ROBERTA BARROSO CAVALCANTE ALTERAÇÕES NOS GENES DA E-CADERINA E β-CATENINA EM ADENOMA PLEOMÓRFICO E CARCINOMA ADENÓIDE CÍSTICO: ESTUDO MOLECULAR E IMUNO-HISTOQUÍMICO. NATAL/RN 2008 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL CURSO DE DOUTORADO EM PATOLOGIA ORAL ALTERAÇÕES NOS GENES DA E-CADERINA E β-CATENINA EM ADENOMA PLEOMÓRFICO E CARCINOMA ADENÓIDE CÍSTICO: ESTUDO MOLECULAR E IMUNO-HISTOQUÍMICO. Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós- Graduação em Patologia Oral do Departamento de Odontologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Patologia Oral. Doutoranda: Roberta Barroso Cavalcante Orientadora: Profa. Dra. Lélia Batista de Souza NATAL - RN 2008   Ao meu filho Haroldo, por quem sempre esperei , mesmo sem que eu soubesse . . . Aos meus pais Geová e Maria Luiza, exemplo inalcançável de determinação, justiça e amor.                         A Deus, que mesmo sem que eu chame, se coloca claramente, agradeço a vida . Ao Haroldo, pelo carinho, paciência e compreensão . À minha família – meus pais e irmãs – Geórgia e Rachel, pelo apoio incondicional aos meus projetos e acolhimento em todos os momentos .     À minha Orientadora, Profa . Lé lia Batista de Souza, agradeço a confiança em mim depositada e o exemplo de competência e dedicação ao trabalho . À Profa . S ilvia Helena Rabenhorst , modelo de pesquisadora, agradeço a sua orientação incansável e precisa, o acolhimento caloroso em seu laboratório, e a paciência frente a minha ansiedade. Aos Professores da Patologia Oral, Dr . Leão Pereira P into, pelo exemplo de determinação e amor à Patologia Oral, Dra . Roseana de Almeida Frei tas por comparti lhar conosco não só seus conhecimentos científicos, mas sua grande sabedoria, Dra . Hébel Cavalcanti Galvão por nos mostrar que podemos ser seres humanos completos, Dr . Antônio de Lisboa Lopes Costa pelo exemplo de dinamismo e coragem, Dra . Lé l ia Maria Guedes Queiroz , pelo acolhimento e exemplo de humildade e por fim Profa . Márcia Cristina da Costa Miguel, minha “co-orientadora”, pela amizade, disponibilidade e frutíferas discussões . Ao Prof. Ângelo Giusepe Roncali de Oliveira, pela gentileza e atenção durante o delineamento estatístico . Aos meus irmãos da Patologia, Renato – o mais velho – que acredita em mim mais que eu mesma, e com quem sempre aprendo mais um pouco, e Karuza – a mais nova – exemplo de amizade e superação, pelo amor e presteza inigualável . A minha colega de turma Érica, a quem muito admiro, pelo seu coleguismo constante . Aos colegas da “minha” turma de mestrado, Danielle, Karuza, João, Cassiano e George pelo acolhimento tão confortante . A todos os colegas das várias turmas de doutorado Gustavo, Rosilene, Márcio, Márcia, R ivadávio, Sormani, S imone, Flávio, Manuel, Fernanda, Antonio Luis, Carmen, Marta, Janaína e C laudine que compartilhando aprendizado e experiências, certamente f icou um pouco de cada um em mim . Ao amigo Gustavo, pelo exemplo de alegria, disposição para a vida e generosidade . Ao amigo Cassiano, agradeço especialmente pela valiosa ajuda na análise estatística, mas também pelas conversas, projetos e sonhos científicos . Ao amigo Mário Henrique, modelo de jovem pesquisador, sempre disponível, atento e crí tico colaborador . À amiga e professora Eveline Turatti , pela a presença durante as minhas ausências . Aos colegas do Laboratório de Genét ica Molecular – LABGEM , em especial ao Germano, Analice e Valeska, sobretudo pelos ensinamentos, mas também pelo apoio constante e convivência muito alegre . Aos funcionários e técnicos da Patologia Oral Gracinha, Idelzuíte, Sandrinha, Hévio e Canindé , pela disponibilidade, colaboração e gentileza sempre presentes . À Universidade de Fortaleza – UNIFOR , em nome da Profa . Fátima Veras, pelo meu licenciamento temporário que possibili tou este curso . À Universidade Federal do R io Grande do Norte – UFRN , pelas condições oferecidas à realização do curso e pesquisa . Ao Conselho Nacional para o Desenvolvimento C ientífico e Tecnológico – CNPQ , pelo financiamento desta pesquisa .   RESUMO O adenoma pleomórfico e o carcinoma adenóide cístico representam neoplasias de glândula salivar benigna e maligna, respectivamente, que compartilham a mesma origem histológica, porém com comportamentos biológicos distintos. O propósito deste estudo consistiu na identificação do polimorfismo -160 C/A da região promotora do gene CDH1 (E-caderina), na triagem de mutações no gene CTNNB1 (β-catenina), e ainda na análise da expressão imuno- histoquímica das proteínas E-caderina e β-catenina em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos. Além disso, objetivou-se correlacionar os achados imuno-histoquímicos com as possíveis mutações e polimorfismo. Foram selecionados 24 casos de adenoma pleomórfico e 24 casos de carcinoma adenóide cístico. Para a identificação do polimorfismo no gene da E-caderina empregou-se a técnica RFLP (restriction fragment length polymorphism) utilizando-se enzimas de restrição HphI e AflIII. A triagem de mutações no exon 3 do gene da β-catenina foi realizada por meio de SSCP (single strand conformational polymorphism). Para a análise imuno-histoquímica, procedeu-se contagem de células, por meio do índice HScore e verificou-se presença ou ausência, intensidade, padrão de distribuição e localização celular e tecidual das proteínas. Os resultados demonstraram diferença estatisticamente significativa quando a marcação imuno-histoquímica, tanto da E-caderina quanto β-catenina, foi comparada entre as duas neoplasias estudadas, apresentando o adenoma pleomórfico expressão reduzida. Observou-se correlação estatisticamente significativa entre a imuno-marcação da E-caderina e β-catenina. Dois casos (1 adenoma pleomórfico e 1 carcinoma adenóide cístico) apresentaram polimorfismo heterozigótico no gene CDH1 e 13 casos (6 adenomas pleomórficos e 7 carcinomas adenóides císticos) exibiram variação no padrão de corrida eletroforética, sugerindo mutação do gene CTNNB1. Não houve correlação estatisticamente significativa entre a marcação imuno-histoquímica e presença de polimorfismo ou possíveis mutações. Conclui-se que a expressão imuno-histoquímica do complexo E-caderina/β-catenina pode estar relacionada com a quantidade e diferenciação do componente mioepitelial e não ao comportamento biológico dos tumores. Os casos que exibiram polimorfismo no gene da E-caderina apresentaram redução na expressão protéica e, por fim, as possíveis mutações no gene CTNNB1 parecem não influenciar na expressão da proteína β- catenina. Palavras-chave: Adenoma pleomórfico, carcinoma adenóide cístico, E-caderina, β-catenina, imuno-histoquímica, RFLP, SSCP.     LISTA DE ILUSTRAÇÕES Página QUADROS Quadro 1 - Especificação dos anticorpos utilizados, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação. 65 Quadro 2- Sítios de expressão celular das proteínas estudadas. 66 Quadro 3: Condições da PCR para o gene MTHFR (adaptação de Skibola et al, 1999). 68 Quadro 4 - Região de amplificação dos genes estudados, seqüência dos primers utilizados e tamanho dos fragmentos obtidos. 68 Quadro 5: Condições da PCR para o gene CDH1 (adaptação de Pookot et al, 2006) 70 Quadro 6: Condições da PCR para o gene CTNNB1 (adaptação de Takahara et al, 2004) 70 Quadro 7. Tipos de estromas observados nos adenomas pleomórficos. 76 TABELAS Tabela 1. Parâmetros utilizados no teste Qui-quadrado (Qui2) para avaliação da intensidade de imunoexpressão para E-caderina e ß-catenina em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. 78 Tabela 2. Parâmetros utilizados no teste Qui-quadrado (Qui2) para avaliação dos padrões de imunoexpressão para E-caderina e ß-catenina em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. 78 Tabela 3. Parâmetros utilizados no teste Qui-quadrado (Qui2) para avaliação da imunoexpressão de E-caderina, segundo localização celular, em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. 80 Tabela 4. Parâmetros utilizados no teste exato de Fisher para avaliação dos padrões de imunoexpressão para E-caderina segundo predominância histológica em adenomas pleomórficos. Natal, RN – 2008. 81 Tabela 5. Parâmetros utilizados no teste exato de Fisher para avaliação da intensidade de imunoexpressão para E-caderina segundo padrões histopatológicos de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. 82 Tabela 6. Parâmetros utilizados no teste exato de Fisher para avaliação dos padrões de imunoexpressão para E-caderina segundo subtipos histopatológicos de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. 83 Tabela 7. Parâmetros utilizados para o teste “t” de Student para avaliação dos H-Scores para E-caderina e ß-Catenina, de acordo com tipo de tumor. Natal – RN, 2008. 84 Tabela 8. Parâmetros utilizados no teste Qui-quadrado (Qui2) para avaliação da imunoexpressão de ß-catenina, segundo localização celular, em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. 85 Tabela 9. Parâmetros utilizados no teste exato de Fisher para avaliação dos padrões de imunoexpressão para ß-catenina, segundo padrões histopatológicos de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. 86 Tabela 10. Parâmetros utilizados no teste exato de Fisher para avaliação da intensidade de imunoexpressão para ß-catenina padrões histopatológicos de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. 86 Tabela 11. Parâmetros utilizados no cálculo do teste de Kruskal Wallis para avaliação dos H-Scores para E-caderina e β-catenina em relação aos padrões histopatológicos de carcinomas adenóides císticos. Natal – RN, 2008. 87 Tabela 12: Características de imuno-marcação da E-caderina nos casos com polimorfismo genético do gene CDH1. Natal – RN, 2008. 89 Tabela 13. Polimorfismo no gene CDH1, tamanho da amostra, média de HScore, desvio padrão, teste t e valor de p. Natal, RN – 2008. 89 Tabela 14. Sugestão de mutação do gene CTNNB1, tamanho da amostra, média, desvio padrão, teste t e valor de p. 90 FIGURAS Figura 1. Aspectos histomorfológicos do adenoma pleomórfico: a. cápsula circunscrevendo estroma condróide, entremeado por cordões epiteliais (H/E – 100x); b. infiltração da cápsula por células tumorais (H/E – 100x); c. células plasmocitóides arranjadas em lençóis (H/E – 400x). 91 Figura 2. Subtipos histológicos do carcinoma adenóide cístico. a. cribriforme; b. tubular; c. sólido (H/E – 100x). 92 Figura 3. Expressão imuno-histoquímica da E-caderina em adenoma pleomórfico: a. Forte imunoexpressão em membrana e citoplasma celular de ninhos, cordões e estruturas pseudo-císticas; b. positividade citoplasmática forte. Notar marcação predominante em células luminais de ductos e revestimento de estruturas pseudo-císticas; c. marcação forte predominantemente em membrana citoplasmática (H/E - 400x) 93 Figura 4. Expressão imuno-histoquímica da E-caderina em carcinoma adenóide cístico: a. positividade forte e difusa em membrana e citoplasma celular de estruturas tubulares; b. ausência de marcação no subtipo cribriforme; c. imunorreatividade forte em membrana e citoplasma (H/E-400x). 94 Figura 5. Expressão imuno-histoquímica da β-catenina em adenoma pleomórfico: a. positividade fraca e predominantemente citoplasmática para em ductos e cordões (400x); b. marcação fraca localizada em áreas de diferenciação escamosa (400x); c. Controle interno positivo. Forte imunorreatividade em glândula salivar normal adjacente ao tumor. Marcação fraca e focal no parênquima tumoral (100x). 95 Figura 6. Expressão imuno-histoquímica da β-catenina em carcinoma adenóide cístico: a. marcação forte e difusa localizada em membrana e citoplasma das células de estruturas tubulares ; b. forte imunorreatividade no subtipo sólido. Destaca-se marcação nuclear; c. positividade fraca citoplasmática e nuclear em células luminais (400x). 96 Figura 7. Gel de poliacrilamida a 6%, onde observa-se bandas de 190pb indicativas da amplificação de fragmentos do gene CDH1. 97 Figura 8. Gel de poliacrilamida a 6%, demonstrando RFLP para o polimorfismo -160 C/A do gene CDH1. Coluna a – 100pb; b e h – produto de PCR não digerido de 190pb; c e f – produto de PCR heterozigoto digerido pela enzima HphI; d e g – produto de PCR heterozigoto (polimórfico) digerido pela enzima AflII; e – produto de PCR homozigoto digerido pela enzima HphI (não polimórfico). 97 Figura 9. Gel de poliacrilamida a 6%, onde observa-se bandas de 230pb indicativas da amplificação de fragmentos do gene CTNNB1. 98 Figura 10. PCR-SSCP em gel de poliacrilamida a 12,5%. Variados padrões de migração são observados. A seta curta mostra o padrão considerado selvagem e as setas longas apontam padrões alterados, considerados sugestivos de mutação do exon 3 do gene CTNNB1. 98 Figura 11. Box-Plot relativo ao índice H-Score para E-caderina, de acordo com a predominância histológica em adenomas pleomórficos. Natal, RN – 2008. 99 Figura 12. Box-Plot relativo ao índice H-Score para E-caderina, de acordo com o padrão histopatológico de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. 99 Figura 13. Box-plot relativo ao índice H-Score para E-caderina, de acordo com tipo de lesão. Natal - RN, 2008. 100 Figura 14. Box-Plot relativo ao H-Score para β-catenina, de acordo com a predominância histológica em adenomas pleomórficos. Natal, RN – 2008. 100 Figura 15. Box-Plot relativo ao índice H-Score para β-catenina, de acordo com o padrão histopatológico de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. 101 Figura 16. Box-plot relativo ao índice H-Score para β-catenina, de acordo com tipo de lesão. Natal – RN, 2008. 101 Figura 17: Scatter-Plot evidenciando a correlação dos índices de H-Score da E- caderina e β-catenina (0,46). Natal, RN – 2008. 102    SUMÁRIO LISTA DE ILUSTRAÇÕES RESUMO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 21 2. REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................... 25 2.1. Adenoma Pleomórfico ........................................................................... 26 2.2. Carcinoma Adenóide Cístico ................................................................. 35 2.3. E-caderina e β-catenina ......................................................................... 42 2.4. E-caderina e β-catenina em tumores de glândula salivar ....................... 52 3. PROPOSIÇÃO .................................................................................................... 58 4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 60 4.1. Caracterização do estudo ....................................................................... 61 4.2. População ............................................................................................... 61 4.3. Amostra .................................................................................................. 61 4.4. Análise Morfológica .............................................................................. 62 4.5. Técnica imuno-histoquímica .................................................................. 64 4.6. Analise da expressão imuno-histoquímica ............................................. 65 4.7. Extração de DNA das amostras de tecido .............................................. 67 4.8. Avaliação da eficiência da extração do DNA por PCR ......................... 68 4.9. Amplificação dos fragmentos de DNA .................................................. 69 4.10. Detecção de polimorfismo do gene da E-caderina por PCR ................ 71 4.11. Triagem de mutações do gene da β-catenina por SSCP ...................... 72 4.12. Análise estatística ................................................................................. 73 4.13. Implicações éticas ................................................................................ 73 5. RESULTADOS .................................................................................................... 74 5.1. Resultados morfológicos ........................................................................ 76 5.2. Resultados imuno-histoquímicos ........................................................... 78 5.2.1. E-caderina ...................................................................................... 78 5.2.2. β-catenina ...................................................................................... 84 5.2.3. E-caderina/β-catenina .................................................................... 87 5.3. Resultados da identificação do polimorfismo da E-caderina ................. 88 5.4. Resultados da triagem de mutações do gene da β-catenina ................... 89 6. DISCUSSÃO ........................................................................................................ 103 7. CONCLUSÕES ................................................................................................... 125 SUMMARY REFERÊNCIAS ANEXOS                             1 . INTRODUÇÃO Os tumores das glândulas salivares, ainda que incomuns, compreendem uma área importante da patologia oral, visto que representam provavelmente as mais complexas das neoplasias humanas . Referidos tumores, na sua grande maioria, apresentam uma origem epitelial . Observa-se ampla variação histológica, o que dificulta sua classificação e diagnóstico . No conjunto das neoplasias benignas e malignas, o adenoma pleomórfico é o tumor de maior incidência, representando até 95% das neoplasias das glândulas salivares maiores e menores (ITO et al, 2005, AL- KHATEEB, ABABNEH , 2007, ANSARI, 2007) . Sua etiologia e patogênese ainda permanecem incertas . As análises citogenét icas têm reconhecido translocações cromossômicas recorrentes, com pontos de quebra nos 8q12, 3p21 e 12q13-15 correspondentes aos genes PLAG1 , β-catenina (CTNNB1) e HMGIC , respectivamente (EVESON et al, 2005, PASTORE , CARINCI, PELUCCHI, 2005, KANDASAMY et al, 2007) . É de se destacar o seu potencial de transformação maligna, podendo ocorrer em 10% a 13% dos casos (ELLIS , AUCLAIR , 1996) . O carcinoma adenóide cístico é um dos tumores malignos de glândula salivar mais comum (LIMA et al, 2005, AL-KHATEEB, ABABNEH , 2007, WANG et al, 2007), caracterizado por crescimento indolente, porém, persistente, ocasionando metástase à distância tardia . É importante salientar que o potencial de transformação maligna e a metástase tumoral estão intimamente relacionados com as propriedades adesivas das células neoplásicas . Dentre as moléculas de adesão implicadas na manutenção da integridade tecidual, estão as caderinas e cateninas . A perda da expressão da E-caderina em tecidos epiteliais é um dos primeiros eventos associados ao processo de transformação celular que ocorre na progressão tumoral . Considerando que o domínio intra-citoplasmático da E- caderina forma um complexo com as proteínas intracelulares com as cateninas, a perda da expressão da E-caderina resultará, além da perda de adesão intercelular, na liberação da β-catenina que poderá se acumular no citoplasma e, possivelmente, translocar-se ao núcleo, onde funcionaria como fator de transcrição (RAMBURAM , GOVENDER , 2002, TAKAHASHI- YANAGA , SASAGURI, 2007) . A expressão da E-caderina e da β-catenina, assim como as alterações em seus genes que justificam a expressão protéica aberrante, têm sido intensamente estudadas em diversos tipos de neoplasias humanas, com ênfase nos tumores gástricos, de mama, próstata, ti reóide e linfomas (PEINADO , PORTILLO , CANO , 2004, TAKAHARA et al , 2004, COW IN , ROWLANDS , HATSELL, 2005, POOKOT et al, 2006) . Nas referidas neoplasias, a alteração mais freqüentemente estudada no gene da β-catenina trata-se de mutação localizada no exon 3 (GARCIA-ROSTAN et al, 2001; CAO et al, 2004, TAKAHARA et al, 2004, KONOPKA et al , 2007) . O gene da E-caderina (CDH1) pode estar alterado, mais comumente, por meti lações ou polimorfismos na sua região promotora, ou ainda, por mutações em vários de seus exons (PARK et al , 2003, OLIVEIRA et al, 2004, KAMOTO et al, 2005, WANG et al, 2007) . Em tumores de glândula salivar, os estudos são escassos, incompletos e contraditórios (DAA et al, 2004, MARUYA et al, 2004, DAA et al, 2005, ZHOU , GAO , 2006, ZHANG et al , 2007) . Tendo em vista a melhor compreensão do comportamento biológico dos adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos de glândula salivar este estudo objetivou identif icar o polimorfismo -160 C /A no gene da E-caderina e possíveis mutações no exon 3 do gene da β-catenina, assim como correlacionar estas alterações entre si e com a expressão imuno-histoquímica das respectivas proteínas em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares humanas .      2 . REVISÃO DA LITERATURA 2 .1 . ADENOMA PLEOMÓRFICO O adenoma pleomórf ico, também tratado na literatura como tumor misto benigno, é a neoplasia mais comum de glândula salivar (DARDICK, 1996, ELLIS , AUCLAIR , 1996, EVESON et al , 2005, ITO et al, 2005, LIMA et al , 2005, P IRES et al , 2006, ANSARI, 2007), compreendendo 28% a 74% de todos estes tumores benignos e malignos, 30% das neoplasias em parótida e 33% de todas as neoplasias em glândulas salivares menores (ELLIS , AUCLAIR , 1996, PIRES et al, 2006) . Acomete, com maior freqüência, pacientes entre 30 e 50 anos de idade, sendo raro nas duas primeiras décadas e incide mais no gênero feminino numa razão de 2 :1 a 4:1 (SOUSA , ARAÚJO , 1994, ELLIS , AUCLAIR , 1996) . C linicamente, mostra-se como massa fi rme, indolor, de crescimento lento e móvel, com exceção do palato duro, onde a mucosa é bem aderida ao osso . Em geral, é recoberta por epitélio íntegro, a menos que haja traumatismo na região . Dificilmente atinge dimensões maiores que 5 cm, possuindo, em sua maioria, menos que 3 cm de diâmetro quando excisado (DARDICK, 1996, ELLIS , AUCLAIR , 1996, EVESON et al , 2005) . Sua etiologia e patogênese ainda permanecem incertas . Em mais de 70% dos casos existe associação com cariótipos anormais, envolvendo o 8q12, locus do gene PLAG1 (EVESON et al, 2005, KANDASAMY et al, 2007) . Inicialmente, estudo de Kools et al, em 1995, mapeou a região 12q13-15, em cultura de células de adenoma pleomórfico, através da técnica de FISH (fluorescence in si tu hibridization), onde foi identificada, como única anomalia citogenética, a região de quebra da translocação t(1;12)(p22;q15) . Mark et al (1997) confi rmaram anomalias na região cromossômica 12q 13-15 de adenomas pleomórficos e adicionalmente identificaram a translocação (3;8) (p21;q12) . Através da análise por Southern blot , Kas et al, em 1997, identificaram o gene PLAG1 (pleomorphic adenoma gene 1) . Segundo os autores, o PLAG1 identif ica-se como um gene constantemente rearranjado por translocações, envolvendo a região 8q12 em adenomas pleomórficos . A demonstração de rearranjos em determinada região do gene PLAG1 , sugere a possibilidade do PLAG1 fusionar-se ao gene posicionado no braço curto do cromossomo três no locus 21 (posição do CTNNB1) . A fusão ocorreria no exon 3 do PLAG1 , idêntico ao exon 1 do CTNNB1 , o gene da β-catenina . Queimado et al (1999), também, estudaram em culturas de cé lulas de adenomas pleomórf icos, de tumores malignos de glândula salivar e de glândula salivar normal, o gene PLAG1. Em glândulas salivares normais não se encontrou o gene PLAG1. Nas culturas de tumores benignos e malignos este gene, no entanto, foi expresso . Os autores sugerem que o gene PLAG1 não é exclusivamente expresso nos adenomas pleomórficos como previamente referenciado . Por isso, provavelmente, não é úti l como marcador para diferenciar tumores benignos e malignos de glândulas salivares . Porém, a ativação do PLAG1 parece ser um evento comum nos tumores benignos e malignos de glândula salivar, sugerindo que tenha papel importante na oncogênese destes tumores . Em 2004, Voz et al realizaram um estudo com o objetivo de identif icar possíveis genes que sofriam alterações por associação ao PLAG1 , seja por mutações ou translocações . Os autores testaram 1200 genes, utilizando dois espécimes de glândula salivar normal e dois adenomas pleomórficos . Dos genes avaliados, 627 apresentaram alguma alteração de expressão nos adenomas pleomórficos avaliados quando comparados com as glândulas salivares normais . Dos 627 genes, 373 apresentaram maior expressão nos dois adenomas pleomórficos e 254 apresentaram expressão reduz ida . C lassificando os genes conforme suas funções, os autores perceberam alterações em diversos aspectos f isiológicos nos adenomas pleomórficos, atribuindo tal observação às alterações de expressão dos genes para fatores de crescimento, fatores de transcrição, reguladores da apoptose, proteínas sinalizadoras e genes do ciclo celular . Outros genes alterados representam o grupo dos codificadores de proteínas da matriz extracelular e do citoesqueleto . Ainda de acordo com os autores, o PLAG1 também regula a angiogênese, sendo de fundamental importância seu papel na patogênese dos adenomas pleomórficos . Kandasamy et al (2007), em estudo com sete casos de adenomas pleomórficos, identificaram grande heterogeneidade de rearranjos do gene PLAG1 , incluindo instabilidades genômicas na forma de amplificação gênica e formação de anel . Histologicamente, o adenoma pleomórfico apresenta grande diversidade morfológica . Os componentes essenciais incluem as células epiteliais e mioepiteliais, os elementos estromais ou mesenquimais (EVESON et al, 2005), além da possível presença de uma cápsula f ibrosa que pode se apresentar incompleta ou, ainda, infi l t rada por células neoplásicas (STENNERT et al, 2001, ZBAREN , STAUFFER , 2007) . O componente epitelial pode formar ductos, pequenas ilhotas, lençóis sólidos, cordões anastomosados, ou ainda, sofrer diferenciação escamosa . As estruturas ductais exibem diâmetros variados e são constituídas por duas ou mais camadas de células . As células internas ou luminais são cubóides com citoplasma eosinofílico e núcleos centrais, ou colunares com núcleo na porção basal . As células externas às luminais são células mioepitel iais anguladas . Este arranjo lembra o ducto intercalar da glândula salivar normal . Porém, em contraste ao ducto intercalar normal, as células mioepiteliais nos adenomas pleomórficos formam espessos colares ao redor das estruturas ductiformes . Os lençóis possuem células poligonais ou hialinas . As poligonais exibem núcleos ovais, hipercormáticos, com contorno irregular ou núcleo oval de contorno regular e cromatina uniformemente distribuída . O citoplasma é escasso, eosinofílico ou claro de limites imprecisos . As células do tipo hialino possuem citoplasma amplo, eosinofílico e núcleo central ou deslocado para a periferia, conferindo o aspecto plasmocitóide . Os cordões e ninhos são constituídos por células poligonais (DARDICK, 1996, ELLIS , AUCLAIR , 1996, EVESON et al, 2005) . As células neoplásicas estão em meio a estromas variados, sendo estes fibroso, mixóide, condróide e hial ino . Diferenciação escamosa, óssea e até l ipomatosa podem ser observadas . P leomorfismo nuclear, mitoses e necrose não são comuns (SEIFERT , SOBIN , 1991, EVESON et al, 2005, IDE et al, 2007) . Dessa diversidade arquitetural e citomorfológica originou-se a sua denominação (SOUZA , ARAÚJO , 1994) . Os adenomas pleomórficos podem ser classif icados como mixóide, celular e clássico, onde o subtipo mixóide apresenta predominância de estroma, o subtipo clássico uma quantidade equilibrada de estroma e células e quando o tumor apresenta-se rico em cé lulas é classificado como celular (SEIFERT , SOBIN , 1991, ELLIS , AUCLAIR , 1996, STENNERT et al, 2001) . Segundo Souza, Araújo, 1994, existem diferenças entre o quadro histopatológico de tumores provenientes de glândulas salivares maiores e menores . Nos de glândulas salivares maiores, observam-se extensas áreas de estroma predominantemente do tipo mixocondróide e estruturas ducti formes em continuidade a pequenos cordões celulares, nos de glândulas menores, sua maior parte é formada por proliferação de células hialinas, com estruturas ductiformes e estroma geralmente do tipo hialino presente em meio a esses grupamentos celulares . Estudos ultraestruturais de adenomas pleomórficos revelaram que nas regiões altamente celularizadas destes tumores, os dois tipos celulares, ou seja, epitel iais luminais e mioepiteliais, são freqüentemente identificados e sua organização mimetiza àquela das unidades acinares e ductais das glândulas salivares normais . Apesar da ausência das características clássicas de células mioepiteliais, a distribuição e organização das células perifericamente orientadas e sua ligação com as células centrais ou luminais através de tonofilamentos associados a desmossomos sugerem tal designação . Os feixes ordenados de microfi lamentos característicos estão usualmente ausentes, mas a membrana plasmática associada a densidades focais l ineares, lâmina basal, desmossomos bem desenvolvidos e processos citoplasmáticos semelhantes a microvilos indicam tentativas de diferenciação e sugerem origem ectodérmica destas células (DARDICK et al, 1983 a, 1983b) . Dardick et al (1983a) demostraram que as zonas de matriz intercelular consistem de uma lâmina basal duplicada, f ibras semelhantes à reticulina, material elástico e depósitos focais de material granular amorfo em proporções variáveis, os quais formam espaços de forma e tamanho variáveis . Conforme haja o acúmulo de matriz extracelular, as células se separam, adquirindo novas características ultraestruturais como a perda gradual de tonofilamentos, a permanência da forma irregular, processos citoplasmáticos longos, microvilos ocasionais, e a formação de lâmina basal focal . A partir destes estudos ultraestuturais, Dardick et al (1983a, 1983b) desenvolveram um modelo explicativo para a histogênese deste tumor . Segundo este modelo, há uma proliferação das células mioepiteliais do ducto intercalar da glândula salivar normal, porém, inicialmente, mantendo a relação com as células luminais do ducto . As células mioepitel iais sofrem variados graus de modif icação e posterior separação resultante do acúmulo de produtos extracelulares . Durante o desenvolvimento das regiões mixóides, os espaços microcísticos aumentam e se expandem, resultando em maior separação e isolamento das células mioepiteliais modificadas . Savera, Gown, Zarbo (1997) classificaram as células mioepiteliais do adenoma pleomórfico do seguinte modo: i . células mioepitel iais-símile: cé lulas justa-tubulares, fusiformes e cuboidais; ii . células mioepitel iais modificadas : localizadas em estroma mixóide condróide e hialino; e, iii . cé lulas mioepiteliais transformadas: cé lulas de áreas epitelióides sólidas, escamosas ou cribiforme-basalóides . A análise imuno-histoquímica não é muito vantajosa no diagnóstico rotineiro do adenoma pleomórfico . Ela é útil na determinação da histogênese, especialmente no que se refere às células mioepiteliais . Marcadores mesenquimais, como a vimentina, S100, α actina de músculo liso (α-SMA), cadeia de miosina pesada de músculo liso (SMMH), actina músculo especifica (HHF-35), H-caldesmon e calponina marcam com intensidades distintas as cé lulas mioepiteliais (SAVERA , GOWN , ZARBO , 1997, ARAÚJO et al, 2000, FURUSE et al , 2005), assim como em células mioepitel iais de glândula salivar normal (FOSCHINI et al , 2000, MARTINS et al , 2002, MIGUEL et al, 2002, OGAWA et al , 2003) . A α actina de músculo liso (α-SMA), cadeia pesada de miosina de músculo liso (SMMH) e calponina foram empregadas em adenomas pleomórficos com o objetivo de marcar seletivamente células mioepiteliais e analisar a sua importância na morfologia desta neoplasia . Observou-se que nem todas as células mioepiteliais neoplásicas eram positivas para α-SMA e SMMH . A calponina, todavia, foi expressa na maioria das células mioepiteliais bem diferenciadas e em parte das células menos diferenciadas, como por exemplo, cé lulas plasmocitóides, células metaplásicas escamosas, indicando sua origem mioepitelial (SAVERA , GOWN , ZARBO , 1997) . Em 1990, Araújo, Araújo apontaram ser a vimentina uma das primeiras proteínas encontradas na diferenciação de células mioepitel iais neoplásicas, incluindo adenomas pleomórficos . A eficiência da vimentina como marcador de células mioepitel iais neoplásicas foi confi rmada por Araújo, Carvalho e Araújo (1994) em um estudo que utilizou 24 tumores de glândula salivar, incluindo 7 adenomas pleomórficos, e comparou a imuno-expressão da vimentina e o HHF-35 . Os autores sugerem que a actina é , pelo menos em parte, substituída pela vimentina em células mioepiteliais tumorais . Araújo et al (2000) demonstraram em seus estudos : a) marcação positiva para vimentina em células não luminais de estruturas ductais e cé lulas plasmocitóides e fusiformes de ninhos e cordões; b) variada positividade para actina músculo-especif ica (HHF-35) para células não luminais e fusiformes dos adenomas pleomórficos; c) rara marcação da citoqueratina (CK) 14 nas células luminais; e, d) expressão das CKs 7, 8 e 19 nas células luminais das formações tubulares e estruturas ductais, exibindo o mesmo imunoperfil das células luminais dos ductos intercalares da glândula salivar normal . Do mesmo modo, estudando marcadores para cé lulas mioepitel iais, Furuse et al , 2005, encontraram marcação positiva nas células não luminais de adenomas pleomórficos, para a calponina e vimentina. A α-SMA foi similar a calponina, exceto nas células poligonais e plasmocitóides, onde não se observou marcação . O S-100 foi posit ivo tanto nas células não luminais quanto luminais dos adenomas pleomórficos e o h-caldesmon foi negativo . Quanto à terapêutica, a excisão cirúrgica é o tratamento eletivo e é quase sempre curativo, tendo em conseqüência, prognóstico excelente . Os tumores de parótida, na sua grande maioria, são tratados pela parotidectomia superficial ou total com preservação do nervo facial . Com esse tratamento as recorrências são próximas de zero . Na submandibular, o tratamento é a remoção total da glândula, assim como nas glândulas salivares menores (DARDICK, 1996, ELLIS , AUCLAIR , 1996, EVESON et al , 2005) . O adenoma pleomórfico de glândula salivar é uma das poucas neoplasias benignas que pode sofrer transformação maligna, ocorrendo este fato em cerca de 10% a 13% dos casos . As variáveis clínicas que possuem correlação com aumento do risco de transformação maligna, incluem o local , idade do paciente e o tamanho e duração do tumor, sendo estes representados respectivamente pela glândula submandibular, pacientes idosos, e tumores com mais de 4,5 cm de diâmetro (ELLIS , AUCLAIR , 1996) . 2 .2 . CARCINOMA ADENÓIDE C ÍSTICO O carcinoma adenóide cístico, além da ocorrência em glândula salivar, pode acometer outras glândulas – mamária, lacrimal, ceruminosa do canal auditivo – além de seios nasais e paranasais, laringe, esôfago, cérvice uterino e próstata (ELLIS , AUCLAIR , 1996) . Ainda assim, constitui uma neoplasia de ocorrência relativamente rara, correspondendo a menos de 1% de todos os tumores malignos da região de cabeça e pescoço (DODD , SLEVIN , 2006), aproximadamente 4% a 14,5% dos tumores de glândulas salivares em geral (ELLIS , AUCLAIR , 1996, ITO et al, 2005, LIMA et al , 2005) e 6,4% dos tumores benignos e malignos de glândulas salivares menores (TOIDA et al, 2005, P IRES et al , 2006) . Considerando-se isoladamente as neoplasias malignas, tais números tornam-se mais expressivos, chegando o carcinoma adenóide cístico a compor 22% do total das lesões em glândulas salivares maiores (KOKEMUELLER et al, 2004) . Quando da análise exclusiva de glândulas salivares menores, relata- se uma incidência de 14,5% a 37% (EL-NAGGAR , HUVOS , 2005, TOIDA et al, 2005, PIRES et al , 2006) . A localização preferencial dos carcinomas adenóides císticos tem mostrado variação nos diferentes estudos . Maciejewski, Szymczyk, Wierzgon (2002), El-Naggar, Huvos (2005), Tincani et al (2006) observam uma tendência ao maior acometimento das glândulas salivares maiores (52,3% a 72%), principalmente, em parótida e submandibular, sendo raramente observado em localização sublingual . Kokemueller et al (2004) e Rapidis et al (2005) encontraram maior prevalência em glândula salivar menor . Entre as glândulas salivares menores intrabucais, o palato representa o sítio mais acometido (ITO et al , 2005, TOIDA et al, 2005, TINCANI et al, 2006) . A idade média de incidência do carcinoma adenóide císt ico acontece entre a quinta e sexta décadas de vida, sendo pouco freqüente em pacientes abaixo dos 18 anos de idade . Geralmente, observa-se predileção pelo sexo feminino (TINCANI et al, 2006), embora Kokemueller et al , 2004 não tenham observado predileção por nenhum dos dois gêneros . Não existem características clínicas específicas capazes de determinar o diagnóstico do carcinoma adenóide cístico . Os sinais e sintomas vão depender, entre outros fatores, de sua extensão e localização anatômica . Nas glândulas salivares maiores, desenvolve-se como um aumento de volume nas regiões parauricular ou submandibular . Desconforto, dor e, até mesmo, paralisia do nervo facial podem se apresentar ao longo do desenvolvimento da doença, estando provavelmente relacionados à ocorrência de infi l t ração perineural, um achado comum nesta neoplasia . Na região submandibular, a obstrução do fluxo salivar pode ser resultante da compressão e/ou invasão do ducto pela massa tumoral . Em glândulas salivares menores, a ulceração da mucosa que recobre a lesão é encontrada especialmente no palato (ELLIS , AUCLAIR , 1996) . Microscopicamente, as células tumorais que compõem esta neoplasia são de apenas dois tipos: luminais e mioepitel iais (EL-NAGGAR , HUVOS , 2005), sendo que estas células se arranjam em variados padrões morfológicos (DARDICK et al, 1996) . O subtipo morfológico clássico é o cribriforme (PEREZ-ORDONEZ, 2003) . Ele consiste de ilhotas de células epiteliais permeadas por numerosos espaços cilíndricos (com o aspecto de queijo suíço ou de peneira). A maioria deles é constituída por pseudocistos contendo em seu interior proteoglicanas e material semelhante à membrana basal . As células que envolvem os pseudocistos são células mioepiteliais de núcleo basofí lico ovóide e citoplasma escasso . Figuras de mitose são raramente observadas (J IA et al, 2004, EL-NAGGAR , HUVOS , 2005) . No que se refere ao padrão tubular, observam-se estruturas ductiformes envoltas por um estroma desmoplásico hialino . Os espaços tubulares são cercados por células do tipo luminal, que por sua vez são cercadas por uma ou mais camadas periféricas de células mioepiteliais (EL-NAGGAR , HUVOS , 2005) . Por último, o padrão sólido é constituído por agregados epiteliais de variados tamanhos, contendo poucas formações glandulares e freqüentemente necrose central . As células tumorais são pequenas, de morfologia variando de cuboidal a basalóide e com núcleo hipercromático denso . Geralmente, exibem pleomorfismo moderado a intenso e figuras de mitose são eventualmente observadas . De permeio, são encontradas estreitas áreas de estroma (J IA et al, 2004) . Por vezes, o estroma hialino eosinofí lico apresenta-se tão proeminente que as células tumorais aparecem como cordões delgados, o que tem sido denominado de padrão trabecular (ELLIS , AUCLAIR , 1996) . A presença simultânea de vários padrões morfológicos em um único tumor é um achado comum (EL-NAGGAR , HUVOS , 2005) e o padrão predominante deve prevalecer na determinação da sua classificação (DARDICK, 1996, ELLIS , AUCLAIR , 1996) . Em alguns casos, onde não existe a predominância de um subtipo histológico, outros tumores fazem diagnóstico diferencial com o carcinoma adenóide cístico, como o adenoma pleomórfico e o adenocarcinoma polimorfo de baixo grau (ELLIS , AUCLAIR , 1996, EL-NAGGAR , HUVOS , 2005) . Segundo Holst et al (1999) e Freier et al (2005), o receptor da tirosina quinase transmembranar (c-kit) pode auxiliar na elucidação deste diagnóstico, principalmente em relação ao adenocarcinoma polimorfo de baixo grau . Outros aspectos microscópicos bastante evidenciados na l iteratura são a ocorrência de infil tração perineural e o comprometimento de margens cirúrgicas . A inf ilt ração perineural é uma característica proeminente do carcinoma adenóide cístico, embora sua incidência apresente uma discrepância considerável nos diferentes estudos, sendo encontrada entre 32% e 72% dos casos (KHAN et al, 2001) . As implicações deste achado microscópico são ainda discutíveis . Apesar de opiniões contrárias (KHAN et al, 2001), a presença de infilt ração perineural, principalmente com o comprometimento de nervos principais, é considerada um possível fator de prognóstico desfavorável para o carcinoma adenóide cístico (LICITRA et al , 2003) . No passado, o comportamento do carcinoma adenóide cístico foi subestimado em decorrência da aparência microscópica indolente e dos bons resultados terapêuticos em curto prazo . No entanto, em longo prazo (10 a 15 anos) tem sido demonstrado um curso clínico desfavorável para estes tumores (KHAN et al , 2001) . Atualmente, existe um consenso de que se trata de um tumor maligno que, apesar de seu crescimento lento, resulta em destruição insidiosa dos tecidos que o circundam (BRADLEY , 2004, KOKEMUELLER et al, 2004, DODD , SLEVIN , 2006) . Entre as variáveis clínicas, o estadiamento é um fator de prognóstico determinante no controle ou cura dos mais variados tumores, o que se verifica no carcinoma adenóide cístico (KHAN et al, 2001) . Ao analisarem tumores T1 e T2 em comparação com tumores T3 e T4, Sur et al (1997) não encontraram diferença no prognóstico dos pacientes . O estadiamento N também não influenciou o curso da doença . Khan et al , 2001, observaram um melhor índice de sobrevida global em pacientes portadores de carcinoma adenóide cístico com estadiamento clínico I e II em comparação com estadiamento III e IV. Recorrências locais são geralmente relatadas entre 12% e 26% dos casos de carcinoma adenóide cístico (MACIEJEWSKI, SZYMCZYK, WIERZGON , 2002, RAPIDIS et al , 2005, TRIANTAFILLIDOU et al, 2006) . As metástases à distância ocorrem entre 25% e 50% dos casos relatados na literatura (HADDAD et al, 1995, KHAN et al, 2001, RAP IDIS et al , 2005) e o local preferencial é , sem dúvida, o pulmão (KHAN et al, 2001, MACIEJEWSKI, SZYMCZYK, WIERZGON , 2002) . Cérebro, ossos, fígado, rim e baço constituem os demais locais de ocorrência (HADDAD et al, 1995, KHAN et al, 2001) . Por outro lado, o índice de metástases em linfonodos é baixo no carcinoma adenóide cístico, sendo encontrado em apenas 6% a 10% dos pacientes (KHAN et al, 2001, TR IANTAFILLIDOU et al, 2006) . Apesar de suas múltiplas recorrências, a sobrevida longa não é um fato incomum (BRADLEY , 2004) . De acordo com Khan et al (2001), a sobrevida média dos pacientes após a ocorrência de metástases no pulmão variou de 4,9 anos (para pacientes com recorrência local simultânea) a 6,8 anos (excluindo- se os casos com recorrência local) . Spiro (1997) observou que 10% dos pacientes com metástase à distância sobreviveram de 10 a 16 anos após a detecção inicial . Contudo, ressalta que o surgimento dos primeiros sintomas no pulmão e a disseminação da doença para vísceras resultam em um curso cl ínico desfavorável , levando a óbito em um período que raramente ultrapassa 1 ou 2 anos após estes eventos . Portanto, o longo período de latência para alguns dos carcinomas adenóides císticos sugere que o seguimento clínico de 5 anos é insuficiente, fazendo-se necessário um controle regular dos pacientes por pelo menos 10 anos (SPIRO , 1997, MACIEJEWSKI, SZYMCZYK, WIERZGON , 2002) . O comprometimento de margens cirúrgicas é altamente variável dependendo da casuística analisada, podendo ocorrer em 29% a 77% dos casos (KHAN et al , 2001) e constitui outro foco de controvérsia . Enquanto Khan et al (2001) não observaram nenhuma influência respectivamente no controle local e sobrevida global dos pacientes, Triantafillidou et al , 2006, observaram que a presença de margens positivas resultava em uma pior sobrevida . Existem estudos correlacionando o padrão morfológico com o prognóstico dos pacientes . O subtipo sólido do carcinoma adenóide císt ico tem mostrado um prognóstico pior que o tipo cribiforme e o tubular (KHAN et al, 2001, KOKEMUELLER et al, 2004, CRUZ-PEREZ et al , 2006) . Já, Khan et al (2001) atribuíram graus microscópicos aos carcinomas adenóides císticos, os quais foram determinados pela ausência ou presença do componente sólido e pela sua porcentagem no tumor . Quanto maior o grau histológico, pior a evolução em termos de metástases e sobrevida global . Além disso, alguns pesquisadores destacam que o padrão tubular representa a forma mais diferenciada do carcinoma adenóide cístico, tendo o prognóstico mais favorável (YASUMATSU et al, 2004) . Contudo, o motivo da existência destas diferenças no prognóstico e atividade proliferativa entre os diferentes subtipos histológicos do carcinoma adenóide císt ico não foi ainda esclarecido (EL-NAGGAR , HUVOS , 2005) . Quanto ao tratamento, as principais opções para o carcinoma adenóide cístico se resumem em cirurgia ampla, com ou sem esvaz iamento cervical, seguida ou não de radioterapia MACIEJEWSKI, SZYMCZYK, WIERZGON , 2002, RAP IDIS et al, 2005, TRIANTAFILLIDOU et al, 2006) . A quimioterapia e as terapias moleculares apresentam baixos índices de sucesso (DODD , SLEVIN , 2006) . 2 .3 . E-CADER INA E β-CATENINA A capacidade de invasão das neoplasias para os tecidos adjacentes e disseminação para órgãos distantes, em parte, é atribuída à diminuição da expressão das moléculas de adesão, o que facilita o desprendimento das cé lulas e seu conseqüente deslocamento . Entretanto, outras funções têm sido imputadas a estas moléculas, incluindo regulação da proliferação, diferenciação e apoptose celular (BEAVON , 2000, WIJNHOVEN , DINJENS , PIGNATELLI, 2000, PEINADO , PORTILLO , CANO , 2004) . Nos últimos anos, algumas moléculas de adesão celular, bioquímica e geneticamente distintas, foram descri tas . Dentre as quais, destacam-se as integrinas, a superfamília das imunoglobulinas, as selectinas, as caderinas e o determinante celular CD44 . É sugerido que, possivelmente, todas as moléculas de adesão contribuem, em maior ou menor proporção, para o controle do comportamento das células neoplásicas ou com o direcionamento da resposta imune antitumoral (BEAVON , 2000, MOON et al , 2004, TAKAHASHI-YANAGA , SASAGUR I, 2007) . A superfamília das imunoglobulinas compreende moléculas que são independentes do cálcio cujos domínios estão relacionados às imunoglobulinas . As integrinas são proteínas heterodiméricas, originalmente conhecidas como receptores para moléculas da matriz extracelular . Também, são mediadoras da adesão célula-célula por se ligarem através de ligações heterotípicas a membros da superfamília das imunoglobulinas . As selectinas são moléculas de adesão representadas por L- , E- , e P-selectina . A lém do que, comportam-se como mediadoras das l igações dos leucócitos às células endoteliais, dos linfócitos nos linfonodos e auxiliam no extravasamento dos leucócitos granulócitos nos tecidos inflamados . As referidas selectinas se ligam a grupos carboidratos específicos através dos domínios de lectina (PETRUZELLI et al, 1999) . O termo CD44 define um grupo de proteínas da superfície celular com diferentes pesos moleculares que variam de 85 a 160 kDa . A proteína de 90 kDa é a forma predominante nos leucócitos enquanto as isoformas maiores (de 150 a 160 kDa) são encontradas em células epiteliais e mesenquimais atuando como um receptor para o ácido hialurônico na matriz extracelular (BÁNKFALVI et al, 1999) . As caderinas representam uma família de moléculas de adesão celular transmembranares, dependentes do cálcio, que se ligam através de ligações homofí l icas . São importantes não apenas no estabelecimento e manutenção das uniões intercelulares, mas também na determinação da especificidade adesiva das células . Geralmente, células com poucas moléculas de caderina apresentam menor adesividade . Sendo, também, essenciais no desenvolvimento da polaridade celular e no estabelecimento da morfologia tecidual . O cálcio é essencial para a função adesiva das caderinas e na proteção contra a digestão pelas proteases (WHEELOCK, JOHNSON , 2003) . A denominação “caderina” foi sugerida inicialmente por Takeichi em 1984, para caracterizar um “sistema de adesão celular dependente do cálcio” (WHEELOCK, JOHNSON , 2003) . As caderinas são divididas em subclasses de acordo com sua distribuição tecidual . A nomenclatura deriva-se do tecido no qual estas glicoproteínas foram inicialmente identificadas . A caderina epitelial (E-caderina), também conhecida como uvomorulina, molécula de adesão celular 120/80 (CAM 120/80), ou Arc-1 (em cães), é encontrada em cé lulas epiteliais de indivíduos adultos . A caderina neural (N-caderina), também chamada A-CAM ou N-cal-CAM , foi inicialmente identificada em tecidos neurais e musculares adultos . A caderina placentária (P-caderina) foi encontrada inicialmente em placenta e no epitélio, embora possa ser expressa em outros tecidos durante o desenvolvimento . Além destas três principais subclasses, existem também a B-caderina (encontrada no cérebro) e a L-CAM (caderina do f ígado de galinha) (W IJNHOVEN , DINJENS , PIGNATELLI, 2000) . Em adultos, quase todos os tipos de epité lio expressam E-caderina e P- caderina . A E-caderina geralmente está uniformemente distribuída em todas as camadas do epité l io, com exceção da camada mais superficial , enquanto que a P-caderina está concentrada mais intensamente na camada basal (WHEELOCK, JOHNSON , 2003) . Em glândula mamária, verif ica-se que as cé lulas luminais expressam E-caderina (BÀNKVALVI et al , 1999) enquanto as células mioepiteliais basais expressam a P-caderina (LEBRET et al, 2006) . Também em glândula sudorípara, as células mioepiteliais não expressam E- caderina (SCHÖN et al, 1999) . Estas moléculas de adesão não estão aleatoriamente distribuídas sobre as superfícies celulares, mas apresentam uma tendência de localização nas junções especializadas denominadas junções aderentes, onde desempenham um papel fundamental no desenvolvimento destas estruturas (RAMBURAM , GOVENDER , 2002) . O gene que codifica a E-caderina humana é o CDH1 situado no braço longo do cromossomo 16 . A E-caderina possui um peso molecular de aproximadamente 120 kDa sendo composta por três domínios, um citoplasmático, um transmembranar e um extracelular, que consiste de cinco subdomínios numerados (C1-C5), onde C1 representa o mais distante da membrana celular . O subdomínio C1 contém três aminoácidos dispostos em uma seqüência: histidina, alanina-valina (HAV) sendo essencial para o processo de adesão cé lula-célula (BEAVON , 2000, HAJRA , FEARON et al, 2002) . No que se refere ao domínio extracelular da E-caderina, este liga-se, através de ligações homofílicas dependentes de cálcio, ao domínio extracelular de uma molécula de E-caderina de uma célula viz inha, assumindo uma conformação de um “z íper molecular” (BEAVON , 2000; WIJNHOVEN , DINJENS , P IGNATELLI , 2000) . O domínio citoplasmático da E-caderina está ligado à actina do citoesqueleto através de interações heterotípicas com as moléculas denominadas cateninas . Estas proteínas foram identificadas por Ozawa, Baribault, Kemler, em 1989, que sugeriram os termos α, β e γ catenina para designar as moléculas de 102, 88 e 80 kDa, respectivamente . Este termo deriva-se do lat im catena (ou cadeia) e está relacionado à principal função das cateninas, que consiste na ligação das moléculas de adesão dependentes do cálcio ao citoesqueleto . A β-catenina e a γ-catenina se ligam ao domínio citoplasmático da E- caderina, enquanto a α-catenina une a β-catenina ou a γ-catenina a rede de microfilamentos de actina do citoesqueleto . Desta forma, numa mesma célula existem dois complexos distintos de E-caderina/catenina, um sendo composto por E-caderina, β-catenina e α-catenina e o outro representado pela E- caderina, γ-catenina e α-catenina (BEAVON , 2000, WIJNHOVEN , DINJENS , PIGNATELLI, 2000) . Norris et al, em 1996, caracterizaram o gene da β-catenina (CTNNB1) , sendo localizado na posição 3p21 . Compõe-se de 12 introns separando 13 exons . Os autores sequenciaram 10 dos 12 introns, pois acreditam que os demais são extremamente extensos, dificultando sua amplificação pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) . Além da participação da β-catenina na adesão celular, por meio de sua ligação com a E-caderina, há também um papel na sinalização celular . A β- catenina é um elemento importante na via de sinalização Wnt (wingless). Na ausência de sinais mitóticos externos a β-catenina é seqüestrada em um complexo com o produto do gene APC possibil itando a sua fosforilação e degradação da β-catenina livre. Normalmente, a quantidade de β-catenina livre no citoplasma é pequena . A elevação no teor de β-catenina livre é o resultado da inativação do sistema APC ou ativação da via WNT-1 (WIJNHOVEN , DINJENS , PIGNATELLI , 2000) . A maioria das mutações do gene APC resulta em uma proteína truncada que continua com a capacidade de formar complexos, mas não degrada a β-catenina . O resultado do aumento da β-catenina livre no citoplasma é sua translocação para o núcleo se ligando a fatores de transcrição que levam a ativação inapropriada da expressão gênica (MOON et al, 2004, IWAI et al, 2005, GAO et al , 2005, SCULLY et al, 2005) . Alterações na expressão da E-caderina podem ocorrer tanto em processos fisiológicos como em patológicos . Dentre os fisiológicos, destaca- se a reação das células epiteliais na cicatrização das feridas . O fechamento da ferida numa camada epitelial requer não apenas uma redução da adesão celular, mas também uma estimulação da motilidade celular . As alterações apresentadas pelas células epitel iais são induz idas pela l iberação de citocinas e outras substâncias ativas após a lesão tecidual . De particular importância é o papel exercido pelo fator de crescimento epidérmico (EGF) e sua interação com seu receptor (EGFR) . Assim que o defeito tenha se fechado, a adesão celular é regulada permitindo que o epitélio retorne à sua resistência inicial (BEAVON , 2000) . Desde que o complexo E-caderina/catenina é um requisito fundamental para a manutenção da adesão intercelular normal, em carcinomas, a E- caderina atua como uma molécula supressora da invasão e sua perda permite ou aumenta o risco de invasão nos tecidos normais subjacentes . De modo geral, a imunomarcação da E-caderina e das cateninas é mais intensa nos tumores bem diferenciados, que mantêm sua adesividade celular e são menos invasivos, mas é reduz ida em tumores pouco diferenciados que perderam a adesão célula-célula e mostram comportamento fortemente invasivo . As alterações na expressão da E-caderina podem, conseqüentemente, ser um importante passo no desenvolvimento e progressão de um tumor maligno (WIJNHOVEN , DINJENS , PIGNATELLI , 2000, MENKE , et al, 2001, BÀNKFALVI et al , 2002) . Em glândula mamária, a expressão da E-caderina e β-catenina foi averiguada por Bànkfalvi et al (1999) utilizando tecido normal, lesões benignas e carcinomas in situ e invasivo . Estas proteínas foram fortemente expressas em cé lulas luminais e basais de tecido glandular normal, lesões benignas proliferativas e neoplásicas benignas . De modo contrário, foi detectada ausência de Ecaderina/β-catenina em carcinoma in situ e carcinoma invasivo lobular . Os autores concluíram que alterações na expressão deste complexo protéico estão envolvidas com fases precoces da carcinogênese mamária . Divergindo destes autores, Tan et al (1999) correlacionaram forte marcação imuno-histoquímica da E-caderina com maior tamanho do tumor, metástase nodal e menor sobrevida em pacientes com carcinoma de mama . Estes autores ressaltam que a forte expressão de E-caderina é fator preditivo de menor sobrevida desta neoplasia. Moon et al (2006) avaliaram o complexo E-caderina/β-catenina, por meio de imuno-histoquímica, em carcinomas de células em anel de sinete pulmonar, gástrico e colo-retal, além de adenocarcinoma pulmonar convencional . Houve redução signif icativa da expressão deste complexo protéico em todos os tumores com exceção ao carcinoma de células em anel de sinete localizado em pulmão . Estes resultados sugerem que o papel biológico da E-caderina e β-catenina em carcinoma de células em anel de sinete pulmonares pode diferir dos tumores em outras localizações . A correlação das al terações genéticas e epigenéticas do gene da E- caderina com os carcinomas gástricos está bem estabelecida, encontrando-se uma redução da expressão protéica variando entre 17% a 92% . Mutações germinativas do CDH1 são encontradas nos carcinomas gástricos familiares (OLIVEIRA et al , 2004, 2005) e mutações somáticas em mais de 50% dos carcinomas gástricos do tipo difuso (LIU et al , 2006) . Além disso, o gene CDH1 pode ser inativado por metilação na seqüência citosina-guanina (CpG) da sua região promotora (LIU et al, 2005) . Também, tem sido bem documentada a associação da perda ou sub- regulação da E-caderina com a progressão do câncer de mama esporádico . A expressão da E-caderina é irreversivelmente perdida em mais de 85% dos carcinomas lobulares invasivos . Isto resulta da perda da heteroz igose (LOH) no 16q22 .1, envolvendo o gene da E-caderina - CDH1 (>50% dos casos), freqüentemente em combinação com mutação ou silenciamento epigenético do alelo CDH1 remanescente (COW IN , ROWLANDS , HATSELL, 2005) . Salahshor et al (2001) analisaram a freqüência de alterações no gene da E-caderina em cânceres familiares e detectaram que mutações nesse gene não é fator de risco para desenvolvimento do câncer de mama, porém, sugerem que mutações somáticas no gene E-caderina têm impacto na divergência fenotípica da lesão, bem como no prognóstico desta neoplasia . Ainda em carcinoma de mama, Caldeira et al (2006) encontraram alta freqüência de metilação no gene CDH1 em 72% dos 79 casos de carcinomas de mama primários estudados e esta al teração foi associada, por vezes, com a redução da expressão não só da proteína E-caderina como também do receptor de estrogênio (ER) e progesterona (PgR) . Em carcinoma de tireóide também tem sido observada metilação na região promotora do gene da E-caderina . Smith et al (2007) sugerem que a identif icação de metilação deste gene pode ser útil na determinação do prognóstico do paciente . Em câncer de próstata, não foi verificada hipermetilação em nenhum dos tumores estudados, assim como não existe diferença na freqüência de meti lação nestes tumores entre a raça negra e branca (WOODSON et al, 2003) . Polimorfismo na região promotora do gene da E-caderina (substituição de C por A na posição -160) representa um fator de risco para diversos tipos de cânceres (WANG et al, 2007) . Vários estudos têm evidenciado que homens portadores do alelo A e genótipo AA apresentaram risco relativo aumentado (variando 1,88 a 9,03) para desenvolvimento de câncer de próstata (VERHAHGE et al , 2002, POOKOT et al , 2006, GOTO et al , 2007, WANG et al, 2007) . Kamoto et al (2005), estudando uma população japonesa, verif icaram, além do aumento do risco da doença, correlação com a progressão tumoral . Este risco aumentado também pode ser observado em câncer renal (KIEMENEY et al, 2006) . Em carcinoma hepatocelular, não foi verif icada associação entre o polimorfismo -160 C→A no gene da E-caderina e maior risco de recorrência tumoral . Do mesmo modo não houve correlação deste polimorfismo com outros parâmetros cl ínico-patológicos como sexo, idade, trombo tumoral em veia porta, nível pré-operatório da alfa feto-proteína, tamanho do tumor e gradação histopatológica (LI et al , 2007) . Shan et al (2007), estudando 152 mulheres portadoras de endometriose, observaram não haver aumento do risco relativo para o desenvolvimento da doença em indivíduos portadores do polimorfismo -160 C→A na região promotora do gene da E-caderina . Este polimorfismo de único nucleotídeo (SNP- single nucleotide polymorphism) localizado na posição -160 da região promotora do gene da E- caderina havia sido identificado por Li et al (2000) . Os autores afi rmaram que o polimorfismo referido influencia na regulação transcricional por alterar a capacidade de ligação a fatores de transcrição, gerando uma atividade 68% menor . A relação entre a imunoreatividade nuclear aberrante e mutações do exon 3 do gene da β-catenina – CTNNB1 – foi verificada por Garcia-Rostan et al (2001) em neoplasias de tireóide . Por meio de SSCP (single strand con formational polymorphism) seguido de seqüenciamento ficou demonstrado que as mutações estão associadas a menor diferenciação do tumor. Park et al (2005), analisando carcinomas hepatocelulares, verificaram mutação do gene da β-catenina em 16% dos tumores, além disso observaram imuno-marcação nuclear da proteína em 30 dos 81 casos estudados . Em casos de linfoma de células T/NK também foram observadas mutações do exon 3 do gene CTNNB1. O i to mutações foram detectadas em 5 (16%) dos tumores e dois destes apresentavam múltiplas mutações (TAKAHARA et al, 2004) . Ainda em linfoma de células T/NK, HONGYO et al (2005) estudaram estes tumores em pacientes japoneses e coreanos, veri f icando maior incidência de mutações no gene da β-catenina nos casos japoneses, além de mutações em diferentes exons no gene P53 . Konopka et al (2007) demonstraram, por meio de SSCP e seqüenciamento, mutações do exon 3 do gene CTNNB1 em 16,1% dos carcinomas endometriais estudados . Os autores ressaltam que estas mutações foram acompanhadas pela mutação do gene PTEN e sugerem que, em carcinomas endometriais, vários mecanismos moleculares devem influenciar no desenvolvimento destes tumores . 2 .4 . E-CADERINA E β-CATENINA EM TUMORES DE GLÂNDULA SALIVAR Em tumores de glândula salivar a expressão da β-catenina e da E- caderina vem sendo pesquisada, por meio de estudos imuno-histoquímicos, sendo escassas as investigações das al terações gênicas . Franchi et al (1999) verificaram a associação da ausência ou o decréscimo na expressão da E-caderina com o aumento das dimensões do carcinoma adenóide cístico, presença de metástases à distância e estados mais avançados desta neoplasia . Pacientes com tumores exibindo ausência ou baixa expressão apresentaram sobrevida l ivre de doença significativamente mais curta, assim como a sobrevida global . A expressão da E-caderina, portanto, se mostrou como um signif icativo indicador de sobrevida. A expressão imuno-histoquímica da E-caderina, α e β-catenina em carcinomas adenóides císticos foram investigadas por Zhang et al , em 2000, utilizando 50 casos de carcinomas adenóides císticos e 10 espécimes de glândula salivar normal . Verificou-se uma expressão forte e estável do complexo da E-caderina-βcatenina em glândula salivar normal, entretanto uma expressão bem mais fraca ou até mesmo ausente foi encontrada em todos os casos de carcinomas adenóides císticos, além do que os níveis de expressão de E-caderina-catenina estiveram correlacionados com a diferenciação das cé lulas do carcinoma adenóide cístico . Ainda em 2000, Economopoulou et al realizaram estudo imuno- histoquímico, utilizando o anticorpo contra a E-caderina, em vários tumores de glândula salivar . Nos casos de adenomas pleomórficos os resultados demonstraram ausência de marcação em células epiteliais dispersas em estroma mixóide, porém marcação linear forte em ductos, cordões e ilhas, além de marcação moderada e descontínua em cé lulas plasmocitóides . Nos carcinomas adenóides císticos foi observada marcação de intensidade variável em células basalóides . Em 2005, Daa et al também avaliaram a expressão da β-catenina, E- caderina e ciclina D1 em 23 casos de carcinomas adenóides císticos de glândula salivar . A β-catenina foi detectada na membrana celular de todos os casos de carcinoma adenóide cístico, apesar de sua distribuição ter sido irregular em relação às estruturas normais . Em três dos 23 casos, detectou-se a β-catenina no núcleo, assim como na membrana celular . A reação em cadeia da polimerase e o seqüenciamento do gene da β-catenina revelaram uma mutação missense em um caso dos três, onde havia sido evidenciada marcação nuclear . Em relação a E-caderina, foi verif icada marcação na membrana celular com a mesma distribuição irregular encontrada para a β-catenina . Em 11 casos, a ciclina D1 localizou-se no núcleo, mas não houve correlação com a marcação nuclear da β-catenina . Os autores sugeriram que os distúrbios na distribuição da β-catenina e da E-caderina devem afetar a morfologia do carcinoma adenóide cístico e que uma pequena fração dos casos é caracterizada pela mutação no gene da β-catenina, a qual está associada com o acúmulo nuclear do produto deste gene, mas não afeta a transcrição do gene da ciclina D1 . Em estudo anterior, Daa et al (2004) investigaram possíveis mutações nos genes componentes da via Wnt , incluindo o CTNNB1 , AXIN1 e APC em carcinomas adenóides císticos, por meio de PCR , SSCP e seqüenciamento . De 20 casos de carcinoma adenóide cístico, sete (35%) estiveram associados com mutações em um ou mais desses três componentes . A mutação em CTNNB1 foi detectada em um caso . Houve uma tendência das mutações serem detectadas mais freqüentemente no padrão cribriforme . Assim como em tumores gástricos, a metilação da região promotora do gene da E-caderina também foi pesquisada em carcinoma adenóide cístico . Maruya et al (2004) verif icaram esta alteração epigenét ica em 16 dos 23 casos estudados, embora, sem correlação com a gradação histológica ou prognóstico . Os autores indicam que : a) o promotor do gene da E-caderina está freqüentemente metilado em carcinomas adenóides císt icos, levando a uma redução da expressão protéica; b) a expressão imuno-histoquímica variável da E-caderina pode resultar na heterogeneidade intratumoral; c) um aumento na extensão das regiões metiladas pode estar associado ao avanço da doença . Em 2007, Zhang et al correlacionaram a ausência de imuno-expressão de E-caderina com a metilação da região promotora do gene codif icador desta proteína . Estes autores sugerem que tal metilação exerce importante papel na citodiferenciação e invasão perineural do carcinoma adenóide cístico . A expressão e a importância clínica dos níveis de β-catenina, P in 1 e ciclina D1 em carcinoma adenóide cístico de glândula salivar foram avaliadas por Zhou e Gao (2006) . Nos 65 casos estudados, a expressão protéica foi avaliada pela técnica imuno-histoquímica e por Western blot . A expressão do RNAm foi verificada por meio de RT-PCR. Quatorze casos (22%) exibiram imunoreatividade para a β-catenina, sendo que em 9% dos casos a marcação mostrou-se nuclear . A redução da marcação de membrana foi observada em casos com metástases (11/14) . Os autores sugeriram, a partir destes e de outros resultados complementares, que a via de sinalização Wnt está ativada no carcinoma adenóide cístico, podendo exercer importante papel nesta neoplasia. Prado et al (2006) avaliaram a expressão imuno-histoquímica da β- catenina em 16 casos de adenoma pleomórfico, além de 3 casos de carcinoma ex-adenoma pleomórfico e 10 casos de glândula salivar normal . Observaram a perda da expressão em adenoma pleomórfico, principalmente nas células estromais e acúmulo citoplasmático nos casos de carcinoma ex-adenoma pleomórfico . A topografia da E-caderina e sua possível correlação com o fenótipo histológico de tumores de glândula salivar foi investigada por Andreadis et al (2006) . Em adenomas pleomórficos observou-se redução ou ausência da expressão da E-caderina em células periféricas de ilhas ou estruturas ductiformes e, ainda, em células plasmocitóides ou estromais . Redução moderada da expressão foi verificada em carcinomas adenóides císticos, embora esta redução tenha sido bem menos significativa que nos casos de carcinoma ductal , carcinossarcomas, carcinoma mioepitelial, adenocarcinomas oncocíticos e adenocarcinomas não especificados . O estudo sugere uma associação direta da expressão da E-caderina com o fenótipo histológico neoplásico, o qual é perdido em tumores mais invasivos e indiferenciados . O complexo E-caderina/β-catenina foi avaliado, por meio de imuno- histoquímica, em diversos tumores de glândulas salivares por Furuse et al (2006) . Todos os tumores estudados, incluindo adenoma pleomórfico e carcinoma adenóide cístico, foram positivos para estas proteínas, apresentando padrão de distribuição similar, no entanto, evidenciou-se expressão mais fraca para a β-catenina . Além disso, o adenoma pleomórfico apresentou imuno-marcação irregular e significativamente mais fraca do que os outros tumores malignos .                           3 . PROPOSIÇÃO Sabendo-se da importância das moléculas de adesão para o comportamento biológico das neoplasias epiteliais, o propósito deste trabalho consistiu em investigar al terações moleculares – o polimorfismo -160 C /A no gene da E-caderina (CDH1), possíveis mutações no exon 3 do gene da β- catenina (CTNNB1) e analisar a expressão imuno-histoquímica das respectivas proteínas - nos adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares . Além disso, procurou comparar os achados morfológicos e imuno-histoquímicos entre os dois tumores e correlacioná-los com as alterações moleculares .     4 . MATERIAL E MÉTODOS 4 .1 . CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO O presente estudo consist iu em uma pesquisa descritiva e comparativa constituída pela observação, análise e registro da expressão imuno- histoquímica das proteínas E-caderina e β-catenina, além da identif icação do polimorfismo -160 C /A na região promotora do gene CDH1 e observação e análise da triagem de mutações no gene CTNNB1 , em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos . 4 .2 . POPULAÇÃO A população alvo incluiu todos os casos de adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císt icos, emblocados em parafina, obtidos dos arquivos do Laboratório de Anatomia Patológica do Departamento de Patologia e Medicina Legal da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará e da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do R io Grande do Norte, no período de 1999 a 2006 . 4 .3 . AMOSTRA No presente trabalho foram selecionados 24 casos de adenoma pleomórfico e 24 casos de carcinoma adenóide cístico de acordo com os seguintes critérios de inclusão: confi rmação do diagnóstico histológico, quantidade de material emblocado suficiente para a realização das análises, mais de 70% do tecido emblocado constituído pela neoplasia e sucesso na extração do DNA. 4 .4 . ANÁLISE MORFOLÓGICA Para o estudo morfológico, foram utilizadas lâminas com cortes de 5 µm de espessura do material incluído em parafina, corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina (descrita adiante) . Foi então realizada análise descritiva dos aspectos histológicos observados nos adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos . O adenoma pleomórfico foi avaliado quanto ao arranjo de seu componente epitel ial (lençóis, ilhotas ou cordões e estruturas ductiformes), tipo de célula mioepitelial (plasmocitóide, fusiforme ou clara), tipo de estroma presente (mixóide, condróide, hialino e fibroso) e a presença ou não de cápsula f ibrosa . Alem disso, os casos de adenomas pleomórficos foram classif icados em dois padrões com relação ao predomínio do componente parenquimatoso ou estromal . Para o carcinoma adenóide cístico foram verificados o padrão morfológico predominante (cribriforme, tubular ou sólido) e infi l t ração perineural (ausente ou presente). TÉCNICA HISTOQUÍMICA DA HEMATOXILINA/EOSINA • Xilol I (15 minutos) • Xilol II (15 minutos) • Álcool absoluto (3 minutos) • Álcool 95° GL (3 minutos) • Álcool 70° GL (3 minutos) • Água corrente (5 minutos) • Hematoxilina de Harris (5 minutos) • Água corrente (5 minutos) • Solução álcool-ácida a 1% (passagem rápida) • Água corrente (5 minutos) • Eosina de Lison (2 minutos) • Álcool 70°GL (3 minutos) • Álcool 95° GL(3 minutos) • Álcool absoluto (3 minutos) • Xilol I (3 minutos) • Xilol II (3 minutos) • Xilol III (3minutos) • Montagem com lamínula e a resina Permount® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) . 4 .5 . TÉCNICA IMUNO-HISTOQUÍMICA Do material emblocado em parafina foram obtidos cortes de 3 μm de espessura e posteriormente estendidos em lâminas de vidro previamente limpas e preparadas com adesivo à base de organosilano (3- aminopropiltriethoxi-silano, S igma Chemical Co, S t Louis MO , USA) . Os cortes foram então submetidos à seguinte seqüência: • Passagem das lâminas em estufa pré-aquecida a 70° C por 120 minutos; • Desparafinização e hidratação em gradiente xileno-álcool-água; • Recuperação antigênica de acordo com o quadro 1; • Incubação com os anticorpos primários (diluição previamente padronizada); • Detecção por polímeros marcados com peroxidase (sistema EnVision – DakoCytomation), por 30 minutos; • Revelação pelo sistema DAB (diaminobenz idina); • Contra-coloração com hematoxilina de Mayer; • Desidratação em gradiente água-álcool-xileno; • Montagem com lamínula e resina PermountTM(Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) . Quadro 1: Especificação dos anticorpos utilizados, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação. E sp ec i f i c i d a d e C lon e Fab r i can t e D i lu i ção Recu p eraçã o An t i gên i ca Incubação E -cade r ina H108 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California. 1 :5 0 Citrato (pH 6,0) 95°C, 3 min - Sistema Pascal (DakoCytomation) 6 0 mi n β-ca t en ina 14 BD Transduction Laboratories, BD Biosciences Pharmingen, San Jose, California. 1 :1 5 0 Citrato (pH 6,0) 95° C, 40 min - Steamer Ov e rn i gh t (1 8 h ora s ) O controle positivo da reação para a E-caderina foi realizado com tecido de urotélio e para a β-catenina epitélio de revestimento da mucosa oral . Tecido de glândula salivar normal e epitélio de revestimento inclusos nos espécimes tumorais foram utilizados como controle interno da reação . Como controle negativo, em alguns cortes, o anticorpo primário foi substituído por BSA a 1% e solução tampão e subseqüentemente foram submetidos a todos os passos já descri tos . 4 .6 . ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA Considerou-se marcação a coloração dist inta em marrom (castanho), em contraposição ao azul/violeta da contra-coloração (hematoxilina), nos locais previstos para a detecção do antígeno estudado (Quadro 2) . As amostras foram analisadas por um único observador em microscópio óptico com aumento de 100 e 400x (OLYMPUS CH 30) . As estruturas ductais presentes nas glândulas salivares normais adjacentes ao tumor, assim como, o epitél io de revestimento da mucosa oral foram utilizados como controle positivo interno da reação . Quadro 2- Sítios de expressão celular das proteínas estudadas. Sítios de Expressão Celular Proteína Membranar Citoplasmático Nuclear E-caderina X X β-catenina X X X Verificou-se a presença ou ausência, a intensidade de marcação, localização celular e na arquitetura tumoral e padrão de distribuição de marcação . A intensidade de marcação e o padrão de distribuição, variáveis do tipo qualitativas ordinais, foram verificadas utilizando-se, respectivamente, os seguintes escores : 0 – ausência de marcação, 1 – fraca marcação, 2 – forte marcação e 0 – ausência de marcação, 1- marcação focal, 2 – marcação difusa . A expressão dos marcadores também foi quantificada através da contagem manual por microscopia óptica de pelo menos 1 .000 (mil) cé lulas, em diferentes campos representativos, utilizando aumento de 400x . Foram atribuídos os valores 0 (ausente), 1+ (fraca), 2+ (moderada) e 3+ (intensa) de acordo com a intensidade observada . Tais valores configuram índices aos quais foram multiplicados os valores percentuais (%) da fração de células que representam a respectiva categoria de intensidade, sendo calculado o H-Score (McCarty et al, 1985), conforme a equação descri ta a seguir: H = (% 0) * 0 + (% 1+) * 1 + (% 2+) * 2 + (% 3+) * 3 4 .7 . EXTRAÇÃO DE DNA DAS AMOSTRAS DE TECIDO A extração do DNA foi realizada pela técnica da quelação . Para remoção da parafina foram adicionados aos tubos de microcentrífuga (eppendorfs) de 1,5 ml contendo os 6 cortes de 10 micra do tecido parafinado, 1ml de xilol em temperatura ambiente e mantidos por 30 minutos em banho- maria a 65°C. Os tubos foram então centrifugados por 5 minutos a 14 .000 rpm, 28°C , desprezando-se o sobrenadante, seguindo-se de novas trocas de xilol até a remoção completa da parafina . O corpo de fundo de tecido foi hidratado em cadeia descendente de etanóis (etanol absoluto, etanol 95%, 70% e água Mill i-Q) no volume de 1 ml . Cada troca foi precedida de homogeneização e centrifugação a 14 .000 rpm durante 5 minutos . Os corpos de fundo de tecido obtidos foram submetidos à digestão enz imática com proteinase K adicionada a resina quelante (Chelex 100 - BioRad), além de dithiothreitol - C leland’s reagent (DTT) na seguinte proporção : 600 µl de Chelex100 a 20%, 12 µl de proteinase K e 42 µl de DTT. Os tubos permaneceram 18 horas (overnight) em banho-maria a 65°C. O material foi novamente centrifugado por 5 minutos a 14 .000 rpm, 28°C , o sobrenadante colhido e adicionado a 1 µl de Chelex100 a 20%, seguida de nova centrifugação . Repetiu-se a coleta do sobrenadante e 1 ml de água Mi lli-Q foi adicionada . O produto final foi mantido a -20  C. 4 .8 . AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA EXTRAÇÃO DO DNA POR PCR Para avaliação da eficácia de extração, todas as amostras de extração de DNA foram submetidas à análise por PCR. Para isto, foram utilizados primers (oligonucleotídeos iniciadores) específ icos para a amplificação de fragmentos do exon 4 do gene constitutivo humano codificador da proteína metilenotetrahidro folato redutase (Quadro 4) . As condições para a reação estão descritas no quadro 3 . O sucesso da amplificação por PCR foi verificado através de eletroforese em gel de agarose 1,0%, corado com brometo de et ídeo (0,5μg/ml) e visualizado sob luz ultra-violeta . Quadro 3 - Condições da PCR para o gene MTHFR (adaptação de Skibola et al, 1999). REAÇÃO TEMPERATURA TEMPO CICLOS Desnaturação inicial 94 °C 2 min 1 X Desnaturação 94 °C 30 seg Anelamento 62 °C 30 seg Extensão 72 °C 30 seg 40 X Extensão final 72 °C 7 min 1 X Quadro 4 - Região de amplificação dos genes estudados, seqüência dos primers utilizados e tamanhos dos fragmentos obtidos. Gene Exon Seqüência dos primers Tamanho 5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’ MTHFR 4 5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’ 198 pb 5’- TCCCAGGTCTTAGTGAGCCA-3’ CDH1 (E-caderina) Região promotora 5’-GGCCACAGCCAATCAGCA-3’ 190 pb 5’ -GCTGATTTGATGGAGTTGGA-3’ CTNBB1 (β-catenina) 3 5’ -CCAGCTACTTGTTCTTGAGTGAA-3’ 230 pb 4 .9 . AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA DOS GENES DA E-CADERINA E β-CATENINA Todas as amostras positivas para o gene da metilenotetrahidro folato redutase (MTHFR) foram submetidas à amplificação da região promotora do gene CDH1 e do exon 3 do gene CTNNB1 utilizando-se os primers especificados no quadro 4 . A reação para amplificação do fragmento do gene da E-caderina foi realizada com volume final de 25 µl contendo 2 µl de DNA genômico, 17 pmol de cada primer aplicados em tubos pré-fabricados contendo 200 µM de cada dNTP , 1,5 mM de MgC l2 , 2,5 U de Taq DNA polimerase, além de 10mM de Tris-HC l e 50 mM de KC l (Il lustra PuReTaq Ready-To-Go™ PCR Beads – GE HealthCare) . Os mesmos reagentes foram empregados para a amplificação do exon 3 do gene CTNNB1 , exceto o volume dos primers , utilizando-se 15 pmol . As condições da PCR relativas a cada primer estão especificadas nos quadros 5 e 6 . Os fragmentos amplificados foram visualizados por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida a 6%, em corrida a 70 V , duração de 1 hora e corado em nitrato de prata . A solução de poliacrilamida 40% é consti tuída de 50 ml de água Milli Q qsq , 19g de acrilamida e 1 g de N ,N meti lenobisacri lamida. Em seguida, 5 ml desta solução a 6% será adicionada a 32 µl de persulfato de amônio a 10% e 3,2 µl N ,N ,N’,N-tetrametiletileno-diamino (TEMED) e aplicada nas placas da unidade de eletroforese – BIORAD . Após polimerização o sistema de placas é montado e o tampão TBE 1X é colocado . A solução a ser aplicada no gel foi constituída por 5 µl do produto de PCR e 2 µl de Loading blue buffer 5x . Para a revelação o gel foi imerso em 200 ml de solução fixadora (100 ml de etanol a 100%, 5 ml de ácido acét ico e 895 ml de água Mill i Q) por 5 min, sendo adicionado 30 ml da solução corante (6g de nitrato de prata em 1000 ml de água Mi lli Q) . Após 5 min, sob agitação constante, o gel foi transferido para 200 ml da solução reveladora (6g de NaOH em 1000 ml de água Milli Q) onde foi adicionado 2 a 5 ml de folmaldeído P.A. Em seguida a solução reveladora foi descartada sendo substituída por 100 ml de solução fixadora e 5 ml de álcool a 70% . Os géis foram montados em placas de vidro . Quadro 5: Condições da PCR para o gene CDH1(adaptação de Pookot et al, 2006). REAÇÃO TEMPERATURA TEMPO CICLOS Desnaturação inicial 94 °C 10 min 1X Desnaturação 94 °C 1 min Anelamento 58 °C 45 seg Extensão 72 °C 1,30 min 42X Extensão final 72 °C 5 min 1X Quadro 6: Condições da PCR para o gene CTNBB1(adaptação de Takahara et al, 2004). REAÇÃO TEMPERATURA TEMPO CICLOS Desnaturação inicial 95 °C 10 min 1X Desnaturação 95 °C 1 min Anelamento 56 °C 1min Extensão 72 °C 1min 40X Extensão final 72 °C 5 min 1X 4 .10 . DETECÇÃO DE POLIMORFISMO NO GENE DA E-CADERINA POR RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) A técnica RFLP uti liza enz imas de restrição para cortar o DNA em sítios específicos constituídos por 4 a 6 pares de base, previamente conhecidos . As amostras de DNA são digeridas por uma ou mais enz imas de restrição e os fragmentos resultantes são separados de acordo com o tamanho molecular, utilizando-se gel de eletroforese . As variações resultam de substi tuição, adição, deleção ou rearranjo na seqüência de bases dentro do sítio a ser reconhecido pela enz ima . Assim sendo, nesta pesquisa, os produtos de PCR do gene da E-caderina foram submetidos à digestão da enz ima de restrição Afl III. Tendo em vista que o polimorfismo investigado gera a substituição de C por A , a enz ima AflIII gerou dois fragmentos de 120 e 70 pb quando reconheceu o alelo polimórfico A . Para fins de confirmação, as amostras polimórficas foram submetidas à digestão da enz ima HphI, que reconhece o alelo selvagem C . Foram uti lizadas 0,8 U e 0,6 U das enz imas HphI e Af l III , respectivamente e 10 µl do produto da PCR (amplicon), em volume total de 25µl . Para a restrição com a enz ima A flIII foi adicionado BSA . O mix foi mantido por 18 horas (overnight) a 37 °C . Os alelos foram discriminados por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida como já descrito. 4 .11 . TRIAGEM DE MUTAÇÕES DO GENE DA β-CATENINA POR SSCP A triagem de mutações do exon 3 do gene da β-catenina foi realizada através da técnica de polimorfismo conformacional de fita simples, ou simplesmente SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) . Esse método é baseado no fato de que a mobilidade eletroforética de uma fita única de ácido nucléico, em gel de poliacrilamida não desnaturante, depende não somente do tamanho, mas também, da sua seqüência (ORITA et al, 1989) . Os produtos de PCR foram acrescidos de SSCP loading buffer (formamida 95%, EDTA 0,02M , xilenocianol 0,5%, bromofenol blue 0,5%) na proporção 2:1 . A mistura obtida foi levada à temperatura de 95 C por 10 minutos, mantida em gelo até o momento da aplicação em gel de poliacrilamida a 12,5% (GeneGel Excel , 12 .5/24 Kit; Pharmacia Biotech) montado na unidade de eletroforese GenPhor (Pharmacia B iotech , Uppsala, Sweden) . A eletroforese foi realizada a 160 V , 8 C por 3 horas . Os fragmentos de fita simples de DNA foram corados pelo nitrato de prata utilizando-se um kit de revelação (DNA Silver Staning Kit- Amersham Bioscience). 4 .12 . ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados obtidos foram submetidos a testes estatísticos adequados com o objetivo de testar as hipóteses levantadas no presente estudo . Os dados foram digitados em planilha eletrônica SPSS (Statistical for Social Science version 13.0 for Windows®, Chicago, Illinois USA) onde foram feitas as análises por meio dos testes estatísticos Qui-quadrado, exato de Fisher, t de Student , Kruskal Wallis e correlação de Pearson . 4 .13 . IMPLICAÇÕES ÉTICAS O projeto de pesquisa desenvolvido foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do R io Grande do Norte, o qual aprovou o projeto através do parecer n° 081/2005, constante no anexo 1 .  5 . RESULTADOS Analisando as variáveis clínico-epidemiológicas de nossa amostra, verif icamos que o sexo feminino foi mais prevalente tanto para o adenoma pleomórfico (70,8% - 2,43:1 feminino/masculino), quanto para o carcinoma adenóide cístico (66,7% - 2:1 feminino/masculino) . De modo geral a média de idade dos casos estudados foi de 42,6 anos . Quando se analisa os casos quanto ao sexo, a média de idade foi de 43,5 anos para o sexo masculino e 42,3 para o sexo feminino . Considerando o t ipo de neoplasia, os pacientes com adenoma pleomórfico apresentaram média de idade de 35,5 anos e a média de idade dos pacientes portadores de carcinoma adenóide cístico foi de 51,6 anos, apresentando diferença estatist icamente significativa (p<0,001) no teste t de Student . A localização mais freqüente dos adenomas pleomórficos, da amostra estudada, foram as glândulas salivares maiores (66,7%), enquanto os carcinomas adenóides císticos em 65,2% dos casos localizaram-se em glândulas salivares menores, resultando em diferença estatist icamente significativa quando se compara a localização das duas lesões pelo teste exato de Fisher (p<0,05) . 5 .1 . RESULTADOS MORFOLÓGICOS Os adenomas pleomórficos de glândula salivar menor e maior estudados apresentaram o aspecto histológico característico, ou seja, exibiram a presença de cápsula (Figura 1a), na maioria das vezes com uma proliferação de cé lulas luminais e não luminais, arranjando-se em cordões, ninhos, ilhas e lençóis sólidos (F igura 1b), formando estruturas ductiformes revestidas por duas ou mais camadas de cé lulas num estroma variável . Em 4 casos (16,66%) de adenoma pleomórfico observou-se áreas de metaplasia escamosa (Figura 1c) . Na maioria dos casos, os tumores mostravam mais de um tipo de estroma, havendo predominância de um tipo estromal específico em apenas 3 casos . O estroma mixóide foi o mais freqüente, seguido do tipo hialino e fibroso . Já o estroma condróide (Figura 1a) esteve presente em 7 casos, destes 5 localizados em glândula salivar maior e apenas 2, em glândula salivar menor (Quadro 7) . O componente epitelial foi predominante em 62,5% dos adenomas pleomórficos em detrimento de 37,5% exibindo predominância do componente estromal . Quadro 7 . Tipos de estromas observados nos adenomas pleomórficos . Estroma Glândula salivar menor Glândula salivar maior Mixóide 12 5 Fibroso 8 7 Hialino 5 4 Condróide 5 2 Em relação à presença de cápsula, dos 24 casos de adenoma pleomórfico de glândula salivar estudados 21 (87,5%) exibiam a presença de cápsula nos cortes histológicos avaliados, estando ausente em 3 casos; 2 oriundos de glândula salivar menor e 1 de glândula salivar maior . Em quase todos os casos que possuíam cápsula foi possível observar a infi ltração da mesma pelas células tumorais (F igura 1b), exceto em 5 casos de glândula salivar maior, onde não se detectou esta infi l t ração . As células infi l t rativas arranjavam-se principalmente na forma de cordões e ninhos, por vezes, cé lulas isoladas também foram observadas . Os carcinomas adenóides císticos avaliados também apresentaram o aspecto típico exibindo proliferação de células epitel iais redondas ou cuboidais com citoplasma escasso e grandes núcleos ovais hipercromáticos originando 3 subtipos histológicos, mostrando estruturas pseudo-císticas no padrão cribiforme (F igura 2a), estruturas tubulares no tubular (Figura 2b), e em forma de lençóis ou ilhas no padrão sólido (Figura 2c) . Em 4 casos, observou-se invasão das células tumorais para estruturas adjacentes (Figura 2b) . Dos 24 casos de CACs selecionados, 10 (41,7%) eram do tipo tubular, 8 (33,3%) cribiforme e 6 (25%) do subtipo sólido . 5 .2 . RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS 5 .2 .1 . E-CADERINA A análise da expressão imuno-histoquímica da proteína E-caderina demonstrou a presença de marcação em quase todos os casos de adenoma pleomórfico, exceto em um caso (4,16%) originado de glândula salivar maior . De forma geral, verif icou-se marcação de intensidade fraca e padrão de distribuição difuso . Em relação à intensidade de marcação (Tabela 1), dos 23 casos considerados positivos, apenas 8 (34,8%) foram registrados com escore 2 (forte marcação) (Figura 3) e os outros 15 casos (65,2%) exibiram fraca marcação, correspondendo ao escore 1 . Tabela 1. Parâmetros utilizados no teste Qui-quadrado (Qui2) para avaliação da intensidade de imunoexpressão para E-caderina e ß-catenina em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. Intensidade de Imunoexpressão Proteína Tumor Fraca n (%) Forte n (%) Total n (%) Qui2 p* E-caderina AP 15 (65,2%) 8 (34,8%) 23 (100%) 1,113 CAC 12 (50,0%) 12 (50%) 24 (100%) 0,292 ß-catenina AP 14 (63,6%) 8 (36,3%) 22 (100%) 4,224 CAC 8 (47,8%) 16 (52,2%) 24 (100%) 0,040 Legenda: AP, adenoma pleomórfico; CAC, carcinoma adenóide cístico * p<0,05 Entre os 23 casos de adenomas pleomórficos positivos, o padrão difuso de distribuição foi discretamente predominante, sendo observado em 13 casos (56,5%) enquanto a marcação focal apresentou-se em 10 casos (43,5%) (Tabela 2) . Tabela 2. Parâmetros utilizados no teste Qui-quadrado (Qui2) para avaliação dos padrões de imunoexpressão para E-caderina e ß-catenina em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. Padrão de Imunoexpressão Proteína Tumor Focal n (%) Difuso n (%) Total n (%) Qui2 p* E-caderina AP 10 (43,5%) 13 (56,5%) 23 (100%) 1,786 CAC 6 (25%) 18 (75%) 24 (100%) 0,181 ß-catenina AP 13 (59,1%) 9 (40,9%) 22 (100%) 7,053 CAC 5 (20,8%) 19 (79,2%) 24 (100%) 0,008 Legenda: AP, adenoma pleomórfico; CAC, carcinoma adenóide cístico * p<0,05 A média do índice de marcação imuno-histoquímica HScore para a E- caderina em adenomas pleomórficos foi 91,43±55,81 . Observou-se marcação citoplasmática (Figura 3b) nos 23 casos positivos de adenomas pleomórficos e, em 11 destes casos (47,8%) além da marcação citoplasmática, verificou-se positividade na membrana plasmática celular (Figura 3a,c) (Tabela 3) . Tabela 3. Parâmetros utilizados no teste Qui-quadrado (Qui2) para avaliação da imunoexpressão de E-caderina, segundo localização celular, em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. Localização da Imunoexpressão Tumor Citoplasma n (%) Citoplasma e Membrana n (%) Total n (%) Qui2 p* Adenoma Pleomórfico 12 (52,2%) 11 (47,8%) 23 (100%) 1,705 Carcinoma Adenóide Cístico 8 (33,3%) 16 (66,7%) 24 (100%) 0,192 * p<0,05 Houve diferença estatisticamente significativa no padrão de distribuição de imuno-expressão da E-caderina entre os adenomas pleomórficos com predomínio do componente epitelial e adenomas pleomórficos com predomínio estromal (p<0,05) (Tabela 4) . Dos 8 casos classificados como predominantemente estromais, 6 (75%) exibiram padrão de distribuição focal . Do mesmo modo, houve diferença estatisticamente significativa quando as médias do índice HScore para a E-caderina foram comparadas entre os dois padrões morfológicos (Figura 11) . Tabela 4. Parâmetros utilizados no teste exato de Fisher para avaliação dos padrões de imunoexpressão para E-caderina segundo predominância histológica em adenomas pleomórficos. Natal, RN – 2008. Padrão de Distribuição da Imunoexpressão Histopatologia Focal n (%) Difuso n (%) Total n (%) p* Predomínio Epitelial 4 (26,7%) 11 (73,3%) 15 (100%) Predomínio Estromal 6 (75%) 2 (25%) 8 (100%) 0,039 *p<0,05 No que concerne à localização, foi evidenciada imunorreatividade para a E-caderina indistintamente nas células periféricas ou centrais de cordões, ninhos e lençóis sólidos e células luminais e não luminais das estruturas ductiformes dos adenomas pleomórficos . Em apenas um caso, evidenciou-se marcação predominante em células luminais das estruturas ductiformes (Figura 3b) . Destaca-se maior intensidade de marcação nas áreas de diferenciação escamosa em todos os tumores que apresentaram tal achado . Também, deve ser salientada a negatividade da marcação de quase a total idade das células mioepiteliais aprisionadas no estroma tumoral . Nos carcinomas adenóides císt icos estudados evidenciou-se imunorreação em todos os casos, sendo observada equidade na quantidade de casos com forte (F igura 4a,c) e fraca marcação (F igura 4b) (Tabela 1) . Para análise estatística da correlação entre a intensidade de marcação e os subtipos histológicos do carcinoma adenóide císt ico, empregando-se o teste exato de Fisher, agrupou-se os subtipos cribriforme e tubular e comparou-se ao subtipo sólido . Do mesmo modo, observou-se distribuição equivalente de casos com fraca e forte marcação (Figura 12) (Tabela 5) . Tabela 5. Parâmetros utilizados no teste exato de Fisher para avaliação da intensidade de imunoexpressão para E-caderina segundo padrões histopatológicos de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. Intensidade de ImunoexpressãoSubtipos histológicos Fraca n (%) Forte n (%) Total n (%) p* Cribriforme e Tubular 9 (50%) 9 (50%) 18 (100%) 1,000 Sólido 3 (50%) 3 (50%) 6 (100%) *p<0,05 O padrão de distribuição foi predominantemente difuso (18 casos – 75%), inclusive quando se considera o subtipo histológico (Tabela 2 e 6) . Em 16 tumores (66,6%) houve marcação membranar (Figura 4a) e o citoplasma exibiu posit ividade em todos os casos (100%) (Figura 4c) (Tabela 3) . A média do índice de marcação imuno-histoquímica HScore para a E- caderina em carcinomas adenóides císticos foi 123,63±55,74 . Tabela 6. Parâmetros utilizados no teste exato de Fisher para avaliação dos padrões de imunoexpressão para E-caderina segundo subtipos histopatológicos de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. Padrão de Imunoexpressão Subtipo Histológico Focal n (%) Difuso n (%) Total n (%) p* Cribriforme e Tubular 5 (27,8%) 13 (72,2%) 18 (100%) 1,000 Sólido 1 (16,7%) 5 (83,3%) 6 (100%) *p<0,05 Assim como nos adenomas pleomórficos, a positividade para a E- caderina nos CACs não mostrou especificidade por nenhum grupo ou arranjo celular em particular . Em dois casos, classificados como tubulares, pôde-se observar expressão predominante no centro das estruturas tubulares, assim como nas células luminais de estruturas císticas de apenas um caso de CAC cribiforme . Por fim, em um único caso de tumor sólido é evidente a predominância de marcação nas células centrais dos ninhos . Quando foram comparados o grupo dos adenomas pleomórficos com o grupo dos carcinomas adenóides císticos não houve diferença estatist icamente significativa com relação a intensidade de marcação - fraca ou forte (Tabela 1) nem quanto a distribuição de marcação - focal e difusa (Tabela 2) para a E- caderina . No entanto, houve diferença estatist icamente signif icativa entre as médias do índice de H-Score das duas lesões (p=0,051) (Tabela 7 e Figura 13) . Tabela 7. Parâmetros utilizados para o teste “t” de Student para avaliação dos H-Scores para E-caderina e ß-catenina, de acordo com tipo de tumor. Natal – RN, 2008. H-Score Tumor N Média Desvio padrão t p* E-Caderina AP 24 91,43 55,81 -1,999 0,051 CAC 24 123,63 55,74 β-Catenina AP 24 86,81 57,40 -3,375 0,002 CAC 24 136,10 42,70 Legenda: AP, adenoma pleomórfico; CAC, carcinoma adenóide cístico * p≤ 0,051 5 .2 .2 . β-catenina A proteína β-catenina foi imuno-expressa em 22 (91,66%) dos 24 adenomas pleomórficos pesquisados . Entretanto, a intensidade de marcação (Tabela 1), quando se considera os casos positivos, foi predominantemente fraca (14 casos – 63,6%) e o padrão de distribuição foi focal na maior parte dos casos (13 casos – 59,1%) (Figura 5a,c) (Tabela 2) . A média do índice de marcação imuno-histoquímica HScore para a β-catenina em adenomas pleomórficos foi 86,81±57,40 e houve diferença estatisticamente significativa quando as médias dos índices HScore foram comparadas entre os diferentes padrões histopatológicos (Figura 14) . Em todos os casos positivos foi evidenciada marcação citoplasmática e em 10 dos 22 casos posit ivos (50%) a membrana citoplasmática também exibiu expressão para a β-catenina . Posit ividade nuclear foi notada em 1 caso (4,5%) (Tabela 8) . Tabela 8. Parâmetros utilizados no teste Qui-quadrado (Qui2) para avaliação da imunoexpressão de ß-catenina, segundo localização celular, em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. Localização da Imunoexpressão Tumor Citoplasma n (%) Citoplasma e Membrana n (%) Núcleo e Citoplasma n (%) Total n (%) Qui2 p* Adenoma Pleomórfico 11 (50%) 10 (45,5%) 1 (4,5%) 22 (100%) 4,429 0,109 Carcinoma Adenóide Cístico 7 (29,2%) 11 (45,8%) 6 (25%) 24 (100%) * p<0,05 Quanto à localização, foi observada marcação indistinta nas células constituintes dos lençóis, ninhos, cordões e ductos . Apenas em três casos se sobressai a expressão em células luminais de estruturas ductiformes . Assim como para a E-caderina, foi marcante a intensidade da expressão da β- catenina nas áreas de diferenciação escamosa (Figura 5b) e também foi patente a negatividade das cé lulas mioepitel iais aprisionadas nos diversos tipos de estromas tumorais . Todos os casos de carcinomas adenóides císticos apresentaram positividade para a β-catenina e, de forma inversa ao observado nos adenomas pleomórficos, a grande maioria dos casos (19 – 79,16%) exibiram padrão difuso de distribuição (Figura 6a,b) (Tabela 2 e 9) . A intensidade de marcação foi preponderantemente forte (16 dos 24 casos – 66,66%) (Tabela 1 e 10) . Tabela 9. Parâmetros utilizados no teste exato de Fisher para avaliação dos padrões de imunoexpressão para ß-catenina, segundo padrões histopatológicos de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. Padrão de Imunoexpressão Subtipo Histológico Focal n (%) Difuso n (%) Total n (%) p* Cribriforme e Tubular 5 (27,8%) 13 (72,2%) 18 (100%) 0,280 Sólido 0 (0%) 6 (100%) 6 (100%) *p<0,05 Tabela 10. Parâmetros utilizados no teste exato de Fisher para avaliação da intensidade de imunoexpressão para ß-catenina padrões histopatológicos de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008. Intensidade de Imunoexpressão Subtipo Histológico Fraca n (%) Forte n (%) Total n (%) p* Cribriforme e Tubular 6 (33,3%) 12 (66,7%) 18 (100%) 1,000 Sólido 2 (33,3%) 4 (66,7%) 6 (100%) *p<0,05 A média do índice de marcação imuno-histoquímica HScore para a β- catenina em carcinomas adenóides císticos foi 136,10±42,70, havendo diferença estatisticamente significativa entre os subtipos histológicos (F igura 15) (Tabela 11) . Tabela 11. Parâmetros utilizados no cálculo do teste de Kruskal Wallis para avaliação dos H- Scores para E-caderina e β-catenina em relação aos padrões histopatológicos de carcinomas adenóides císticos. Natal – RN, 2008. H-Score Padrão Histológico n Mediana Q25-Q75 Média dos Postos KW p* E-caderina Cribriforme 8 101,95 89,78 - 120,35 9,38 2,741 0,254 Tubular 10 124,90 97,65 - 177,18 13,20 Sólido 6 136,30 134,33 - 172,85 15,50 β-catenina Cribriforme 8 89,40 67,45 - 132,08 7,38 6,334 0,042 Tubular 10 150,55 133,93 - 165,80 15,30 Sólido 6 145,05 138,83 - 153,68 14,67 * p<0,05 A expressão citoplasmática foi evidenciada em todos os casos (100%), enquanto que a membrana citoplasmática apresentou-se imuno-marcada em 11 casos (45,83%) . De forma destacável, nos casos onde existiu marcação nuclear (6 – 25%) (Figura 6b) não se observou marcação membranar (Tabela 8) . Em apenas três casos pôde-se apontar marcação diferenciada em células luminais de estruturas císticas ou em cé lulas centrais de estruturas tubulares ou ninhos sólidos (F igura 6c) . De forma geral, a imuno-marcação ocorreu de modo indiferenciado no parênquima neoplásico . Quando se comparou o grupo dos adenomas pleomórficos com o grupo dos carcinomas adenóides císticos houve diferença estatisticamente significativa para os parâmetros de expressão imuno-histoquímica da β- catenina avaliados (Figura 16) . A intensidade de marcação - fraca ou forte (Tabela 1), distribuição de marcação - focal e difusa (Tabela 2) e média do índice de H-Score (Tabela 7) apresentaram valor de p<0,05 . 5 .2 .3 E-caderina/β-catenina Aplicando-se o índice de correlação de Sperman, houve correlação estatíst icamente significativa dos índices de H-Score da E-caderina com da β- catenina . O coeficiente de correlação de Spearman revela ser uma fraca correlação (0 .46) (Figura 17) . 5 .3 . RESULTADOS DA ANÁLISE DO POLIMORFISMO DA E- CADERINA Das 48 amostras investigadas, 2 (4,16%) exibiram polimorfismo heteroz igótico na posição -160 da região promotora do gene CDH1 evidenciada por digestão da enz ima A f l III, a qual gerou três bandas; a primeira de 190pb, correspondente ao alelo selvagem não cortado e outras duas de 120 e 70 pb . As amostras digeridas pela enz ima A flIII também foram cortadas pela enz ima HphI, resultando em três bandas, uma correspondente ao alelo polimórfico não cortado e outras duas correspondentes ao alelo selvagem cortado (F igura 8) . Os dois casos onde se observou o polimorfismo genético, um foi adenoma pleomórfico e o outro carcinoma adenóide cístico . As característ icas da marcação imuno-histoquímica destes casos estão evidenciadas na Tabela 12 . Não houve diferença estatisticamente significativa quando se comparou as médias do índice HScore dos casos polimórficos com as médias do índice HScore dos casos sem polimorfismo (p<0,05) (Tabela 13) . Tabela 12: Características de imuno-marcação da E-caderina nos casos com polimorfismo genético do gene CDH1 . Natal – RN , 2008 . Lesão In tensidade D i str ibu ição Méd ia do HScore Loca l ização Adenoma P leomór f ico Fraca Foca l 55,5 C i toplasmát ica Carcinoma Adenóide C í s t ico Fraca D i fusa 84,5 C i toplasmát ica Tabela 13. Polimorfismo no gene CDH1, tamanho da amostra, média de HScore, desvio padrão, teste t e valor de p. Natal, RN – 2008. Proteína Polimorfismo CDH1 n Média HScore Desvio padrão t p* E-Caderina Presente 2 69,75 20,15 2,370 0,151 Ausente 46 109,17 58,15 *p<0,05 5 .4 . RESULTADOS DA TRIAGEM DE MUTAÇÕES DO GENE CTNNB1 Treze amostras (27,08%) apresentaram variação do padrão de mobilidade eletroforética do PCR-SSCP , sugestivas de mutação do exon 3 do gene CTNNB1 (F igura 10) . Dos treze casos, 6 eram adenomas pleomórficos e 7 carcinomas adenóides císticos . Quando as médias de H-Score dos casos sugestivos de mutação foram comparadas com as médias de H-Score dos casos com corrida eletroforét ica padrão não foi observada diferença estatist icamente significativa (p<0,05) (Tabela 14). Houve marcação imuno- histoquímica da proteína β-catenina em núcleo em 2 desses casos, enquanto 7 exibiram marcação apenas citoplasmática e 4 marcação membranar e citoplasmática . Tabela 14. Sugestão de mutação do gene CTNNB1, tamanho da amostra, média, desvio padrão, teste t e valor de p. Natal, RN – 2008. H-score Mutação CTNNB1 n Média Desvio padrão t p* β-Catenina Presente 13 96,32 43,52 1,322 0,196 Ausente 35 117,10 59,41 *p <0,05 Componente EstromalComponente epitelial Predominância Histológica 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 Hs co re Ca de rin a SólidoTubularCribriforme Diferenciação Histológica 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 Hs co re Ca de rin a 28 Figura 11. Box-Plot relativo ao índice H-Score para E-caderina, de acordo com a predominância histológica em adenomas pleomórficos. Natal, RN – 2008.   Figura 12. Box-Plot relativo ao índice H-Score para E-caderina, de acordo com o padrão histopatológico de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008.    Carcinoma Adenóide CísticoAdenoma Pleomórfico Lesão 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 Hs co re Ca de rin a 44 28 Componente EstromalComponente epitelial Predominância Histológica 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 Hs co re Ca ten ina Figura 13. Box-plot relativo ao índice H-Score para E-caderina, de acordo com tipo de lesão. Natal - RN, 2008.   Figura 14. Box-Plot relativo ao H-Score para β-catenina, de acordo com a predominância histológica em adenomas pleomórficos. Natal, RN – 2008.  SólidoTubularCribriforme Diferenciação Histológica 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 Hs co re Ca te nin a 34 28 26 Carcinoma Adenóide CísticoAdenoma Pleomórfico Lesão 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 Hs co re Ca ten ina  Figura 15. Box-Plot relativo ao índice H-Score para β-catenina, de acordo com o padrão histopatológico de carcinomas adenóides císticos. Natal, RN – 2008.             Figura 16. Box-plot relativo ao índice H-Score para β-catenina, de acordo com tipo de lesão. Natal – RN, 2008. 250,00200,00150,00100,0050,000,00 Hscore Caderina 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 H sc o re Ca te n in a R Sq Linear = 0,18 F igura 17 . Scatter-P lot evidenciando a correlação dos índices de H-Score da E- caderina e β-catenina (0,46) . Natal , RN – 2008 .   6 . DISCUSSÃO Os tumores de glândulas salivares compõem um grupo distinto de neoplasias que apresentam comportamento clínico variado e ampla diversidade morfológica, tornando a abordagem temática um desafio . Identificam-se como lesões raras, pois perfazem cerca de 2% a 6,5% do conjunto de neoplasias de cabeça e pescoço . É importante destacar que 54% a 79% destas neoplasias são benignas e 21% a 46%, malignas (EVESON et al, 2005, ITO et al, 2005, PIRES et al, 2006, AL-KHATEEB et al, 2007, ANSARI, 2007) . Dentre as neoplasias benignas, o adenoma pleomórfico é , sem dúvida, o tumor mais freqüente e pesquisado e o carcinoma adenóide cístico está entre as três neoplasias malignas mais prevalentes, a depender da localização anatômica considerada . De modo geral , os tumores epiteliais primários de glândula salivar ocorrem em glândula parótida numa prevalência entre 4% a 80%, e em glândulas salivares menores, no intervalo de 9% a 23% (EVESON et al , 2005, ITO et al, 2005, TOIDA et al, 2005) . A distribuição etária dos pacientes da amostra em estudo, no momento do diagnóstico, refletiu os estudos epidemiológicos nacionais e internacionais, ocorrendo entre indivíduos de 20 a 50 anos de idade para o adenoma pleomórfico (LIMA et al, 2005, PRADO et al, 2006) . Já, referindo- se à casuística de carcinomas adenóides císticos, observou-se uma faixa etária superior, isto é , entre a quinta e sexta década de vida, em consonância com os trabalhos de Khan et al (2001) e Jia et al (2004) . Com relação a variável sexo dos pacientes, do presente estudo, observou-se predileção pelo sexo feminino, dado este semelhante aos relatos nacionais e internacionais (MACIEJEWSKI, SZYMCZYK, W IERZGON , 2002, LIMA et al , 2005, PIRES et al, 2006, TINCANI et al , 2006, TRIANTAFILLIDOU et al , 2006) . Registre-se que em relação ao carcinoma adenóide cístico, alguns autores não apontam predileção por sexo (KOKEMUELLER et al, 2004, EL-NAGAR , HUVOS , 2005) . A relação feminino/masculino, para o adenoma pleomórfico foi de 2,43:1 e para o carcinoma adenóide cístico, 2 :1 . Finalizando a análise clínico-epidemiológica, a localização dos adenomas pleomórficos estudados reproduz iu o que a literatura aponta, ou seja, as glândulas salivares maiores representaram o local de origem da maioria dos casos (66,7%) . Tratando-se do carcinoma adenóide cístico, houve variação nas séries de casos relatados na literatura consultada, em relação à localização anatômica mais acometida . De modo semelhante aos estudos de Kokemueller et al (2004) e Rapidis et al (2005), onde, respectivamente 59,5% e 56,5% dos CACs foram originários de glândula salivar menor, 65,2% dos CACs do presente estudo tinham como sí tio primário glândula salivar menor. De outra forma, T incani et al (2006) observaram leve predileção dos carcinomas adenóides císticos pelas glândulas salivares maiores (52,3%), enquanto Maciejewski, Szymczyk, Wierzgon (2002) relataram uma freqüência de 72% em glândula salivar maior . Histologicamente, os tumores de glândula salivar constituem, provavelmente, as neoplasias de maior heterogeneidade de todo o organismo humano . Segundo Dardick (1996), tal diversidade morfológica é atribuída à capacidade de diferenciação das células parenquimatosas, entre as quais, as cé lulas mioepiteliais, identif icadas em graus variáveis de diferenciação . Diferentemente, as neoplasias de pâncreas, glândula que não apresenta na sua arquitetura tecidual cé lula mioepitelial, não exibem esta variação morfológica evidenciada em glândula salivar (SOUSA , ARAÚJO , 1994) . As neoplasias, aqui estudadas, compartilham a mesma origem celular, embora apresentem diferentes graus de diferenciação mioepitelial . Conforme Sousa e Araújo (1994) entre os tumores de glândula salivar, um interesse especial tem sido reservado ao adenoma pleomórfico, pois além de ser o mais freqüente, apresenta um aspecto histológico bastante peculiar, compartilhando como característica principal um misto de componentes epiteliais e mesenquimais-símile . O adenoma pleomórfico pode ser subclassificado com base na proporção do componente epitelial em relação ao componente mesenquimal- símile . O t ipo celular representa aquele com componente epitelial preponderante, enquanto o tipo mixóide indica os tumores constituídos, em sua maior extensão, por estroma mixomatoso ou mixocrondróide e, por fim, o subtipo clássico denota um equilíbrio dos componentes epitel iais e estromais . Os tumores aqui investigados foram classificados pela predominância de seu componente parenquimatoso (epitel ial) ou estromal (mesenquimal), sendo observada uma predominância parenquimatosa em 62,5% dos casos, o que está em relativo desacordo com alguns autores (SEIFERT , SOBIN , 1991, e STENNERT et al, 2001) . Esta distinção não tem significado prognóstico ou terapêutico mas, ajuda a enfatizar o amplo espectro de possibilidades morfológicas dentro de um mesmo tumor (ELLIS , AUCLAIR , 1996, EVESON et al, 2005) . No presente estudo, a subclassificação, anteriormente descrita, poderá auxiliar na compreensão dos tumores com maior componente mioepitelial, uma vez que é reconhecido que as células localizadas no estroma apresentam fenótipo mioepitelial e aquelas que apresentam fenótipo epitelial encontram-se em lençóis, ninhos, cordões e ductos . O parênquima dos adenomas pleomórficos avaliados, de modo geral, exibiu os achados histopatológicos característicos, como descri tos por Sousa e Araújo (1994) Dardick (1996) e Eveson et al (2005), pois houve o predomínio de cé lulas cuboidais, fusiformes e plasmocitóides, e, ocasionalmente, células claras . Células mucosas, sebáceas e acinares serosas não foram evidenciadas . Em relação às configurações arquiteturais, foram notados lençóis sólidos, formações císticas, estruturas tubulares e ductais, constituídas por duas ou mais camadas celulares . Dos espécimes analisados, 21 (87,5%) apresentaram-se encapsulados . A cápsula estava ausente em dois casos de glândula salivar menor e em um caso de glândula salivar maior. Foi possível observar a infi l t ração da cápsula por cé lulas neoplásicas, em variados arranjos, em todos os outros tumores, exceto em cinco casos localizados em glândula salivar maior . Tais achados concordam com os relatos de Dardick (1996), S tennert et al (2001) e Eveson et al (2005) os quais afi rmam que apesar do adenoma pleomórfico normalmente possuir cápsula, esta pode, muitas vezes, mostrar infi l tração pelas células tumorais . Verificaram-se estromas de tipos variados nos adenomas pleomórficos ora estudados . Na maioria dos tumores, mais de um tipo de estroma pôde ser observado, sendo o t ipo mixóide o mais comum, seguido pelos tipos hialino, fibroso e condróide, achados que corroboram os resultados obtidos por Bento et al (2006) . Outro dado histológico interessante, refere-se a presença de metaplasia escamosa em quatro casos, fato também descrito por Sousa e Araújo, 1994, e Dardick (1996) . Em relação ao carcinoma adenóide cístico, três padrões morfológicos são bem reconhecidos; o cribriforme é considerado o mais comum, perfazendo mais de 40% dos casos relatados na literatura; o sub-tipo tubular está presente em cerca de 30% a 35% e, por fim, o subtipo sólido que constitui um pouco mais de 20% (DAA et al, 2004, J IA et al, 2004, KOKEMUELLER et al , 2004) . Na amostra em discussão, houve uma inversão dessa seqüência, onde o padrão tubular estava presente na maior parte dos casos (41,7%), seguido do cribriforme (33,3%) e sólido (25%) . A diferença entre a freqüência dos subtipos histológicos verificado e aquele encontrado na literatura (J IA et al , 2004, KOKEMUELLER et al , 2004), provavelmente, deve-se ao acaso . É importante considerar, ainda, que os subtipos histológicos foram determinados com base no predomínio das característ icas histológicas, embora, algumas vezes, fosse evidenciado quase um equil íbrio de dois padrões em uma mesma lesão . Sabendo-se ser o adenoma pleomórfico e o carcinoma adenóide cístico neoplasias de origem epitelial e que a perda da coesão celular é um dos primeiros eventos na tumorigênese epitelial, um dos objetivos do presente estudo foi avaliar a expressão imuno-histoquímica de proteínas que compõem as junções celulares, especificamente a E-caderina e a β-catenina . Esta expressão foi comparada entre uma neoplasia benigna e uma maligna com o propósito de identif icar diferenças que contribuam para a explicação do comportamento biológico distinto destes tumores . Também, foi objeto deste estudo, a identificação de alterações moleculares nos genes da E-caderina e β- catenina, que pudessem estar implicadas na variação da expressão protéica . As junções celulares ligam as células epitel iais umas com as outras, sendo constituídas por diversas proteínas denominadas genericamente moléculas de adesão . Tais moléculas regulam o crescimento e a diferenciação das células epiteliais, bem como exercem papel fundamental na manutenção da integridade estrutural e no alto nível de organização dos epitélios . A E- caderina faz parte de uma superfamília de moléculas de adesão intercelular dependente de cálcio, cuja função adesiva depende, de modo crucial , de sua associação com a proteína citoplasmática β-catenina (PETRUZELLI et al , 1999, BEAVON , 2000, RAMBURAN , GOVENDER , 2002, SCULLY et al, 2005) formando um complexo funcional . Estas proteínas devem ser avaliadas em conjunto, no entanto, a β-catenina não está envolvida apenas no processo de adesão celular, também é parte da via de sinalização Wnt , o que torna a interpretação de sua expressão mais complexa. Ainda não há evidências científicas que esclareçam de modo suficiente a relação entre as alterações no padrão de expressão do complexo E- caderina/β-catenina e o comportamento biológico das neoplasias . A maior parte da li teratura pertinente demonstra que a redução da E-caderina está, preponderantemente, associada a parâmetros de maior agressividade biológica, aumento de invasividade, metástase e recorrência dos tumores e pior prognóstico para os pacientes (GARCIA-ROSTAN et al, 2001, BEAVON , 2000, BÀNKFALVI et al, 2002, COWIN , ROWLANDS , HATSELL, 2005, LIU et al , 2006) . Entretanto, em alguns tumores, não se observa relação entre a redução de expressão da E-caderina/β-catenina e o comportamento biológico mais agressivo . Tan et al (1999) correlacionaram forte marcação imuno- histoquímica da E-caderina com menor sobrevida, tamanho de tumor e ocorrência de metástase nodal em carcinomas de mama. Por sua vez , em outro estudo da expressão da E-caderina em carcinomas de células em anel de sinete gástricos, colo-retais e pulmonares, Moon et al (2006) não identificaram a expressão aberrante da E-caderina nem tão pouco acúmulo de β-catenina em núcleo nos tumores pulmonares . Do mesmo modo, para as neoplasias de glândula salivar, somos da opinião que a redução da expressão do complexo E-caderina/ β-catenina não reflita maior potencial invasivo ou transformação maligna destes tumores, opinião também compartilhada por Furuse et al (2006) . Na presente investigação, houve maior índice de marcação HScore nos casos de carcinomas adenóides císticos que nos de adenomas pleomórficos, tanto da E- caderina (p=0,051) quanto β-catenina (p<0,05) . É importante registrar que a marcação aqui evidenciada nos casos de carcinomas adenóides císticos, tanto para E-caderina, quanto para β-catenina, foi positiva, porém, relativamente menor quando se comparou com o tecido glandular normal, presente na periferia dos tumores estudados . Economopoulou et al (2000) também observaram uma redução da expressão da E-caderina em carcinomas adenóides císticos em comparação com a estável e forte marcação evidenciada em glândula salivar normal, embora, por vezes, a marcação tumoral fosse negativa, o que não se observou em nosso estudo . Em concordância com o trabalho de Maruya et al (2004), o qual descreveu variação de expressão de E-caderina em carcinomas adenóides císticos, com marcação fraca ou até mesmo ausente em alguns tumores e intensa positividade em outros, a presente investigação também evidenciou variação no padrão de marcação, inclusive dentro de um mesmo caso . Em contraposição aos achados do presente estudo e ao descri to na maior parte da literatura, Daa et al (2004) demonstrou manutenção da marcação membranar de β-catenina em todos os subtipos histológicos do carcinoma adenóide cístico . A ausência ou redução da expressão da E-caderina foi associada com menor diferenciação e desenvolvimento de metástases nos carcinomas adenóides císticos (FRANCHI et al , 1999) . A inda, no mesmo sentido, Zhang et al (2000) relataram redução e até ausência da expressão da E-caderina/ β- catenina em comparação ao padrão de glândula salivar normal e esta redução foi correlacionada com fenótipo de maior infi l t ração perineural e vascular . Em relação ao adenoma pleomórfico, a marcante redução ou ausência de imuno-marcação da E-caderina, vista nas células dispersas no estroma, foi um achado também evidenciado em outros estudos (ECONOMOPOULOU et al, 2000, ANDREADIS et al, 2006, FURUSE et al , 2006) . Quando se considerou as células parenquimatosas, evidenciou-se, de forma geral , marcação fraca tanto da E-caderina, quanto para a β-catenina, nas células constituintes dos lençóis, ninhos, cordões e ductos, indistintamente no lúmen ou em células não luminais . Apenas dois casos foram negativos para a β-catenina e um caso negativo para a E-caderina . No entanto, a literatura apresenta resultados conflitantes para a expressão destas proteínas nas cé lulas do parênquima . Economopolou et al (2000) verificaram marcação linear forte em ductos, cordões e ilhas, além de marcação moderada e descontínua em células plasmocitóides . Em divergência, Andreadis et al (2006) observaram redução ou ausência da expressão da E- caderina em células periféricas de ilhas ou estruturas ductiformes e, ainda, em cé lulas plasmocitóides . Furuse et al (2006) verificaram expressão considerada normal em células luminais de estruturas ductiformes bem formadas e fraca marcação em células mioepiteliais basalóides que envolviam células luminais . A menor expressão imuno-histoquímica da E-caderina e β-catenina nos adenomas pleomórficos em relação aos carcinomas adenóides císticos pode ser just ificada pela diferenciação das cé lulas mioepiteliais nestes tumores . É importante ressaltar que as células mioepitel iais dos tumores se apresentam em diversos estágios de diferenciação, quando se compara com as células mioepiteliais das glândulas salivares normais (FOSCHINI et al, 2000, MARTINS et al, 2002, MIGUEL et al, 2002, OGAWA et al, 2003) . Em 2005, Furuse et al demonstraram que os adenomas pleomórficos, de modo geral , expressam marcadores mioepiteliais com maior intensidade e distribuição que os carcinomas adenóides císticos . Paralelamente, existem diferentes perfis de células mioepiteliais dentro do adenoma pleomórfico . O clássico estudo de Dardick et al (1983a,b) em que foi delineado um modelo explicativo para a histogênese desta neoplasia, sugere que as células mioepiteliais do ducto intercalar da glândula salivar normal proliferam, inicialmente mantendo relação com as células luminais do ducto e, posteriormente, sofrem variados graus de modificação . Por f im, a deposição estromal resulta em separação e isolamento das células modificadas . Assim sendo, considerando-se que as cé lulas aprisionadas no estroma (mioepiteliais modif icadas) do adenoma pleomórfico foram negativas para E- caderina e β-catenina, é l ícito inferir que a diferenciação das células mioepiteliais influencia na expressão das moléculas de E-caderina e conseqüentemente β-catenina nestas cé lulas . Assim posto, é relevante comparar a marcação da E-caderina observada em glândula salivar normal e em adenoma pleomórfico, no presente estudo . Uma possível interpretação para a marcação fraca e focal em adenoma pleomórfico é a modificação sofrida pela célula mioepitelial em relação à glândula salivar normal – marcação intensa e difusa – o que, em parte, está de acordo com Furuse et al (2006) . Ainda sobre a correlação da expressão do complexo E-caderina/β- catenina e a diferenciação das células mioepiteliais, observou-se no carcinoma adenóide cístico uma distribuição mais difusa destas proteínas no subtipo histológico sólido, em comparação com os demais subtipos, onde, sabidamente, as células mioepiteliais são menos diferenciadas (ARAÚJO , ARAÚJO , 1990, ARAÚJO , CARVALHO , ARAÚJO , 1994, FURUSE et al, 2005) . Além disto, em alguns casos de carcinoma adenóide cístico tubular, houve marcação da E-caderina/β-catenina apenas nas células luminais de estruturas ductais, confi rmando a idé ia de que a diferenciação mioepitelial influencia na expressão das proteínas estudadas . Quando se analisa a expressão da E-caderina em células mioepitel iais de outras glândulas humanas normais, como sudoríparas ou mamárias, verif ica-se ausência ou redução desta expressão em relação às células epiteliais luminais (BÀNKVALFI et al, 1999, SCHÖN et al, 1999, COW IN , ROWLANDS , HATSELL, 2005) . Sendo assim, a variação morfológica observada entre os tumores e, ainda dentro de um mesmo tumor, resultante da presença e diferenciação de cé lulas mioepiteliais, parece influenciar na expressão do complexo E- caderina/β-catenina, e isto não tendo relação direta com comportamento biológico dos tumores estudados . Além disso, é possível que haja outros mecanismos envolvidos na redução da expressão do complexo E-caderina/β-catenina em adenomas pleomórficos . Células de carcinoma de mama sofrem diferenciação mioepitelial, e conseqüentemente redução da expressão da E-caderina, quando em contato com matriz extracelular de origem sarcomatosa (LEBRET et al, 2006) . De forma semelhante, o colágeno I e II do estroma de neoplasias malignas são capazes de induz i r redução da expressão gênica da E-caderina em células epitel iais (MENKE et al, 2001) . Isto posto, é provável que proteínas da matriz extracelular do estroma do adenoma pleomórfico induzam a redução de expressão de E-caderina . Os resultados do presente estudo indicam que provavelmente a redução de E-caderina/β-catenina exerça papel minoritário no comportamento biológico agressivo do carcinoma adenóide cístico . Sendo assim, outros mecanismos moleculares devem atuar de forma mais decisiva nos processos de invasão e metástase desta neoplasia . A molécula de adesão N-CAM , constituinte da superfamília das imunoglobulinas, tem sido estudada em carcinoma adenóide cístico, tendo em vista seu neurotropismo . A imuno-expressão desta proteína foi associada a infilt ração perineural (HUTCHESON et al, 2000, SHANG et al , 2007) . No entanto, em cultura de célula de carcinoma adenóide císt ico a N-CAM exerceu papel anti-invasivo (FRANÇA et al, 2001) . Pelo menos duas características do carcinoma adenóide císt ico justificam a manutenção da expressão do complexo E-caderina/β-catenina . O estudo da morfologia deste tumor indica não haver a presença de células ou mesmo pequenos grupamentos celulares dispersos no estroma, tal fato é compatível com a manutenção da expressão de moléculas de adesão intercelulares . Outra característica desta neoplasia é a ocorrência de metástase tardia (LICITRA et al , 2003, BRADLEY , 2004, KOKEMUELLER et al, 2004), o que pode signif icar necessidade de perda da coesão celular apenas em fases tardias do tumor e, portanto a manutenção da expressão de E- caderina/β-catenina em fase precoce . Outro achado relevante observado no presente estudo foi a correlação entre a expressão imuno-histoquímica da E-caderina e β-catenina . Considerando-se conjuntamente os dois tumores, os índices HScore da E- caderina pôde ser correlacionado com os índices HScore da β-catenina de modo estatisticamente significativo (p<0,05), embora esta correlação seja considerada fraca (coeficiente de correlação de Pearson – 0,46) . Do mesmo modo, houve uma tendência de correlação entre a intensidade (66,6% dos casos) e a distribuição (68,7% dos casos) de expressão dos dois marcadores analisados . Quando se correlaciona os marcadores estudados com a localização celular da expressão, parece lícito afi rmar que a redução da marcação membranar da E-caderina foi acompanhada da redução da expressão, também membranar da β-catenina, embora estes dados não tenham sido estatist icamente confirmados . Dentre os 48 casos da nossa amostra, 37 apresentaram expressão na mesma localização celular (membranar ou citoplasmática) e entre os 11 casos onde não houve tal coincidência, 5 exibiram apenas fraca marcação membranar . A correlação da marcação imuno- histoquímica de E-caderina e β-catenina sugere uma degradação normal da β- catenina citoplasmática e ausência de sinalização Wnt . Em apenas sete casos, sendo seis carcinomas adenóides císticos e um adenoma pleomórfico, houve marcação nuclear para a β-catenina . Destes, seis não exibiram marcação membranar da E-caderina, levando-se a supor que quando a expressão da E-caderina foi reduz ida ou ausente em membrana, a β- catenina livre no citoplasma não foi degradada e sofreu translocação para o núcleo, assim como relata a literatura . Convém ressaltar que a degradação da β-catenina citoplasmática depende da sua capacidade de ligação ao complexo GSK-3β-APC-AXIN-1, bem como do perfeito funcionamento destas proteínas (BEAVON , 2000, RAMBURAN , GOVENDER , 2002, MOON et al, 2004, TAKAHASHI-YANAGA ,SASAGURI, 2007) . Como anteriormente discutido, tem sido demonstrada redução da expressão imuno-histoquímica do complexo E-caderina/β-catenina tanto em adenoma pleomórfico quanto em carcinoma adenóide cístico (FRANCHI et al , 1999, ECONOMOPOULOU et al, 2000, ZHANG et al, 2000, FURUSE et al , 2005, ANDREADIS et al, 2006), embora, ao que parece, esta redução não esteja diretamente relacionada com o comportamento biológico destas neoplasias . A compreensão do mecanismo que resulta em decréscimo da expressão destas proteínas é importante para o melhor entendimento da biologia dos tumores e até mesmo para futuras propostas terapêuticas . Várias alterações gênicas e epigênicas podem acontecer de forma isolada, ou mesmo em associação, acarretando a redução da expressão protéica . Há mutações germinativas, como a que acontece nos carcinomas gástricos familiares (OLIVEIRA et al, 2004, 2005) ou carcinomas de mama (COW IN , ROWLANDS , HATSELL, 2005) ou mutações somáticas, como é visto, por exemplo, nos carcinomas gástricos difusos (OLIVEIRA et al , 2004, 2005) ou de mama (SALAHSHOR et al, 2001, COWIN , ROWLANDS , HATSELL, 2005) . Entretanto, não tem sido verificada uma mutação somática ou mesmo germinativa que se repita com freqüência suf iciente para ser diretamente relacionada com a carcinogênese de um determinado tumor (SALAHSHOR et al, 2001, LIU et al , 2006) . O polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) na posição -160 da região promotora do gene da E-caderina é crít ico, pois, este é o sítio do inicio da transcrição deste gene. A partir do estudo de Li et al (2000), demonstrando que o polimorfismo (C→A) gera uma atividade transcricional 68% menor, várias pesquisas apontam um aumento do risco de desenvolvimento de vários cânceres em indivíduos portadores do alelo A (VERHAGE et al, 2002, KAMOTO et al , 2005, KIEMENEY et al , 2006, GOTO et al, 2007) . O carcinoma de próstata é a neoplasia cuja relação entre risco de doença e o polimorfismo em discussão é mais estudado (KAMOTO et al, 2005, POOKOT et al, 2006), embora a metilação do gene também seja discutida (WOODSON et al, 2003) Em 2007, Wang et al apontaram disparidades no risco de desenvolvimento de câncer para diferentes populações raciais . Considerando a população européia, existe um risco significantemente aumentado para o desenvolvimento de câncer gástrico em indivíduos heteroz igóticos (-160A) enquanto a população asiática parece ser tolerante . Ainda em europeus, indivíduos homoz igóticos (-160AA) apresentam maior risco para câncer de urotélio e indivíduos apenas heteroz igóticos (-160A) estão mais propensos ao desenvolvimento de câncer de próstata e pulmão . Entretanto, não tem sido demonstrado que o alelo -160A predisponha ao câncer de mama, colo retal ou esofagiano . A endometriose, uma doença benigna muito freqüente em ginecologia também, já foi investigada quanto a três polimorfismos no gene da E-caderina e, embora tenha havido diferença signif icativa da presença de polimorfismo na região 3’UTR C→T entre mulheres com endometriose e as pacientes controle, não se observou nenhuma correlação com o polimorfismo -160 (C→A), assim como -347(G→GA) (SHAN et al, 2007) . De modo similar, em carcinoma hepatocelular, não foi encontrada nenhuma associação de parâmetros clínico-patológicos como sexo, idade, trombo tumoral em veia porta, nível pré-operatório da alfa feto-proteína, tamanho do tumor, gradação histopatológica ou recorrência e o polimorfismo em questão (LI et al , 2007) . O nosso estudo não indica diferença estat isticamente significativa entre a presença do polimorfismo avaliado e menor índice de marcação imuno- histoquímica da E-caderina, embora a média do índice HScore dos casos polimórficos tenha sido bem inferior (69,75), quando comparada com a média do índice HScore dos casos não polimórficos (109,17) . Levando-se em consideração que o polimorfismo heteroz igótico, observado nos casos mencionados, anularia apenas parte da atividade transcricional do gene, tal polimorfismo poderia justificar a marcada redução de expressão da E- caderina . Entretanto, como o polimorfismo em questão foi identif icado em apenas dois dos 48 casos investigados, outros mecanismos devem estar envolvidos na redução da expressão da proteína E-caderina em adenoma pleomórfico e carcinoma adenóide cístico . O gene CDH1 também pode ser si lenciado por metilações nas i lhas citosina-guanina (CpG) da região promotora, como se demonstra em diversas neoplasias, incluindo carcinoma gástrico (LIU et al, 2005, 2006), de mama (CALDEIRA et al , 2006), de tireóide (SMITH et al , 2007) . Em estudos recentes com carcinoma adenóide cístico, foi demonstrada uma associação estat isticamente significativa entre a redução ou ausência da expressão da E-caderina e a metilação do promotor deste gene (MARUYA et al, 2004, ZHANG et al, 2007) . Além disto, foi evidenciada uma correlação positiva entre o maior grau histológico de malignidade e invasão perineural com a metilação discutida (ZHANG et al, 2007) . Sendo assim, provavelmente a redução da E-caderina, pelo menos nos carcinomas adenóides císticos, permita ser explicada pelo si lenciamento do gene metilado e não pela redução da transcrição gênica induz ida pelo polimorfismo -160 do gene CDH1 . Talvez , a combinação de uma ou mais vias de transcrição gênica e tradução protéica seja responsável pela redução observada da expressão desta proteína . A região do gene CTNNB1 estudado - exon 3 - é a mesma investigada na ampla maioria das pesquisas relacionadas à mutação do gene da β-catenina (GARCIA-ROSTAN et al, 2001, DAA et al , 2004, TAKAHARA et al , 2004, PARK et al, 2005) . Isto porque o exon 3 codifica uma região responsável pela fosforilação protéica, por meio da ligação com proteína quinase-3β glicogênio sintetase (GSK3β) . Em última análise, a fosforilação determina a regulação da localização da proteína na célula . Normalmente, na ausência do sinal Wnt , a proteína fosforilada é direcionada para degradação pelo sistema ubiquitina- proteosomase . A fosforilação não ocorre quando da sinalização Wnt ou quando a GSK3β não consegue se ligar à β-catenina . Sendo assim, o acúmulo citoplasmático e, principalmente, a expressão nuclear da β-catenina, verif icada por imuno-histoquímica, pode ser explicada pela mutação do exon 3, o que gera sua incapacidade de ligar-se à GSK3β e, conseqüentemente, impede sua fosforilação . O percentual de casos de adenomas pleomórficos (25%) e de carcinomas adenóides císticos (29,2%) que apresentaram diferentes padrões de mobilidade eletroforética em SSCP , sugestivos de mutações, estão próximos ao encontrado em estudos de carcinomas de tireóide pobremente diferenciados - 25% (GARCIA-ROSTAN et al , 2001), carcinoma hepatocelular – 11,4% (PARK et al , 2005), linfoma de células T/NK sinonasal – 22% (HONGYO et al, 2005), e carcinomas endometriais – 16, 1% (KONOPKA et al, 2007) . Entretanto, as referidas mutações, diferentemente do polimorfismo estudado no gene da E-caderina, em posição específica, localizam-se em diferentes posições do exon 3 e, portanto podem gerar conseqüências distintas . Park et al, em 2005, detectaram 13 mutações missense no exon 3 do gene da β-catenina em carcinomas hepáticos, entretanto, apenas cinco destas mutações geraram modif icações em resíduos serina ou treonina, que representam importantes sítios de fosforilação para a degradação da β- catenina . Assim, entende-se que nem todas as mutações no exon 3 do gene CTNNB1 resultará em acúmulo protéico no citoplasma e conseqüente translocação nuclear . Desta forma, em apenas 4 dos 13 casos sugestivos de mutação observou-se forte imuno-marcação da β-catenina, indicando não haver acúmulo citoplasmático desta proteína em pelo menos 9 dos 13 casos em discussão . Não foi observada associação estatisticamente significativa entre alteração da expressão imuno-histoquímica da β-catenina e padrão variado de mobilidade eletroforética em PCR-SSCP do gene CTNNB1 . A média do índice Hscore dos casos com mutação sugerida (96,31) foi muito similar aos casos considerados dentro do padrão (117,07), indicando que muito provavelmente as variações no padrão de mobilidade eletroforé tica não estejam relacionadas com a al teração da expressão imuno-histoquímica . A provável relação entre mutações no gene CTNNB1 e a marcação nuclear da β-catenina foi investigada . No entanto, dos sete casos exibindo marcação nuclear, apenas dois foram indicativos de mutação do gene CTNNB1 , permitindo sugerir que as possíveis mutações identificadas não estariam relacionadas com a codificação dos aminoácidos responsáveis pela fosforilação da proteína . Sabe-se que o acúmulo nuclear de β-catenina pode não ser resultado apenas da mutação do gene CTNNB1 , mas uma conseqüência da mutação do gene APC , AXIN 1 ou até mesmo da inativação do gene GSK- 3β , que como já foi mencionado é responsável pela degradação proteolítica da β-catenina (GAO et al , 2005, IWAI et al , 2005) . Nesta lógica, Daa et al (2004) encontraram mutação no exon 3 do gene da β-catenina em apenas um dentre 20 casos de carcinomas adenóides císticos avaliados, embora, tenham sido verificadas mutações nos genes APC e AXIN1 . O futuro seqüenciamento das amostras sugestivas de mutação do presente estudo esclarecerá o efeito destas alterações na codificação protéica e, conseqüentemente, em sua expressão, assim como o desfecho da via de sinalização Wnt nestes tumores .   7 . CONCLUSÕES Diante dos nossos resultados, podemos concluir que : 1 . A expressão imuno-histoquímica do complexo E-caderina/β-catenina foi maior, de forma estatist icamente significativa, em carcinomas adenóides císticos que nos adenomas pleomórficos, assim como, dentro dos adenomas pleomórficos foi ausente ou focal nas áreas estromais, levando-se sugerir que a expressão destas proteínas está relacionada com a diferenciação do componente mioepitelial das neoplasias . 2 . Quando os subtipos histológicos do carcinoma adenóide císt ico foram comparados em relação ao padrão de marcação imuno-histoquímica de E- caderina/β-catenina não houve diferença estatisticamente significativa . Tal fato em associação a imuno-marcação reduz ida observada em adenomas pleomórficos – neoplasia benigna – indica que a expressão deste complexo protéico não parece estar relacionada com o comportamento biológico deste tumor maligno . 3 . A redução na marcação imuno-histoquímica da E-caderina nos casos polimórficos em relação aos casos sem polimorfismo, embora não tenha sido estatist icamente significativa, sugere que, em parte, a expressão gênica da E- caderina está diminuída nestes casos . 4 . A semelhança no padrão de expressão imuno-histoquímica de β-catenina entre os grupos com e sem variação na mobilidade eletroforética em PCR- SSCP indica que possíveis mutações do gene CTNNB1 sugeridos nesta amostra não alteram a expressão protéica .    SUMMARY Alterations of E-cadherin and β-catenin genes in pleomorphic adenoma and adenoid cystic carcinoma: molecular and immunohistochemical study Pleomorphic adenoma and adenoid cystic carcinoma represent a benign and malignant salivary gland neoplasm, respectively, that shares the same histological origin, however with distinct biological behavior. The aim of the present study was identify the -160 C/A polymorphism in the gene CDH1, mutational analysis of CTNNB1 gene and evaluation the expression of the E-cadherin and β-catenin in pleomorphic adenomas and adenoid cystic carcinomas. Furthermore, it was proposed correlate the immunochemistry staining patterns with the polymorphism and mutations. Twenty-four pleomorphic adenomas and 24 adenoid cystic carcinomas were retrieved. The polymorphism analysis was performed by restriction fragment length polymorphism (RFLP), using the restriction enzymes HphI or AflIII and the mutational screening was performed by PCR-single strand conformational polymorphism (PCR-SSCP). The immunohistochemical analysis was taken by the counting of cells, recorded as the Hscore index, and considering the presence or absence, intensity, distribution and localization of proteins expression. Comparing the two neoplasms, the results demonstrated statistically significant difference for the E-cadherin and β-catenin expression, with pleomorphic adenoma presenting weaker immunostaining. Was observed statistical correlation between E-cadherin and β-catenin expression. CDH1 heterozigotic polymorphism was seen in two cases and 13 cases displayed abnormal mobility electrophoretic shifts, suggesting CTNNB1 gene mutation. The immunohistochemical expression was not statistically correlated with the polymorphism or suggested mutations. In conclusion this study supports that the E-cadherin/β-catenin complex immunohistochemical expression might be related with the myoepithelial component amount and differentiation neither the tumor biological behavior. The cases that showed E-cadherin gene polymorphism presented reduced protein expression and, moreover, CTNNB1 suggested mutations seem not influence in the β-catenin protein expression. Key-words: Pleomorphic adenoma, adenoid cystic carcinoma, E-cadherin, β-catenin, RFLP, SSCP.    REFERÊNCIAS1 AL-KHATEEB, T . H.; ABABNEH , K . T . Salivary tumors in north Jordanians : a descriptive study. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod , S t . Louis, v .103, n .5, p .53-9, May. 2007 . ANDREADIS , D. et al . Immunohistochemical detection of E-cadherin in certain types of salivary gland tumours . J Laryngol Otol , Cambridge, v .120, n .4, p .298-304, Apr . 2006 . ANSARI, M. H. Salivary gland tumors in a Iranian population : a retrospective study of 130 cases . J Oral Maxillofac Surg , Philadelphia, v .65, n .11, p .2187- 94, Nov . 2007 . ARAÚJO , V. C. et al . Application of immunohistochemistry to the diagnosis of salivary gland tumors . App l Immuno Mol Morphol , Hagerstown, v .8, n .3, p .195-202, Sep . 2000 . ARAÚJO , V. C.; ARAÚJO N . S . V imentin as a marker of myoepithelial cells in salivary gland tumors . Eur Arch Otorhino laryngol , Heildelberg, v .247, n .4, p .252-5, Apr . 1990 .   1 Segundo a normalização realizada pela Associação Brasileira de Normas e Técnicas (ABNT-NRB 6023/2002) ARAÚJO , V. C.; CARVALHO , Y. R.; ARAÚJO , N . S . Actin versus vimentin in myoepithelial cells of salivary gland tumors . A comparative study. Oral Surg Ora l Med Ora l Pathol , S t Louis, v .77, n .4, p .387-91, Apr . 1994 . BÁNKFALVI, A. et al . Deranged expression of the E-cadherin/β -catenin complex and the epidermal growth factor in the clinical evolution and progression of oral squamous cell carcinomas J Ora l Pathol Med , Copenhagen, v .31, n .8, p .450-457, Sep . 2002 . BÀNKFALVI, A. et al . Immunophenotypic and prognostic analysis of E- cadherin and beta-catenin expression during breast carcinogenesis and tumor progression: a comparative study with CD44 . Histopathology , Oxford, v .34, n .1, p .25-34, Jan . 1999 . BEAVON , I. R. G. The E-cadherin-catenin complex in tumour metastasis : structure, function and regulation . Eur J Cancer , Oxford, v .36, n .13, p .1607- 1620, Aug . 2000 . BENTO , P. M. et al . Tenascin and fibronectin in pleomorphic adenoma of the salivary gland . J App l Oral Sci , Bauru, v .14, n .3, p .198-202, Jun . 2006 . BRADLEY , P.J . Adenoid cystic carcinoma of the head and neck: a review . Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg , Philadelphia, v .12, n .2, p .127-32, Apr . 2004 . CALDEIRA , J . R. et al . CDH1 promoter hypermethylation and E-cadherin protein expression in infi l t rating breast cancer. BMC Cancer , London, v .6, n .48, Mar . 2006 . CAO , X. et al . Beta-catenin gene alteration in glandular stomach adenocarcinomas in N-methy-N-nitrosourea-t reated and Helicobacter pylori- infected Mongolian gerbils . Cancer Sci , Oxford, v .95, n .6, p .487-90, Jun . 2004 . COWIN , P ; ROWLANDS , T . M; HATSELL, S . J . Cadherins and catenins in breast cancer . Curr Opin Cell B iol , Philadelphia, v .17, n .5, p .499–508, Oct . 2005 . CRUZ-PEREZ, D. E. et al . Adenoid cys tic carcinoma and mucoepidermoid carcinoma of the maxillary sinus: report of a 44-year experience of 25 cases from a single inst itution . J Oral Maxillofac Surg , Philadelphia, v .64, n .11, p .1592-7, Nov . 2006 . DAA , T . et al . Expression of beta-catenin, E-cadherin and cyclin D1 in adenoid cystic carcinoma of the salivary gland . J Exp Clin Cancer Res , Roma, v .24, n .1, p .83-7, Mar . 2005 . DAA , T . et al . Mutations in components of the Wnt signaling pathway in adenoid cystic carcinoma . Mod Pathol , Hagerstown, v .17, n .12, p .1475-82, Dec . 2004 . DARDICK, I. Color At las/Text of Salivary Gland Patho logy . New York: Igaku-Shoin Medical Publishers, 1996 . 274p . DARDICK, I. et al . P leomorphic adenoma, I: ultrastructural organization of “epithelial” regions . Hum Pathol , Philadelphia, v .14, n .9, p .780-97, Sep . 1983 . DARDICK, I. P leomorphic adenoma, II: ultrastructural organization of “stromal” regions . Hum Patho l , Philadelphia, v .14, n .9, p .798-809, Sep . 1983 . DODD , R. L. ; SLEVIN , N . J . Salivary gland adenoid cyst ic carcinoma: a review of chemotherapy and molecular therapies . Oral Onco l , Oxford, v .42, n . 8, p .759-69, Sep . 2006 . ECONOMOPOULOU , P.; HANBY , A.; ODELL, E. W . Expression of E- cadherin, cellular differentiat ion and polarity in epithelial salivary neoplasms . Oral Oncol , Oxford, v . 36, n . 6, p .515-8, Nov . 2000 . ELLIS , G. L.; AUCLAIR , P. L. Tumors of the Salivary Glands: Atlas of Tumor Pathology, 3 ed . Washington, D.C: Armed Forces Institute of Pathology, 1996 . 468 p . EL-NAGGAR , H.; HUVOS , A. G. Adenoid cyst ic carcinoma . In: Barnes, L. et al (Eds) . Pathology and Genetics of Head and Neck Tumors. Lyon : IARC Press, 2005 . p . 221-2 . EVESON , et al . P leomorphic adenoma . In: Barnes, L. et al (Eds) . Pathology and Genetics of Head and Neck Tumors. Lyon : IARC Press, 2005 . p . 254- 258 . FOSCHINI, M.P. et al . Differential expression of myoepithelial markers in salivary, sweat and mammary glands . Int J Surg Pathol , Thousand Oaks, v .8, n .1, p .29-37, Jan . 2000 . FRANÇA , C. M. et al . Effect of N-CAM on in vitro invasion of human adenoid cystic carcinoma cells . Oral Oncol , Oxford, v .37, n .8, p .638-42, Dec . 2001 . FRANCHI, A. et al . Reduced e-cadherin expression correlates with unfavorable prognosis in adenoid cystic carcinoma of salivary glands of the oral cavity. Am J Cl in Pathol ¸ Philadelphia, v .111, n .1, p .43-50, Jan . 1999 . FREIER , K . et al . Differential KIT expression in histological subtypes of adenoid cystic carcinoma (ACC) of the salivary gland . Oral Onco l , Oxford, v .41, n . 9, p .934-9, Oct . 2005 . FURUSE , C. et al . Beta-catenin and E-cadherin expression in salivary gland tumors . Int J Surg Pathol , Thousand Oaks, v .14, n .3, p .212-7, Jul . 2006 . FURUSE , C. et al . Myoepithelial cell markers in salivary gland neoplasms . Int J Surg Pathol , Thousand Oaks, v .13, n .1, p .57-65, Jan . 2005 . GAO , S . et al . Cytoplasmic expression of E-cadherin and beta-catenin with LOH and hypermethylation of the APC gene in oral squamous cell carcinomas . J Oral Pathol Med , Copenhagen, v .34, n .2, p .116-9, Feb . 2005 . GARCIA-ROSTAN , G. et al . Beta-catenin dysregulation in thyroid neoplasm: down-regulation, aberrant nuclear expression, and CTNNB1 exon 3 mutations are markers for aggressive tumors phenotypes and poor prognosis . Am J Pathol , Philadelphia, v .158, n .3, p . 978-96, Mar . 2001 . GOTO , T . et al . S ignificance of an E-cadherin gene promoter polymorphism for risk and disease severity of prostate cancer in a Japonese population . Urology , New York, v .70, n .1, p .127-30, Jul . 2007 . HADDAD , A. et al . Adenoid cystic carcinoma of the head and neck: a clinicopathologic study of 37 cases . J Otolaryngol , Hamilton, v .24, n .3, p .201-5, Jun . 1995 . HAJRA , K . M.; FEARON , E. R. Cadherin and catenin alteration in human cancer . Genes Chromosomes Cancer , New York, v .34, n .3, p .255-68, Jul, 2002 . HOLST , V. A. et al . KIT protein expression and analysis of c-kit gene mutation in adenoid cystic carcinoma . Mod Patho l , Hagerstown, v .12, n .10, p .956-60, Oct . 1999 . HONGYO , T . et al . p53, K-ras, c-kit and beta-catenin gene mutations in sinonasal NK/T-cell lymphoma in Korea and Japan . Oncol Rep , Athens, v .13, n .2, p .265-71, Feb . 2005 . HUTCHESON , J . A. et al . Neural cell adhesion molecule expression in adenoid cyst ic carcinoma of the head and neck . Laryngoscope , Philadelphia, v .110, n .6, p .946-8, Jun . 2000 . IDE , F.; TANAKA , A.; KUSAMA , K . Further evidence for adypocyt ic differentiation by the neoplastic myoepithelium . J Oral Pathol Med , Copenhagen, v .36, n .3, p .187-9, Mar . 2007 . ITO , F. A. et al . Salivary gland tumors in a Braz ilian population: a retrospective study of 496 cases . Int J Oral Maxillofac Surg , Copenhagen, v .34, n . 5, p .533-6, Jul . 2005 . IWAI, S . et al . Mutations of the APC , beta-catenin, and axin 1 genes and cytoplasmic accumulation of beta-catenin in oral squamous cell carcinoma . J Cancer Res Clin Oncol , Berlin, v .131, n .12, p .773-82, Dec . 2005 . J IA , L. et al . Prognostic value of apoptosis and apoptosis-associated proteins in salivary gland adenoid cystic carcinoma . Pathol Int , Carlton South, v .54, n . 4, p .217-23, Apr . 2004 . KAMOTO , T . et al . Association of a genetic polymorphism of the E-cadherin gene with prostate cancer in a Japanese population. Japanese J Clin Oncol , Tokyo, v .35, n .3, p .158-61, Mar . 2005 . KANDASAMY , J . et al . Heterogeneity of PLAG1 gene rearrangements in pleomorphic adenoma . Cancer Genet Cytogenet , New York, v .177, n .1, p .1- 5, Aug . 2007 . KAS , K . et al . promoter swapping between the genes for a novel z inc finger protein and beta-catenin in pleomorphic adenomas with t(3;8)(p21;q12) translocations . Nat Genet , New York, v .15, n .2, p .170-4, Feb . 1997 . KHAN , A. J . et al . Adenoid cystic carcinoma: a retrospective clinical review . Int J Cancer , New York, v .96, n .3, p .149-158, Jun . 2001 . KIEMENEY , L. A. et al . Polymorphisms in the E-cadherin (CDH1) gene promoter and the bladder cancer . Eur J Cancer , Oxford, v .42, n .18, p .3219- 27, Dec . 2006 . KOKEMUELLER , H. et al . Adenoid cyst ic carcinoma of the head and neck-a 20 years experience . Int J Oral Maxil lofac Surg , Copenhagen v .33, n .1, p .25-31, Jan . 2004 . KONOPKA , B. et al . Molecular genetic defects in endometrial carcinomas : microsatellite instability, PTEN and beta-catenin (CTNNB1) gene mutations . J Cancer Res C lin Oncol , Berl in, v .133, n .6, p .361-71, Jun . 2007 . KOOLS , P. F. et al . Identification of the chromossome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t(1;12)(p22;q15) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet , New York, v .79, n .1, p .1-7, Jan . 1995 . LEBRET , S . C. et al . Myoepithelial molecular markers in human breast carcinoma PMC42-LA cells are induced by extracellular matrix and stromal cells . In Vi tro Ce ll Dev Biol Anim , Columbia, v .42, n .10, p .298-307, Nov- Dec . 2006 .  LI, L. C. et al . A single nucleotide polymorphism in the E-cadherin gene promoter alters transcriptional activities . Cancer Res , Baltimore, v .60, n .4, p .873-6, Feb . 2000 . LI, X. D. et al . No association exists between E-cadherin gene polymorphism and tumor recurrence in patients with hepatocellular carcinoma after transplantation . Hepatobil iary Pancreat Dis Int , Qingchunru, v .6, n .3, p .254-8, Jun . 2007 . LICITRA , L. et al . Major and minor salivary glands tumours . Crit Rev Onco l Hematol , Boca Raton, v .45, n .2, p .215-225, Feb . 2003 . LIMA , S . S . et al . Epidemiologic profile of salivary gland neoplasms: analysis of 245 cases . Rev Bras Otorrinolaringol , São Paulo, v .71, n .3, p .335-40, May-Jun . 2005 . LIU , Y. C. et al . Helicobacter pylori infection in relation to E-cadherin gene promoter polymorphism and hypermethylation in sporadic gastric carcinomas . Wor ld J Gastroenterol , Beijing, v .11, n .33, p .5174-9, Sep . 2005 . LIU , Y. C. et al . Mechanisms inactivating the gene for E-cadherin in sporadic gastric carcinomas . Wor ld J Gastroenterol , Beijing, v .12, n .14, p .2168-73, Apr . 2006 . MACIEJEWSKI, A.; SZYMCZYK, C.; WIERZGON . Outcome of surgery for adenoid cystic carcinoma of head and neck region . J Craniomaxi llofac Surg , Edinburgh, v .30, n . 30, p .59-61, Feb . 2002 . MARK, J .; DAHLENFORS , R.; WEDELL , B . Impact of the in vitro technique used on the cytogenetic patterns in pleomorphic adenomas . Cancer Genet Cytogenet , New York, v .95, n . 1, p .9-15, May. 1997 . MARTINS , M. D. et al . Expression of cytoskeletal proteins in developing human minor salivary glands . Eur J Ora l Sci , Copenhagen, v .110, n .4, p .316- 21, Aug . 2002 . MARUYA , S . et al . Promoter methylat ion and protein expression of the E- cadherin gene in the clinicopathologic assessment of adenoid cystic carcinoma . Mod Pathol , Hagerstown, v .17, n .6, p .637-45, Jun . 2004 . McCARTY , K . S . Jr . et al . Estrogen receptor analysis . Correlation of a biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies . Arch Pathol Lab Med , Chicago, v .109, n .8, p .716- 21, Aug, 1985 . MENKE , A. et al . Down-regulation of E-cadherin gene expression by collagen type I and type III in pancreatic cancer cell l ines . Cancer Res , Baltimore, v .61, n .8, p .3508-17, Apr . 2001 . MIGUEL, M. C. Hyperplasia of myoepithelial cells expressing calponin during atrophy of the rat parotid gland induced by duct l igation . Histochem J , London, v .34, n .10, p .499-506, Oct . 2002 . MOON , K . C. et al . Distinct expression patterns of the E-cadherin and β- catenin in signet ring cell carcinoma components of primary pulmonary adenocarcinoma . Arch Pathol Lab Med , Chicago, v .130, n .9, p .1320-5, Sep . 2006 . MOON , R. T . et al . Wnt and β-catenin signalling: diseases and therapies . Nat Rev Genet , London, v .5,n .9, p .691-701, Sep . 2004 . NORRIS , A. L. et al . Characterization of the human beta-catenin gene . Mamm Genome , New York, v .7, n .2, p .160-2, Feb . 1996 . OGAWA , Y. Immunocytochemistry of myoepithelial cells in the salivary glands . Prog Histochem Cytochem , Jena, v .38, n . ,4, p .343-426, Apr . 2003 . OLIVEIRA , C. et al . E-Cadherin (CDH1) and p53 rather than SMAD4 and Caspase-10 germline mutations contribute to genetic predisposition in Portuguese gastric cancer patients . Eur J Cancer , Oxford, v .40, n .12, p .1897–1903, Aug . 2004 . OLIVEIRA , C. et al . Role of pathology in the identification of hereditary diffuse gastric cancer: report of a Portuguese family. Virch Arch , Berlin, v .446, n . 2, p .181-4, Feb . 2005 . ORITA , M. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphism using polymerase chain reaction . Genomics , San Diego, v .5, n .4, p .874-9, Nov . 1989 . OZAWA , M.; BARIBAULT , H.; KEMLER , R. The cytoplasmic domain of the cell adhesion molecule uvomorulin associates with three independent proteins structurally related in different species . EMBO J , Oxford, v .8, n .6, p .1711-7, Jun . 1989 . PARK, J . Y. et al . Mutations of β-catenin and AXIN1 genes are a late event in human hepatocelular carcinogenesis. L iver Int , Oxford, v .25, n .1, p .70-76, Feb, 2005 . PARK, W . S . et al . A single nucleotide polymorphism in the E-cadherin gene promoter -160 is not associated with risk of Korean gastric cancer . J Korean Med Sc i , Seoul, v .18, n .4, p .501-504, Aug . 2003 . PASTORE , A; CARINCI, F; PELUCCHI, S . Genetic expression profiling of parotid neoplasms by cDNA microarrays . Acta Otorhinolaryngol Ita l , P isa, v .156-160, n .3, p .153-60, Jun . 2004 . PEINADO H , PORTILLO F , CANO A. Transcriptional regulation of cadherins during development and carcinogenesis . Int J Dev B iol , Vizcaya, v .48, n .5-6, p .365-375, 2004 . PEREZ-ORDONEZ, B. Selected topics in salivary gland tumour pathology. Curr Diagn Pathol , New York, v .9, n .6, p .355-65, Dec . 2003 . PETRUZZELLI, L. ; TAKAMI, M.; HUMES , D. S tructure and function of cel l adhesion molecules . Am J Med , New York, v .106, n .4, p .467-476, Apr . 1999 . PIRES , F. R. et al . Intra-oral minor salivary gland tumors: A clinicopathological study of 546 cases . Oral Oncol , Oxford, v .14, n .5, p . 463-70, May. 2007 . POOKOT , D. et al . The E-cadherin -160 C /A polymorphism and prostate câncer risk in White and Black American men . J Uro l , Hagesstown, v .176, n .2, p .793-6, Aug . 2006 . PRADO , R. F.; CONSOLARO , A.; TAVEIRA. L. A. Expression of beta- catenin in carcinoma in pleomorphic adenoma, pleomorphic adenoma and normal salivary gland: an immunohistochemical study. Med Oral Pato l Oral Cir Bucal , Valencia, v .11, n .3, p .247-51, May. 2006 . QUEIMADO , L. et al . P leomorphic adenoma gene 1 is expressed in cultured benign and malignant salivary gland tumor cells . Lab Invest , New York, v .79, n .5, p .583-9, May. 1999 . RAMBURAN , A.; GOVENDER , D. Cadherins and catenins in pathology. Curr Diag Pathol , New York, v .8, n .5, p .305-17, Oct . 2002 . RAPIDIS , A. D. et al . Adenoid cystic carcinoma of the head and neck . C linicopathological analysis of 23 patients and review of the literature . Oral Oncol , Oxford, v .41, n .3, p . 328-325, Mar . 2005 . SALAHSHOR , S . et al . Low frequency of the E-cadherin alterations in familial breast cancer . Breast Cancer Res , London, v .3, n .3, p .199-207, Mar . 2001 . SAVERA , A. T .; GOWN , A. M.; ZARBO , R. J . Immunolocalization of novel smooth muscle-specific proteins in salivary gland pleomorphic adenoma: Assessment of the morphogenetic role of myoepithelium . Mod Pathol , Hagerstown, v .10, n .11, p .1093-100, Nov . 1997 . SCHÖN , M. et al . Human sweat gland myoepithelial cells express a unique set of cytokeratins and reveal the potential for alternative epithelial and mesenchymal differentiation states in culture . J Cell Sci , London, v .112, n .12, p .1925-36, Jun . 1999 . SCULLY , C. et al . Epithelial biology. Ora l Dis , Copenhagen, v .11, n .2, p .58-71, Mar . 2005 . SEIFERT , G.; SOBIN , L. H. Histological classif ication of salivary gland tumors. 2 ed . Berl in: Springer-Verlag, 1991 . 113p . SHAN , K . et al . Association of three single nucleotide polymorphism of the E-cadherin gene with endometriosis in a Chinese population . Reproduction , Bristol, v .134, n .2, p .373-8, Aug . 2007 . SHANG , J . et al . Expression of neural cell adhesion molecule in salivary adenoid cystic carcinoma and its correlation with perineural invasion . Oncol Rep , A thens, v .18, n .6, p .1413-6, Dec . 2007 . SKIBOLA , C. F. et al . Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene are associated with susceptibility to acute leukemia in adults . PNAS, Washington, v .96, n .22, p .12810-5, Oct . 1999 . SMITH , J . A. Methylation status of genes in papil lary thyroid carcinoma . Arch Otolaryngo l Head Neck Surg , Chicago, v .133, n .10, p .1006-11, Oct . 2007 . SOUSA , S . O. M.; ARAÚJO , V. C. Estudo morfológico e imuno-histoquímico do adenoma pleomórfico de glândula salivar menor. RPG, São Paulo, v .1, n .2, p .22-6, Abr/Jun . , 1994 . SPIRO , R.H. D istant metastasis in adenoid cystic carcinoma of sal ivary origin . Am J Surg , New York, v . 174, n .5, p . 495-8, Nov . 1997 . STENNERT , E. et al . Histopathology of pleomorphic adenoma in the parotid gland: a prospective unselected series of 100 cases . Laryngoscope , Philadelphia, v .111, n .12, p .2195-200, Dec . 2001 . SUR , R. K . et al . Adenoid cystic carcinoma of the salivary glands: a review of 10 years . Laryngoscope , Philadelphia, v .107, n .9, p .1276-80, Sep . 1997 . TAKAHARA , M. p53, N- and K-Ras, and beta-catenin gene mutations and prognostic factors in nasal NK/T-cell lymphoma from Hokkaido, Japan . Hum Pathol , Philadelphia, v .35, n .1, p .86-95, Jan . 2004 . TAKAHASHI-YANAGA , F. ; SASAGURI, T . The Wnt/β-catenin signaling pathway as a target in drug discovery. J Pharmacol Sci , Kyoto, v .104, n .4, p .293-302, Aug, 2007 . TAN , D. S . et al . The biological and prognostic signif icance of cel l polarity and E-cadherin in grade I inf iltrating ductal carcinoma of the breast . J Pathol , London, v .189, n .1, p .20-7, Sep . 1999 . TINCANI, A. J . et al . Management of salivary gland adenoid cyst ic carcinoma : inst itutional experience of a case series . Sao Pau lo Med J , São Paulo, v .124, n .1, p .26-30, Jan . 2006 . TOIDA , M. et al . Intraoral minor salivary gland tumors: a clinicopathological study of 82 cases . Int J Oral Maxillofac Surg , Copenhagen, v .34, n .5, p .528- 32, Jul, 2005 . TRIANTAFILLIDOU , K . et al . Management of adenoid cys tic carcinoma of minor salivary glands . J Oral Maxillofac Surg , Philadelphia, v .64, n .7, p . 1114-20, Jul . 2006 . VERHAGE , B . A. et al . S ingle-nucleotide polymorphism in the E-cadherin gene promoter modifies the risk of prostate cancer . Int J Cancer , Genève, v .100, n .6, p .683-5, Aug . 2002 . VOZ, M.L. et al . Microarray screening for target genes of the proto-oncogene PLAG1 . Oncogene , Basingstoke, v .23, n .1, p .179-91, Jan . 2004 . WANG , D. et al . Intraoral minor salivary gland tumors in a Chinese population: a retrospective study on 737 cases . Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod , S t . Louis, v .104, n .1, p .94-100, Jul . 2007 . WANG , G. Y. The E-cadherin gene polymorphism 160 C /A and cancer risk : a HuGe review and meta-analysis of 26 case-control studies . Am J Epidemiol , Cary, v .167, n .1, p .7-14, Jan . 2008 . WHEELOCK, M.J . , JOHNSON , K .R. Cadherins as modulators of cellular phenotype . Annu Rev Cell Dev B iol , Palo Alto, v .19, p .207-35, 2003 . WIJNHOVEN BP , DINJENS WN , PIGNATELLI M. E-cadherin-catenin cell- cell adhesion complex and human cancer . Br J Surg , Chichester, v .87, n .8, p .992-1005, Aug . 2000 . WOODSON , K . et al . Hypermethylation of GSTP1, CD44, and E-cadherin genes in prostate cancer among US B lacks and Whites . Prostate , New York, v .55, n .3, p .199-205, May. 2003 . YASUMATSU , R. et al . Cyclin D1 expression does not effect cell proliferation in adenoid cyst ic carcinoma of the salivary gland . Eur Arch Otorhinolaryngol , Heildelberg, v .4, n .10, p .123-130, Dec . 2004 . ZBAREN , P.; STAUFFER , E. P leomorphic adenoma of the parotid gland: histopathologic analysis of the capsular characteristics of 218 tumors . Head Neck , New York, v .29, n .8, p .751-7, Aug . 2007 . ZHANG , C. Y. et al . Promoter methylation as a common mechanism for inactivating E-cadherin in human salivary gland adenoid cystic carcinoma. Cancer , Genève, v .110, n .1, p .87-95, Jul . 2007 . ZHANG , Z . Y. et al . The expression of E-cadherin- catenina complex in adenoid cystic carcinoma of salivary glands . Chin J Res , Beijing, v .3, n .3, p .36-39, Nov . 2000 . ZHOU , C. X.; GAO , Y. Aberrant expression of beta-catenin, P in1 and cylin D1 in salivary adenoid cystic carcinoma : relation to tumor proliferation and metastasis . Oncol Rep , Athens, v .16, n .3, p .505-11, Nov . 2006 .