag/AgCl), enquanto que o voltamograma (b) apresenta um pico bem definido referente ao processo de redução Cu 2+/1+ com potencial de -106 mV (versus Ag/AgCl). Esses valores correspondem, aproximadamente, ao potencial de meia onda dos processos redox obtidos na voltametria cíclica. A Tabela 20 apresenta alguns parâmetros do processo redox do centro metálico, tais como variação de potenciais e razão entre as correntes dos picos catódico e anódico, a fim de avaliar a reversibilidade desse par redox. Os dados apresentados são referentes ao voltamograma cíclico obtido na região de -500 a 250 mV. Tabela 20 – Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos de oxirredução do Cu2+/1+/ Cu 1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(vpca)2]. Complexo Cu 2+/1+ / Cu 1+/2+ Epc(mV) Epa(mV) ΔEp ipc (µA) ipa (µA) ipa/ipc [Cu(phen)(vpca)2] -174 -13 161 3,9 15,5 3,97 Fonte: Autora (2018). Ao analisar a tabela acima, verifica-se que a diferença de potencial entre os picos anódico e catódico é superior à 59 mV, bem como, a razão entre as correntes de pico anódico e catódico é aproximadamente 4,0, o que indica a quase reversibilidade do processo redox. Além disso, foram realizadas varreduras cíclicas em diferentes velocidades, as quais estão sobrepostas na Figura 75. 137 Figura 75–Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo [Cu(phen)(vpca)2] em diferentes velocidades de varredura, na região de -420 a 160 mV Autor: Fonte (2016). Observa-se que o pico anódico diminui a corrente à medida que a velocidade de varredura reduz, com pequenos deslocamentos para menores valores de potenciais e, consequentemente, um aumento na reversibilidade do par redox. Tais variações indicam determinada instabilidade do composto. A Figura 76 apresenta o gráfico de corrente versus raiz quadrada da velocidade para os picos de oxidação, a fim de verificar sua linearidade e, com isso, avaliar a reversibilidade do processo. 138 Figura 76–Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente dos processos de oxidação do complexo [Cu(phen)(vpca)2] Fonte: Autora (2018). O gráfico apresenta R = 0,989, indicando que as correntes são diretamente proporcionais à raiz quadrada da velocidade e, portanto, o complexo apresenta um perfil quase reversível, ou seja, o metal apresenta determinada estabilidade frente aos processos redox realizados. 5.5. SISTEMA [M(phen)(vpcaZnCl2)2], M= Cu 2+ (9) e Zn 2+ (10) 5.5.1. Espectros vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(vpcaZnCl2)2] A sobreposição dos espectros de absorção na região do infravermelho dos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], obtidos em pastilhas de KBr, na região de 4000 a 400 cm -1 , é apresentada na Figura 77. O elevado número de bandas observadas nesses espectros pode ser justificado pela baixa simetria das moléculas, exibindo vários modos vibracionais que são ativos no infravermelho. Ao analisar os espectros vibracionais, observam-se duas bandas em 3071 e 2832 cm -1 para o complexo (9) e três bandas em 3060, 2933 e 2837 cm -1 para o complexo (10), sendo as bandas acima de 3000 cm -1 referentes aos estiramentos C-H aromático e as demais características de estiramento C-H alifático. Verifica-se também uma banda larga próximo a 3500 cm -1 , característica de estiramento O-H, presente nos espectros devido a humidade da amostra ou do KBr utilizado no preparo da pastilha. 139 Figura 77- Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm -1 Fonte: Autora (2018). Figura 78 – Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (vermelho) na região de 1780 a 500 cm -1 Fonte: Autora (2018). 140 Ao avaliar os espectros dos complexos trinucleares, Figura 78, observa-se bandas em 1711 e 1631 cm -1 (9) e em 1665 e 1624 cm -1 (10), características de estiramentos C=N, bem como bandas em 1600 e 1556 cm -1 para o complexo (9) e em 1607, 1588 e 1504 cm -1 para o complexo (10), referentes aos estiramentos C=C aromáticos, presentes nos ligantes phen e vpca. Além dessas, o complexo heteronuclear apresenta duas bandas em 1360 cm -1 e 759 cm - 1 , enquanto que o complexo homonuclear apresenta essas bandas em 1338 e 764 cm -1 , características de estiramento H2C-CH e deformação angular C-H fora do plano, respectivamente, sendo ambos referentes à molécula pca. Observam-se ainda outros modos vibracionais referentes aos ligantes vpca e phen, como a banda em 1027 cm -1 (9) e 1026 cm -1 (10), característica de estiramento O-CH3 do vanilóide, e as bandas em 850 e 723 cm -1 (9) e 848 e 727 cm -1 (10), as quais se referem à deformação angular C-H fora do plano da fenantrolina. A Figura 79 apresenta a sobreposição dos espectros do sistema [M(phen)(vpcaZnCl2)2] com seu precursor [M(phen)(vpca)2], a fim de realizar uma melhor caracterização dos complexos trinucleares e poder sugerir a coordenação dos átomos de zinco às bases de Schiff vpca. Figura 79 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos (a) [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto), [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) e (b) [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto), [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho) na região de 1780 a 500 cm -1 (a) (b) Fonte: Autora (2018). Os espectros dos complexos trinucleares apresentaram deslocamentos em várias bandas, em comparativo aos espectros dos seus precursores. Dessa forma, serão discutidas a 141 seguir as principais bandas modificadas, as quais são responsáveis pela caracterização do sistema. A banda em 1711 cm -1 no espectro do [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2], referente ao estiramento C=N da base de Schiff, apresenta um deslocamento significativo de 30 cm -1 para maiores números de onda quando comparado ao precursor [Cu(phen)(vpca)2], justificado pela alteração na estrutura do composto, através da coordenação do centro metálico de zinco ao nitrogênio presente nessa ligação. Já o espectro do complexo homonuclear de zinco apresenta as duas bandas referentes ao estiramento C=N (1665 e 1624 cm -1 ) com deslocamentos de 19 e 8 cm -1 para menores números de onda, respectivamente, quando comparado ao complexo precursor. Tendo em vista que o átomo de nitrogênio presente nessa ligação é um dos sítios ativos que se coordenam ao zinco(II) doando densidade eletrônica a esse metal e, considerando a isomeria cis-I desse composto, onde os átomos de oxigênio fenólicos estão trans um ao outro, o efeito de ressonância ao longo de toda a molécula vanilóide será ativo, tornando a ligação C=N enfraquecida, com maior caráter de ligação simples, e, por isso, precisa de menos energia para fazer vibrar essa ligação, comparativamente ao grupo C=N não coordenado e comparado ainda ao complexo (9), que apresenta isomeria cis-III, onde os átomos de oxigênio fenólicos estão trans ao ligante receptor fenantrolina, o que dificulta o efeito de ressonância sobre toda a molécula. Analisando os espectros dos complexos precursores, observa-se que as bandas em 1506 e 1228 cm -1 (7) e em 1515 e 1225 cm -1 (8), referentes ao estiramento C=C aromático e deformação angular C-H (WILLIAMS; AYMONINO, 1986), respectivamente, são deslocadas para maiores números de onda, sendo verificadas no espectro do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] em 1518 e 1253 cm -1 e no complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] em 1504 e 1234 cm -1 . Além dessas, a banda em 1384 cm -1 (7) e 1378 cm -1 (8) presente no sistema [M(phen)(vpca)2], referente ao estiramento C-C alifático, também sofre deslocamento significativo de 24 e 40 cm -1 para menores números de onda. Nota-se que essa ligação é fortemente influenciada pela coordenação do zinco, tendo em vista que o grupo H2C-CH está localizado entre os átomos de nitrogênio que se coordenam ao metal, o que justifica o deslocamento verificado. As bandas referentes aos grupos vanilóides, no entanto, não sofreram deslocamentos significativos, como, por exemplo, o estiramento O-CH3 presente em 1027 cm -1 e 1028 cm -1 nos espectros dos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Cu(phen)(vpca)2], respectivamente, 142 bem como em 1026 e 1031 cm -1 nos complexos [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpca)2], respectivamente. As principais bandas referentes ao ligante fenantrolina, ou seja, as bandas características de deformação angular C-H fora do plano do anel da phen, não sofreram alterações quando comparados ambos os complexos trinucleares com seus precursores. A banda característica da molécula precursora 2-picolilamina, observada em 759 cm -1 no complexo (9) e em 764 cm -1 no complexo (10), sofreu pequeno deslocamento quando comparada aos respectivos espectros dos complexos precursores, justificado também pela coordenação do zinco em cada composto. Na Tabela 21 são apresentadas as principais bandas presentes nos espectros de infravermelho dos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], as quais corroboram com dados da literatura. Tabela 21 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] Atribuições [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] C-H aromático 3071 3060 C-H alifático 2832 2933, 2837 C=N 1711, 1631 1665, 1624 C=C aromático 1600, 1556, 1518 1607, 1588, 1504 assCH3 metóxido eC=N aromático 1478, 1426 1464, 1427 H2C-CH 1400, 1360 1338 C-H aromático 1312, 1294, 1269, 1253 1338, 1304, 1287 O-CH3 1027 1026 C-H fora do plano (phen) 850, 723 848, 727 C-H fora do plano (pca) 759 764 Fonte: Autora (2018). 5.5.2. Espectros de absorção eletrônica na região do Ultravioleta e Visível do sistema [M(phen)(vpcaZnCl2)2] Os espectros eletrônicos (UV-Vis) dos complexos [M(phen)(vpcaZnCl2)2], obtidos em meio aquoso, apresentam bandas intensas em toda a região do ultravioleta e parte do visível, como pode ser observado na Figura 80. 143 Figura 80 – Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto), 1,15 x 10 -5 mol L -1 , e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (vermelho), 7,0 x 10 -6 mol L -1 , em meio aquoso. Fonte: Autora (2018). Ao observar os espectros acima, verifica-se no complexo (9) uma banda em 218 nm e um ombro em 290 nm, referentes às transições -* intraligantes da fenantrolina, enquanto que no complexo (10) observa-se uma banda em 200 nm, referente às transições intraligantes -* da phen e do vpca possivelmente sobrepostas, bem como uma banda I.L. da phen em 225 nm. O complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] também apresenta duas bandas bem próximas em 261 e 269 nm, referentes às intraligantes -* do vpca e da phen, respectivamente, além de um ombro de menor intensidade em 291 nm, também característico da fenantrolina. Já o complexo heteronuclear possui apenas uma banda em 271 nm, referente às transições intraligantes de natureza -* do vpca e da fenantrolina provavelmente sobrepostas nessa região, bem como um ombro em 290 nm proveniente de uma transição da phen. Observam-se no espectro eletrônico do complexo homonuclear duas bandas intensas em 350 e 388 nm, e uma banda de menor intensidade em 479 nm, sendo a primeira uma transição I.L. -* do grupo vanilóide, e as demais referentes à transição n-* do grupo imina, ambas presentes no ligante vpca. Para o complexo heteronuclear, verifica-se uma banda larga de grande intensidade em 375 nm, possivelmente referente à sobreposição das 144 transições intraligantes -* do vanilóide e n-* da imina, presentes no ligante vpca. A atribuição desta ultima transição corrobora com dados da literatura (KAZEMI, et al., 2015). As atribuições das bandas presentes no espectro dos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] em meio aquoso são apresentadas na Tabela 22, juntamente com os valores de absortividade molar. Tabela 22 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] em meio aquoso. [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] Atribuição das Transições Comprimento de Onda (nm) ε (L mol-1 cm-1) Comprimento de Onda (nm) ε (L mol-1 cm-1) I.L. phen e/ou vpca (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. phen e/ou vpca (π → π*) I.L. phen (π → π*) I.L. vpca (π → π* e/ou n → π*) I.L. vpca (n → π*) - 218 271 290 375 - - 7,71. 10 4 5,30. 10 4 3,49. 10 4 2,35. 10 4 - 200 225 261 e 269 291 350 e 388 479 1,43 10 5 8,09. 10 4 7,07. 10 4 e 7,27. 10 4 3,56. 10 4 4,58. 10 4 e 4,36. 10 4 1,40. 10 3 Fonte: Autora (2018). A Figura 81 apresenta a sobreposição dos espectros dos complexos trinucleares [M(phen)(vpcaZnCl2)2] e seus respectivos precursores [M(phen)(vpca)2], com o objetivo de avaliar as alterações entre eles e, a partir disso, indicar a coordenação dos átomos de zinco(II) aos ligantes vpca. 145 Figura 81 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos (a) [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) e (b) [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho), obtidos em meio aquoso (a) (b) Fonte: Autora (2018). Ao analisar a sobreposição dos espectros dos complexos de cobre, verifica-se que a banda intraligante da phen, presente em 218 nm no [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2], sofre um pequeno deslocamento de 6 nm para menores comprimentos de onda comparado ao complexo mononuclear, enquanto que a banda assimétrica em 271 nm no complexo polinuclear (I.L. phen e/ou vpca) não apresenta deslocamento significativo comparado ao seu precursor. Adicionalmente, o espectro do complexo mononuclear de cobre apresenta duas bandas intraligantes do vpca em 314 e 355 nm referentes às transições -* dos grupos vanilóides e nenhuma banda n-* do vpca, enquanto que o complexo trinuclear apresenta uma única banda larga em 375 nm, referente à sobreposição das transições -* do vanilóide e n-* do grupo imina do vpca. A banda I.L. do vpca em 314 nm (complexo precursor) não é observada no composto polinuclear, provavelmente devido a sobreposições à banda intensa em 375 nm. Pode-se avaliar, então, que o complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] apresenta bandas intraligantes da phen e do vpca, cujos pequenos deslocamentos com relação ao complexo precursor são justificados pela coordenação do zinco(II). Nesse complexo não foram observadas as bandas d-d do cobre (II) devido à baixa solubilidade do composto em meio aquoso. No entanto, o complexo precursor apresenta duas bandas d-d em 446 e 600 nm, indicando a presença do cobre no composto sintetizado. Ao analisar os espectros dos complexos de zinco (Figura 81b), observa-se que as bandas intraligantes da fenantrolina não sofreram alterações significativas, no entanto, as 146 bandas intraligantes do vpca apresentaram algumas modificações, tais como, a banda em 261 nm, presente no complexo trinuclear, não é observada no complexo precursor, isso porque ela esta deslocada para maiores comprimentos de onda e, portanto, sobreposta à banda I.L. da phen. O complexo mononuclear apresenta ainda uma banda em 315 nm e um ombro pouco definido em 355 nm, referentes às transições intraligantes -* do vpca (grupos vanilóides), enquanto que o complexo com três centros metálicos apresenta apenas uma banda intensa em 350 nm referente a essas transições. Com relação às transições I.L. n-* do grupo imina, cujo átomo de nitrogênio está diretamente coordenado ao centro metálico no complexo polinuclear, há duas transições presentes no espectro, sendo uma com elevada permissividade, em 388 nm, e outra com menor intensidade em 479 nm, enquanto que no complexo precursor, há apenas uma transição de baixa intensidade em 398 nm. Tais modificações presentes nas bandas referentes ao ligante vpca, como deslocamentos, novas bandas e variações nas intensidades, ocorrem devido à coordenação dos átomos de nitrogênios do vpca ao centro metálico, cujo ligante irá agir como base de Lewis, doando densidade eletrônica ao zinco(II), que está deficiente em elétrons. A Figura 82 apresenta a sobreposição dos espectros do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] obtidos em água, metanol e acetonitrila, e do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] obtidos em água e metanol, de modo a realizar um comparativo entre as transições eletrônicas na presença de solventes com diferentes polaridades. Além da água e metanol, o complexo heteronuclear foi também analisado em acetonitrila, visto que nesse solvente as bandas intraligantes do vpca estão mais definidas para esse composto. 147 Figura 82 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos (a) [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] em meio aquoso (preto), metanol (vermelho) e acetonitrila (verde), e (b) [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho). (a) (b) Fonte: Autora (2018). Com relação às bandas intraligantes de natureza -* da fenantrolina, não foram observadas nenhuma alteração significativa com a mudança do solvente nos complexos, no entanto, no complexo heteronuclear, em metanol, observa-se uma banda em 265 nm referente à transição I.L do vpca, a qual não é bem definida em água por estar sobreposta à banda da fenantrolina em 271 nm. O complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] em acetonitrila apresenta duas bandas em 346 e 390 nm referentes às transições intraligantes -* e n-* dos grupos vanilóide e imina, respectivamente, confirmando que ambas as transições estão presentes no complexo, porém, em meio aquoso e metanol elas se encontram sobrepostas, sendo observada uma única transição em 375 (água) e 389 nm (metanol). Tais deslocamentos observados indicam que essas transições do vpca têm maior influência sobre o meio em que a amostra está inserida, comparativamente às transições da phen. As bandas intraligantes -* do vpca no complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] em metanol apresentam algumas alterações, como o ombro em 262 nm, o qual se apresentou menos definido comparado ao espectro em meio aquoso, além da presença de uma nova banda em 310 nm, que não é visualizada em água devido a elevada intensidade da banda em 350 nm. O espectro em metanol apresentou ainda duas bandas em 398 e 459 nm, referente às 148 transições I.L. n-*, as quais são menos intensas e são observadas com pequenos deslocamentos, comparativamente ao espectro desse composto em água. Na Tabela 23 são apresentadas as transições verificadas nos espectros do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] obtidos em meio aquoso, metanol e acetonitrila, e do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] obtidos em água e metanol. Tabela 23– Dados comparativos entre as bandas de absorção do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2], utilizando água, metanol e acetonitrila como solventes, e do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], utilizando água e metanol como solventes. [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] Atribuições Água Metanol Acetonitrila Água Metanol I.L. phen e/ou vpca (π → π*) I.L. phen (π→π*) I.L. phen e/ou vpca (π → π*) I.L. phen (π→π*) I.L. vpca (π→π*) I.L. vpca (π→π* e/ou n → π*) I.L. vpca (n→π*) - 218 271 290 - 375 - - a 221 265 e 270 291 - 389 - - 224 272 285 - 346 e 390 - 200 225 261 e 269 291 - 350 e 388 479 - a 227 262 e 270 292 310 398 459 a região não verificada, pois metanol absorve nesta região. Fonte: Autora (2018). 5.5.3. Voltamogramas do ligante vpca e do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] Os voltamogramas cíclicos do ligante vpca e do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] nas regiões de -700 a 1100 e -700 a 300 mV, obtidos em eletrólito KCl, 0,1 mol L -1 e pH 7,0, com velocidade de varredura 100 mV s -1 , são apresentados na Figura 83. 149 Figura 83–Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vpca de -1000 a 1200 mV,e do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] de (b) -700 a 300 mV e (c) -700 a 1100 mV (a) (b) (c) Fonte: Autora (2018). O voltamograma do ligante vpca apresenta dois picos de oxidação em 420 e 679 mV (versus Ag/AgCl), os quais estão presentes no complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] em 448 e 770 mV (versus Ag/AgCl). Tais resultados indicam uma maior deficiência eletrônica do grupo vanilóide no ligante vpca quando coordenado aos metais (cobre e zinco). O voltamograma cíclico do [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] apresenta ainda um par redox do metal, com o pico catódico em -545 mV (versus Ag/AgCl), referente a redução do Cu 2+ a Cu 1+ , e o pico anódico em 148 mV (versus Ag/AgCl), referente ao processo de oxidação do Cu 1+ para Cu 2+ , gerando potencial de meia onda de -198,5 mV (versus Ag/AgCl). Os 150 processos de oxidação do ligante, bem como o par redox do metal reduzem significativamente suas correntes, à medida que novos ciclos são obtidos, exceto no voltamograma que varre apenas a região do metal (Figura 83b), cuja corrente não se altera para uma mesma velocidade de varredura. Para o complexo na janela de potencial de -700 a 300 mV, observa-se um pico catódico, em -518 mV (versus Ag/AgCl), referente à redução de Cu 2+ a Cu 1+ , bem como um processo anódico em 189 mV (versus Ag/AgCl), referente à oxidação do Cu 1+ a Cu 2+ , apresentando um potencial de meia onda de -164,5 mV (versus Ag/AgCl). O processo redox apresenta pequenos deslocamentos para maiores potenciais quando comparado ao voltamograma com varredura na região de -700 a 1100 mV, obtendo-se um perfil menos irreversível quando o ligante vpca não sofre oxidação. A variação de potencial (Epa-Epc) apresentada no voltamograma do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2], bem como a razão entre as correntes obtidas para cada processo, estão dispostas na Tabela 24. Tabela 24 – Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos de oxirredução do Cu2+/1+ e Cu 1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] Complexo Cu 2+/1+ e Cu 1+ /2+ Epc(mV) Epa(mV) ΔEp ipc (µA) ipa (µA) ipa/ipc [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] -518 189 707 1,5 4 2,7 Fonte: Autora (2018). A diferença de potencial de 707 mV para o complexo trinuclear, associado à razão de corrente de 2,7, sugerem um perfil pouco reversível para o processo redox do centro metálico, indicando a instabilidade do complexo frente à alteração no estado redox do metal. A Figura 84 apresenta a sobreposição dos voltamogramas do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] obtido em diferentes velocidades. 151 Figura 84 -Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] em diferentes velocidades de varredura, na região de -650 a 300 mV Fonte: Autora (2018). Os voltamogramas acima mostram que, à medida que a velocidade é reduzida, as correntes dos processos redox também diminuem e não há deslocamentos significativos de potenciais, indicando que a alteração estrutural do complexo com a variação do estado de oxidação do metal ocorre em um intervalo de tempo muito curto e, portanto, não é possível acompanhar tal alteração mesmo quando varia a velocidade de varredura. A Figura 85 apresenta o gráfico de corrente versus raiz quadrada da velocidade para os picos de redução, construído com o objetivo de verificar sua linearidade e, com isso, avaliar a reversibilidade do processo. Figura 85–Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente dos processos de redução do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] Fonte: Autora (2018). 152 O gráfico referente ao pico catódico apresenta R = 0,9479. Tal valor mostra linearidade significativa ao processo de redução, indicando que as correntes são proporcionais à raiz quadrada das velocidades. Esses resultados indicam que o complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2], mesmo apresentando um perfil com caráter irreversível, apresenta certa reversibilidade. 5.5.3.1.Comparativo entre os complexos [Cu(phen)(L)2], com L = van, vglu, vpca e vpcaZnCl2 Os ligantes vanilóides presentes nos complexos de cobre analisados nesse trabalho possuem potenciais de oxidação com variações significativas. A Tabela 25 apresenta os potenciais de oxidação dos ligantes vanilina, vglu, vpca com átomos de nitrogênio livres e vpca coordenado ao íon metálico de zinco (II), presentes nos complexos [Cu(phen)(van)2], [Cu(phen)(vglu)2], [Cu(phen)(vpca)2] e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2], respectivamente. Tabela 25 - Potenciais de oxidação dos ligantes vanilóides nos voltamogramas dos complexos [Cu(phen)(van)2], [Cu(phen)(vglu)2], [Cu(phen)(vpca)2] e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]. Complexos Eoxi (1) Eoxi (2) Eoxi (3) [Cu(phen)(van)2] [Cu(phen)(vglu)2] [Cu(phen)(vpca)2] [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] 516 518 357 448 610 - 544 - 760 853 792 770 Fonte: Autora (2018). Ao observar os processos de oxidação na tabela acima, verifica-se a presença de três picos de oxidação dos ligantes van e vpca nos complexos [Cu(phen)(van)2] e [Cu(phen)(vpca)2], enquanto que os demais compostos de coordenação apresentam apenas dois picos anódicos. O vglu apresenta maior potencial de oxidação, o que o classifica como um ligante pobre eletronicamente e, portanto, precisa ser aplicado maior potencial para perder elétrons. Com relação ao primeiro potencial anódico, verifica-se que o vpca apresenta menor potencial de oxidação quando seus átomos de nitrogênio estão livres, o que indica que esse possui maior densidade eletrônica do que quando coordenado ao íon metálico de zinco (II), tendo em vista que no ultimo caso a densidade eletrônica do ligante vpca será compartilhada com o centro metálico deficiente em elétrons. 153 A Figura 86 apresenta a sobreposição dos voltamogramas dos complexos [Cu(phen)(van)2], [Cu(phen)(vglu)2], [Cu(phen)(vpca)2] e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2], obtidos em KCl 0,1 mol L -1 , pH 7,0, com velocidade de varredura de 100 mV s -1 . Figura 86–Sobreposição dos voltamogramas cíclicos em KCl 0,1 mol L-1, pH 7,0, dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2], (b) [Cu(phen)(vglu)2], (c) [Cu(phen)(vpca)2] e (d) [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]. (d) (c) (b) (a) Fonte: Autora (2018). 154 Ao observar a sobreposição dos voltamogramas, verifica-se que todos os complexos possuem um par redox referente aos processos de oxirredução do cobre, cujos picos anódicos apresentam maiores correntes, em comparativo aos picos catódicos. Os complexos a-c apresentam perfis quase reversíveis, enquanto que o complexo d apresenta um perfil com maior caráter irreversível. Esse último voltamograma apresenta processo de redução com menor potencial, indicando que este centro metálico é mais rico eletronicamente do que os demais complexos e, portanto, precisa de maior quantidade de potencial para reduzir. O perfil do complexo d mostra maior instabilidade do composto com a alteração do estado de oxidação do centro metálico, enquanto os perfis dos demais complexos conferem maior estabilidade aos compostos frente aos processos redox do cobre. A Tabela 26 apresenta os potenciais de oxidação e redução do centro metálico de cobre para todos os complexos analisados, com o objetivo de realizar um comparativo entre eles. Tabela 26 - Potenciais de oxidação e redução dos voltamogramas dos complexos [Cu(phen)(van)2], [Cu(phen)(vglu)2], [Cu(phen)(vpca)2] e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]. Compostos Eoxi Ered E1/2 [Cu(phen)(van)2] [Cu(phen)(vglu)2] [Cu(phen)(vpca)2] [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] 49 97 -13 189 -141 -101 -174 -518 -46,0 -2,0 -93,5 -164,5 Fonte: Autora (2018). Ao analisar a tabela acima, verifica-se que os complexos com vglu e vanilina obtiveram maiores potenciais de redução, seguidos do complexo com vpca, e, por ultimo, o complexo com o vpca e zinco (II). Tais resultados mostram que o complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] possui maior dificuldade em sofrer redução, estando consequentemente mais rico eletronicamente, enquanto que o complexo [Cu(phen)(vglu)2] terá maior facilidade em reduzir, de maneira a precisar aplicar potencial menos negativo para que esse processo ocorra, indicando, portanto, uma condição onde o metal se encontra mais pobre eletronicamente. Dessa forma, verificam-se que todos os complexos apresentam processo redox referente ao centro metálico dentro da faixa tida como acessível no meio biológico e, à medida que se altera os ligantes vanilóides, observa-se alterações significativas nos potenciais redox do cobre, podendo facilmente ajustar o sistema às condições necessárias do meio. 155 5.5.4. Ressonância Magnética Nuclear de 1H do ligante 2-picolilamina e do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] O espectro de RMN 1 H do ligante 2-picolilamina, obtido em MeOD, sob temperatura de 303 K e frequência de 300 MHz, é apresentado na Figura 87. Faz-se necessária a análise dessa molécula tendo em vista sua importância no presente trabalho ao ser utilizada na síntese com a vanilina para formação da base de Schiff vpca. Figura 87–Espectro de RMN 1H para 2-picolilamina, obtido em MeOD, 300 MHz, na região de 3,2 a 8,9 ppm Fonte: Autora (2018). O espectro apresenta um sinal intenso com deslocamento químico em 3,9 ppm, referente ao próton HP5 presente no grupo CH2. Esse grupo possui maior efeito de desproteção devido à presença do nitrogênio vizinho, o qual retira densidade eletrônica do CH2, tornando- o mais disponível para interagir com o campo magnético externo. Na Figura 88 é apresentado o espectro de RMN 1 H da molécula 2-picolilamina, com ampliação da região de 4,5 a 8,75 ppm, a fim de melhor visualizar os demais sinais dos prótons presentes nesse composto orgânico. 156 Figura 88–Espectro de RMN 1H para 2-picolilamina, obtido em MeOD, 300 MHz na região de 4,5 a 8,75 ppm Fonte: Autora (2018). O espectro apresenta dois tripletos referentes aos prótons HP2 e HP3 em 7,3 e 7,8 ppm, respectivamente. O próton HP3 está mais desprotegido em comparativo ao outro tripleto, tendo em vista sua posição para com relação ao heteroátomo de nitrogênio. Essa posição é mais eletropositiva, tornando esse próton mais disponível para interagir com o campo magnético externo e, portanto, gerando maior deslocamento químico. Os sinais de dubletos referentes aos prótons HP4 e HP1 possuem deslocamentos químicos em 7,45 e 8,5 ppm, respectivamente. O próton HP1 está localizado na posição orto do anel e, portanto, possui maior desproteção, quando comparado ao próton HP4. Essa desproteção é ainda mais forte nesse caso, tendo em vista que o átomo eletronegativo de nitrogênio se encontra vizinho ao próton HP1. Dados da literatura reportam deslocamentos químicos de 8,64, 7,61, 8,10, 7,66 e 4,41 ppm, para os prótons HP1, HP2, HP3, HP4 e Hp5, respectivamente, em D2O, pH 2,75 (RAU; SHOUKRY e ELDIK, 1997), o que corroboram com os deslocamentos químicos apresentados nesse trabalho. A Tabela 27 apresenta os deslocamentos químicos dos prótons obtidos no espectro de RMN 1 H unidimensional para a molécula 2-picolilamina. 157 Tabela 27 – Dados de RMN 1H para o composto 2-picolilamina HP1 HP2 HP3 HP4 HP5 2-picolilamina 8,5 (d) 7,3 (t) 7,8 (t) 7,45 (d) 3,9 (t) tripleto; (d) dubleto. Fonte: Autora (2018). A Figura 89 apresenta o COSY da molécula 2-picolilamina, de forma a observar os possíveis acoplamentos apresentados pelos prótons desse composto. Figura 89– Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação homonuclear para a molécula 2- picolilamina, em MeOD, 300 MHz Fonte: Autora (2018). Ao observar o COSY da molécula orgânica, verifica-se que o próton HP1 realiza apenas um acoplamento com HP2, tendo em vista que o sinal do hidrogênio P1 se desloca para o seu único próton vizinho, P2. Além desse, o hidrogênio HP2 apresenta mais um acoplamento, realizado com o próton HP3, o qual também acopla com HP4. Dessa forma, tem-se um único acoplamento para os hidrogênios HP1 e HP4, justificando seus sinais dubletos, bem como dois acoplamentos para HP2 e HP3, os quais apresentam tripletos no espectro de RMN 1 H, confirmando as atribuições realizadas na análise unidimensional. 158 O espectro de RMN 1 H do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], obtido em MeOD, sob temperatura de 303 K e frequência de 300 MHHz, é apresentado na Figura 90. Figura 90–Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], obtido em MeOD, 300 MHz na região de 0 a 10,0 ppm Fonte: Autora (2018). O espectro do complexo trinuclear apresenta dois singletos em 3,86 e 4,25 ppm, característicos do próton 1V do CH3 de metoxila presente no grupo vanilóide, e do próton P5 do CH2 presente na molécula picolilamina, respectivamente. Ambos os prótons estão desprotegidos devido os átomos eletronegativos de oxigênio (vanilóide) e nitrogênio (picolilamina) se encontrarem vizinhos ao CH3 e CH2, retirando densidade eletrônica desses. A Figura 91 apresenta o espectro de RMN 1 H do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], com ampliação da região de 6,5 a 10,0 ppm, a fim de melhor visualizar os demais sinais dos prótons presentes no complexo. 159 Figura 91–Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], obtido em MeOD, 300 MHz na região de 6,5 a 10,0 ppm Fonte: Autora (2018). A região de menor deslocamento químico do espectro apresenta dois dubletos em 6,85 e 6,88 ppm e 7,42 e 7,45 ppm, referentes aos prótons H2V e H4V do vanilóide, respectivamente, cujos sinais acoplam entre si, por estarem vizinhos um ao outro. Além disso, o espectro apresenta um singleto em 7,40 ppm, referente ao próton H3V do vanilóide, o qual quase se sobrepõe ao dubleto do H4V. O espectro apresenta dois sinais próximos em 7,57 e 7,60 ppm, que correspondem a um tripleto com baixa resolução do próton HP2, bem como um tripleto em 8,05, 8,08 e 8,10 ppm, referente ao próton HP3. Observa-se um sinal em 8,62 ppm, característico de um dubleto pouco definido do próton HP1, além de um dubleto em 8,85 e 8,87 ppm, referente ao hidrogênio HP4. Esses prótons referentes à base de Schiff vpca sofrem algumas alterações quando comparados à molécula 2-picolilamina livre, como, por exemplo, o dubleto HP1, que diminui seu efeito de blindagem no complexo. Esse comportamento pode ser explicado pela coordenação do zinco metálico, tendo em vista que o metal age como ácido de Lewis e retira densidade eletrônica do nitrogênio e do hidrogênio vizinho, e este ultimo fica menos 160 protegido. Esse resultado indica a coordenação do zinco(II) ao átomo de nitrogênio do ligante vpca. Os sinais referentes à fenantrolina são muito fracos, devido à baixa solubilidade do composto no solvente de análise, juntamente com a baixa proporção estequiométrica desse ligante. Dessa forma, é possível observar apenas um sinal largo de baixa intensidade em 9,14 ppm, referente ao próton Ha da fenantrolina. Por fim, o espectro apresenta um sinal intenso em 9,65 ppm, referente a um singleto do próton H6V da base de Schiff vpca. No complexo [Zn(phen)(van)2], o hidrogênio do aldeído apresenta esse sinal em 9,40 ppm e, portanto, há uma variação de 25 ppm para maiores deslocamentos químicos com a substituição da carbonila pelo grupo imina. Os deslocamentos químicos dos prótons presentes no espectro de RMN 1 H do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] são apresentados na Tabela 28. Tabela 28 – Dados de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] H(a) H2V H3V H4V H6V HP1 HP2 HP3 HP4 (1) 9,14 (d) 6,88 (d) 6,85 7,40 7,45 (d) 7,42 9,65 8,62 (d) 7,60 (t) 7,57 8,10 (t) 8,08 8,05 8,87 (d) 8,85 (t) tripleto; (d) dubleto. Fonte: Autora (2018). A Figura 92 apresenta os acoplamentos presentes no complexo trinuclear, através da análise bidimensional, COSY, utilizando as mesmas condições de temperatura e frequência. 161 Figura 92– Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação homonuclear para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], em MeOD, 300 MHz Fonte: Autora (2018). Ao analisar o COSY, observa-se um acoplamento entre os prótons H4V e H2V, presentes no grupo vanilóide do vpca, o qual corrobora com as atribuições desses hidrogênios na análise unidimensional. O diagrama apresenta ainda acoplamentos importantes entre os prótons da picolilamina utilizada na formação da base de Schiff vpca, tais como, os hidrogênios HP4 e HP3, bem como os prótons HP3 e HP2, além dos prótons HP2 e HP1, os quais confirmam as atribuições dos sinais de hidrogênio realizadas para esse complexo, e indicam a presença do ligante vpca no complexo formado. 162 Conclusão 163 6. CONCLUSÃO Em conformidade com os objetivos estabelecidos no presente trabalho, pode-se considerar que os resultados obtidos foram satisfatórios, de forma que os complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] tiveram suas estruturas elucidadas pela difração de raios- X de monocristal, aliadas a técnicas espectroscópicas e eletroquímicas. A partir da difração de raios-X, foi possível verificar a formação de isômeros diferentes para os complexos de cobre e zinco com vanilina, os quais podem influenciar diretamente nas propriedades químicas desses sistemas, tais como reatividade, labilidade dos ligantes na esfera de coordenação e entre outros. Os complexos [M(phen)(van)2] apresentaram geometria com distorção tetragonal, tendo o complexo de cobre alongamento do eixo axial e o complexo de zinco compressão do eixo axial. É importante destacar que esse é o primeiro estudo realizado com relação aos isômeros presentes na literatura para complexos vanilóides. A partir desse estudo, é possível determinar o tipo de isômero a ser obtido em determinada síntese, de acordo com o sistema e a aplicação proposta. A geometria octaédrica distorcida para o complexo [Cu(phen)(van)2] também foi evidenciada no espectro de ressonância paramagnética de elétrons (EPR), obtido em solução congelada de dimetilformamida (DMF), o qual exibiu um perfil anisotrópico típico de complexos monoméricos de cobre(II) com simetria axial, cujos parâmetros geométricos de g// (2.30) > g (2.06) > 2.0023 indicaram que o cobre(II) possui um ambiente distorcido com alongamento do eixo axial. A partir do sistema [M(phen)(van)2], foi possível desenvolver novos derivados [M(phen)(vglu)2], CS-MPV, [M(phen)(vpca)2] e [M(phen)(vpcaZnCl2)2], com M = Cu 2+ e Zn 2+ , os quais foram caracterizados por técnicas espectroscópicas e eletroquímicas. Os espectros de IV para esses complexos indicaram a presença dos ligantes fenantrolina e vanilóides, através de estiramentos importantes como do anel aromático da phen e do νC=O para a vanilina e νC=N para as bases de Schiff formadas, além dos estiramentos O-CH3 presentes nos vanilóides. Os deslocamentos significativos entre os modos vibracionais nos espectros dos complexos são resultado das diferenças estruturais entre eles. Além disso, através do IV foi possível indicar a coordenação dos íons metálicos de zinco(II) nos complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], a partir das bandas referentes aos estiramentos C=N das bases de Schiff vpca, as quais apresentaram 164 deslocamentos significativos de 30 e 19 cm -1 , respectivamente, em comparativo aos seus precursores [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2]. Com base nos resultados de UV-Vis obtidos em meio aquoso, foi possível confirmar a presença do ligante fenantrolina nos sistemas [M(phen)(van)2], [M(phen)(vglu)2], [M(phen)(vpca)2] e [M(phen)(vpcaZnCl2)2], com M = Cu 2+ e Zn 2+ , através de bandas intensas de transições π → π* na região de 200 a 294 nm, características da phen, com deslocamentos pouco significativos. Essa técnica também teve grande importância para confirmar a presença dos vanilóides desprotonados através de duas transições π → π* na região de 300 a 350 nm, além da banda de baixa intensidade próxima a 400 nm, referente à transição n → π* do grupo imina, a qual indica a formação das bases de Schiff nos sistemas [M(phen)(vglu)2], [M(phen)(vpca)2] e [M(phen)(vpcaZnCl2)2]. Os complexos de cobre apresentaram mais de uma transição d-d, o que é mais um indicativo de que os compostos apresentam geometria octaédrica distorcida, sendo possível ocorrer até três transições entre os orbitais d. Através da voltametria cíclica realizada com os complexos de cobre(II), [Cu(phen)(van)2], [Cu(phen)(vglu)2], [Cu(phen)(vpca)2] e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2], foi possível identificar a presença de um par redox para cada centro metálico, referente aos processos Cu 2+/1+ com E1/2 = -46 mV (versus Ag/AgCl), -2 mV (versus Ag/AgCl), -93,5 mV (versus Ag/AgCl) e -164,5 mV (versus Ag/AgCl), respectivamente, os quais estão dentro da faixa descrita como acessível para sistemas biológicos, indicando, assim, que os complexos podem estar presente dentro da célula como complexos de cobre(I) e que podem gerar espécies reativas de oxigênio, como o radical hidroxila, o qual causa sérios danos ao DNA. Através da espectroscopia de RMN 1 H realizada para os complexos de zinco (II), [Zn(phenCl2], [Zn(phen)(van)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], foi possível identificar deslocamentos químicos e acoplamentos provenientes dos prótons da fenantrolina e dos grupos vanilóides, com características de desproteção de aldeído para a vanilina, e de desproteção do grupo imina para a base de Schiff vpca. Com relação ao complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], também foi possível indicar a presença do ligante precursor 2- picolilamina, utilizado na condensação com a vanilina para formação da base de Schiff vpca. Essa técnica teve, portanto, grande importância para a caracterização das estruturas desses novos compostos de zinco, os quais também podem auxiliar na caracterização dos complexos de cobre, mediante a semelhança estrutural entre esses sistemas. 165 Os ensaios biológicos realizados para o novo complexo [Cu(phen)(van)2] mostraram que este apresenta uma forte capacidade de clivagem do DNA apenas sob co-ativação dos agentes redox peróxido de hidrogênio e glutationa, indicando uma via de nuclease oxidativa. O aumento de ROS promove um grande desequilíbrio redox que leva a danos graves e morte celular. Os resultados obtidos para o [Cu(phen)(van)2] apresentaram IC50 baixo para três células cancerosas diferentes, significativamente menores do que as encontradas para CuCl2 ou os ligantes 1,10-fenantrolina e vanilina, individualmente. Com isso, cnclui-se que o complexo é um gerador ROS mais efetivo. Na verdade, [Cu(phen)(van)2] apresentou-se ainda melhor que a cisplatina, como mostrado por ensaios de citometria de fluxo contra a linha celular 786-0, onde 10 μmol L-1 (IC50) resultaram em 58,95% de células apoptóticas (Q2 e Q3) e 98,77% para 50 μmol L-1 (IC50), enquanto a cisplatina atingiu apenas 47,7% em doses ainda maiores. Com relação à forma de administração desses novos complexos sintetizados, os filmes de quitosana modificados CS-MPV se mostraram promissores para serem utilizados como sistemas transportadores de fármacos no organismo, seja como uso tópico durante um procedimento cirúrgico, ou aplicado sobre uma ferida, liberando o composto com ação cicatrizante. Através do UV-Vis e eletroquímica foi possível confirmar a liberação dos complexos [M(phen)(van)2] nos filmes CS-MPV, em meio aquoso, a qual foi reafirmada com os estudos in vivo realizados com os filmes poliméricos de zinco, que comprovaram a liberação controlada do complexo [Zn(phen)(van)2] em meio aquoso e o seu potencial efeito cicatrizante. A partir dos novos complexos desenvolvidos e estruturalmente caracterizados nesse trabalho e, com base nos resultados biológicos obtidos para o complexo de cobre com vanilina, é possível proceder a estudos biológicos com os novos complexos derivados de cobre(II) e zinco(II), visando obter resultados mais efetivos com relação a atividade antitumoral apresentada pelo complexo [Cu(phen)(van)2]. 166 REFERÊNCIAS ABDALLAH, S. M.; MOHAMED, G. G.; ZAYED, M. A.; EL-ELA, M. S. A. 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