1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Monique Gomes Dantas CARACTERIZAÇÃO TÉRMICA E DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DAS GUANILHIDRAZONAS WE005, WE015 E WE016 ORIENTADOR: Prof. Dra. Ana Paula Barreto Gomes COORIENTADOR: Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão NATAL-RN 2015 2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Monique Gomes Dantas CARACTERIZAÇÃO TÉRMICA E DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DAS GUANILHIDRAZONAS WE005, WE015 E WE016 Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas ORIENTADOR: Prof. Dra. Ana Paula Barreto Gomes COORIENTADOR: Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão NATAL-RN 2015 3 CATALOGAÇÃO NA FONTE CATALOGAÇÃO NA FONTE D192c Dantas, Monique Gomes. Caracterização térmica e desenvolvimento de método analítico para determinação simultânea das guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 / Monique Gomes Dantas. – Natal, 2014. 112f.: il. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Paula Barreto Gomes. Coorientador: Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 1. Farmacologia – Dissertação. 2. Guanilhidrazonas – Dissertação. 3. Técnicas térmicas – Dissertação. 4. Planejamento fatorial – Dissertação. I. Gomes, Ana Paula Barreto. II. Título. RN-UF/BS-CCS CDU: 615.01 (043.3) 4 5 Aos meus pais Gebson e Sueli 6 AGRADECIMENTOS A Deus pela vida, pelas bênçãos concedidas e por fazer realizar sempre o Seus planos em minha vida; Aos meus pais Gebson Brito Dantas e Sueli Gomes Ferreira Dantas por todo o amor, compreensão e apoio constante, por serem os grandes responsáveis por todas as vitórias; a minha família que é o meu maior tesouro; A minha orientadora, professora Ana Paula Barreto Gomes, pela confiança a mim concedida, por todo apoio, compreensão, orientação, por todas as vezes em que foi admiravelmente humana ao educar e se fazer presente em todos os aspectos da minha formação humana e acadêmica; Ao meu coorientador, professor Cícero Flavio Soares Aragão, por ter acreditado em mim, por todas as orientações, estímulo, dedicação, por todos os ―insigths‖ nas horas certas, pela paciência e pelos ensinamentos de vida; Aos professores Fernando Henrique Nogueira, Maria de Fátima Vitória, Fábio Santos, Waldenice Morais, Euzébio Guimaraes e Silvana Zucolotto por terem contribuído com esse trabalho; A Lílian Grace da Silva Solon por ser uma amiga muito especial, por ter me ensinado, me motivado, por compartilhar diversos momentos importantes pra minha formação pessoal e acadêmica; A toda família LCQMed pela acolhida, por todos os momentos de fé, de alegria, união, força e amizade. Aos meus queridos amigos Fátima Duarte Freire, Wanessa Azevedo de Brito, Cândida Mendonça, Regina Carmem Espósito, Klécia Santos, Leandro Vinícius, Themístocles Begreiros, Nilma Ramiro, Thereza Milene, Edilamar, Wydaiany, Maxciara, Gessiane, Graziene Lopes, muitíssimo obrigada por serem parceiros em todas as horas, por terem me ensinado tantas coisas. Não caberia nessa dissertação. Amo vocês! Ao professor João Xavier pela atenção e doação das amostras utilizadas nesse estudo; Aos professores, alunos e funcionários da Universidade Federal do Rio Grande do Norte que contribuíram para esse trabalho; Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêutica por todo o apoio concedido; A CAPES pela bolsa de estudos. 7 ―A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original‖ (Albert Einstein) 8 RESUMO Guanilhidrazonas são substâncias amplamente estudadas por apresentar grande potencial biológico, principalmente atividades antitumoral, antimicrobiana, antimalárica, anti- hipertensiva e antifúngica. Nesse estudo foram avaliadas as guanilhidrazonas sintéticas WE005 (3,4-dimetoxibenzaldeídoguanilhidrazona), WE015 (benzaldeídoguanilhidrazona) e WE016 (metil-4-formilbenzoatoguanilhidrazona) com o objetivo de caracterizar e desenvolver método analítico utilizando técnicas térmicas (DSC e TG), espectroscópica (FTIR), microscópica (MEV) e cromatográfica (CLUE/DAD). Na caracterização por DSC e TG foram utilizadas as seguintes razões de aquecimento: 2,5; 5,0; 10 e 20 °C/min em atmosfera de nitrogênio (50 mL/min) até 500°C (DSC) e 900°C (TG). O estudo cinético foi feito através do método de Ozawa. A análise na região do infravermelho médio das moléculas foi realizada a temperatura ambiente e na temperatura de fusão. Os espectros foram comparados através da correlação de Pearson utilizando o algoritmo ad hoc. Para o desenvolvimento do método analítico foi utilizado o planejamento fatorial. As técnicas térmicas foram capazes de caracterizar as moléculas através de suas transições de fase e etapas na curva termogravimétrica, informando ainda sobre a estabilidade térmica, com temperatura inicial de decomposição em torno de 240 °C. O estudo cinético mostrou que as velocidades de decomposição térmica das moléculas apresentam ordem zero e que a amostra WE016 apresentou maior energia de ativação. Os espectros de infravermelho de acordo com a correlação de Pearson apresentaram mudanças significativas entre a temperatura ambiente e o espectro da faixa de fusão. O planejamento fatorial através dos gráficos de superfície-resposta e Pareto revelou que a variável de maior influência sobre todas as variáveis dependentes foi o comprimento da coluna. O melhor método para a separação das guanilhidrazonas deste estudo foi: coluna C18 (50 mm x 2 mm t.p. 2.2 μm), fase móvel MeOH:H2O:TEA 40:60:0,1, pH 3,5 ajustado com ácido acético; fluxo de 0,2 mL/min, temperatura do forno 30 °C. A concentração final das guanilhidrazonas foi de 30 µg/mL e foram detectadas simultaneamente através do comprimento de onda de 290 nm. Um método rápido foi desenvolvido para separar as guanilhidrazonas WE005, WE015 E WE016 por CLUE/DAD. Planejamento fatorial foi uma ferramenta útil para o desenvolvimento racional do método. Palavras-chaves: guanilhidrazonas, técnicas térmicas, CLUE/DAD, planejamento fatorial 9 ABSTRACT Guanilhidrazonas substances are widely studied for presenting great biological potential, especially antitumor activity, antimicrobial, antimalarial, antifungal and anti-hypertensive. This study assessed the synthetic guanylhydrazones WE005 ((2-[(3,4- dimethoxyphenyl)methylene]-hydrazinecarboximidamide),WE015 (2(phenylmethylene)- hydrazinecarboximidamide) and WE016 (4-[[2-(aminoiminomethyl) hydrazinylidene]methyl]-benzoic acid methyl ester) in order to characterize and develop analytical method using thermal techniques (DSC and TGA), spectroscopic (FTIR ) and microscopic (SEM) and chromatographic (UHPLC / DAD). The characterization by DSC and TG were used the following heating rates: 2.5; 5.0; 10 and 20 º C / min in a nitrogen atmosphere (50 ml / min) to 500 ° C (DSC) and 900 ° C (TG). The kinetic study was done by Ozawa method. The analysis in the mid-infrared region of molecules was performed at room temperature and the melting temperature. The spectra were compared using Pearson's correlation using ad hoc algorithm. For the development of the analytical method was used factorial design. Thermal techniques have been able to characterize the molecules through their phase transitions and steps in the thermogravimetric curve, and telling about the thermal stability, with an initial decomposition temperature of about 240 ° C. The kinetic study showed that the speed of the thermal decomposition of molecules has zero order and that the WE016 sample showed higher activation energy. Infrared spectra according to the Pearson correlation showed significant changes between the room temperature and the melting range of the spectrum. The factorial design through surface-response graphs and Pareto showed that the most influential variable on all dependent variables was the length of the column. The best method for the separation of guanylhydrazones this study was: C18 column (50 mm x 2 mm tp 2.2 microns), mobile phase MeOH: H2 O: TEA 40: 60: 0.1, pH 3.5 adjusted with acetic acid; flow rate of 0.2 ml / min, oven temperature 30 ° C. The final concentration of guanylhydrazones was 30 mg / mL and were detected simultaneously by a wavelength of 290 nm. A rapid method was developed to separate guanylhydrazones WE005, WE015 and WE016 by CLUE / DAD. Factorial design was a useful tool for the rational development of the method. Keywords: guanylhydrazones, thermal techniques, UHPLC/DAD, factorial design 10 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Estrutura química da WE005 (a), WE015 (b) e WE016 (c) 24 Figura 2 – Estrutura molecular e logP da amostra WE005 ................... 24 Figura 3 – Distribuição das espécies conforme alteração de pH para a amostra WE005..................................................................................... 25 Figura 4 – Estrutura molecular e logP da amostra WE015.................. 25 Figura 5 – Distribuição das espécies conforme alteração de pH para a amostra WE015 ..................................................................................... 26 Figura 6 – Estrutura química e logP da amostra WE016....................... 26 Figura 7 – Distribuição das espécies conforme mudança de pH da amostra WE016 ..................................................................................... 27 Figura 8 - Curvas DSC da amostra WE005 nas razões de aquecimento 2,5; 5,0; 10,0 e 20 ºC/min em atmosfera de nitrogênio ... 47 Figura 9 - Curvas TG da WE005 nas razões de 2,5; 5; 10 e 20°C/min 48 Figura 10 - Curvas TG e DSC da amostra WE005, na razão de aquecimento de 10ºC/min ................................................................... 50 Figura 11 - Curvas calorimétricas da amostra WE015 nas razões de aquecimento 2,5; 5,0; 10,0 e 20 ºC/min em atmosfera de nitrogênio ... 51 Figura 12 - Curvas TG da WE015 nas razões de 2,5; 5; 10 e 20°C/min .............................................................................................. 52 Figura 13 - Sobreposição das curvas TG e DSC da amostra WE015, na razão de aquecimento de 10ºC/min ............................................... 53 Figura 14 - Curvas calorimétricas da amostra WE016 nas razões de aquecimento 2,5; 5,0; 10,0 e 20ºC/min ................................................. 54 Figura 15 - Sobreposição das curvas TG da WE016 nas razões de 2,5, 5,0, 10,0 e 20,0°C/min .......................................................................... 55 Figura 16 - Sobreposição das curvas TG e DSC da amostra WE016, na razão de aquecimento de 10ºC/min .................................................. 57 Figura 17 - Sobreposição das curvas DSC(A) e TG(B) da WE005, WE015 e WE016 na razão de 10°C/min .............................................. 58 Figura 18 – Curvas do (A) logaritmo da razão de aquecimento (logß) em função do inverso da temperatura (K) e da função G(X) pelo inverso da temperatura (K) da WE005................................................................................................... 59 Figura 19 – Curvas do (A) logaritmo da razão de aquecimento (logß) em função do inverso da temperatura (K) e da função G(X) pelo inverso da temperatura (K) da WE015................................................................................................... 59 Figura 20 - Curvas do (A) logaritmo da razão de aquecimento (logß) em função do inverso da temperatura (K) e da função G(X) pelo inverso da temperatura (K) da WE016.................................................. 60 11 Figura 21 - Espectros de infravermelho das guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 em temperatura ambiente e durante a fusão e a correlação de Pearson............................................................................ 61 Figura 22 - Imagens de microscopia eletrônica de varredura das guanilhidrazonas ................................................................................... 62 Figura 23 – Espectros UV das guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016................................................................................................... 63 Figura 24 – Cromatograma obtido por CLUE da mistura de WE005, WE015 e WE016 no método de gradiente ............................................ 64 Figura 25 – Cromatogramas obtidos a partir do planejamento fatorial 1............................................................................................................. 67 Figura 26 – Cromatogramas obtidos a partir do planejamento fatorial 2 ........................................................................................................... 70 Figura 27 – Gráfico de superfície-resposta e de Pareto referente a variável tempo de retenção................................................................. 72 Figura 28 – Gráfico de superfície-resposta e de gráfico de Pareto referente à variável número de pratos teóricos.................................... 73 Figura 29 – Gráfico de superfície-resposta e gráfico de Pareto referente a variável fator de cauda....................................................... 74 Figura 30 – Gráfico de superfície-resposta e gráfico de Pareto referente a variável resolução................................................................ 75 Figura 31 – Cromatograma da melhor condição experimental ........... 76 Figura 32 - Espectro 3D das guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 .................................................................................................. 77 12 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Descrição dos fatores e níveis estudados no planejamento fatorial 1 para o desenvolvimento do método por CLUE-DAD ............................................... 44 Tabela 2 - Descrição dos fatores e níveis estudados no planejamento fatorial 2 para o desenvolvimento do método por CLUE-DAD ............................................... 44 Tabela 3 – Dados das curvas DSC da WE005 nas razões de 2,5; 5,0; 10,0 e 20 ºC/min em atmosfera de nitrogênio ........................................................................... 48 Tabela 4 – Dados das curvas TG não isotérmicas da WE005 nas razões de 2,5, 5,0, 10 e 20°C/min em atmosfera de nitrogênio ............................................................... 49 Tabela 5 – Dados das curvas DSC da WE015 nas razões de 2,5; 5,0; 10,0 e 20 ºC/min. em atmosfera de nitrogênio .................................................................. 51 Tabela 6 - Dados das curvas TG não isotérmicas da WE015 nas razões de 2,5, 5,0, 10,0 e 20 ºC/mim em atmosfera de nitrogênio...................................................... 53 Tabela 7 – Dados das curvas DSC da WE016 nas razões de 2,5; 5,0; 10,0 e 20 ºC/min em atmosfera de nitrogênio..................................................................... 55 Tabela 8 - Dados das curvas TG não isotérmicas da WE016 nas razões de 2,5; 5; 10 e 20 ºC/min em atmosfera de nitrogênio.......................................................... 56 Tabela 9 – Valores dos parâmetros cinéticos obtidos através do estudo não- isotérmico .................................................................................................................. 58 Tabela 10 – Condições cromatográficas utilizadas na análise em gradiente exploratório ................................................................................................................ 63 Tabela 11 - Descrição dos fatores e níveis estudados no planejamento fatorial 1 para o desenvolvimento do método por CLUE-DAD ............................................... 65 Tabela 12 – Matriz do planejamento fatorial 1 no desenvolvimento do método por CLUE-DAD ............................................................................................................. 66 Tabela 13 – - Descrição dos fatores e níveis estudados no planejamento fatorial 2 para o desenvolvimento do método por CLUE- DAD............................................................................................................................ 68 Tabela 14- Parâmetros da melhor condição experimental ..................................... 76 13 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ACN Acetonitrila ∆H Entalpia µg Micrograma ANOVA Análise de variância C18 Coluna octadecilsilano CCD Cromatografia em camada delgada CG Cromatografia gasosa CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLUE Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência CP Cromatografia em papel DAD Detector de arranjo de fotodiodos DSC Calorimetria Exploratória Diferencial DTA Análise Térmica Diferencial EGD Detecção de gás desprendido FC Fator de cauda FM FM* Fórmula Molecular Fase Móvel FTIR Fourier transform infrared spectroscopy H2O Água ICTAC International Confederation for Thermal Analysis and Calorimetry IV Infravermelho J/g Joule/grama K Fator de retenção KBr Brometo de potássio Kgf Kilograma-força L Comprimento LCQM Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos LCQPF Laboratório de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos LDM Laboratório de Desenvolvimento de Medicamentos MeOH Metanol MEV Microscópio Eletrônico de Varredura mg Miligrama 14 min Minuto MIR Mid Infra Red mL Mililitro mm Milímetro mM Milimolar MPa Milipascal N Número de pratos teóricos nm Nanômetro NUPRAR Núcleo de Processamento Primário e Reuso de Água Produzida e Resíduos ºC Grau Celsius pH Potencial hidrogeniônico pKa Constante de dissociação ácida PM Peso Molecular Ppm Partes por milhão Psi Libra por polegada quadrada RDC Resolução da Diretoria Colegiada RMN Ressonância Magnética Nuclear Rs Resolução TEA Trietilamina TG Termogravimetria TMA Thermal Mecanics Analysis Tonset Temperatura onset Tpico Temperatura do pico Tr Tempo de retenção UV Ultravioleta WE005 3,4-dimetoxibenzaldeídoguanilhidrazona WE015 Benzaldeídoguanilhidrazona WE016 Metil-4-formilbenzoatoguanilhidrazona μL Microlitro µm Micrômetro 15 SUMÁRIO 1INTRODUÇÃO .............................................................................................. 17 2 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................... 21 2.1 Controle de Qualidade de matérias-primas .............................................. 21 2.2 Guanilhidrazonas ........................................................................................ 22 2.2.1 Propriedades físico-químicas das guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 .............................................................................................................. 24 2.3. Técnicas Térmicas e Aplicações ................................................................ 27 2.3.1. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) ........................................ 29 2.3.2. Análise Termogravimétrica .................................................................... 31 2.4. Estudo da cinética das reações de decomposição térmica: método não isotérmico ................................................................................................. 32 2.5. Espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) ...................................................................... 33 2.6 Microscopia Eletrônica de varredura ............................................................................................................................ 34 2.7 Cromatografia ............................................................................................. 35 2.8 Planejamento Fatorial ................................................................................. 37 3. OBJETIVOS ................................................................................................ 39 3.1 Objetivo Geral ............................................................................................ 39 3.2 Objetivos Específicos ................................................................................. 39 4. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 41 4.1 Amostras ..................................................................................................... 41 4.2 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) ............................................. 41 4.3 Termogravimetria (TG) ............................................................................. 41 4.4 Infravermelho (FTIR) ................................................................................. 42 4.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ............................................. 42 4.6 Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE) ............................................................................................................................. 42 4.6.1 Preparo de amostra para análises cromatográficas .................................. 43 4.6.2 Preparo de fase móvel .............................................................................. 43 4.7 Equipamentos utilizados .............................................................................. 43 4.8 Planejamento fatorial ................................................................................... 44 4.9 Tratamento de dados .................................................................................... 45 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 47 5.1 Caracterização da Guanilhidrazona WE005 ............................................ 47 5.2 Caracterização da Guanilhidrazona WE015 ............................................. 50 5.3 Caracterização da Guanilhidrazona WE016 ............................................. 54 5.4 Infravermelho ............................................................................................... 60 5.5. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ............................................ 61 5.7 Desenvolvimento de método analítico por CLUE .................................... 62 6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 78 16 REFERÊNCIAS ................................................................................................. 79 APÊNDICE A – ARTIGO PROPOSTO ……………………………………... 89 APÊNDICE B – ARTIGO SUBMETIDO ……………………………………. 96 ANEXO A – DOCUMENTO DE SUBMISSÃO ............................................ 104 ANEXO B – DOCUMENTO DE SUBMISSÃO ............................................. 105 ANEXO C - Ressonância Magnética Nuclear ................................................. 106 17 INTRODUÇÃO 18 1 INTRODUÇÃO Guanilhidrazonas são compostos químicos formados por um grupo guanil ligado a uma hidrazona. Essas substâncias têm sido bastante estudadas devido ao seu potencial biológico para o tratamento de diversas doenças, com ênfase em neoplasias e doenças cardiovasculares, infecções bacterianas e fúngicas (XU e WANG, 2010). O processo de descoberta de um novo fármaco perpassa diversos estágios e se inicia com estratégias de planejamento molecular. Durante as etapas de obtenção muitos processos de síntese podem comprometer a ação de uma espécie química ativa devido a presença de impurezas (AHUJA, 2007). A análise de fármacos e medicamentos é uma ferramenta importante no monitoramento dessas etapas e é realizada rotineiramente pelos laboratórios da indústria farmacêutica por ser crucial para assegurar a segurança e a eficácia do medicamento. Os métodos de análise farmacêutica são diversos e sua escolha depende primariamente das características físico-químicas do analito e dos parâmetros que se deseja analisar (PARISOTTO, 2005). Quando se determina a atividade biológica de uma substância, se faz necessário caracterizá-la em função de seus aspectos físico-químicos através de análises com métodos instrumentais. Nesse contexto, a análise térmica é um conjunto de técnicas que relaciona as características físicas da substância em função da temperatura, por meio de um programa controlado de temperatura, ao qual a substância é submetida (ICTAC, 2014). As técnicas térmicas possibilitam a medida de diversas variáveis como decomposição térmica, determinação do teor de cinzas, oxidação térmica, cinética de reação, diagrama de fases, determinação do calor específico, entre outras. A partir dessas análises pode-se obter a caracterização de matérias-primas e produtos acabados, bem como a determinação da estabilidade térmica, determinação de pureza, estudo da interação fármaco-excipiente, polimorfismo, determinação de parâmetros cinéticos, etc. Dessa forma, a utilização de técnicas térmicas como Termogravimetria (TG), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), DSC – Fotovisual e Análise Térmica Diferencial (DTA) são essenciais para o desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos (GIRON, 2002; FAÇANHA-FILHO et al, 2012). A Termogravimetria (TG) e a Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) são técnicas térmicas aplicadas com sucesso na indústria farmacêutica e revelam informações importantes sobre propriedades físico-químicas de fármacos e excipientes; como 19 polimorfismo, estabilidade, pureza e compatibilidade entre as substâncias utilizadas numa formulação (YOSHIDA, 2011). Um dos métodos mais utilizados para avaliar estabilidade dos fármacos e medicamentos é o estudo cinético. A cinética das reação de decomposição pode ser dividida em métodos isotérmicos e não-isotérmicos e os parâmetros cinéticos podem ser calculados a partir de dados gerados por qualquer técnica que possa medir o consumo de reagente ou a formação de um produto. Até o momento a caracterização térmica de guanilhidrazonas aromáticas só foi realizada por Galvão et al (2012) que analisou as guanilhidrazonas sintéticas WE010(3,5-di-tert-butil-4-hidroxibenzaldeídoguanilhidrazona), WE14 (4-Bifenilcarboxialdeídoguanilhidrazona) e WE017 (3,4- Diclorobenzaldeídoguanilhidrazona) por DSC, DSC-Fotovisual e TG. Neste estudo obteve-se resultados em relação a estabilidade, ordem e cinética de reação, pureza, temperatura de fusão e perda de massa em função da temperatura. Foi observado que a presença de impurezas interfere na avaliação dos parâmetros cinéticos (GALVÃO, 2012). Além da análise térmica, são necessárias técnicas complementares para conferir melhor compreensão e confiabilidade dos dados. Dentre as técnicas não térmicas mais utilizadas na caracterização de fármacos pode-se destacar a Espectroscopia de Absorção na região do Infravermelho com transformada de Fourier (IF-TR), a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Cromatografia e a Difração de Raio-x. O infravermelho é uma técnica utilizada na identificação e até mesmo quantificação de fármacos; pode ser aplicada no estudo de compatibilidade, estabilidade e análise de pureza através da verificação do aparecimento, diminuição ou desaparecimento das bandas espectrais, as quais estão diretamente relacionadas com os grupos funcionais presentes no analito (FERREIRA 2012). O MEV na área farmacêutica é frequentemente associado às análises por difração de raios-x e revela características morfológicas da substância, as quais são importantes na identificação de possíveis polimorfos. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é a técnica instrumental mais utilizada para a análise de produtos farmacêuticos. A técnica baseia-se na migração de componentes de uma mistura entre duas fases: a fase estacionária que retém elementos e a fase móvel que conduz a mistura por meio de um soluto através da fase estacionária. Devido à alta precisão e confiabilidade dessa técnica, a cromatografia líquida é muito utilizada na área farmacêutica para identificação e quantificação de fármacos, produtos de degradação e impurezas (SIDDIQUI et al, 2013). Assim, diante da escassez de estudos de caracterização, separação por técnicas cromatográficas de guanilhidrazonas e da importância desses resultados para avaliar a 20 qualidade da síntese, para estudos de pré-formulação e consequentemente desenvolvimento de novos métodos de análise, se faz necessário o desenvolvimento de pesquisas que envolvam caracterização e desenvolvimento de métodos para identificar guanilhidrazonas. 21 REVISÃO DA LITERATURA 22 2 Revisão da literatura A pesquisa de novos fármacos tem avançado no sentido de descobrir novas moléculas capazes de produzir o melhor efeito farmacológico, com a menor toxicidade e o menor risco de efeitos adversos. Tão importante quanto a pesquisa farmacológica, o controle de qualidade de matérias-primas deve ser realizado o mais cedo possível no processo de desenvolvimento para garantir que o fármaco da forma que foi produzido, embalado, armazenado e transportado, consiga manter a eficácia dentro do prazo de validade estabelecido através dos estudos de estabilidade. Ao passo que novas moléculas são descobertas surgem à necessidade de desenvolver métodos analíticos para caracterizar e monitorar a qualidade desses novos fármacos (CHOOI et al, 2014). 2.1. Controle de qualidade de matérias-primas O desenvolvimento de novos fármacos compreende uma cadeia complexa de ações interdisciplinares. Fatores tecnológicos como os solventes utilizados na cristalização, precipitação, processos de compressão e redução do tamanho de partícula são de grande importância no comportamento físico e químico do fármaco, como por exemplo, transições polimórficas, resquícios de solventes e impurezas, as quais podem alterar significativamente as características do fármaco e consequentemente sua eficácia e segurança (LU; SOHRAB, 2009). Outro aspecto importante a ser considerado no controle da síntese é a estereoquímica das moléculas. A maior parte das rotas sintéticas leva a produção de racematos, ou seja, de uma mistura equimolar de estereoisômeros. Uma das maiores complicações de uma rota sintética é que ocorra uma alteração do perfil de impurezas, portanto é necessário desenvolver métodos analíticos para a determinação de possíveis impurezas. Entre os fatores mais importantes relacionados à síntese de fármacos que podem ser modificados durante sua obtenção, acarretando uma provável alteração na eficácia do produto final estão o polimorfismo e a estereoisomeria (GASPAROTTO, 2005; BARREIRO; FRAGA, 2005). A RDC nº 17, de 16 de abril de 2010 dispõe sobre as boas práticas de fabricação e relata informações que devem conter o relatório sobre o controle de qualidade de um fármaco. De acordo com a RDC deve ser descrita a rota de síntese com descrição das moléculas intermediárias e seus nomes químicos, descrição das especificações do fabricante, identificação dos métodos analíticos utilizados pelo fabricante quantificação e limites dos principais contaminantes, de acordo com a rota de síntese do fármaco; relação dos solventes 23 utilizados no processo; dados sobre os teores dos estereoisômeros, no caso de fármacos que apresentam quiralidade, cuja proporção de estereoisômeros possa comprometer a eficácia e a segurança do medicamento; informações e determinação dos prováveis polimorfos e a metodologia analítica para fármacos que apresentem polimorfismo (BRASIL, 2010). As características necessárias para que se tenha qualidade, segurança e eficácia de produtos farmacêuticos são rigorosamente monitoradas por órgãos sanitários de todos os países. Dessa forma, deve ser responsabilidade das indústrias realizar o controle de qualidade desde matérias-primas, embalagens, processos, até o produto acabado. A definição de parâmetros de qualidade e o fornecimento de especificações mínimas de qualidade para os produtos farmacêuticos e todos os insumos utilizados em sua fabricação são de responsabilidade legal e exclusiva das farmacopeias (OLIVEIRA, 2011). As técnicas analíticas instrumentais são ferramentas essenciais para investigar a qualidade de um produto ou matéria-prima. Parâmetros como precisão, sensibilidade e especificidade conferem às técnicas instrumentais maior confiabilidade nos resultados. A eficácia de um medicamento é dependente da qualidade de suas matérias-primas e dos processos pelos quais foi produzido. Dessa forma, o desenvolvimento de metodologias limpas, rápidas e de baixo custo é objeto de estudo de pesquisadores de diversas áreas (PIRES, 2011). Algumas das técnicas mais utilizadas no controle e caracterização físico-químico de fármacos são: técnicas térmicas (calorimetria exploratória diferencial, análise termogravimétrica, análise térmica diferencial), técnicas espectrofotométricas (infravermelho, ultravioleta), difração de raios X, microscopia eletrônica óptica e de varredura, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). 2.2. Guanilhidrazonas As guanilhidrazonas representam um grupo de substâncias químicas caracterizadas pela presença do grupamento amidina (guanil) ligado a uma hidrazona. Na química, são utilizadas como intermediários na construção de compostos heterocíclicos polifuncionais contendo átomos de nitrogênio (KUMAR et al, 2012). A primeira síntese de guanilhidrazonas aconteceu na Alemanha por Thiele e Dralle em 1898. Após isso, diversas pesquisas foram conduzidas a fim de avaliar a função farmacológica dessas novas moléculas com ênfase na 24 atividade antitumoral (FREEDLAND & FRENCh, 1958; WARRELL & BURCHENAL, 1983). Os fármacos contendo o grupo guanidino têm sido alvo de intensa avaliação clínica e pré-clínica para o tratamento de tumores (LOESBERG et al., 1991; TRONCONE & RUFINI 1997; EKELUND et al., 2001a; ANDREANI et al., 2004; 2006). Acredita-se que em relação à estrutura atividade, o grupo guanidino é essencial para a ação citotóxica em células leucêmicas (SMETS et al., 1988). As hidrazonas são um grupo de compostos orgânicos intermediários para a síntese de inúmeros compostos químicos e já foram relatadas como potenciais antimaláricos, e recentemente foi publicado seu efeito antifúngico in vitro sobre cepas de Candida spp. e Rhodotorula spp (DUVAL et al., 2011). Há um grande interesse no estudo dessas moléculas devido a relação de suas características químicas com atividades biológicas (WALZER et al., 1994; MITCHELL et al., 1998 apud PINHATTI, 2009). Dentre o potencial biológico dessas moléculas, as ações que mais se destacam são antitumorais (HASSAN, 2011), anti-hipertensivas (MARTINS et al., 2003; 2004), devido a semelhança estrutural com as poliaminas naturais, um dos focos é a investigação da atividade tripanocida, antimalarial, antibacteriana/antifúngica (CUNHA et al, 2009) e mais recentemente descobriu-se atividade inibidora da butirilcolinesterase, sendo um possível fármaco para tratamento da Doença de Alzheimer (SEKUTOR et al, 2012). Considerando o amplo espectro de atividades biológicas dos derivados de guanilhidrazonas e o baixo custo de produção, Martins (2004) sintetizou uma série de derivados de guanilhidrazonas. Dentre estes, o cloridrato de 17 (E)2[(2,3 dimetoxifenil) metileno] hidrazinocarboximidamida (2,3DMeB), e o cloridrato de (E) 2 [(3,4dimetoxifenil) metileno] hidrazinocarboximidamida (3,4DMeB), os quais demonstraram efeitos antibacterianos em Staphyloccocus aureus e Escherichia coli e efeitos antifúngicos em Candida albicans (MARTINS, 2004). As amostras utilizadas na análise em questão são guanilhidrazonas aromáticas denominadas WE005 (3,4-dimetoxibenzaldeídoguanilhidrazona), WE015 (benzaldeídoguanilhidrazona) e WE016 (metil-4-formilbenzoatoguanilhidrazona) (Fig. 1). O processo de obtenção dessas moléculas ocorreu pela reação direta dos respectivos aldeídos com cloridrato de aminoguanidina, em refluxo de etanol 95%, utilizando-se uma adaptação da metodologia descrita por Ulrich e Cerami (1984), por meio da condensação equimolar de um derivado carbonilado, do tipo aldeído ou cetona, com aminoguanidinas em meio alcoólico sob refluxo e quantidades catalíticas de ácido (ULRICH, 1984). Os produtos obtidos tiveram suas estruturas elucidadas por RMN 1H, RMN 13C, e IV. A variação foi feita na região do anel 25 aromático, obtendo-se uma série diversificada de guanilhidrazonas com rendimentos compreendidos entre 71 e 98% apresentados na figura 1. Figura 1 – Estrutura química da WE005 (a), WE015 (b) e WE016 (c) 2.2.1 Propriedades físico-químicas das guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 De acordo com as análises calculadas pelo software MarvinSketch 5.12.0 através da estrutura química das moléculas pode-se destacar algumas propriedades físico-químicas importantes para relacionar com as técnicas utilizadas nesse estudo. A amostra WE005 possui fórmula molecular C10H14N4O2 com massa molar de 222,24 g/mol conforme observado na Figura 2. A figura 3 apresenta a distribuição das espécies para a amostra WE005 conforme alteração de pH. Figura 2 – Estrutura molecular e logP da amostra WE005 26 Figura 3 – Distribuição das espécies conforme alteração de pH para a amostra WE005 A amostra WE015 possui massa molar de 162,19 g/mol e fórmula molecular C8H10N4, conforme observado na Figura 4. A figura 5 apresenta a distribuição das espécies para a amostra WE015 conforme alteração de pH. Figura 4 – Estrutura molecular e logP da amostra WE015 27 Figura 5 – Distribuição das espécies conforme alteração de pH para a amostra WE015 A amostra WE016 possui massa molar de 220,09 g/mol e fórmula molecular C10H12N4O2, conforme observado na Figura 6. A figura 7 apresenta a distribuição das espécies para a amostra WE016 conforme alteração de pH. Figura 6 – Estrutura química e logP da amostra WE016 28 Figura 7 – Distribuição das espécies conforme mudança de pH da amostra WE016 A estrutura química das moléculas mostra que são compostos básicos e, portanto possuem facilidade para ionização em pH neutro. Através dos gráficos podemos ver que cada substância pode assumir duas formas ionizáveis de acordo com o pH do meio. Quando em pH alcalino, a forma não ionizada está presente em maior proporção até que seu ponto máximo (100% da espécie não ionizada) seja atingido no pH mais básico. No pH ácido observamos o inverso, a maior proporção será das formas ionizadas, variando essa porcentagem de acordo com o pH. O coeficiente de partição é uma medida quantitativa da lipofilicidade de um composto. Para a amostra WE005 o logP (0,65) é menor do que o das amostras WE015 e WE016 (0,97). Dessa forma espera-se que a amostra WE005 tenha menor afinidade por fase orgânica do que as amostras WE015 e WE016. 2.3. Técnicas Térmicas e Aplicações Muitos estudos associam às técnicas térmicas a caracterização de fármacos e medicamentos através da medida das propriedades físicas destes. É crescente a utilização dessas técnicas no controle de qualidade devido a rapidez, praticidade e precisão de resultados. Segundo a Farmacopeia Brasileira 5 ed , o conceito de análise térmica é: 29 ―A análise térmica é um conjunto de técnicas que possibilitam medir as propriedades físico-químicas de uma substância em função da temperatura‖. As técnicas mais comumente utilizadas são as que medem as variações de energia ou de massa de uma substância. (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010). Uma série de métodos térmicos pode ser citada diferindo apenas na propriedade medida. Estes métodos encontram-se em larga expansão de uso no controle de qualidade e também na aplicação de pesquisas nos produtos industriais, tais como, polímeros, medicamentos, fitoterápicos, argila, minerais, e metais (HATAKEYAMA, 1997). As principais técnicas térmicas são: calorimetria exploratória diferencial (DSC), análise térmica diferencial (DTA), termogravimetria (TG), análise termomecânica (TMA) e análise de gás desprendido (EGD). A análise térmica é uma ferramenta crucial na análise de fármacos e medicamentos, pois utiliza a temperatura controlada para caracterizá-los através das propriedades físicas e químicas. Diversos estudos demonstram o uso da análise térmica na análise de fármacos e medicamentos para caracterizar, determinar a pureza, umidade, realizar estudos de compatibilidade, verificação de polimorfismo, cristalinidade, avaliação da estabilidade através de estudo da cinética de decomposição térmica (SABER et al, 2014; LAVOR et al, 2013; MENDONÇA, et al 2013; GAO et al 2011; GOMES et al 2007; MEDEIROS et al 2007; BERNAL et al. 2002). Há muitos trabalhos em análise térmica discutindo o uso dessas técnicas na indústria farmacêutica. Desta forma, as indústrias estão, cada vez mais, demonstrando o interesse neste âmbito. Os artigos publicados demonstram que os dados obtidos por análise térmica estão diretamente relacionados com a qualidade final de um produto farmacêutico, seja quanto à eficácia terapêutica do medicamento ou à estabilidade do mesmo ao longo do prazo de validade. Além disso, muitos órgãos regulamentadores de insumos e produtos farmacêuticos já descrevem a importância da análise térmica e dos parâmetros de qualidade dela provenientes (OLIVEIRA et al 2011; GIRON 2002; GIRON 1986; GRANT e ABOUGELA 1982). Atualmente, novos equipamentos de análise térmica têm sido desenvolvidos permitindo a utilização de técnicas simultâneas como, por exemplo, TG e DSC, TG e DTA, 30 aplicadas à mesma amostra, avaliando variações de massa e aspectos energéticos. As medidas simultâneas são utilizadas, principalmente, para o estudo de materiais poliméricos e de estabilidade de produtos químicos (OZAWA, 2000; CHENG et al., 2000). Em um sistema de análise térmica genérico, a amostra é colocada em um ambiente no qual é possível observar, direta ou indiretamente, uma modificação em função da temperatura e do tempo. As mudanças ocorridas na amostra são monitoradas por um transdutor apropriado, que conduz um sinal elétrico análogo à mudança física ou química. Este sinal é ampliado eletronicamente e aplicado ao dispositivo de leitura e registro (MALEIXO, 2002). Vantagens da análise térmica sobre outros métodos analíticos: (HATAKEYAMA, 1997)  A amostra pode ser estudada sobre uma grande faixa de temperatura usando vários programas de temperatura,  Quase todas as formas físicas da amostra (sólido, líquido ou gel) podem ser usadas,  Uma pequena quantidade de amostra (0,1μg – 10mg) é requerida,  A atmosfera na vizinhança da amostra pode ser padronizada,  O tempo requerido para completar o período de experimento é de alguns minutos a algumas horas,  Os instrumentos de análise térmica têm preços razoáveis. A associação de técnicas térmicas, tais como DTA, DSC e TG são úteis na compreensão dos mecanismos físico-químicos relativos a processos de decomposição térmica ou no estudo e desenvolvimento de novos compostos, entre outros (ANDRADE et al., 2007). Os resultados de análises térmicas também são muitas vezes associados a resultados de outras técnicas, tais como espectroscopia, difração de raios X, cromatografia, entre outras, visando à interpretação de fenômenos de maior complexidade. 2.3.1. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) Segundo a Farmacopeia Brasileira 5ª ed ―A calorimetria exploratória diferencial é uma técnica que possibilita avaliar os fenômenos energéticos, físicos e/ou químicos produzidos durante o aquecimento (ou resfriamento) de uma substância. Essa técnica possibilita medir o fluxo de calor diferencial entre a amostra e um material de referência termicamente inerte em função da temperatura e/ou tempo de aquecimento sob um programa controlado de 31 temperatura‖ (BRASIL, 2010). Estas medidas fornecem dados qualitativos e quantitativos em relação a mudanças físicas e químicas que envolvem processos endotérmicos e exotérmicos. Esta técnica proporciona informações tais como: transição vítrea, temperatura e tempo de cristalização, ponto de fusão, calor específico, oxidação, pureza, estabilidade térmica, ponto de ebulição, cinética de reação e outros (MOTHÉ e AZEVEDO, 2002). Quando um material sofre algum tipo de mudança de estado físico ou reação química, alguma quantidade de calor é envolvida, liberado ou absorvido. A DSC mede as variações de energia térmica para manter em equilíbrio as temperaturas da amostra e do material de referência, durante o evento térmico. Por regra geral considera-se que transição de fase, desidratação, redução, e algumas reações de decomposição produzem efeitos endotérmicos, ao passo que cristalização, oxidação e algumas reações de decomposição produzem efeitos exotérmicos. Isto é válido tanto para DSC quanto para DTA (DANTAS, 2006). Existem dois tipos de instrumentação para obtenção de dados de DSC, de acordo com o método de medição utilizado:  DSC de compensação por potência: possui dois fornos individuais, a amostra e a referência são aquecidas e resfriadas individualmente. Garante-se uma diferença de temperatura entre a amostra e a referência, devido à absorção ou perda de calor; a potência nos aquecedores individuais é ajustada de forma que restaure o equilíbrio. Esta diferença de temperatura entre a amostra e referência é compensada por variação do calor requerido para manter ambos os cadinhos a mesma temperatura. Esta diferença de energia é plotada como uma função da temperatura da amostra (CLAS et al, 1999).  DSC de fluxo de calor: utiliza um simples forno, a amostra e a referência são aquecidas por uma única fonte de calor e colocadas em cadinhos idênticos. As diferenças no fluxo de calor na amostra e referência são medidas em função da temperatura da amostra. O calor é transferido através do disco para a amostra e a referência e o fluxo de calor diferencial entre os dois cadinhos é controlado por termopares conectados abaixo dos cadinhos. Desta forma, a curva calorimétrica é apresentada na forma de diferença de temperatura entre a amostra e a referência em função do tempo ou da temperatura. Os dois métodos dão a mesma informação, porém os instrumentos são fundamentalmente diferentes. Em geral, as amostras de DSC são analisadas em pequenos cadinhos de metal, designadas pela ótima condutividade térmica e reações mínimas com as amostras (por ex., alumínio, platina, prata, liga e aço inoxidável) (CLÃS et al., 1999). 32 A curva obtida em um DSC permite calcular a variação de entalpia ocorrida em um processo pelo cálculo da área sob o pico obtido. A direção do pico indica o tipo de processo observado. Em um aparelho de DSC com compensação de potência, o pico endotérmico é representado por uma variação de linha base para cima, enquanto que um pico exotérmico apresenta uma variação de linha base para baixo. Para sistema com fluxo de calor, ocorre o inverso (POPE et al., 1977). Na área farmacêutica a técnica de DSC é bastante utilizada na caracterização térmica e determinação da pureza de fármacos, pois permite a determinação direta da pureza evitando o uso demasiado de materiais de referência, o que consiste em uma alternativa interessante para o controle de qualidade. Outras aplicações consistem no estudo de compatibilidade em estudos de pré-formulação e identificação de polimorfismo com determinação das entalpias de cada forma cristalina (OLIVEIRA, 2011). 2.3.2. Análise Termogravimétrica ―A termogravimetria é a técnica de análise térmica em que a variação de massa da amostra é determinada como uma função da temperatura, ou tempo de aquecimento, utilizando um programa controlado de temperatura‖ (BRASIL, 2010). Durante o desenvolvimento farmacêutico a termogravimetria (TG) é amplamente usada para avaliar a estabilidade térmica dos fármacos e medicamentos de forma rápida e eficaz. Assim como todas as técnicas, alguns fatores (característico da amostra ou instrumental) podem influenciar no resultado e devem ser monitorados de forma a manter uma padronização a cada análise, tais como: massa da amostra, volume e forma física, o tamanho e a natureza da amostra, a natureza e a pressão da atmosfera em que estará a amostra e a razão de aquecimento. Essas variáveis tem influência importante nas características da curva termogravimétrica registrada (KEATTCH & DOLLIMORE, 1975), por isso a análise termogravimétrica pode ser utilizada para caracterização e identificação quando se compara curvas realizadas nas mesmas condições de análise. As curvas obtidas fornecem a informação sobre a composição e a estabilidade térmica da amostra, dos produtos intermediários e de resíduos finais (SILVA; PAOLA; MATOS, 2007). Os métodos termogravimétricos podem ser classificados como: dinâmico (ou não isotérmico) em que a perda de massa é registrada continuamente à medida que a temperatura aumenta a uma razão constante ou linear; isotérmico, quando a variação de massa da amostra é registrada em função do tempo mantendo-se a temperatura constante; e quasi-isotérmico, no 33 momento em que a amostra começa a perder massa a temperatura é mantida constante até que a massa se estabilize, quando isto ocorre, o aquecimento é retomado, este procedimento pode se repetir em cada etapa da decomposição térmica (LOPES, 2005). Na área farmacêutica a termogravimetria é utilizada na caracterização, determinação de umidade, identificação de pseudopolimorfismo, avaliação da estabilidade de fármacos e medicamentos e em estudos de cinética de degradação (OLIVEIRA; YOSHIDA; GOMES, 2011). 2.4 Estudo da cinética das reações de decomposição térmica – método não isotérmico A cinética de reações compreende o estudo da velocidade com que as reações ocorrem e foi desenvolvida a partir do estudo da cinética das colisões em fase gasosa por Arrhenius. Posteriormente a partir da similaridade entre os sistemas homogêneos, esses estudos da cinética foram aplicados a soluções (teoria do estado de transição) e reações em fase sólida. O objetivo do estudo da cinética das reações é prever a estabilidade térmica de determinadas substâncias químicas através de parâmetros cinéticos. A análise térmica pode ser usada para realizar estudo em reações químicas envolvendo diversos materiais (TITA, 2011). Os métodos desenvolvidos podem ser divididos em isotérmicos e não isotérmicos. Dentre os métodos não isotérmicos ou dinâmicos, o modelo de Ozawa é um dos mais utilizados. O método de Ozawa utiliza curvas termogravimétricas dinâmicas para prever parâmetros como ordem de reação, fator de frequência e energia de ativação. A ordem de reação de uma substância está relacionada com a velocidade com que uma reação acontece e também identifica se há dependência da concentração dos reagentes e produtos. Pode ser classificada como reação de ordem zero, em que a velocidade de formação dos produtos independe da concentração dos reagentes; de ordem diferente de zero quando a velocidade de decomposição depende da concentração dos reagentes e pode ser considerada proporcional em relação ao tempo. O fator de frequência é a medida da ocorrência de uma determinada situação na reação. Pode ser relacionado com a quantidade de colisões que as moléculas sofrem. Quanto maior o fator de frequência, maior a quantidade de colisões e menor é a estabilidade dessas moléculas, pois a quantidade de colisões propicia uma maior velocidade de reação. A energia de ativação é a energia necessária para que uma reação dê início. É uma barreira energética que precisa ser vencida para que os reagentes se transformem em produto. 34 Portanto quando maior for essa energia necessária, maior será a estabilidade da molécula (NETO, 2011). 2.5 Espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) A espectrofotometria está baseada na absorção de energia eletromagnética por moléculas. As diferenças na estrutura química e na concentração dessas moléculas vão conferir absorções energéticas diferentes. Dessa forma, é possível caracterizar, quantificar e identificar substâncias a partir de técnicas espectrofotométricas. Dependendo da frequência da energia aplicada a espectrofotometria, a absorção pode ser dividida em ultravioleta, visível e infravermelho. Na região do infravermelho médio (MIR) ocorrem transições de energia vibracional por ser a radiação nesta região insuficientemente energética para promover transições eletrônicas. As vibrações induzidas por radiação infravermelha compreendem estiramentos e tensionamentos de ligações interatômicas e modificações de ângulos de ligações (BRASIL, 2010). A técnica de espectroscopia de infravermelho com transformada de Forrier (FTIR) é bastante utilizada na caracterização de sistemas sólidos. Dentre as técnicas utilizadas para caracterizar fármacos, os métodos espectroscópicos nessa região oferecem vantagens importantes nas análises, como por exemplo, não serem destrutivos, permitirem informações químicas, serem rápidos e utilizarem pequenas quantidades de material (PARISOTTO et al, 2009). Medidas na região do infravermelho médio e próximo podem ser obtidas por refletância, a qual é observada quando uma luz incide em uma matriz descontínua, penetra na amostra e reflete trazendo informações espectrais. Desta forma a luz refletida pode ser atenuada por absorção e o espectro resultante é similar ao obtido através da técnica no infravermelho por transmissão utilizando KBr (brometo de potássio). Uma importante diferença entre a transmitância e a refletância se dá devido ao caminho óptico diferente percorrido pela luz. Enquanto que na transmissão o caminho óptico é constante para todo número de onda, na refletância por sua vez, o caminho pode ser variável. É de conhecimento geral que em regiões do espectro, onde a amostra absorve fracamente, a luz penetra mais profundamente na matriz, sendo que o contrário acontece onde há forte absorção (FERREIRA, 2012). 35 Portanto, ao se comparar o espectro obtido por transmissão (pastilha de KBr) com o obtido por refletância, as intensidades relativas das bandas serão diferentes. Por exemplo, as bandas fracas no espectro por transmissão aparecerão mais fortes na refletância. Deve-se ressaltar a diferença marcante entre infravermelho médio e próximo. No infravermelho próximo as distorções nos espectros são quase imperceptíveis, enquanto que no infravermelho médio as distorções são mais frequentes. Uma maneira de contornar esse efeito não desejado é diluindo a amostra numa matriz não absorvente, como KBr (SOUZA, FERRÃO, 2006). A região do infravermelho médio apresentou maior número de estudos do que a região do infravermelho próximo. Isso se deve possivelmente a maior absorção de compostos orgânicos e a maioria dos grupos funcionais nessa região, como: ácidos carboxílicos, amidas, alquilas e aromáticos. 2.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Um dos instrumentos mais importantes para a análise de materiais sólidos é o MEV, isto devido a sua versatilidade e capacidade de fornecer características estruturais do material. O microscópio eletrônico de varredura tem como princípio a utilização de um feixe de elétrons para explorar a superfície da amostra e transmitir um sinal do detector a uma tela catódica a qual é sincronizada com o feixe incidente. A varredura eletrônica de uma superfície pode gerar sinais com características diferentes, o que vai depender da interação entre o feixe eletrônico e a amostra (DEDAVIDE, GOMES MACHADO, 2007). Muitas áreas do conhecimento utilizam a microscopia eletrônica de varredura. Na área farmacêutica é bastante utilizada para caracterizar complexos de polímeros e fármacos, obter informações detalhadas sobre estados de cristalização e polimorfismo (ALVES et al, 2010). O conhecimento detalhado da microestrutura dos materiais permite o entendimento e, em muitos casos, até a previsão das suas propriedades e respostas químicas. Com a MEV, pode-se avaliar a diminuição da cristalinidade das partículas obtidas com diversos métodos para a formação de complexos de inclusão, à medida que permite a visualização e diferenciação das partículas e dos cristais dos fármacos (PIRES, 2011). Nery e colaboradores (2008) caracterizaram amostras de fornecedores diferentes do padrão da glibenclamida utilizando métodos térmicos e não térmicos como a MEV. Foi observado que pelo menos uma amostra se apresentou com morfologia diferente das demais. 36 2.7 Cromatografia Concomitante à análise térmica, a cromatografia é uma das técnicas analíticas mais utilizadas na análise de fármacos. Consiste numa técnica físico-química de separação e fundamenta-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária (BRASIL, 2010). A classificação das técnicas cromatográficas mais comuns refere-se quanto ao mecanismo de separação; quanto à técnica empregada e em relação ao tipo de fase móvel utilizada. As técnicas cromatográficas podem ser divididas principalmente em cromatografia em papel (CP), cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), e mais atualmente a cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE). Os métodos cromatográficos podem ser utilizados separadamente ou em conjunto dependendo dos componentes a serem separados ou identificados. ―A cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) é uma técnica de separação fundamentada na distribuição dos componentes de uma mistura entre duas fases imiscíveis, a fase móvel, líquida, e a fase estacionária sólida, contida em uma coluna cilíndrica‖ (BRASIL, 2010). A CLAE é uma técnica bastante utilizada para análise de fármacos, medicamentos e matérias-primas devido à obtenção de resultados mais precisos, rápidos, utilizando partículas cada vez menores e menos solvente em comparação a outras técnicas cromatográficas (GUMUSTAS et al, 2013). Atualmente, há grande interesse no desenvolvimento de métodos analíticos rápidos e que forneçam parâmetros apropriados para análises quantitativas de fármacos. Tais métodos são importantes para análises de rotina durante o controle de qualidade e também no desenvolvimento de novas formas farmacêuticas (RUELA, ARAUJO, PEREIRA, 2009). Segurança e eficácia são dois fatores fundamentais relacionado a terapêutica medicamentosa. A segurança é determinada através do perfil toxicológico assim como também os efeitos adversos causados pela presença de impurezas. Sendo nítido que essas impurezas podem provocar um efeito farmacológico indesejado, é óbvio que os produtos farmacêuticos devem ser monitorados utilizando técnicas analíticas que assegurem eficácia e segurança (RAO, NAGARAJU, 2003). Rao & Nagaraju (2003) fizeram uma revisão na literatura e constataram que a CLAE foi amplamente utilizada na avaliação da pureza de compostos químicos utilizados na 37 fabricação de medicamentos, além de uma grande variedade de abordagens para estabelecer o perfil de impurezas de fármacos sintéticos. A vantagem especial da CLAE, quando comparado a outras técnicas é a sua especificidade química. Diversas são as aplicações da CLAE, por exemplo, Shabir (2010) desenvolveu e validou um método utilizando cromatografia líquida de alta eficiência para a determinação simultânea de ácido sórbico, propilparabeno e domperidona em formulações orais de suspensão farmacêutica. Já Hasei Tomohiro et al (2012) utilizaram a cromatografia líquida para determinar a distribuição de partículas de um potencial carcinogênico humano, a 3- nitrobenzatrona, transportadas pelo ar. Em 1980, Michael e Loo desenvolveram um método para quantificar guanilhidrazonas em fluidos biológicos por CLAE. O método foi desenvolvido numa coluna analítica de fase reversa e fase móvel 0,03 M de acetato de sódio ajustado com ácido acético para o pH de 4,3 e metanol 5%. Este método apresentou boa faixa linear e baixo limite de detecção em urina, porém se faz necessário desenvolver outros métodos para diminuir a interferência da matriz (MICHAEL e LOO, 1980). A necessidade de rapidez e eficiência analítica exigida atualmente contribui para que outra técnica cromatográfica venha se firmando como uma técnica bastante aplicável quando se deseja obter análises rápidas, reprodutibilidade melhorada e detecção de amostras complexas, tornando-se um instrumento valioso para o controle de qualidade de medicamentos e fitoterápicos (LIANG et al, 2010). A cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE) é uma técnica que vem ganhando espaço e está sendo utilizada em análises de rotina em diversas áreas. Esta rápida difusão está relacionada principalmente à disponibilidade da instrumentação totalmente desenvolvida e adequada para as necessidades do emprego de partículas < 2 µm, a altas pressões (KAWANO, 2008). O uso destas partículas juntamente com a alta velocidade linear da fase móvel aumenta a resolução, a detecção e diminuem o tempo das análises (WU et. al., 2008). Os ajustes nos sistemas envolvem uma bomba binária de alta fluidez, a qual é capaz de trabalhar com pressões acima de 100 MPa (15.000 psi ou 400 kgf) (NOVÁKOVÁ et. al.,2006b; PIETERS et. al.,2010). As modificações requeridas em um sistema de CLUE são: capacidade de trabalhar a pressões muito altas (100 MPa), volumes internos muito menores (conexões, alça de amostragem, cela do detector, bombas), celas do detector sem dispersão e com alta taxa de aquisição, melhoramento no sistema de controle de dados, colunas resistentes para trabalharem com altas pressões e com baixo volume morto, injetores com precisão na faixa de microlitros (MARQUEZ, 2011). 38 2.8 Planejamento Fatorial Um planejamento fatorial é uma abordagem onde se aplica um conjunto de métodos estatísticos de forma racional que podem fornecer informações sobre o funcionamento de um sistema. São provocadas mudanças propositais na variável de entrada (fator) a fim de verificar os efeitos na variável resposta. Também chamado de delineamento experimental ou planejamento experimental, essa ferramenta estatística possui a vantagem de explorar as possíveis combinações entre os fatores e níveis escolhidos (GARG et al, 2013). Dessa forma, pode-se economizar tempo e ao mesmo tempo abranger todas as condições experimentais previamente estabelecidas através da escolha dos fatores, níveis e variáveis-resposta. A análise de dados para os modelos de planejamento de experimentos fica praticamente inviabilizada sem o uso de softwares específicos, os quais geralmente expressam os resultados através de ANOVA, comparações múltiplas, análise de resíduos e gráficos de superfície resposta. Quando se trata de desenvolvimento de método por CLAE/CLUE, o planejamento fatorial pode ser utilizado para selecionar a melhor condição experimental, além disso, é possível verificar quantitativamente quais variáveis exercem maior influência nas respostas selecionadas previamente (HIBBERT, 2013). 39 OBJETIVOS 40 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Caracterizar as guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 por técnicas térmicas, MEV e Infravermelho e desenvolver um método analítico por CLUE para quantificação simultânea das guanilhidrazonas. 3.2 Objetivos Específicos  Caracterizar as guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 por análise térmica, MEV e Infravermelho médio;  Realizar estudo da cinética das reações através de método não-isotérmico.  Desenvolver um método por CLUE para determinação simultânea das guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 através de planejamento fatorial. 41 MATERIAL E MÉTODOS 42 4. MATERIAL E MÉTODOS A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQM) na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) em parceria com a Universidade Federal de Alagoas (UFAL), o Núcleo de Processamento Primário e Reuso de Água Produzida e Resíduos (NUPPRAR) na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), o Laboratório de Desenvolvimento de Medicamentos (LDM) na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e o Laboratório de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos (LCQPF) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB). 4.1 Amostras As guanilhidrazonas utilizadas neste trabalho foram doadas pelo Prof João Xavier da Universidade Federal de Alagoas (UFAL). As estruturas das guanilhidrazonas WE005 (3,4- dimetoxibenzeno-guanilhidrazona); WE015 (fenilguanilhidrazona); WE016 (4 – metilbenzoato-guanilhidrazona) foram eluciadas por RMN 1 H, RMN 13 C, e IV. 4.2 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) As amostras foram hermeticamente fechadas em cadinhos de alumínio e analisadas num calorímetro Shimadzu, modelo DSC-60A, numa atmosfera de nitrogênio, fluxo de 50 mL/min, nas razões de aquecimento de 2,5; 5,0; 10 e 20,0°C/min até a temperatura de 500ºC, cuja massa foi de 1,00 mg ± 0,05. O equipamento foi calibrado, em relação à temperatura, com o padrão índio (156,6°C ± 0,3) através de seu pico de fusão. A entalpia foi calibrada com o calor de fusão do índio (28,59 J/g ± 0,30). O fator de correção foi calculado de acordo com os procedimentos e especificações do fabricante. As amostras foram analisadas através das suas transições de fase características, utilizando o programa TASYS da Shimadzu. 4.3 Termogravimetria (TG) As curvas termogravimétricas não isotérmicas das amostras foram obtidas utilizando- se uma termobalança Shimadzu, modelo DTG-60H, com razões de aquecimento de 2,5, 5,0, 43 10 e 20 ºC/min até temperatura de 900 ºC, na atmosfera de nitrogênio, com fluxo constante de 50 mL/min. A massa utilizada foi de 4,0 mg ± 0,5 a qual foi acondicionada num cadinho de alumina. As curvas foram analisadas pelo programa TASYS da Shimadzu, a fim de caracterizar as etapas de decomposição e perda de massa das mesmas. As curvas termogravimétricas não isotérmicas das amostras foram utilizadas para determinação dos parâmetros cinéticos: ordem de reação, fator de frequência e energia de ativação, segundo o modelo de Ozawa. 4.4 FTIR Os espectros foram obtidos no ATR-FTIR Spectrometer (IRprestige-21 Shimadzu) numa faixa de 700 and 4000 cm -1 , resolução ótica de 1.0 cm -1 e 20 scans. Os espectros foram obtidos a temperatura ambiente e durante a faixa de fusão de cada amostra (WE005 - 180°C, WE015 - 150°C e WE016 - 260°C) e comparados através do algoritmo ad hoc. Este algoritmo calcula a correlação entre os espectros de forma que uma correlação abaixo de 0,5 foi considerada baixa similaridade e significante alteração espectral. 4.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) As imagens por microscopia eletrônica de varredura foram obtidas em um MEV HITACHI TM3000 do Departamento de Engenharia de Materiais/UFRN. As imagens de elétrons retroespalhados foram registradas com uma ampliação de 100x, 250x e 400x. As amostras foram fixadas num suporte metálico. 4.6 CLUE O cromatógrafo utilizado foi o UFLC XR SHIMADZU equipado com degaseificador DGU-20A3, sistema de bombas binário LC-20AD XR, auto amostrador SIL-20AC XR, forno da coluna CTO-20AC, sistema de detecção DAD SPD-M20A e módulo de comunicação com o computador CBM-20A. Foram utilizadas colunas Shim-pack com grupos octadecilsilano, modelo XR-ODS: 30 mm x 2 mm; 50 mm x 3 mm e 75 mm x 4.6 mm. Os solventes utilizados nesse estudo foram água ultrapura (Mili-Q), metanol (J. T. Barker grau HPLC), trietilamina e ácido acético. Os solventes foram filtrados em membrana de nylon com 0,22 μm de diâmetro 44 de poro (Millipore) e degaseificados por ultrassom (QUIMIS-Q3350) antes de introduzidos no sistema. 4.6.1 Preparo de amostra para análises cromatográficas Pesou-se 10 mg de cada guanilhidrazona em balão volumétrico de 10 mL, onde solubilizou-se numa proporção igual dos componentes da fase móvel. As amostras foram diluídas e misturadas de forma que cada uma tivesse numa concentração final de 30 μg/mL (30 ppm) em solução. A solução final foi filtrada num filtro de membrana com diâmetro de poro 0,22 μm. As análises foram feitas em triplicata. 4.6.2 Preparo da fase móvel A fase móvel para o planejamento fatorial I foi constituída de uma solução de acetonitrila e água adicionada de trietanolamina. A água ultrapura foi medida num balão volumétrico de 500 mL, em seguida foi adicionado 1 mL da solução de trietanolamina (1%) e agitada. A fase móvel para o planejamento II foi uma mistura de metanol e água modificada com trietilamina e ácido acético. A água ultrapura foi medida em um balão de 500 mL e foi adicionado 500 µL de trietilamina. O balão foi agitado e a solução foi transferida para um becker onde foi ajustado o pH com ácido acético até atingir o pH de 3,5. O pHmetro foi calibrado previamente. 4.7 Equipamentos utilizados  Termobalança - DTG-60H (Shimadzu)  Calorímetro Exploratório Diferencial – DSC-60A (Shimadzu)  Cromatógrafo Líquido de Ultra Eficiência (CLUE) (Shimadzu)  Microscópio Eletrônico de Varredura TM3000 (Hitachi)  Infravermelho – FTIR (Shimadzu IRprestige-21)  Balança analítica  pHmetro (Hanna) 45 4.8 Planejamento Fatorial O planejamento fatorial foi utilizado para otimizar o método cromatográfico, utilizando três fatores (comprimento de coluna, fluxo e composição de fase móvel) e três níveis (3 3 ) totalizando 27 condições experimentais. As variáveis respostas foram: fator de cauda, tempo de retenção, resolução e número de pratos teóricos. O tratamento dos dados foi feito no software Statistica 10.0. O planejamento fatorial foi realizado em dois momentos, a fim de avaliar diferentes fases móveis, o que gerou o planejamento fatorial 1 e planejamento fatorial 2, apresentados nas tabelas 1 e 2, respectivamente. Tabela 1 - Descrição dos fatores e níveis estudados no planejamento fatorial 1 para o desenvolvimento do método por CLUE-DAD NÍVEIS FATORES -1 0 +1 Coluna 30 50 75 Fluxo (mL/min.) 0,2 0,3 0,4 Composição de FM (ACN:H2O) 17:83 20:80 23:77 Tabela 2 - Descrição dos fatores e níveis estudados no planejamento fatorial 2 para o desenvolvimento do método por CLUE-DAD NÍVEIS FATORES -1 0 +1 Coluna 30 50 75 Fluxo (mL/min.) 0,2 0,3 0,4 Composição de FM (MeOH:H2O) 35:65 40:60 45:55 46 4.9 Tratamento de dados Os softwares utilizados foram TA60 da Shimadzu, LC Solutions da Shimadzu, Excel 2007, Origin 8.0, Statistica 10.0, MarvinSketch 5.12.0. 47 RESULTADOS E DISCUSSÃO 48 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Caracterização da guanilhidrazona WE005 As curvas DSC da amostra WE005 mostram três eventos endotérmicos (Figura 8) em todas as razões de aquecimento estudadas. Na razão de 10°C/min. O primeiro evento apresentou Tonset em 54 °C e Tpico em 81 °C, com entalpia de - 198,70 J/g. O segundo evento endotérmico corresponde a fusão e apresenta-se com Tonset de 178 °C e Tpico em 180 °C e ∆H de 109,03 J/g. O terceiro evento endotérmico se apresenta largo e assimétrico e está relacionado com a decomposição da amostra. A tabela 3 mostra os valores das temperaturas Tonset, Tpico e ∆H do primeiro evento e da fusão para todas as razões de aquecimento. Com o aumento da razão de aquecimento a intensidade dos picos aumenta, bem como a entalpia, pois a amostra chega a temperaturas mais altas em pouco tempo, podendo causar sobreposição de evento (BERNAL, 2002). O aumento da sensibilidade das transições pode ser expressa pela equação fundamental do DSC ou de fluxo de calor (GABBOTT, 2008): DSC (sinal) (W/g) = Capacidade de calor (J/ (Kg)) x razão de aquecimento (K/s) Dessa forma é preciso investigar qual a melhor razão de aquecimento para cada amostra de forma a visualizar as transições de menor fluxo de calor e para prevenir sobreposição de eventos. Figura 8 - Curvas DSC da amostra WE005 nas razões de aquecimento 2,5; 5,0; 10,0 e 20 ºC/min em atmosfera de nitrogênio 49 A tabela 3 mostra os resultados das análises das curvas DSC da WE005 nas diferentes razões de aquecimento. Pode-se observar que a temperatura de pico e a entalpia aumentam com o aumento da razão, porém os valores de ∆H apresentam variações muito maiores com a variação da razão de aquecimento. Roy e colaboradores (2002) também observaram que a mudança na razão de aquecimento provoca uma maior influência na mudança do calor de fusão. Tabela 3 – Dados das curvas DSC da WE005 nas razões de 2,5; 5,0; 10,0 e 20 ºC/min em atmosfera de nitrogênio Razão de aquecimento (β/°C/min) 1º evento 2º evento Tonset /°C Tpico /°C ∆H /J/g Tonset / °C Tpico /°C ∆H/J/g 2,5 46,4 64,1 185,0 177,8 179,0 103,2 5,0 55,4 73,1 169,9 177,8 179,2 94,0 10,0 54,0 81,7 198,7 178,0 179,9 109,3 20 77,2 91,6 204,8 178,2 181,4 115,3 As curvas TG não isotérmicas da WE005 foram obtidas em atmosfera de nitrogênio nas razões de 2,5; 5; 10 e 20 ºC/min e estão apresentadas na Figura 9. Figura 9 - Curvas TG da WE005 nas razões de 2,5; 5; 10 e 20°C/min. 50 Os cálculos para a determinação da perda de massa foram obtidos através da sobreposição da curva derivada da TG, a qual permite melhor visualização das etapas, bem como pelo cálculo da tangente. De acordo com as curvas obtidas podemos destacar a presença de quatro etapas de perda de massa. A partir da segunda etapa o fármaco começa a se decompor lentamente em quatro etapas, as quais são mostradas mais detalhadamente na tabela 4. Tabela 4 – Dados das curvas TG não isotérmicas da WE005 nas razões de 2,5, 5,0, 10 e 20°C/min A tabela 4 mostra os dados da curva TG da WE005, no qual podemos observar um leve aumento na temperatura inicial das perdas de massa em decorrência do aumento da razão de aquecimento. Nas razões estudadas, as maiores perdas de massa foram na segunda e na última etapa de decomposição. Analisando a curva TG na razão de 10°C/min podemos observar que a primeira etapa ocorreu numa faixa de temperatura de 71-102°C com perda de massa de 6%. As demais etapas mostram as seguintes perdas: 41%, 17% e 35%, respectivamente. A variação na perda de massa de forma lenta e em várias etapas representa um fármaco com complexa cinética de decomposição. É importante ressaltar que transformações físicas não apresentam perda de massa. Dessa forma, a sobreposição das curvas TG e DSC na razão de 10°C/min permite identificar os eventos com maior precisão (Figura 10). A figura 10 mostra que a guanilhidrazona WE005 na razão de 10°C/min apresentou uma perda de massa simultaneamente ao primeiro evento endotérmico, evidenciando uma possível dessolvatação ou perda de algum grupo da molécula. O solvente perdido pode ser água ou algum solvente orgânico proveniente da β 1ª 2ª 3ª 4ª 2,5 ∆T/°C 62-84 213-285 285-457 457-880 Perda de massa/% 7 40 20 36 5,0 ∆T/°C 66-95 222-330 330-465 465-880 Perda de massa/% 6 46 15 37 10 ∆T/°C 71-102 243-329 320-490 491-880 Perda de massa/% 6 41 17 35 20 ∆T/°C 83-119 247-327 327-495 496-880 Perda de massa/% 6 34 23 35 51 síntese. De acordo com o método de síntese observou-se que ao final da reação as guanilhidrazonas são lavadas com acetato de etila. Assim é possível que exista resíduos de acetato de etila nessas moléculas em quantidades variadas. O acetato de etila que possui ponto de ebulição na temperatura de 77 °C pode ser a causa do primeiro evento endotérmico e da primeira etapa de perda de massa que acontece entre 71 e 102 °C quando analisada a curva na razão de 10 °C/min. Na faixa de temperatura do segundo evento endotérmico não ocorre perda de massa, caracterizando-se por um pico de fusão simétrico e definido. O terceiro evento endotérmico concorda com a temperatura inicial de perda de massa mais significativa, caracterizando essa fase como o início da degradação da amostra. Figura 10 - Curvas TG e DSC da amostra WE005, na razão de aquecimento de 10ºC/min 5.2 Caracterização da guanilhidrazona WE015 As curvas calorimétricas da WE015 nas várias razões de aquecimento podem ser visualizadas na figura 11 e apresentam três eventos endotérmicos. O primeiro pico endotérmico ocorre por volta de 47 °C (Tonset), o segundo é caracterizado como o pico de fusão e o terceiro evento caracteriza-se como o início da decomposição da amostra. Na razão de 20°C/min pode-se observar que o pico de fusão desapareceu e o primeiro pico endotérmico apresentou maior absorção de energia (214,57 J/g) quando relacionada a absorção de energia 52 na mesma temperatura para as razões menores. Isso pode acontecer devido à rapidez com que a amostra chega a temperaturas mais altas. Figura 11 - Curvas calorimétricas da amostra WE015 nas razões de aquecimento 2,5; 5,0; 10,0 e 20 ºC/min em atmosfera de nitrogênio. A tabela 5 mostra a Tonset, Tpico e a variação de entalpia nos dois principais eventos para as quatro razões de aquecimento estudadas da guanilhidrazona WE015. Tabela 5 – Dados das curvas DSC da WE015 nas razões de 2,5; 5,0; 10,0 e 20 ºC/min Razão de aquecimento (β/°C/min) 1º evento 2º evento Tonset /°C Tpico /°C ∆H /J/g Tonset /°C Tpico /°C ∆H /J/g 2,5 48,4 51,0 91,6 149,0 151,4 63,0 5,0 48,7 52,0 85,1 147,3 150,0 38,2 10,0 47,4 52,6 52,24 143,5 148,6 55,3 20,0 49,4 54,2 214,57 - - Foi observado que as temperaturas do pico de fusão (2º evento) encontram-se próximas nas razões estudadas. Isso demonstra que essa amostra não é alterada drasticamente pela velocidade de aquecimento. 53 A figura 12 mostra as curvas TG não isotérmicas da WE015 nas razões de 2,5, 5,0,10 e 20 ºC/min. em atmosfera de nitrogênio. Figura 12 - Curvas TG da WE015 nas razões de 2,5; 5; 10 e 20°C/min A amostra apresentou perda de massa semelhante nas duas razões de aquecimento. A temperatura inicial da perda de massa foi ligeiramente maior na razão de 20°C/min, fato já observado na WE005. Esses dados estão apresentados na tabela 6. Na razão de 10°C/min a amostra apresentou quatro etapas, na qual a primeira está na faixa de temperatura de 29-95 °C e perda de massa de 5%. A segunda etapa teve início por volta de 236 °C e caracterizou-se como o início da degradação apresentando a maior perda de massa (68%) entre as etapas. A quarta etapa teve início aproximadamente a 471 °C e ao final (897°C) apresentou perda de massa de 10%. De acordo com a sobreposição das curvas TG e DSC para a WE015 (Figura 13), pode- se observar que no primeiro evento endotérmico ocorre com perda de massa visualizada na curva termogravimétrica; o segundo evento caracterizado pela fusão ocorre numa faixa de temperatura em que a amostra não apresenta perda de massa. 54 Tabela 6 - Dados das curvas TG não isotérmicas da WE015 nas razões de 2,5, 5,0, 10,0 e 20 ºC/min β Etapas 1ª 2ª 3ª 4ª 2,5 ∆T/°C 26-60 62-158 159-321 323-871 Perda de massa/% 10 6 76 18 5,0 ∆T/°C 23-71 74-200 212-332 333-871 Perda de massa/% 7 8 76 21 10 ∆T/°C 29-95 236-316 317-471 471-897 Perda de massa/% 5 68 14 10 20 ∆T/°C 31-108 243-342 342-553 553-801 Perda de massa/% 6 70 16 7 Figura 13 - Sobreposição das curvas TG e DSC da amostra WE015, na razão de aquecimento de 10ºC/min Após a fusão, começa o processo de degradação da amostra caracterizado pela perda de massa expressiva no TG e pelo pico fortemente endotérmico e assimétrico no DSC. Ao final da curva DSC observa-se um pico exotérmico referente também à degradação da 55 amostra. Picos endotérmicos podem significar transformações físicas (fusão, vaporização, sublimação, etc) e/ou reações químicas (dessolvatação, desidratação, decomposição, etc). De acordo com as curvas TG e DSC, observa-se que o segundo evento endotérmico é uma transformação física caracterizada por fusão. 5.3 Caracterização da Guanilhidrazona WE016 As curvas calorimétricas da WE016 podem ser visualizadas na Figura 14. A amostra WE016 apresenta três eventos endotérmicos, sendo o primeiro característico de fusão e o segundo relaciona-se com o início da decomposição da amostra. De acordo com a sobreposição das curvas nas razões estudadas, observou-se que o aumento da razão de aquecimento provocou elevação gradativa da temperatura onset e do pico de fusão (Tabela 07). Essa variação significativa (> 2°C) da faixa de fusão pode indicar a presença de impurezas ou até mesmo de polimorfismo na amostra. Figura 14 - Curvas calorimétricas da amostra WE016 nas razões de aquecimento 2,5; 5,0; 10,0 e 20ºC/min A presença de impurezas produz considerável aumento no intervalo de fusão (diferença entre a temperatura de início da fusão até que a substância torne-se completamente líquida), provocando o início da fusão a uma temperatura mais baixa que a temperatura 56 determinada para a substância pura (IOSHII, 1997). Dessa forma, a análise térmica aplicada à pesquisa de impurezas numa substância é uma técnica rápida e eficaz para uma análise inicial, sendo necessárias outras técnicas não térmicas para confirmar a existência de impurezas ou polimorfos. Tabela 7 – Dados das curvas DSC da WE016 nas razões de 2,5; 5,0; 10,0 e 20 ºC/min Razão de aquecimento (β/°C/min) 1º evento Tonset (°C) Tpico (°C) ∆H (J/g) 2,5 247,5 251,4 248,8 5,0 255,4 258,0 213,1 10,0 262,0 265,0 146,1 20,0 267,8 270,9 172,6 A figura 15 mostra as curvas TG não isotérmicas da WE016 nas razões de 2,5, 5,0, 10 e 20 ºC/min. em atmosfera de nitrogênio. De acordo com a figura 15 pode-se observar que a amostra apresenta cinco etapas de perda de massa. Figura 15 - Sobreposição das curvas TG da WE016 nas razões de aquecimento de 2,5, 5,0, 10,0 e 20,0°C/min 57 Analisando os dados da tabela 8, temos que a temperatura inicial das etapas se apresentou maior na razão de 20°C/min concordando com os dados da WE005 e WE015. O perfil termogravimétrico da WE016 apresentou na razão de 10°C/ min. quatro etapas de perda de massa como descrito na tabela abaixo. A amostra apresentou boa estabilidade térmica, tendo em vista o início de sua decomposição por volta de 240 °C. Na maior razão estudada observou-se a sobreposição de uma etapa de perda de massa, decorrente da maior velocidade de aquecimento já explicado anteriormente. A primeira etapa refere-se à decomposição da amostra que tem início na temperatura de 242 °C (razão de 10°C/min). As etapas seguintes demonstram lentamente a degradação da amostra, as quais podem ser visualizadas em mais quatro etapas consecutivas. Na razão de 20°C/min. podemos observar uma ausência do último evento de decomposição visualizado na razão de 10°C/min. Este fato pode ser explicado pela passagem mais rápida por determinadas temperaturas, restando pouco tempo de exposição ao calor para que as reações de decomposição se completem. Nas razões de aquecimento mais baixas (2,5 °C e 5 °C) observa-se uma antecipação das temperaturas iniciais e finais em todas as etapas. Os dados detalhados estão apresentados na tabela 8. Tabela 8 - Dados das curvas TG não isotérmicas da WE016 nas razões de aquecimento de 2,5; 5; 10 e 20 ºC/min β 1ª 2ª 3ª 4ª 2,5 ∆T/°C 229-295 295-450 451-606 607-878 Perda de massa/% 35 31 12 28 5,0 ∆T/°C 234-309 312-462 465-609 611-883 Perda de massa/% 35 28 11 24 10 ∆T/°C 244-312 313-470 471-633 633-882 Perda de massa/% 33 32 10 24 20 ∆T/°C 248-355 357-513 515-874 - Perda de massa/% 39 33 18 - 58 A sobreposição das curvas de TG e DSC da WE016 na razão de 10°C/min (Figura 16) permite observar que o pico característico de fusão ocorre concomitante com a perda de massa da amostra; indicando que a decomposição inicia na mesma faixa de temperatura do evento de fusão. Após esse pico fortemente endotérmico, segue-se a decomposição da amostra caracterizada pela perda de massa em sucessivas etapas e picos endotérmicos. Figura 16 - Sobreposição das curvas TG e DSC da amostra WE016, na razão de aquecimento de 10ºC/min Desta forma analisando a Figura 17-A é possível caracterizar as amostras através da transição de fase de fusão, verificando a seguinte ordem crescente de ponto de fusão: WE015WE005=WE015. Porém, com base nas características térmicas de cada amostra nas curvas TG e DSC, constatou-se que a WE016 apesar de iniciar a perda de massa mais tardiamente que os outros fármacos, apresenta a decomposição concomitante à faixa de fusão. Assim, é necessária a complementação de demais estudos para assegurar qual das amostras é a mais estável. No entanto, a alta estabilidade das mesmas é inquestionável. 59 Figura 17 - Sobreposição das curvas DSC (A) e TG (B) da WE005, WE015 e WE016 na razão de 10°C/min O estudo cinético é uma ferramenta importante para obter informações sobre a estabilidade de substâncias. Nesse trabalho foi aplicado o método de Ozawa para obtenção dos seguintes parâmetros cinéticos: energia de ativação (Ea), fator de frequência (A) e ordem de reação. Tabela 9 – Valores dos parâmetros cinéticos obtidos através do estudo não isotérmico Amostra Ea (kJ.mol -1 ) A (min -1 ) Ordem de reação WE005 115,8 2,3x10 10 0,3 WE015 90,7 1,12x10 8 0,3 WE016 145 2,6x10 13 0,5 60 De acordo com a tabela 9, a substância com maior energia de ativação foi a WE016, demonstrando que ela possui uma maior barreira energética para dar início as reações de decomposição e, portanto possui maior estabilidade térmica. Em relação ao fator de frequência, a WE016 também apresentou maior valor do que as outras moléculas estudadas. As três substâncias apresentam ordem de reação próxima de zero, indicando que a velocidade de formação dos produtos independe da concentração dos reagentes. As figuras 18, 19 e 20 mostram os gráficos de lnβ x K-1, para as amostras WE005, WE015 e WE016, respectivamente, a partir do modelo proposto por OZAWA. Nas figuras que seguem abaixo foi possível determinar a Ea da primeira etapa de decomposição das amostras a partir dos dados provenientes de cinco curvas TG, bem como correlacionar a massa residual da amostra pelo tempo reduzido, determinando-se também a ordem da reação e o fator de frequência (SAVIO NETO, 2010). Figura 18- Curvas do (A) logaritmo da razão de aquecimento (logß) em função do inverso da temperatura (K) e da função G(X) pelo inverso da temperatura (K) da WE005. Figura 19 - Curvas do (A) logaritmo da razão de aquecimento (logß) em função do inverso da temperatura (K) e da função G(X) pelo inverso da temperatura (K) da WE015 61 Figura 20 - Curvas do (A) logaritmo da razão de aquecimento (logß) em função do inverso da temperatura (K) e da função G(X) pelo inverso da temperatura (K) da WE016. 5.4 Infravermelho As análises de espectroscopia de absorção na região do infravermelho (Figura 21) foram feitas com o objetivo de complementar os resultados obtidos por análise térmica. Para a amostra WE005 as principais bandas são: 3489 cm -1 estiramento (N-H), 1661 cm -1 (C=N), 1640 cm -1 (NH + e C=C), 1513 cm -1 (C-C aromático), 1261 cm -1 (C-O), 1019 cm -1 (C-N), 942 cm -1 (N-H). Para essa amostra as principais alterações espectrais foram nas bandas referentes as ligações N-H e C=C. A amostra WE015 apresenta as seguintes bandas: 3300 cm -1 (N-H), 1670 cm -1 (C=N), 1619 cm - 1 (NH + e C=C), 1542 cm -1 (C-C aromático), 1222 cm -1 (C-N), 950 cm -1 (N-H). Na molécula WE015 a alteração mais significante foi na região da ligação N- H. Para a substância WE016 as principais bandas de absorção são: 3413 cm -1 (N-H), 1713 cm - 1 (C=O), 1675 cm -1 (C=N), 1620 cm -1 (N-H e C=C), 1445 cm -1 (C-C), 1282 cm -1 (C-N), 1279 cm -1 (C-O), 942 cm -1 (N-H). A alteração mais significante no espectro foi na região do N-H (MARTINS, 2004; HOLZER, 1992, FARMACOPÉIA JAPONESA, 2011). Os dados são melhor evidenciados pela correlação de Pearson (Figura 21). Foi considerada alteração significativa quando R<0,5. A amostra WE005 apresenta duas regiões de alteração significativa quando se compara o espectro à temperatura ambiente e o espectro a temperatura de fusão. Na curva TG da WE005 observa-se perda de massa antes da fusão no valor de 6% na faixa de temperatura de 71-102 °C. Essa perda pode estar associada a alteração espectral evidenciada no infravermelho durante a fusão da amostra. Algo semelhante acontece com a amostra WE015, a qual perde 5% de massa antes da fusão. A molécula WE016 apresenta a primeira etapa de decomposição simultânea ao evento de fusão. 62 Dessa forma, seria esperado que o espectro durante a temperatura de fusão sofresse alterações. A manutenção das propriedades físico-químicas das matérias-primas farmacêuticas depois do processo de produção e síntese é fundamental para assegurar a atividade biológica. A fusão é uma propriedade física característica de cada molécula. No processo de fusão podem ocorrer interações sólido-líquido, transformações polimórficas, decomposição, que podem provocar alterações no espectro (GABBOTT, 2008). Figura 21 – Espectros de infravermelho das guanilhidrazonas WE005 (a), WE015 (b) e WE016 (c) em temperatura ambiente e durante a fusão e correlação de Pearson 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 80 100 80 100 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 R Wavenumber (cm -1 ) T ra n s m it a n c e ( % ) T 260 °C T ra n s m it a n c e ( % ) T amb 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 20 40 60 80 100 70 80 90 100 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 R Wavenumber (cm -1 ) T ra n s m it a n c e ( % ) T 150 °C T ra n s m it a n c e ( % ) T amb 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 40 60 80 100 60 80 100 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 R Wavenumber (cm -1 ) T ra n s m it a n c e ( % ) T 180 °C T ra n s m it a n c e ( % ) T amb Desta forma, a correlação de Pearson mostrou moderada correlação com a maioria das bandas espectrais. A comparação entre os espectros das amostras WE005 e WE015 mostrou duas regiões com baixa correlação. WE016 mostrou baixa correlação somente no intervalo de 3500-3000 cm -1 . As amostras decompõem após a fusão. 5.5. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) As propriedades tecnológicas dos pós são afetadas pelo formato, e distribuição do tamanho das partículas. Dessa forma se faz necessário caracterizar essas novas moléculas quanto à morfologia das partículas. As imagens de microscopia eletrônica de varredura das amostras são mostradas na figura 22. A amostra WE005 apresenta partículas com formato irregular. A amostra WE015 apresenta partículas também assimétricas, porém com algumas Número de onda (cm -1 ) Número de onda (cm -1 ) Número d onda (cm -1 ) a b c 63 partes planas. A substância WE016 se apresenta com o menor tamanho de partícula entre as moléculas estudadas e distribuição mais uniforme do tamanho de partícula. Figura 22 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura das guanilhidrazonas 5.7 Desenvolvimento de método analítico por CLUE Inicialmente foi realizado um gradiente exploratório. Dessa forma foi possível explorar todas as faixas de polaridade e obter um ponto de partida para o desenvolvimento do método (MARQUEZ et al., 2011). Neste contexto, foi feita uma análise em gradiente, conforme condições cromatográficas apresentadas na tabela 10. 64 Tabela 10 – Condições cromatográficas utilizadas na análise em gradiente exploratório Parâmetros Condições Fase estacionária C18 (L=50 x 4,6 mm; d.p 2,2 µm) Fase móvel 0 —100% ACN Concentração amostra 30 ppm Fluxo (mL/min.) 0,2 pH do sistema Sem adição de modificadores Volume de injeção (μL) 1 Comprimento de onda (nm) 290 Temperatura 30 °C Tempo 30 min A figura 23 mostra os espectros de UV de varredura para as amostras, no qual é possível verificar que utilizando o detector com arranjo de fotodiodos, o melhor comprimento de onda para determinação simultânea (290 nm). Para a determinação de forma isolada os comprimentos foram 289 nm (WE005), 280 (WE015) e 296 nm (WE016). Figura 23 – Espectros UV das guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 nm 0 25 50 mAU 2 9 7 2 5 4 2 0 7 3 6 2 3 1 2 2 8 9 2 3 0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 nm 0 25 50 75 mAU 2 3 0 3 3 6 2 8 0 2 1 7 WE005 WE015 65 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 nm 0 25 50 75 100 mAU 2 0 5 2 3 2 3 6 2 2 9 5 2 1 6 A partir do método cromatográfico apresentado na Tabela 10 foi observado a coeluição de duas das moléculas e a terceira eluindo próximo ao pico de co-eluição (Figura 24). Figura 24 – Cromatograma obtido por CLUE da mistura de WE005, WE015 e WE016 no método de gradiente 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 min -2.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 mAU 290nm,4nm (1.00) Quando o gradiente é linear, pode-se obter valores aproximados de proporção de fase móvel durante o tempo de retenção das susbstâncias. Considerando que em 30 minutos tem-se 100% de ACN, então em 7,5 min temos aproximadamente 25% de ACN. A partir desse cálculo foi possível estabelecer um parâmetro para nortear as próximas análises. Além disso, a partir do pKa das moléculas foi possível prever o melhor pH para a separação. A retenção de solutos ionizáveis é altamente influenciados pelo pH da fase móvel, uma vez que oo pH da fase móvel influencia no grau de ionização dos solutos e dos silanóis residuais da fase estacionária dependem desse pH. O comportamento da retenção de solutos básicos e ácidos frente ao pH está relacionado ao pKa do soluto. Quando o pH da fase móvel está duas unidades abaixo do pKa do soluto básico, este se encontra na forma ionizada, dessa forma sua polaridade é maior e, em fase reversa, isso significa maior interação com a fase WE016 66 móvel ocasionando uma menor retenção. Quando há uma maior proximidade entre o pH da fase móvel e o pKa do soluto básico, pequenas variações no pH refletem maiores variações na retenção do soluto. Na faixa em que o pH da fase móvel é pelo menos duas unidades maior do que o pKa do soluto básico, este se encontra como base livre, resultando numa maior retenção devido a maior interação hidrofóbica com as cadeias C18 da fase estacionária (BORGES, 2012). Dessa forma é possível controlar a ionização e consequentemente a retenção dessas moléculas através do ajuste de pH. Para manter as substâncias na forma molecular foi adicionado trietanolamina na fase aquosa, atigindo uma concentração final de 0,002% e um pH de 8,5. A fim de otimizar as análises e racionalizar os experimentos utilizou-se planejamento fatorial. A Tabela 11 mostra o planejamento fatorial com 3 níveis e 3 fatores (3 3 ) utilizado inicialmente neste estudo para desenvolvimento do método por CLUE-DAD. Tabela 11 - Descrição dos fatores e níveis estudados no planejamento fatorial 1 para o desenvolvimento do método por CLUE-DAD NÍVEIS FATORES -1 0 +1 Coluna (mm) 30 50 75 Fluxo (mL/min.) 0,2 0,3 0,4 Composição de FM (ACN:H2O + Trietanolamina) 17:83 20:80 23:77 Alguns autores (ALBERTI, 2014; MALENOVIC, 2013; BEG, 2012; FICARRA, 2002; HEYDEN, 1995) também utilizaram o planejamento fatorial como ferramenta para auxiliar no desenvolvimento de método por cromatografia líquida. Para as separações cromatográficas, é importante ter uma resposta aceitável que atenda aos critérios mínimos. O objetivo é muitas vezes localizar essa região (por exemplo: pH alto, a temperatura mais baixa) (HIBBERT, 2012). Uma das questões mais importantes no delineamento experimental é a escolha dos fatores e níveis. É primordial buscar parâmetros na literatura para que os resultados respondam de forma coerente. Uma análise mutivariada requer do pesquisador um conhecimento prévio do que pode acontecer nos resultados (BEG, 2012). 67 A tabela 12 apresenta a matriz do planejamento fatorial 3 3 utilizado no desenvolvimento do nosso método pro CLUE-DAD. Diversos são os métodos de planejamento experimental que auxiliam no desenvolvimento de métodos. O planejamento racional de experimentos permite identificar as variáveis que mais influenciam na resposta observada, facilitando o desenvolvimento do método. Tabela 12 – Matriz do planejamento fatorial 1 no desenvolvimento do método por CLUE- DAD Experimento Fluxo (mL/min.) Composição de FM Coluna 1 -1 -1 -1 2 0 -1 -1 3 +1 -1 -1 4 -1 0 -1 5 0 0 -1 6 +1 0 -1 7 -1 +1 -1 8 0 +1 -1 9 +1 +1 -1 10 -1 -1 0 11 0 -1 0 12 +1 -1 0 13 -1 0 0 14 0 0 0 15 +1 0 0 16 -1 +1 0 17 0 +1 0 18 +1 +1 0 19 -1 -1 +1 20 0 -1 +1 21 +1 -1 +1 22 -1 0 +1 23 0 0 +1 24 +1 0 +1 25 -1 +1 +1 26 0 +1 +1 27 +1 +1 +1 A figura 25 mostra que quanto maior o comprimento da coluna, maior é o tempo de retenção e maior a resolução. Na coluna de maior comprimento (7,5 cm) obtiveram-se um tempo de retenção muito alto (25 a 50 min nas variadas condições), picos largos e com intensidade muito baixa, inviabilizando a utilização dessa coluna nessas condições para essas substâncias. Com relação a composição de fase móvel, observou- se que quanto maior a 68 proporção de acetonitrila (ACN) menor é o tempo de retenção, porém a probabilidade de coeluição é maior, principalmente na coluna de comprimento menor. O fluxo crescente diminuiu o tempo de retenção e a largura do pico, porém promoveu a coeluição em condições mais propícias como quando a proporção de fase móvel era maior e o comprimento da coluna era menor. Figura 25 – Cromatogramas obtidos a partir do planejamento fatorial 1 69 Nas condições estabelecidas no planejamento não foi possível diminuir a largura dos picos e obter uma boa separação. A partir do planejamento fatorial I e de mudanças realizadas de acordo com a literatura foi realizado um planejamento fatorial II (tabela 13). A escolha de níveis do planejamento fatorial II foi feita através da observação da resposta relacionada aos fatores no planejamento fatorial 1 e do ajuste da força eluotrópica ao substituir o solvente orgânico. As principais alterações foram no solvente orgânico e no pH. O planejamento fatorial além de investigar outras possíveis condições melhores, foi capaz de avaliar a influência de cada parâmetro na resposta. Equação para ajuste da força eluotrópica: ST = ∑ Si ᴓi Onde, ST é força total do solvente de uma mistura, Si são os fatores de peso da força de solvente e ᴓ é a fração volumétrica do solvente. Dessa forma, como nível central foi estabelecido a utilização de 40% de metanol na fase móvel, 0,3 de fluxo e comprimento da coluna 50 mm x 3mm. Tabela 13 - Descrição dos fatores e níveis estudados no planejamento fatorial 2 para o desenvolvimento do método por CLUE-DAD NÍVEIS FATORES -1 0 +1 Coluna 30 50 75 Fluxo (mL/min.) 0,2 0,3 0,4 Composição de FM (MeOH:H2O + TEA 0.1% + ácido acético pH 3.5) 35:65 40:60 45:55 A utilização de metanol parte de uma abordagem de menor custo para a análise de rotina de fármacos e medicamentos (BEG,2012). A mudança de pH foi feita na tentativa da molécula encontrar-se ionizada, tendo em vista que no pH anterior, todas as moléculas se encontravam em duas formas, uma ionizada e a outra livre, com proporções variadas. Isso possivelmente ocasionou o alargamento do pico. Além disso, a coluna suporta uma faixa de pH entre 1,5 e 7,5; portanto é interessante que se trabalhe dentro dessa faixa para não causar danos a fase estacionária. 70 Borges e colaboradores (2012) observaram que quando for necessário aumentar a resolução de solutos básicos o pH da fase móvel é uma variável importante uma vez que influencia fortemente a retenção de solutos ionizáveis; o uso de fases móveis ácidas aumenta a retenção de solutos ácidos e o uso de fases móveis alcalinas aumenta a retenção de solutos básicos. O pH 3,5, ajustado com ácido acético, foi escolhido, pois as três moléculas se encontram na forma ionizada 2 (ver figuras 3, 5 e 7). Outro problema observado no planejamento fatorial 1 foi o elevado fator de cauda das condições analisadas. Picos caudados são um problema em cromatografia, particularmente na separação de compostos básicos, portanto um problema constante na análise de produtos farmacêuticos, que são em sua maioria de caráter básico. Picos com cauda causam inúmeros problemas, incluindo baixa resolução, sensibilidade reduzida, precisão e quantificação inadequada. Caudas podem ser causadas por diversos motivos, como por exemplo, presença de metais na fase estacionária, grupos silanóis ativos causando interação secundária, solvente da amostra mais forte que a fase móvel, excesso de massa de amostra e vazios na coluna (SONG, WANG, 2003). Para a solução desse problema recomenda-se adicionar um modificador de amina, como a trietilamina ou substituir a coluna por outra de menor atividade silanofílica (KROMIDAS, 2005; DONG, 2006; DONGRE, 2008). Assim, a trietilamina (TEA) foi adicionada a fase aquosa para atuar como uma base competitiva e diminuir a exposição dos grupos silanóis da coluna. 71 Figura 26 – Cromatogramas obtidos a partir do planejamento fatorial 2 72 O aumento da força de eluição na maioria das vezes provoca diminuição do tempo de retenção e com isso pode acontecer uma diminuição da resolução entre os picos, porém a afinidade que cada molécula possui frente a diferentes proporções de fase móvel pode diferir o que pode causar até mesmo uma melhora na resolução. 73 Além disso, buscou-se analisar quais os parâmetros apresentavam mais influência na análise e também investigar outras condições utilizando o planejamento fatorial. Os dados foram tratados através da metodologia de superfície-resposta, que é uma ferramenta eficaz para otimizar processos e desenvolver métodos, pois é possível avaliar o efeito das variáveis e suas interações (ALBERTI, 2014). A metodologia de superfície-resposta tem como vantagem permitir um estudo completo onde todos os efeitos são estimados; a partir disso vê-se uma região experimental que pode ser descartada ou válida dependendo das respostas frente os fatores avaliados (FICARRA, 2002). O gráfico de Pareto apresenta a influência dos fatores sobre a resposta de forma quantitativa. O gráfico de Pareto informa também a relação entre o fator e a resposta (+ ou -). Na figura 27, está apresentado o gráfico de superfície e de Pareto referente a variável dependente tempo de retenção. Este gráfico representa a influência do fluxo e da proporção da fase móvel em relação ao tempo de retenção, de acordo com as variações propostas através dos níveis. O tempo de retenção é um dos fatores importantes no desenvolvimento de um método devido à necessidade constante de diminuir tempo e consumo de solvente. Entender quais e com qual intensidade os fatores influenciam no tempo de retenção ajuda a obter melhores resultados. No gráfico abaixo se pode observar que quanto maior o fluxo e a proporção de fase orgânica na fase móvel, menor será o tempo de retenção. Em relação ao tempo de análise, pode-se descartar o fluxo de 0,4 mL/min e a proporção de fase móvel 35:65 (v:v) devido ao tempo longo de análise. Figura 27 - Gráfico de superfície-resposta e de Pareto referente a variável tempo de retenção 74 O gráfico de Pareto relaciona os três fatores com a variável dependente. Dessa forma pode-se perceber a grande influência do comprimento da coluna no tempo de retenção. A fase móvel percorrerá um caminho maior na coluna com comprimento maior, aumentando assim o tempo em que o analito permanecerá retido. Porém tal diferença entre os fatores pode ser atribuída aos níveis muito altos da variável ―comprimento de coluna‖ (30 mm, 50 mm, 75 mm), frente aos níveis menos discrepantes do fluxo (0,2; 0,3; 0,4) e da proporção de fase móvel (35; 40; 45%). O aumento do comprimento da coluna geralmente melhora a resolução, porém é necessário avaliar até que ponto uma análise rápida proporciona uma resolução adequada para quantificação dos analitos de interesse. A Figura 28 mostra o gráfico de superfície e o gráfico de Pareto, os quais descrevem as variações no número de pratos teóricos em relação a diferentes proporções de fase móvel e fluxos. O número de pratos teóricos está associado à eficiência da coluna. Este fato é explicado pelo mecanismo de separação relacionado ao equilíbrio, no qual a existência de maior número de locais propícios ao equilíbrio termodinâmico entre fase móvel, fase estacionária e analito ocasiona maior eficiência de separação da coluna. Por isso se faz necessário monitorar o número de pratos teóricos. Figura 28 - Gráfico de superfície-resposta e de gráfico de Pareto referente à variável número de pratos teóricos 75 O fluxo não apresentou influência significativa no número de pratos teóricos. No gráfico de superfície é possível ver que em todos os fluxos testados o número de pratos manteve-se acima de 5000. No gráfico de Pareto observa-se a confirmação do que foi descrito no gráfico de superfície. No gráfico de Pareto o fluxo não teve influência significativa (para um nível de significância de 5%) em nenhuma das formas (quadrática e linear). Através de Pareto se observa que novamente o comprimento da coluna foi a variável de maior influência para as respostas e consequentemente para o número de pratos teóricos tanto em sua forma linear, quanto quadrática. Colunas maiores possuem mais zonas de equilíbrio, proporcionando maior número de pratos. A proporção de fase móvel teve significância estatística para a variável dependente em estudo somente na forma linear. Através do gráfico de superfície tem- se que quanto menor a proporção de fase orgânica, maior o número de pratos teóricos. Com a menor força eluotrópica, o analito passa mais tempo interagindo com a fase estacionária, maior será a possibilidade de interações e o número de pratos teóricos aumenta. A cauda é um dos grandes problemas na separação de compostos básicos, pois esses analitos se ionizam facilmente em pH neutro podendo causar mais de um mecanismo de retenção na coluna. É necessário evitar picos caudados, pois estes tornam a quantificação imprecisa. Nesse estudo foi verificada a influência da proporção de fase móvel, do fluxo e do comprimento da coluna no fator de cauda (Figura 29). Figura 29 - Gráfico de superfície-resposta e gráfico de Pareto referente a variável fator de cauda 76 O gráfico de superfície (Figura 29) mostra que em fluxos maiores ocorre discreto aumento no fator de cauda, este dado é confirmado pelo gráfico de Pareto, no qual o fluxo em sua forma linear é a terceira variável a influenciar significativamente o fator de cauda. Em relação à proporção de fase móvel, nota-se um aumento no fator de cauda concomitante ao aumento da proporção de fase orgânica na fase móvel. Ainda no gráfico de Pareto, verificamos que o fator de maior influência no fator de cauda, para estes níveis, foi o comprimento da coluna. Quanto maior o comprimento da coluna, menor o fator de cauda, isto é evidenciado pelo sinal negativo no gráfico de Pareto sobre a variável comprimento de coluna. Todos os fatores tiverem influência significativa de forma apenas linear. É importante ressaltar que todas as condições experimentais proporcionaram fator de cauda dentro do aceitável. A resolução é um dos parâmetros mais importantes no desenvolvimento de um método. Uma separação ruim entre picos indica uma resolução que precisa ser melhorada. De acordo com o gráfico de superfície, há uma melhor resolução no menor fluxo (0,2 mL/min) e na proporção de fase móvel central (40:60 v/v). Através do gráfico de Pareto pode-se observar que todos os fatores foram significativos em sua forma linear e quadrática, com exceção da forma quadrática do fluxo (Figura 30). Figura 30 - Gráfico de superfície-resposta e gráfico de Pareto referente a variável resolução 77 Considerando os parâmetros: tempo de retenção, número de pratos teóricos, fator de cauda e resolução, a melhor condição foi à apresentada na tabela 14, com consequente cromatograma na figura 31 e espectros de UV na Figura 32. Tabela 14 – Parâmetros da melhor condição experimental Parâmetros Condições Fase estacionária C18 (L= 50 mm) Fase móvel MeOH:H2O:TEA + acid. acético (40:60:0,1) Concentração amostra 30 ppm Fluxo (mL/min.) 0,2 pH do sistema 3,5 Volume de injeção (μL) 1 Comprimento de onda (nm) 290 Temperatura 30 °C De acordo com o espectro e o tempo de retenção de cada guanilhidrazona é possível identificá-las no cromatograma. Figura 31 – Cromatograma da melhor condição experimental 0 1 2 3 4 0 20000 40000 60000 80000 100000 in te n s id a d e ( m A u ) Tempo (min) Molécula TR ÁREA K RS F. DE CAUDA N WE005 2.16 389892 0 0 1.67 2256 WE015 2.59 388894 0.19 2.29 1.61 3030 WE016 3.23 551720 0.49 3.19 1.67 3644 WE005 WE015 WE016 78 Figura 32 – Espectro 3D das guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 79 6 CONCLUSÕES  As técnicas térmicas DSC e TG são úteis para a caracterização de novas moléculas, tendo em vista que são técnicas limpas, sensíveis e utilizam pouca quantidade de amostra. De acordo com a caracterização térmica e comparação das três guanilhidrazonas, pode-se concluir que possuem estabilidade térmica semelhante;  O estudo cinético não isotérmico pelo método de Ozawa, através do triplete cinético demonstrou que a amostra WE016 possui maior energia de ativação e, portanto maior estabilidade do que as outras guanilhidrazonas desse estudo. As três moléculas apresentaram ordem de reação zero;  As análises por infravermelho demonstraram que as três moléculas sofrem alteração durante a faixa de fusão, de acordo com a correlação de Pearson;  Um método rápido foi desenvolvido com o auxílio de planejamento fatorial para a separação das guanilhidrazonas WE005, WE015 e WE016 através de CLUE/DAD. 80 REFERÊNCIAS AHUJA S. Assuring quality of drugs by monitoring impurities. Advanced Drug Delivery Reviews. 59:3–11. 2007 ALBERTI A, ZIELINSKI AAF, ZARDO DM, DEMIATE IM, NOGUEIRA A, MAFRA LI . Optimisation of the extraction of phenolic compounds from apples using response surface methodology. Food Chemistry 149:151–158. 2014 ANDRADE J, IHA K, ROCCO JAFF; BEZERRA EM; SUÁREZ-IHA MEV; PINHEIRO GFM . Análise térmica aplicada ao estudo de materiais energéticos. Quím. Nova vol.30 no.4 São Paulo July/Aug. 2007 ANDREANI A, LEONI A, LOCATELLI A, MORIGI R,RAMBALDI M, RECANATINI M, GARALIENE V. Potential Antitumor Agents. 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Lourival de Mello Motta, s/n, Tabuleiro dos Martins, Zip. 57072-970 - Maceio, AL - Brazil c Unified Laboratories of Development and Assays of Medicines – LUDEM – Federal University of Paraíba – UFPB, Campos 1, Zip. 58059-900, João Pessoa – PB. * Corresponding author at: Prof. Ana Paula Barreto Gomes Av, General Cordeiro de Faria s/n, Petrópolis, Zip. 59000-000, Natal – Rio Grande do Norte - Brazil Address: ana.pbgomes@gmail.com Telephones: +55 84 3342-9813 Abstract Guanylhydrazones are chemical compounds formed by a guanyl group attached to a hydrazone. These substances have been widely studied because of their biological potential. The aim of this study was to develop a method with isocratic elution for simultaneous quantification of three guanylhydrazones (WE005, WE15 and WE016). It was evaluated the influence of the factors on chromatographic parameters through 3 3 factorial design. Factors were the composition of mobile phase, flow and column length. System suitability parameters (retention time, resolution, tailing factor and theoretical plate number) were obtained from the 27 chromatograms which surface-response graphs were plotted. According to the Surface Response and Pareto graphics, the column length and the proportion of mobile phase had the greatest influence on the chromatographic parameters. The best conditions found were: a stainless steel Shim-pack XR-ODS column (50 mm x 2 mm id, particle size 2.2 mM), at 30 °C, mobile phase methanol: water (40:60), with 0.1% of triethylamine in aqueous phase, pH 3.5 adjusted by acetic acid and a flow rate of 0.2 ml min -1 . Experimental design showed a good choice for the 91 development and improvement of a rapid and suitable method for simultaneous quantification of guanylhydrazones. Keywords: guanylhydrazone, UHPLC, factorial design Introduction Guanylhydrazones are chemical compounds formed by a guanyl group attached to a hydrazone. These substances have been widely studied because of their biological potential [1]. The guanylhydrazones this work has demonstrated antibacterial and antifungal activity in vitro, but further studies are needed to confirm. Quality control is essential to monitor the safety and efficacy of medicines. According to pharmaceutical manufacturers association of U.S. ―quality is the sum of all the factors which contribute directly or indirectly to the safety, effectiveness and acceptability of the product‖. New and better medicinal agents are being produced at an accelerated rate [2]. Development of rapid and economical methods for the quality control of medicines is becoming very useful chromatographic methods for the determination and quantification of Active Pharmaceutical Ingredients (APIs) and pharmaceutical formulations, impurities and degradation products. Ultra Hight Performance Liquid Chromatographic (UHPLC) is a recent technique in liquid chromatography, which enables significant reductions in separation time and solvent consumption when a compare with method HPLC. The advantage of UHPLC method provides principle to run separations of APIs along with degradation products using a column packed with smaller particles at higher flow rates to give a superior resolution and sensitivity in a short run time [3, 4]. In the present study, UHPLC technology has been applied to the method development of assay determination of guanylhydrazones WE005, WE015 and WE016. The application of chromatographic methods introduces a powerful tool for quality control of medicines. The ability of a chromatographic method to successful separate, identify and quantify species is determined by many factors. A factorial design is an approach which applies a set of statistical methods in a rational way that can provide information about the functioning of a system. Factorial design cause deliberate changes in the input variable (factor) in order to verify the effects on the response variable. Also called experimental design or factorial design, this statistical tool has the advantage of exploring the possible combinations of factors and levels chosen [5]. Thus, it is possible to save time and at the same time covering all the experimental conditions previously set by the choice of factors and response variables levels. Several authors reported the factorial design as support for method development by HPLC [6-8]. This study aims to development of UHPLC method for simultaneous determination of guanylhydrazones by factorial design. Material and Methods Chemicals Methanol HPLC grade (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), acetonitrile HPLC grade, acetic acid HPLC grade and triethylamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) were used. Deionized Milli Q water (Millipore, Bedford, 92 MA) was used to prepare the mobile phase and diluent solutions. All guanylhydrazones were synthesized as described by Epifânio [1] and identified by RMN 1 H, RMN 13 C, e IV. UHPLC equipment Shimadzu UFLC XR (Japan) consisting of a binary pump system LC-20AD XR, DGU-20A3 degasser, auto sampler SIL-20AC XR, CTO-20AC column oven, detection system photodiode array (PDA) SPD-M20A and communication module CBM-20A computer. Shim-pack columns with octadecylsilane groups, XR-ODS were used: 30 mm x 2 mm; 50 mm x 3 mm x 4.6 mm and 75 mm. The internal particle diameter was 2.2 micrometers. Full spectra were recorded in the range 200-400 nm. Sample solutions For the method development weighed 10 mg each guanylhydrazone in 10 ml volumetric flask where in the mobile phase (MeOH or ACN: H2O 1:1). The samples were mixed and diluted so that each had a final concentration of 30 mg / mL (30 ppm) in solution. The final solution was filtered through a membrane filter with pore diameter 0:22 micrometers. Factorial design The factorial design to select the chromatographic method was used with three factors (column, flow and composition of the mobile phase) and three levels (33) totaling 27 experimental conditions. The response variables were the tail factor, retention time, resolution and number of theoretical plates. Results and Discussion Initially an exploratory gradient was performed using ACN: H2O in order to explore a wider range of polarity to determine the retention times of guanylhydrazones. According to this initial analysis one can observe the coelution of two molecules eluted in the third and final retention time of approximately 7.5 min. When the gradient is linear, one can obtain approximate values for rate of the mobile phase during the retention time of substances into. In 30 minutes is up 100% ACN in 7.5 min then have approximately 25% ACN. From this simple calculation, it was possible to set a parameter to guide the subsequent analyzes. Various proportions of acetonitrile were tested, but no selectivity. The use of methanol is an alternative to improve the selectivity and the shape of the peaks further has a lower cost and is widely used in routine analysis of drugs [9]. Thus it was decided to change the organic solvent and pH. Considering that the feature in question guanylhydrazones ionized at neutral pH, which could be hindering the separation. From some physico-chemical properties of the molecules was possible to predict the best pH for separation. The ionizable solute retention are highly influenced by the pH of the mobile phase, since the degree of ionization of the solute and the stationary phase residual silanols that depend on pH. The change in pH occurred in an attempt to leave the ionized molecule. Furthermore, the column supports a pH range between 2 and 7,5, so it is interesting to work within this range do not cause damage to the stationary phase. When it is necessary to increase the resolution of basic solutes, the pH of the mobile phase is a first variable that should be 93 explored, as it strongly influences the retention of ionizable solute; the use of acidic mobile phase increases the retention of acid solutes and the use of alkaline mobile phase increases the retention of basic solutes [10]. The pH 3.5, adjusted with acetic acid, was chosen as this, the three molecules are ionized. Tails are a problem in chromatography, especially in the separation of basic compounds, therefore a constant problem in the analysis of pharmaceuticals, which are mostly basic character. Peaks with tails cause numerous problems, including low resolution, low sensitivity, precision and inadequate quantification. Tails can be caused by various reasons such as presence of metals in stationary phase, active silanol groups causing secondary solvent interaction stronger than the mobile phase sample, excess mass of sample and blank in column [11]. To solve this problem it is recommended to add a modifier amine, such as triethylamine or replace the column by one of lower activity silanofílica [12, 13]. Thus, triethylamine (TEA) was added to the aqueous phase to act as a competitive basis and reducing exposure of the silanol groups of the column. Through adjustments in the ratio of chromatographic mobile phase, we attempted to improve the number of theoretical plates, the tailing factor and retention time. Thus, the condition that provided the best chromatogram was: a stainless steel Shim- pack XR-ODS column (50 mm x 2 mm id, particle size 2.2 mM) at 30 ° C, mobile phase methanol: water (40:60 ), with 0.1% of triethylamine in aqueous phase, pH 3.5 adjusted by acetic acid and a flow rate of 0.2 ml min-1. From this condition, we attempted to analyze which parameters had more influence in the analysis and to investigate other conditions using factorial design in order to get the best method. Data were treated by response surface methodology (Table 1), which is an effective tool to optimize processes and develop methods; it is possible to evaluate the effect of variables and their interactions [14]. Table 1 - Factors and levels of the factorial design Levels Factors -1 0 +1 Column (mm) 30 50 75 Flow (mL/min.) 0,2 0,3 0,4 Mobile phase (MeOH:H2O + TEA 0.1% + acetic acid pH 3.5) 35:65 40:60 45:55 System suitability parameters (retention time, resolution, tailing factor and theoretical plates number) were obtained from the 27 chromatograms which surface-response graphs were plotted. 94 Fig. 2 Surface Response and Pareto graphics from A-retention time, B-Number of theoretical plates, C-Tailing factor, and D-Resolution variable In Fig. 2A Surface Response and Pareto graphics referring to the dependent variable retention time. This graph represents the influence of the flow and the proportion of the mobile phase relative to the retention time. The retention time is an important factor in the development of a method due to the constant need to reduce solvent consumption and time. Understand what and with what intensity factors influencing the retention time help to achieve better results. In the graph below which have higher flow and the ratio of mobile phase, the lower the retention time. In relation to the analysis time can be discarded and the flow rate of 0.4 mobile phase 35:65 due to the long time of analysis. The Pareto graphic lists the three factors with the dependent variable, thus we can realize the great influence of column length for retention time, it is because the mobile phase will take longer to traverse the entire length of a column with a greater length, thereby increasing the time in which the analyte is retained. But such a difference between factors can be attributed to the very high levels of variable "column length" (30 mm, 50 mm, 75 mm), compared with less disparate levels of flow (0.2; 0.3, 0.4) and the proportion of mobile phase (35, 40, 45%). Increasing the length of the column generally improves resolution, but it is necessary to assess to what extent a quick analysis. Fig. 2B shows a graph of surface and Pareto chart, which describes variations in the number of theoretical plates in relation to different ratios of mobile phase and flow. The number of theoretical plates is associated with the efficiency of the column. This fact is the separation mechanism related to equilibrium, in which there is a higher number of favorable thermodynamic equilibrium between the mobile phase, stationary phase and the analyte causes greater separation efficiency of the column. Therefore it is necessary to monitor the 95 number of theoretical plates. The flow showed no significant influence on the number of theoretical plates. The graph surface can see that all the flows tested in the number of plates remained above 5000. On the Pareto chart shows the confirmation of what has been described in the chart surface. In the Pareto chart the flow had no significant influence (for a significance level of 5%) in any of the forms (quadratic and linear). Through Pareto again noted that the column length was the variable with the highest influence to the responses and consequently the number of theoretical plates in both a linear form as quadratic. The proportion of mobile phase was statistically significant for the dependent variable under study only the linear form. The graphical surface we see that the smaller the proportion of the organic phase, the greater the number of theoretical plates. The tail is a major problem in the separation of basic compounds, because these analytes are ionized at neutral pH and can easily cause more of a retention mechanism in the column. In this study we investigated the influence of the ratio of mobile phase flow and the length of the column in the tail factor. The surface graphic (Fig 2C) shows that in larger streams slight increase in tailing factor occurs, this finding is confirmed by the Pareto graphic, in which the flow in its linear form is the third variable to significantly influence the tailing factor. About the proportion of mobile phase, note an increase in the concomitant increase in the proportion of organic phase in the mobile phase tail factor. Still in the Pareto graphic, we the most influential factor in the tail factor to these levels, it was the length of the column. The greater the length of the column, the lower tailing factor, this is evidenced by the negative sign on the Pareto graphic of the variable length column. All factors have significant influence only linearly. Importantly, all experimental conditions provided tail factor within the acceptable. Resolution is one of the most important parameters in the development of a method. A bad breakup between peaks indicates a resolution that needs to be improved. According to the chart surface, (Fig 2D) there is improved resolution at lower flow rate (0.2 ml / min) and the proportion of the central mobile phase (40:60). Through the Pareto graphic all the factors were significant in their linear and quadratic form, with the exception of the quadratic form of the flow. The Fig 3 shows the better chromatogram considering the parameters: retention time, number of theoretical plates, tail factor and resolution. Fig. 3 The best chromatogram and conditions 96 Conclusions The proposed method was able to separate the guanylhydrazones WE005, WE015 and WE016. Experimental design showed a good choice for the development and improvement of a rapid and suitable method for simultaneous quantification of guanylhydrazones. References 1. Epifânio WAN. (2011) Dissertação de mestrado, Universidade Federal de Alagoas,Maceió 2. Shinde VM, Dhalwal K, Potdar M, Mahadik RK (2009) International Journal of Phytomedicine 1: 4-8 3. 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Lourival de Mello Motta, s/n, Tabuleiro dos Martins, Zip. 57072-970 - Maceio, AL – Brazil c Chemistry Institute, Federal University of Rio Grande do Norte - Campus Universitário, Natal-RN, Zip 59078- 970, Brazil Abstract The synthesis of new drugs involves several steps which have to be monitored in order to ensure their quality, safety and effectiveness. Guanylhydrazones are a class of substances widely studied due to their great biological potential. In this study, the synthetic guanylhydrazones WE005 ((2-[(3, 4-dimethoxyphenyl)methylene]- hydrazinecarboximidamide), WE015 (2-(phenylmethylene)-hydrazinecarboximidamide) and WE016 (4-[[2- (aminoiminomethyl)hydrazinylidene]methyl]-benzoic acid methyl ester) were evaluated using thermal techniques (DSC and TG) and FTIR. DSC and TG were employed using the following heating rates: 2.5, 5.0, 10 and 20 °C min -1 , in a nitrogen atmosphere (50 mL min -1 ). The samples showed very similar stability, with the initial decomposition temperature of about 240 °C by TG. It was not possible to accurately determine the purity of these molecules due to the limitations of DSC technique. Spectral analysis showed that significant chemical changes occurred with the guanylhydrazones in the melting range. The WE016 sample showed higher activation energy and thermal stability. Keywords: Guanylhydrazones, DSC, TG, FTIR, SEM Introduction The guanylhydrazones are characterized by the presence of the guanidine group connected to a hydrazone. Many studies point that the guanidine group is the primary responsible for the pharmacological activity of guanylhydrazones [1-4]. There is great interest in the study of these molecules due to their biological activities, 98 such as antitumor, antihypertensive, trypanocidal, antimalarial, antibacterial / antifungal, cardiotonic effect, antitubercular activity and more recently it was discovered a butyrylcholinesterase inhibitory activity, what makes them candidate drugs for the treatment of Alzheimer's disease [5-7]. The development of prototypes from these new molecules occurs with substitutions in the aromatic region. The synthesis of organic molecules involves residues of toxic solvents and a precursor substance [1, 5]. The rational design of a pharmaceutical product should begin with the characterization of the active pharmaceutical ingredients (API’s) in order to determine their physicochemical properties. For rational drug development, it is therefore essential to characterize the physicochemical properties, polymorphic forms and stability of the new entity. The quality control of new drugs is employed to set parameters for preformulation studies, which is an essential knowledge for the optimization of production processes, storage and final quality. The synthesis of new molecules can involve heating stages, in which the stability of these molecules may be reduced. Thus, it is needed to evaluate the thermal stability of these new chemical entities in order to assure that no modifications in its structure would happen upon heating. The thermal techniques are widely employed to evaluate drug stability. The reaction kinetic study in solid state is an effective tool to evaluate the stability of molecules trough the kinetic triplet (activation energy, frequency factor and reaction order). In the present study, the thermal stability of drugs was evaluated using the Ozawa´s non-isothermal kinetic study, which is based on the Arrhenius equation. The Ozawa´s equation is shown below: Where Ea is the activation energy, R is the gas constant, dT is the temperature variation, T is the temperature (Kelvin), A is the pre exponential factor. The determination of these factors is performed experimentally [8]. Thermal techniques are a set of techniques that measure the physical characteristics of the substance as a function of time or temperature through a controlled temperature program. Thermogravimetry (TG) and Differential Scanning Calorimetry (DSC) are successfully applied in the pharmaceutical industry and reveal important information about the physicochemical properties of APIs and excipients such as polymorphism, stability, purity and compatibility of the substances in the formulation [9-13]. DSC is a technique widely used to characterize substances, which possess events involving absorption or heat release. Some events related are almost every phase transition, chemical reaction, absorption, mixing or similar activity is accompanied by an exchange of heat. The TG is a technique related with stability of drugs through variation mass in a temperature control program. Overall, thermal analysis methods provide the best techniques for general screening and troubleshooting at all stages of drug development, from the choice of the salt form to the marketed product. The chemical structures of the studied samples are shown in Fig. 1. According to Lima et al and other researchers, the interpretation of thermal data is not simple, and requires careful evaluation to prevent misinterpretation. Thus, besides thermal techniques, other analytic techniques often have been used such as FTIR and SEM as methods for characterization of new compounds with potential bioactivity [14-18]. 99 Pearson’s correlation coefficient can be considered an auxiliary tool in the interpretation of chemical interactions or changes in the chemical structure due heating and decomposition. It is also a quantitative method when there are large data sets [14,19, 20]. This study aims to characterize the guanylhydrazones WE005 (2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methylene]- hydrazinecarboximidamide), WE015 (2-(phenylmethylene)-hydrazinecarboximidamide) and WE016 (4-[[2- (aminoiminomethyl)hydrazinylidene]methyl]-benzoic acid methyl ester) by DSC, TG, FTIR, SEM and determination of the kinetic triplet employing Ozawa’s method [21]. Material and Methods Samples The molecules are the aromatic guanylhydrazones WE005, WE015 and WE016. The prototypes were synthesized by direct reaction of the corresponding aldehydes with aminoguanidine hydrochloride. The reaction solvent was 95% ethanol under reflux. This was an adaptation of the method described by Ulrich and Cerami (1984) by condensation of equimolar carbonylated derivative (aldehyde or ketone) with aminoguanidine in an alcoholic medium under reflux and catalytic amounts of acid [22]. The product was heated at 100 °C and then it was washed with ethyl acetate. The reaction products were elucidated by 1 H NMR, 13 C NMR and IR [5]. Thermal Analysis DSC curves were obtained on a DSC-60A Shimadzu Calorimeter using aluminum crucibles with about 1.0 ± 0.1 mg of sample under nitrogen atmosphere (flow rate of 50 mL min -1 ) and the following heating rates: 2.5, 5.0, 10.0 and 20.0 °C min -1 , from 25 to 500 °C. DSC was calibrated with indium standard (156.6 ± 0.3 °C). TG curves were obtained in a DTG-60H Shimadzu Thermobalance using alumina crucibles with a sample mass of 4.0 ± 0.5 mg, under a nitrogen atmosphere (flow rate of 50 mL min -1 ) and heating rates of 2.5, 5.0, 10.0 and 20.0 °C min -1 , from 25 to 900 °C. The apparatus was calibrated with calcium oxalate monohydrate standard?. The TG curve was analyzed using the TASYS software from Shimadzu. Scanning Electron Microscopy (SEM) Images by scanning electron microscopy were obtained in a SEM HITACHI TM3000. Micrographs were recorded on magnification of 100 and 400x . Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR) The spectra of the individual compounds were recorded on an ATR-FTIR Spectrometer (Shimadzu IRprestige- 21) between 700 and 4000 cm -1 , optical resolution of 1.0 cm -1 and average of 20 scans. The spectra obtained for the samples submitted to different temperatures were compared using an ad hoc algorithm. This algorithm calculate correlations of successively increasing number of data points from the two spectra and plots the results as peaks that indicates the region with low similarity. A correlation below 0.5 is considered an indication that samples suffered degradation upon heating [14, 19, 20]. Results and discussion 100 Thermal Analysis Figure 2 shows the DSC and TG/DTG curves of WE005, WE015 and WE016 at the heating rate of 10 ºC min -1 . The DSC curve of WE005 showed three endothermic events: The first one presented Tonset at 81 °C with ∆H = - 199 J g-1 The event was atribued with the dehydration/desolvation In general, humid samples present a broad endothermic peak at temperatures around 60 – 70 oC [23]. The second endothermic event corresponds to sample melting with Tonset at 178 °C and Tpeak at 180 °C (∆H = -109 J g-1). The third endothermic event appears wide, asymmetrical and it is related to the decomposition of the sample. DSC curves were obtained at four heating rates to evaluate polymorphism, but the Tonset of melting remained constant even with an increase in the heating rate (data not shown). The TG/DTG curve of WE005 showed four steps of mass loss and presented thermal stability up to an average temperature of 243 °C. The first stage of weight loss occurred at a temperature range of 71-102 °C with weight loss of 6%. The other steps showed the following weight losses: 41%, 17% and 35%, respectively. The calorimetric curve of WE015 presented three endothermic events. The first event began at 47 °C (Tonset) (∆H = -52 J/g) and can be attributed to dehydration/ desolvation. The second endothermic event was the sample melting with Tonset of 143 °C (∆H = -55 J g-1) and melting range of 132 - 154 ºC. The third event was the sample decomposition. The TG/DTG curve at 10 °C min -1 showed four steps of mass loss. The first one is attributed to dehydration/desolvation at a temperature range of 29-95 °C (mass loss of 5%). The second step began around 236 °C and it corresponds to sample degradation (mass loss of 68%). The fourth stage presented a temperature range of 471 - 897 °C with mass loss of 10%. The DSC curves of WE016 showed three endothermic events. The first endothermic event was characteristic of sample melting (Tonset = 262 ºC and ∆H = -146 J g-1) and the second event was related to the decomposition of sample. It was observed in the superposition of the DSC curves, at the heating rates studied, that increasing the heating rate caused gradual increase in the onset temperature of melting peak. This significant change (> 2 °C) in the melting range may represent the presence of impurities or even sample polymorphism . The thermogravimetric curve of WE016 presented four stages of mass loss. The sample demonstrated good thermal stability, with its decomposition beginning at about 240 °C. The first step was related to drug decomposition at a temperature of 242 °C. The following steps demonstrated the slow degradation of the sample which occurred in four consecutive steps. The method for determining the purity by DSC employs Van't Hoff´s law of depreciation of the melting point, without the need of a pure standard. However, to employ this method, the melt needs to be a solution in which the impurities are soluble and the impurities content is less than 2.5 mol%, the compound must not react or decompose with the atmosphere and/or impurities, the melting process must occur under conditions of thermodynamic equilibrium and quasi-solid should be completely crystalline [24-26]. It was not possible to accurately determine the purity of these molecules due to the limitations of DSC technique. WE005 and WE015 showed intense endothermic peak before the melting and mass loss. WE016 showed melting and decomposition occurring simultaneously. Scanning Electron Microscopy (SEM) 101 The physical properties of the powders are affected by shape and distribution of particle size. Thus it is necessary to characterize the morphology of the particles of these new molecules. The images of scanning electron microscopy of the samples are shown in Fig. 2. The WE005 sample shows porous particles with irregular shape. The WE015 sample has also asymmetric particles, but with some flat parts. The WE016 substance is presented with the smallest particle size among the studied molecules and a more uniform particle size distribution. Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR) Infrared analyzes were made with the purpose of supplementing the results obtained by thermal analysis. The spectral data obtained is shown on Table 1. For sample WE005, the main spectral changes were in bands related to NH and C = C bonds. The most significant change of WE015 was in the NH bond region. The most significant change in the WE016 spectrum was in the NH bond [27-29]. The Pearson's correlation between the spectra of guanylhydrazones at room temperature and after melting showed moderate correlation for most of the spectral bands. The comparison between WE005 and WE015 spectra showed two regions with low correlation. WE016 showed low correlation only in the range of 3500-3000 cm -1 . The samples probably decomposed after the melting. Kinetic analysis The thermal stability was characterized using the kinetic parameters, on the basis of the kinetic study performed under non-isothermal conditions. The kinetic parameters such as the activation energy (Ea), the pre- exponential factor (A) and reaction order (n) were determined from the TG/DTG curves, using the Ozawa method. Table 2 shows the values of the kinetic triplet to evaluate the stability of the molecules. The substance with the highest activation energy was WE016, what makes it the one with the higher thermal stability. Regarding the frequency factor, the WE016 also showed the highest value, what it is probably associated with the higher initial decomposition temperature which causes an increased frequency of collisions between molecules. The three substances exhibit zero order. The reaction order is related with the reaction velocity among other factors such as the reagents concentration. For substances with zero order , the reaction velocity is constant and independent of the reagents concentration [30]. Conclusions The guanylhydrazones WE005, WE015 and WE016 were characterized by DSC, TG, SEM and FTIR. Thermal characterization is an important application in quality control of new APIs. The Pearson’s correlation showed differences between the sample at room temperature and after melting. The differences between the spectra can be related with mass loss before the melting point. The WE016 sample showed the higher activation energy and thermal stability. Acknowledgments 102 The authors would like to thank Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte (FAPERN), Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) for their technical and financial support in this research. References 1. Pinhatti, VR. Avaliação das atividades biológicas de genotóxicas em dois derivados de guanilhidrazonas.Dissertaçao (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) – Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre. 2009. 2. Hassan GS, Kadry HH, Abou-Seri SM, Ali M M, El-Din Mahmoud AE. Synthesis and in vitro cytotoxic activity of novel pyrazolo[3.4-d]pyrimidines and related pyrazole hydrazones toward breast adenocarcinoma MCF-7 cell line. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2011; 19:6808–6817. 3. Cunha S, Macedo JR, FC, Costa GAN, Neves DC, Souza Neta LC, Vencato I, Sabino JR, Lariucci C. 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Fig. 1 Chemical structures of a WE005, b WE015, c WE016 Fig. 2 Thermal characterization and micrographs (SEM) of guanylhydrazones WE005, WE015 and WE016 Fig. 3 FTIR spectra of guanylhydrazones WE005, WE015 and WE016 at a room temperature, b melting point and c Pearson’s Correlation Fig. 4 Curves a heating logarithm of the ratio (logß) as a function of inverse temperature (K) and b G(X) by the inverse function of temperature (K) 105 ANEXO A – DOCUMENTO DE SUBMISSÃO 106 ANEXO B – DOCUMENTO DE SUBMISSÃO 107 ANEXO C - Ressonância Magnética Nuclear WE005 108 109 WE015 110 111 112 WE016 113