UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE-UFRN CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS-PPGCB LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR E GENÔMICA-LBMG Caracterização funcional de dois cDNAs de cana-de- açúcar: PKCI e SHAGGY. FRANCINALDO LEITE DA SILVA Natal-RN Maio-2011 ii UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS-PPGCB LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR E GENÔMICA Caracterização funcional de dois cDNAs de cana-de- açúcar: PKCI e SHAGGY. FRANCINALDO LEITE DA SILVA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Orientadora: Dra. Katia Castanho Scortecci Natal-RN Maio-2011 iii UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR E GENÔMICA A dissertação: Caracterização funcional de dois cDNAs de cana-de-açúcar: PKCI e SHAGGY Elaborada por: Francinaldo Leite da Silva E aprovada por todos os membros da Banca Examinadora, foi aceita pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas e homologada pelos referidos membros como requisito final para obtenção do título de MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DATA: 16/05/2011 BANCA EXAMINADORA ___________________________________________________ Dra. Kátia Castanho Scortecci – (Orientadora) Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN ____________________________________________________ Dr. João Paulo Matos Santos Lima – (Membro interno) Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN __________________________________________________ Dra. Márcia Soares Vidal (Membro externo) EMBRAPA-RJ iv "Eu não sei o que eu possa parecer para o mundo; mas para mim eu pareço ter sido apenas como um garoto brincando na praia, e me divertindo de vez em quando encontrando uma pedra arredondada ou uma concha mais bonita que as comuns, enquanto o grande oceano da verdade repousa desconhecido perante a mim." (Isaac Newton) v AGRADECIMENTOS  A uma “Luz” maior que me guia, que impõe limites e me orienta.  A minha família, por me apoiar em tudo! Especialmente ao meu pai, João Gonçalves, e à minha mãe, Maria de Fátima, por me ensinarem os valores da vida!  A minha orientadora, Katia Scortecci, por acreditar em mim desde o primeiro período da minha graduação, e por demonstrar confiança em tudo que faço. Obrigado por me orientar, por me compreender e apoiar.  A João Gabriel, aluno de iniciação científica, e mais do que qualquer outra coisa, meu amigo, por ter me auxiliado em todos os meus experimentos. Obrigado! Sem você teria sido muito mais difícil!  A todos os colegas do grupo de pesquisa em Biologia Molecular e Genética Vegetal.  Ao professor João Paulo Matos e ao seu aluno de mestrado, Tafarrel Melo Torres, por colaborem na execução desse trabalho.  Ao meu núcleo de GRANDES amigos caicoenses, em especial a Félix Filho, Fábio Dias, João Paulo Dias, Thalyne Yuri, Benedita Medeiros e Alisson Diêgo. Muito do ser HUMANO que hoje sou devo a vocês!  Aos amigos Alexandre Freitas, Miguel Neto, Joseias, Marília e Albery Lúcio, por estarem ao meu lado, por me distraírem e por tornarem a minha vida mais alegre!  Aos colegas de trabalho do IDIARN, em especial a Jailma Araújo por me distrair com sua alegria, ter sido companheira e compreender os momentos em que estive ausente. vi  Agradecimentos muito especiais aos amigos Valeska Souto, Amanda Medeiros, Renata Kaline e Adilson Trindade, por me aturarem esse tempo todo, e por sempre me ajudarem nos momentos que precisei.  Aos meus amigos do LBMG, Fábio Teixeira, Abínadabe, Ana Rafaela, Angélica, Daniele Maria, Thayse, Leonam, Daniel, Delane e todos que estiveram presentes no laboratório durante a realização de meus experimentos. vii RESUMO A floração é controlada por diversos fatores como condições ambientais e fatores endógenos que se associam em uma rede de mecanismos bastante complexos. A caracterização funcional de alguns genes realizada no modelo vegetal A. thaliana tem fornecido muitas informações a respeito dos mecanismos genéticos e bioquímicos que controlam a floração. Existem muitos homólogos descritos em diversas espécies, inclusive em plantas de interesse agronômico, como: arroz e milho. Em cana-de-açúcar pouco se sabe sobre esse processo, embora o estudo nessa cultura seja muito importante, uma vez que a floração precoce pode acarretar perdas substanciais no teor de sacarose que podem chegar a até 40% da produção. Com isso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a função de dois cDNAs, identificados anteriormente em bibliotecas subtrativas scPKCI e scSHAGGY, por meio de análises in silico e a superexpressão gênica nas orientações senso e antisenso utilizando plantas de Nicotiana tabacum. Os resultados obtidos com a análise in silico permitiram observar que os dois cDNAs encontram-se bem conservados, com domínios catalíticos funcionais. Os resultados das plantas transgênicas contendo o cassete de superexpressão do gene scPKCI na orientação senso mostrou que esta construção influenciou negativamente no desenvolvimento normal de plantas de tabaco transgênicas acarretando a diminuição da altura média das plantas e da área foliar. Para superexpressão de scPKCI em orientação antissenso, foi observado alterações no número de ramificações das plantas transgênicas T1, enquanto que as plantas transgênicas T2 apresentaram o início do desenvolvimento atrasado. Para o outro cDNA analisado, os resultados obtidos mostraram que a superexpressão do cDNA scSHAGGY na orientação senso não alterou o desenvolvimento das plantas, porém a planta apresentou um aumento no tamanho da estrutura floral do gineceu em 100% das flores analisadas (dez flores em seis plantas). Os nossos resultados juntamente com resultados existentes na literatura com outras plantas permitem propor que os cDNAs scPKCI e scSHAGGY estariam envolvidos no processo de floração em cana-de-açúcar. Palavras-chave: superexpressão, tabaco, genes da floração. viii ABSTRACT Flowering is controlled by several environmental and endogenous factors, usually associated with a complex network of metabolic mechanisms. The gene characterization in Arabidopsis model has provided much information about the genetic and molecular mechanisms that control flowering process. Some of these genes had been found in rice and maize. However, in sugarcane this processe is not well known. It is known that early flowering may reduce its production up to 60% at northeast conditions. Considering the impact of early flowering in sugarcane production, the aim of this work was to make the gene characterization of two cDNAs previously identified in subtractive cDNA libraries: scPKCI and scSHAGGY. The in silico analysis showed that these two cDNAs presented both their sequence and functional catalytic domains conserved. The results of transgenic plants containing the overexpression of the gene cassette scPKCI in sense orientation showed that this construction had a negative influence on the plant development as it was observed a decrease in plant height and leaf size. For the scPKCI overexpression in antisense orientation it was observed change in the number of branches from T1 transgenic plants, whereas transgenic T2 plants showed slow development during germination and initial stages of development. The other cDNA analyzed had homology to SHAGGY protein. The overexpression construct in sense orientation did not shown any effect on development. The only difference observed it was an increase in stigma structure. These results allowed us to propose a model how these two genes may be interact and affect flowering development. Keywords: Flowering, sugarcane, flowering network. ix LISTA DE ABREVIATURAS °C: graus Celsius μg: micrograma μL: microlitro μM: micromolar BAP: 6- Benzilaminopurina BLAST: programa de alinhamento de seqüências (do inglês, Basic Local Alingment Search TooL) CaMV35S: promotor do vírus do mosaico da couve flor cDNA: DNA complementar cm: centímetros DNA: ácido desoxirribonucléico dNTP: desoxiribonucleotídeos trifosfato D.O.: densidade óptica kb: quilo bases kg: quilogramas LB: Meio de cultura Luria Bertani M: molar mg: miligrama mL: mililitro mm: milímetros mM: milimolar RNAm: RNA mensageiro MS: Murashige & Skoog NAA: Ácido naftaleno acético ηg: nanograma pb: pares de bases PKCI: Proteína inibidora da quinase C (do inglês, Protein kinase C inhibitor) RNA: ácido ribonucléico rpm: rotações por minuto RNAr: RNA ribossômico SDS: dodecil sulfato de sódio TAE: Tris, Acetato e EDTA TE: Tris-EDTA V: volts X: vezes x LISTA DE FIGURAS Figura 1. Inflorescência da cana-de-açúcar 3 Figura 2. Transição do meristema durante o desenvolvimento do milho 4 Figura 3. Fases do desenvolvimento floral em cana-de-açúcar 5 Figura 4. Síntese das vias metabólicas e genes associados à floração em A. thaliana 7 Figura 5. Fotoperíodo em plantas de dias curtos (PDC) e plantas de dias longos (PDL) 9 Figura 6. Processo de isoporização da cana-de-açúcar 17 Figura 7. Representação esquemática da construção dos cassetes de superexpressão 22 Figura 8. Resultados do alinhamento múltiplo para sequências homólogas a PKCI visualizado através do programa ClustalX 37 Figura 9. Dendograma para a proteína scPKCI 38 Figura 10. Resultados do alinhamento múltiplo para sequências homólogas a scSHAGGY visualizado através do programa ClustalX 42 Figura 11. Dendograma para a proteína scSHAGGY 44 Figura 12. Perfil de migração eletroforética dos produtos de restrição de SalI e SacI dos cassetes de superexpressão no vetor intermediário pBC 46 Figura 13. Esquema das construções no vetor binário pZP211 48 xi Figura 14. Perfil de migração dos produtos de PCR para a amplificação do gene nptII a partir do DNA plasmidial extraído de LBA4404 49 Figura 15. Plantas transformadas com os cassetes de superexpressão 51 Figura 16. Perfil eletroforético dos produtos de PCR utilizando primers para a amplificação do gene nptII em plantas resistente a canamicina submetidas à transformação com pZP211/PKCI senso e antissenso 52 Figura 17. Padrão de bandas gerado pelo Southern blot 53 xii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Programa para amplificação do gene nptII 30 Tabela 2. Análise in silico para o cDNA scPKCI 36 Tabela 3. Análise in silico para o cDNA scSHAGGY 40 xiii SUMÁRIO Resumo .................................................................................................................... vii Abstract ................................................................................................................... viii Lista de Abreviaturas ............................................................................................... ix Lista de Figuras ......................................................................................................... x Lista de Tabelas ...................................................................................................... xii 1- INTRODUÇÃO ................................................................................................... 1 1.1- A floração em cana-de-açúcar .................................................................... 2 1.2- Aspectos moleculares da floração ............................................................. 6 2- OBJETIVOS ..................................................................................................... 19 2.1- Objetivo Geral ............................................................................................ 19 2.2- Objetivos Específicos ............................................................................... 19 3- METODOLOGIA .............................................................................................. 20 3.1- Coleta de Material Vegetativo ................................................................... 20 3.2- Mineração dos dados ............................................................................... 20 3.3- Construção de cassetes pZP211/PKCI e pZP211/SHAGGY ................... 21 3.3.1- Obtenção das Bactérias Competentes DH10B .................................. 22 3.3.2- Ligação e transformação em células eletrocompetentes DH10B .... 23 3.3.3- Extração do DNA plasmidial em pequena escala (minipreparação de plasmídeos) ....................................................... 24 3.3.4-Digestão dos vetores recombinantes ................................................. 25 3.3.5-Minipreparação para sequenciamento................................................. 25 3.3.6-Eletroforese em Gel de Agarose.......................................................... 26 3.3.7-Reação de sequenciamento ................................................................. 26 3.4-Transformação genética de plantas utilizando os cassetes de superexpressão pelo sistema de A. tumefaciens ................................. 27 3.4.1- Preparação de células eletrocompetentes A. tumefaciens .............. 28 xiv 3.4.2-Transformação por eletroporação de células de A. tumefaciens ....................................................................................... 29 3.4.3- PCR para triagem de A. tumefaciens transformantes .................... 29 3.4.4-Transformação genética de Nicotiana tabacum .............................. 30 3.4.5- Indução de calos ................................................................................ 31 3.4.6- Alongamento, enraizamento e seleção de transformantes com antibiótico de seleção (canamicina) ................................................ 31 3.4.7- PCR para confirmação da transformação ....................................... 31 3.4.8- Análise fenotípica dos transgênicos................................................ 32 3.5- Análise de DNA por Southern blot ....................................................... 33 3.5.1- Extração de DNA vegetal .................................................................. 33 3.5.2- Eletroforese em gel de agarose e transferência alcalina para membrana .......................................................................................... 34 3.5.3- Produção da sonda para marcação radioativa ................................ 34 4- RESULTADOS............................................................................................... 35 4.1- Análises in sílico ..................................................................................... 35 4.1.1- Protein kinase C inhibitor-like (PKCI) .............................................. 35 4.1. 2- GLICOGEN SYNTHASY KINASE3 /GSK3 (SHAGGY) ..................... 39 4.2- Construção dos cassetes de expressão, pZP211/PKCI e pZP211/SHAGGY para a análise funcional em plantas de tabaco....... 45 4.3-Transformação genética de plantas utilizando os cassetes de superexpressão através sistema de A. tumefaciens ................... 49 4.3.1-Confirmação de transformação de A. tumefaciens LBA4404 ......... 49 4.3.2-Transformação dos discos foliares e regeneração dos transformantes .................................................................................... 50 4.3.3- Caracterização Molecular dos Transformantes .............................. 51 4.3.4- Análise fenotípica dos transgênicos ............................................... 52 4.4- Padrão molecular dos genes scPKCI e scSHAGGY ............................ 52 5- DISCUSSÃO .................................................................................................... 54 6- CONCLUSÕES ................................................................................................. 59 xv 7- CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 60 8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 61 1 1- INTRODUÇÃO A floração é um evento programado no desenvolvimento da planta marcado pela conversão do meristema apical vegetativo em reprodutivo, sendo este processo controlado por múltiplos estímulos que respondem a diferentes sinais ambientais e fisiológicos, culminando na produção de flores (CORBESIER & COUPLAND, 2005; BERNIER & PÉRILLEUX, 2005). Os primeiros trabalhos que estabeleceram as bases científicas sobre o processo de floração foram realizados por GARNER e ALLARD (1920), quando foi estudado o efeito do comprimento do dia no desenvolvimento das plantas. A partir dessa data, a literatura científica tornou-se extensa no que se diz respeito aos estudos fisiológicos da floração. Esses estudos foram melhor analisados a partir dos trabalhos realizados por MURNEEK (1948) e por LEOPOLD e colaboradores (1951). Mas, os estudos puramente genéticos passaram a ser desenvolvidos a partir de 1970 com o adavento da tecnologia do DNA recombinante e o desenvolvimento da engenharia genética (SCHUMANN & FERREIRA, 2004). Estudos fisiológicos têm demonstrado que, para assegurar o sucesso reprodutivo, as plantas devem estar em um ambiente onde as condições necessárias para o seu desenvolvimento e, consequentemente, produção das sementes seja ideal. Esse ambiente deve estar ainda de acordo com as necessidades fisiológicas específicas para cada etapa de desenvolvimento. Os experimentos fisiológicos clássicos evidenciam que em espécies de clima temperado as variações sazonais, como o fotoperíodo, a temperatura, a precipitação e o estágio de desenvolvimento da planta são condicões importantes que regulam a transição floral (HASTINGS & FOLLET, 2001). Muitas espécies vegetais têm a capacidade de florecer durante a estação do ano ideal para a sua reprodução, e essa capacidade depende principalmente da precisão na percepção das mudanças no comprimento do dia e da temperatura (THOMAS & VINCE, 1997; LOEWENSTEIN & PALLARDY, 2002). O comprimento do dia, ou fotoperíodo da floração, permite que espécies de 2 plantas adaptem-se às condições para o crescimento em variáveis latitudes, altitudes, estações e localidades de cutivo (IZAWA, 2007; HIROYUKI et al., 2010). 1.1- A floração em cana-de-açúcar A cana-de-açúcar é uma das seis espécies do gênero Saccharum, que corresponde a gramíneas altas, e que pertence à família Poaceae, que tem como característica o crescimento do caule em colmos e as folhas com lâminas de sílica em suas bordas aberta e o tipo de inflorescência denominado de espiga (Figura 1). Essa cultura encontra-se difundida em uma ampla faixa de latitude de 35º N a 30º S, sendo cultivada em altitudes variando do nível do mar até 1.000 m (MAGALHÃES, 1987). No Brasil, a área cultivada com cana-de- açúcar na safra 2009/2010 foi de 7.409,6 mil hectares, com produção 604.513,6 mil toneladas, gerando uma receita bruta de, aproximadamente, R$ 19,5 bilhões. Em relação à área total, o Estado de São Paulo representa 54,23% (4.357,01 mil hectares), seguido por Minas Gerais com 8,1% (649,94 mil hectares), Paraná com 7,25% (582,32 mil hectares), Goiás com 7,46% (599,31 mil hectares), Alagoas com 5,46% (438,57 mil hectares), Mato Grosso do Sul com 4,93% (396,16 mil hectares) e Pernambuco com 4,32% (346,82 mil hectares). Já a participação do estado do Rio Grande do Norte é bastante pequena na produção de cana-de-açúcar, sendo a área cultivada de 67,037 hectares, com produção de 3.472,5 toneladas em uma área que representa apenas 0,9% da área de produção nacional (CONAB, 2011). A cultura da cana-de-açúcar é bastante influenciada pelas condições edafoclimáticas; isto é, sofre a influência de fatores como: a precipitação pluviométrica, a temperatura, a umidade relativa e a insolação que são condicionantes climáticos importantes na determinação da disponibilidade hídrica e térmica para esta cultura. Esses parâmetros têm efeito sobre o comportamento fisiológico da cultura em relação ao metabolismo do crescimento e desenvolvimento dos colmos, florescimento, maturação e produtividade. Da mesma forma, o relevo, a geologia e geomorfologia 3 influenciam as características pedológicas, que também estabelecem implicações diretas sobre manejo da cultura, considerando a fertilidade do solo e todos os aspectos a ela relacionados (MELO et al., 1999; CASTRO, 2001; ARALDI et al ., 2010). Na cana-de-açúcar a inflorescência ou panícula (Figura 1A) é chamada de flecha, bandeira ou flor apresentando tamanho, cor e formação dependendo das espécies ou cultivares. É originária a partir da gema apical do último entrenó da cana-de-açúcar onde se desenvolve um eixo principal ou ráquis. Do ráquis, saem os eixos secundários e destes, os terciários. Os eixos secundários e terciários vão diminuindo de baixo para cima, dando o aspecto piramidal da inflorescência como pode ser visualizado na figura 1B (CASAGRANDE, 1991; RODRIGUES, 1995). Nas ramificações terciárias de base e secundárias do ápice localizam-se as espiguetas, cada uma com uma flor. Figura 1. Inflorescência da cana-de-açúcar. A) Inflorescência (panícula) da cana-de-açúcar; B) Figura esquemática representando a inflorescência da cana-de-açúcar. Diferentemente do modelo de Arabidopsis thaliana, onde o meristema apical floral é formado diretamente da conversão do ápice meristemático apical e lateral, em cana-de-açúcar, assim como em milho, são necessárias duas conversões meristemáticas distintas: a transição do meristema apical A B 4 vegetativo para meristema da inflorescência (Figura 2) e, em seguida, suas células se diferenciarão para formar os órgãos florais de cada flor dentro da inflorescência. Figura 2. Transição do meristema durante o desenvolvimento do milho. A. Transição do meristema apical vegetativo para o meristema da inflorescência. B. A inflorescência do milho produz três tipos de meristemas axiais. Cada meristema de ramificação produz duas espículas meristemais. As duas espículas meristemais ramificam formando o meristema floral (MCSTEEN et al., 2000). Com relação ao processo de florescimento em cana-de-açúcar, este se divide, didaticamente, em quatro fases: transformação do meristema apical em gema floral; transformação desta em inflorescência, o desenvolvimento da inflorescência e da folha bandeira; e por final, a emissão da inflorescência (Figura 3). Logo ao final da primeira fase, inicia-se a segunda fase desenvolvendo-se no eixo principal as ramificações e, logo após, os ramos secundários. Nessa fase, o tecido meristemático se desenvolve e formará a bainha da folha bandeira, a qual protegerá a inflorescência (Figura 3A e 3B). A terceira fase caracteriza-se pelo alongamento da bainha da folha bandeira (que alcança entre 70 - 80 cm) e o desenvolvimento da inflorescência, cujo eixo principal chega a mais de 60 cm. A bainha da folha desenvolve-se para fornecer espaço para a inflorescência, bem como para evitar que esta se A B 5 quebre. Nas figuras 3B e 3C são evidenciados os ápices meristemáticos induzidos para a floração. Já nas figuras 3D e 3E estão mostradas as transformações da inflorescência e, na figura 3F observam-se as espiguetas (indicada com setas na cor vermelha) que iniciam o seu desenvolvimento nessa fase, até a formação da estrutura completa da inflorescência. O passo seguinte é a emissão da inflorescência, visualizada na Figura 1, seguida pela abertura das flores e a sua polinização. Para CLEMENTS e AWADA (1965) a completa emissão da inflorescência dura de quatro a cinco semanas, enquanto que a abertura das flores, formação de frutos e maturação, não mais que duas a três semanas. Figura 3. Fases do desenvolvimento floral em cana-de-açúcar. A: Ápice Vegetativo, não- induzido; B e C: Ápice reprodutivo, induzido; D e E: Transformação em inflorescência. (retirado de CALLUCI, 1989); A seta preta indica o ápice meristemático induzido (aspecto pirâmidal), na figura B; A seta vermelha na figura F indica as espiguetas. F 6 1.2- Aspectos moleculares da floração Os estudos atuais envolvendo a identificação e a caracterização de genes associados ao processo de transição e floração vêm possibilitando consideráveis descobertas sobre o desenvolvimento meristemático e a identidade dos órgãos florais. Tais estudos foram realizados, principalmente, em A. thaliana (COEN et al., 1990; GEORGYADI et al., 2002). Apesar dos estudos fisiológicos, moleculares e bioquímicos identificarem várias proteínas associadas a esse processo fisiológico, ainda não é conhecido um mecanismo universal para todas as plantas. Os modelos genéticos mais utilizados para o processo de floração utilizam as plantas A. thaliana e Oryza sativa (arroz). Tais modelos propõem uma regulação multifatorial (luz, hormônios e metabólitos primários) que atuam na transição do apice meristemático vegetativo para floral dependendo do estado fisiológico da planta (BERNIER, TRESCA & JOLLES, 1998; BLÁZQUEZ et al., 2006; TSUJI et al., 2010). Em A. thaliana, até o momento, foram identificadas cinco vias metabólicas para a floração: via Fotoperiódica, via de Vernalização, via Autônoma e via de Giberelina (GA) e via de Integração (Figura 4). No entanto, outros autores propõem um modelo de seis vias incluindo uma via que responde a qualidade da luz denominada via Termosensorial, que estaria relacionada também à percepção de variações de temperatura (LEE et al., 2007; LIU et al., 2009). 7 Figura 4. Síntese das vias metabólicas e genes associados à floração em A. thaliana. As setas representam interações positivas e as T-linhas interações negativas. As linhas pontilhadas representam interações ainda não descritas (ADAPTADO DE KOMEDA, 2004). FRI = FRIGIDA; VRN1 = VERNALIZATION 1; VRN2 = VERNALIZATION 2; FCA = FLOWERING TIME CONTROL LOCUS A; LD = LUMINIDEPEDENS; FLD = FLOWERING LOCUS D; SOC1 = SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1; LFY = LEAFY; AP1 = APETALLA1; TFL1 = TERMINAL FLOWER 1; GI = GIGANTEA; CO = CONSTANS; FT = FLOWERING LOCUS T; GA1 = GIBERELINA 1; RGA = REPRESSOR DE GA1; PHYA, B, C, D, E = PHYTOCHROME A, B, C, D e E; CRY1, 2 = CRYPTOCHROME1 e 2; ELF3 = EARLY FLOWERING 3; LHY = LATE ELONGATED HYPOCOTYL; CCA = CIRCADIAN CLOCK– ASSOCIATED; TOC1 = TIMING OF CAB EXPRESSION1; ESD4 = EARLY IN SHORT DAYS 4; VIP 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 = VERNALIZATION INDEPENDENCE 1,2,3,4, 5, 6 e 7; CAL = CAULIFLOWER. A via de fotoperíodo corresponde a uma via que é responsiva a fatores externos relacionados ao comprimento do dia e a qualidade da luz. Na figura 5, é mostrado esquematicamente o fotoperíodo de 24 horas para plantas em condições de dias longos e dias curtos. Nessa figura, pode ser observado que as plantas de dia curto florescem em uma determinada época do ano em que os dias são menores do que as noites. Já quando os dias são maiores e as noites são longas, elas por sua vez crescem vegetativamente. No caso das 8 plantas de dias longos, ocorre justamente o contrário. As plantas de dias longos florescem em dias maiores do que as noites e crescem vegetativamente em situação inversa. Em A. thaliana, planta de dia longo (16 horas de luz), os genes relacionados à floração são expressos quando fotoreceptores detectam fotoperíodos de dias longos e ativam uma cascata de sinalização que promove a expressão de genes chaves, principalmente o gene FLOWERING LOCUS T (FT) que desencadeia o processo de transição floral no ápice meristemático. Já em condições de dias curtos (8 horas de luz), alguns genes chaves são reprimidos ocorrendo assim um atraso no processo de florescimento. O fotoperíodo e a indução da floração são controlados por um relógio circadiano da planta que atua como um mecanismo que mensura o tempo da duração dos dias e noites. (SUÁREZ-LÓPEZ et al., 2001; YANOVSKY & KAY, 2002). O relógio circadiano corresponde a um oscilador endógeno, com um período aproximado de 24 horas. Este responde as variações diárias de luz e temperatura e regula a expressão de genes envolvidos na floração como CIRCADIAN CLOCK–ASSOCIATED 1 (CCA1) e LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) (DUNLAP, 1999; FUJIWARA et al., 2008). É importante ressaltar que algumas gramíneas, como o trigo, são plantas de dias longos que precisam ser expostas primeiramente aos fotoperíodos de dia curto e, subsequentemente, aos fotoperíodos de dia longo para florescer eficientemente (HEIDE, 1994). No entanto, esse não é o caso da cana-de-açúcar, do arroz ou do milho, que correspondem a culturas tropicais que florescem em dias inferiores a um fotoperíodo crítico que corresponde a 12.5 h, sendo portanto classificadas como uma planta de dia curto (ARÉVALO et al., 1968; SEGATO et al., 2006; COLASANTI & COVENA, 2009; ARALDI et al., 2010). 9 Figura 5. Fotoperíodo em plantas de dias curtos (PDC) e plantas de dias longos (PDL). A parte branca da barra representa o comprimento do dia, enquanto que a barra preta representa o comprimento das noites. O desenho da flor mostra a condição de fotoperído em que a planta floresce. Já os ramos vegetais representam a condição de fotoperído em que a planta cresce vegetativamente. Em relação à via fotoperíodica, BLÁZQUEZ et al. (2006) propõe que a luz é percebida por fotorreceptores presentes nas folhas. Os sinais gerados dessa percepção são traduzidos para o ápice meristemático, onde estimulariam alguns genes desencadeando assim a transição floral. Em A. thaliana, uma planta de dia longo, foram identificados pelo menos nove receptores fotossensíveis que compõem a via fotoperíodica, incluindo cinco fitocromos (phyA-phyE), dois criptocromos (cry1 e cry2) e duas fototropinas (phot1 e phot2), os quais atuam na regulação de muitas de suas respostas à luz (SCHEPENS, DUEK & FANKHAUSER, 2004; LIN & SHALINTIN, 2003; MOCKLER, et al., 2003). KOMEDA (2004) propõe como pode ser observado na figura 4, que, na via de fotoperíodo, os fitocromos e criptocromos atuam como reguladores negativos da floração ao inibirem a expressão dos genes CONSTANS (CO) e GIGANTEA (GI) respectivamente. Já outros genes regulados pelos fotorreceptores tais como: LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY), CIRCADIAN CLOCK–ASSOCIATED (CCA), EARLY FLOWERING 3 (ELF3), TIMING OF CAB EXPRESSION1 (TOC1) e EARLY IN SHORT DAYS 4 (ESD4) atuam como promotores ao ativar a expressão de GI. 10 Já a Via de Vernalização corresponde a um grupo de genes ativados pelo processo de vernalização. Esse processo, necessário para o florescimento de algumas espécies de plantas, corresponde a exposição dessas plantas a baixas temperaturas. Muitos vegetais precisam passar por esse período de frio que interrompe o desenvolvimento vegetativo e promove o desenvolvimento reprodutivo. O processo de vernalização foi descoberto, primeiramente, em gramíneas (trigo) e, posteriormente, passou a ter uma grande importância agronômica para aumentar a produção de frutos em plantas que necessitam do tratamento do frio para florir (CHOUARD, 1960; AMANSINO, 2004; ALEXANDRE, & LARS, 2008). Na figura 4, onde é representado a via de vernalização, os genes VERNALIZATION 2 (VIRN2), e VERNALIZATION INDEPENDENCE 4 (VIP4) atuam inibindo a expressão de FLOWERING LOCUS C (FLC), um gene repressor da floração que atua regulando outros genes na integração das vias. Há bastante tempo, tem sido demonstrada a importância dos fitormônios no processo de floração. E muitos trabalhos evidenciam que vários fitormônios estão envolvidos no nesse processo, incluindo citocininas, ácidos abisíco (ABA), auxinas, brassinosteróides e ácido giberélico (GA), (DAVIS, 2009). Nesse contexto, GA recebe um papel de destaque, tendo sido estudado pela primeira vez em 1957 por LANGRIDGE, quando mostrou que a aplicação exógena de GA acelerava o florescimento das plantas. Em A. thaliana, o fitohormonio GA integra a via de giberilina, onde GA tem um papel crucial na transição floral (Figura 4). Tem sido observado, em A. thaliana, que a ação da giberilina em dias logos induz a expressão de genes que atuam promovendo a floração. No entanto, foi observado que mutantes deficientes na biossíntese de giberilina, cultivados em dias curtos, nunca florescem (KOMEDA, 2004). Outros estudos mostram que as aplicações de GA em inflorescências expostas a condições de dias curtos e dias longos apresentam pouco efeito (GOCAL et al., 2001; ERICKSSON et al., 2006), entretanto, um papel para GA é consistente com a evidência recente de um grande aumento de GA endógeno associado com a florescência tardia em dias curtos. Ao contrário do que tem sido observado para a planta de A. thaliana, em Lolium temulentum (Joio ou Cinzânia), que é uma planta monocotiledônea e de dia longo, foi observado 11 que quando GA é aplicada na folha, esta planta produz uma inflorescência em dias curtos (KING et al., 2006). A via autônoma apresentada na figura 4 corresponde à via que regula o processo de florescimento por meio do monitoramento de sinais endógenos nos diferentes estágios de desenvolvimento da planta. Tais sinais podem atuar tanto como fatores promotores ou inibidores da indução floral. Foi observado que mutantes de genes dessa via apresentam o tempo requerido para a floração alterado, sendo este tardio ou precoce (AMASINO, 2004). A via autônoma foi inicialmente identificada como uma via específica para a floração através da expressão e repressão de genes. Atualmente, foram clonados sete genes relativos a essa via. O mais estudado é o gene FLC, que foi primeiramente identificado em mutantes de A. thaliana com floração tardia. Esses mutantes apresentavam o gene FLC reprimido o que possibilitou aos mutantes responder a estímulos de variações de fotoperíodo e tornaram-se sensíveis à vernalização. Os genes dessa via codificam proteínas associadas à cromatina ou de ligação ao RNA. Dois genes desta via FLD e FVE têm sido descritos na literatura atuando na desacetilação de complexos de histonas (HE et al., 2003; BAURLE & DEAN, 2008). Muitos estudos, utilizando tanto mutantes como construções de cassetes de superexpressão nas plantas modelo de A. thaliana e Oryza sativa, têm permitido identificar a função de determinados genes relacionados ao processo floral, por exemplo, FLOWERING LOCUS T (FT), SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1), FRIGIDA (FRI), FLOWERING LOCUS C (FLC), LEAFY (LFY) (BLÁSQUEZ, 2000). O produto da expressão do gene FRIGIDA (FRI) é responsável por regular negativamente o fator de transcrição MADS-box FLC, que atua como repressor floral (MICHAELS e AMASINO, 2001); o produto do gene FLC neutraliza os efeitos do fotoperíodo, inibindo genes chaves que induzem a floração, é o caso do gene CO, como pode ser revisto na figura 4 (BORNER et al., 2000; LEE et al., 2000; ONOUCHI et al., 2000; HEPWORTH et al., 2002; MICHAELS et al., 2005; MOON et al., 2005; YAMAGUCHI et al., 2005; HELLIWELL et al., 2006; SEARLE et al., 2006; JANG et al., 2009). Assim, o gene FLC é um ponto da convergência para a via 12 autônoma e da via de vernalização. Na maioria das situações o tempo de floração na ausência de vernalização é determinado por um balanço de ativações opostas entre FLC e CO, em genes de promoção floral tais como: FLOWERING LOCUS T (FT) e TWIN SISTER OF FT (TSF) (SIMPSON & DEAN, 2002). O gene TSF é parólogo do gene FT e atua promovendo um estímulo floral redundante com a função de FT, na ativação compartilhanda da ligação de CO á proteína FD (MICHAELS et al., 2005; YAMAGUCHI et al., 2005; JANG et al., 2009). Recentemente D'ALOIA e colaboradores (2011), mostraram, através da utilização de mutantes, que os genes TSF e SOC1 são necessários para o florescimento em resposta ao fitohormonio BAP (6- Benzilaminopurina). Assim, a cascata de sinalzação da floração pode agir parcialmente independentemente do gene FD. Mostrando, portanto, o papel de citocininas na floração e que os genes redundantes FT e TSF são diferentemente reguladas por distintos sinais de indução floral. Os estudos moleculares da floração evidenciam que alguns genes relacionados as vias de floração em A. thaliana são conservados e mantém as mesmas funções em gramíneas, porém nestas são bem menos compreendidos (LAURIE et al., 2004; TURCK et al., 2008), no entanto, pesquisas envolvendo as plantas modelos monocotiledôneas O. sativa e Z. mays apontam para um mecanismo genético de floração que envolve também a participação de genes exclusivos para esse grupo de plantas. Em Z. mays a proteína codificada pelo gene INDETERMINATE1 (ID1) é uma proteína reguladora chave na transição do crescimento vegetativo para reprodutivo. Mutantes id1 com perda de função produzem muitas folhas e florece muito mais tarde do que o normal quando comparado do tipo selvagem (SINGLETON, 1946; COLASANTI et al., 1998 COVENA et al., 2007). COVENA e colaboradores (2007) compararam plantas de milho mutantes para gene ID1 em condições de fotoperído induzido e não- induzido e verificaram que não havia expressão diferencial de quatro genes b- glucosidase (Zmdhr1, Zmdhr2 e Zmdhr3) associados à floração em milho e que o gene ID1 provalvelmente atue na via de floração autonoma independente da via de fotoperíodo (COVENA et al., 2007). Embora as plantas id1 mutantes sejam severamente prejudicadas na sua capacidade de florir, até o ponto de transição floral são praticamente idênticas na sua taxa de crescimento e 13 apresentam morfologia normal quando cultivadas em câmara de crescimento vegetal (COLASANTI & COVENA, 2009). Os fisiologistas vegetais concordam que a fisiologia do florescimento é complexa e que deve ser estudada especificamente para cada planta, sendo esse fato extremamente apropriado para a cana-de-açúcar, planta nativa dos trópicos, particularmente sensível a pequenas alterações no fotoperíodo (RODRIGUES, 1995). As gramíneas como um todo são plantas geneticamente pouco estudadas. Isso, sobretudo pelo fato de apresentarem genoma bastante complexo. A cana-de-açúcar não é diferente e para estudá-la foi necessário que os pesquisadores desenvolvessem estratégias que facilitassem os estudos de caracterização genética, utilizando, assim, a comparação com genomas menos complexos como uma referência. A comparação da expressão gênica em diferentes células e organismos pode fornecer a informação básica necessária para a análise dos processos biológicos que controlam a maneira como os organismos respondem a diferentes situações (LIANG & PARDEE, 1992). Devido à alta ploidia existente, até pouco tempo atrás a cana-de-açúcar era, dentre os membros da família Poacea, uma das espécies menos caracterizada geneticamente. Em 1998 com a criação do Projeto Genoma da cana-de-açúcar (SUCEST- Sugarcane Expressed Sequence Tag) esse panorama foi alterado, já que o projeto possibilitou a identificação de 42.377 genes dentro de 291.904 ESTs produzidos (VETTORE et al., 2001). No projeto SUCEST foram construídas 4 bibliotecas utilizando as estruturas florais, estas permitiram a identificação e análise in silico de alguns cDNAs caracterizados na planta modelo A. thaliana (DORNELAS & RODRIGUES, 2001). Entretanto, este trabalho utilizou variedades crescidas na região sudeste, onde as condições edafoclimáticas são contrastantes das condições climáticas da região nordeste. Assim, em 2005 foi realizada em nosso laboratório a construção de quatro bibliotecas subtrativas utilizando duas variedades (uma precoce e outra 14 tardia para florescimento) com o intuito de identificar genes que estejam associados ao processo de florescimento nas condições da região Nordeste (FURTADO, 2007). Neste trabalho, foram identificados alguns cDNAs específcos tanto para a variedade com florescimento precoce como tardio. Dentre os cDNAs sequenciados e identificados, um deles apresentou homologia ao gene SHAGGY que apresenta homologia para a uma família de proteínas denominada GLYCOGEN SYNTHASE KINASE3 (GSK3)/ SHAGGY- like kinases. A família multigênica GSK3, que apresentam atividade quinase, tem sido descrita há bastante tempo em células de mamíferos e leveduras, no entanto, em plantas sua função passou a ser melhor caracterizada a partir dos trabalhos de BIANCHI e colaboradores (1994) por meio da clonagem e expressão de um homólogo de A. thaliana em E. coli. Esses estudos demonstraram, através da análise da expressão dos genes da família GSK3 em plantas de A. thaliana (AtSK), uma expressão constitutiva desse gene em todos os órgãos vegetais analisados. Foi observado ainda que alguns desses genes da família aumentavam o nível de expressão em flores de plantas crescidas em certas condições ambientais, como por exemplo, em condição de escuro (CHARRIER et al., 2002). A superexpressão do gene AtSK2-2 resultou em uma maior resistência das plantas transgênicas ao estresse salino (PIAO et al., 2001). Um segundo membro dessa da família GKS3, o BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 2 ou BIN2 (também conhecido como ASKƞ, DWARF12 ou UCU1) tem sido caracterizado como um regulador negativo da via de biossíntese de brassinosteróides (BRs) (LI & NAM, 2002; HE et al., 2002; PEREZ-PEREZ et al., 2002). O gene BIN2 é descrito como um regulador negativo da sinalização de BR (BRASSINOSTEROIDES), porque a proteína BIN2 fosforila e inibe a transcrição responsiva a BR de fatores de transcrição como BRASSINAZOLE RESISTENTE 1 (BZR1) e EMS BRI1 1 (BES1, também conhecido como BZR2) (HE et al., 2002; YIN et al., 2002; VERT & CHORY, 2006; YAN et al., 2009). LI e NAM (2002) demonstraram que o mutante bin2 possui uma mutação no domínio catalítico da proteína AtSK21. Esta proteína apresentou um acréscimo de 30% em na atividade quinase. A atividade quinase, como já descrito antes, é uma das características das proteínas GSK3. Além disso, DORNELAS e colaboradores (2000) propõem que os genes AtSK1.1 (alpha) e AtSK1.2 (gamma) devam regular a floração em 15 diferentes fases durante o desenvolvimento da estrutural floral. Ambos os genes são expressos na extremidade dos meristemas florais. Adicionalmente, foi observado que mutantes contendo a construção de superexpressão em orientação antissenso de AtSK1.1 e AtSK1 apresentaram níveis reduzidos de expressão, com isso promoveram um aumento do número de órgãos do perianto da flor e a uma alteração no padrão da morfologia do gineceu. Recentemente, ROZHON (2010) mostrou que a GSk3 ou GSk3θ é regulada negativamente pelo produto da expressão do gene BRI 1 (BRI1 KINASE INHIBITOR 1). Os produtos da expressão gene do BR1 juntamente com os do gene BAK1 (BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1 BAK1) têm demonstrado aumentar a sinalização de brassinosteróides (CLOUSE, 2008; WANG et al., 2008; YAN et al., 2009). Plantas de A. thaliana superexpressando GSK3θ acumularam elevados níveis de castasterol, brassinolide e fitosterol. Além disso, os fatores de transcrição como BEH2, BED1 e BZR1, presentes na cascata de sinalização de BR interagiram com GSK3θ em ensaio de dois híbridos em levedura, evidenciando assim a presença de GSK3θ na cascata de sinalização de BR (ROZHON et al., 2010). Os dados já publicados a respeito da família desses genes possibilitam a hipótese de que o produto da expressão do gene scSHAGGY, identificado anteriormente nas bibliotecas subtrativas em cana-de-açúcar, possa exercer uma função crucial no processo de transição floral. Outro cDNA encontrado na biblioteca subtrativa de meristemas apicais (induzidos e não-induzidos) apresentou homologia para a proteína PKCI (Protein Kinase C Inhibitor). O gene PKCI tem sido descrito até o momento apenas em animais e plantas. Porém, poucos estudos foram realizados em plantas com a finalidade de caracterizar a função desse gene. A proteína PKCI foi inicialmente identificada como uma proteína que conseguia inibir in vitro a fosforilação da proteína kinase C dependente de Ca+2 (PKC) na atividade do cérebro bovino (MCDONALD et al., 1985; PEARSON et al., 1990, LIMA et al., 1996). Estudos realizados por ROBINSON e colaboradores (1995) utilizando uma proteína PKCI clonada de milho, ZBP14, demonstrou que sua estrutura é semelhante à proteína recombinante de bovino. No entanto, foi observado que 16 a proteína ZBP14 de milho tinha uma baixa atividade como um inibidor direto de PKC em cérebro mamíferos. Esses pesquisadores observaram que, para a proteína ZBP14 ser ativa, era necessária a proteína 14-3-3. Com isso, as duas juntas exerciam um papel inibitório sobre a proteína PKC. Os resultados deste estudo sugerem que o papel da família de proteínas PKCI família pode ser ligado à sua função de ligação de zinco em vez da inibição de PKC. A PKCI, conhecida também como PROTEIN HISTIDINE TRIAD – HINT1 é uma pequena molécula intracelular largamente expressa em tecidos animais do Sistema Nervoso Central e Periférico, rins e fígado (SU et al., 2003, LIU et al., 2008). As sequências dos membros da família HIT são conservadas em uma ampla gama de organismos de micoplasma, bactéria, plantas e mamíferos (LIU et al., 2008). Assim como para PKCI, outros trabalhos na literatura com membros dessa família são raros. As proteínas da família HIT (Histidine triad-family) são conhecidas por interagir com diferentes monos e dinucleotídios e catalisar sua hidrólise (atividade hidrolase). Durante um estudo da especificidade de substrato de sete proteínas da família HIT, foi mostrado que cada um pode agir como uma sulfohidrolase, catalisando a liberação de AMP a partir de 5’- adenosina-fosfosulfatado (APS ou SO4-PA), entretanto, recentemente foi visto que, na presença de ortofosfato, uma Hint4 de A. thaliana e Caenorhabditis elegans também se comportou como fosforilases APS, formando ADP sugerindo uma dupla atividade para a família das proteínas HIT-proteins (GURANOWSKI et al., 2010). Embora o florescimento seja muito importante para as plantas, inclusive para programas de melhoramento genético, esta se torna indesejável do ponto de vista do cultivo comercial em cana-de-açúcar, pois acarreta grandes prejuízos na produção. Os danos consequentes do florescimento são ocasionados pelo consumo do açúcar pela respiração, utilizando o açúcar para a formação das panículas ao invés de armazenar na forma de sacarose nos colmos. Tal consumo de sacarose provoca a perda de água dos entrenós, ocorrendo o fenômeno chamado de isoporização, também conhecido por 17 chochamento da cana-de-açúcar (Figura 6), que ocorre no sentido do topo da planta para a base (SEGATO et al., 2006). O florescimento de uma variedade de cana-de-açúcar em campo, de quatro a oito meses antes do período de colheita, compromete a produtividade e, conseqüentemente, a sacarose produzida por unidade de cana colhida (CASTRO, 2001). Em consequência das condições edafoclimáticas da região Nordeste alguns cultivares apresentam um processo de florescimento precoce que pode promover a isoporização do colmo, com perdas evidentes que podem chegar a 40% do teor de sacarose. Figura 6. Processo de Isoporização da cana-de-açúcar. As setas em preto mostram regiões de isoporização. Aumento de 10X. Alguns métodos têm sido utilizados para evitar o processo de floração precoce em variedades comerciais que apresentam floração precoce. Dentre eles, o uso de inibidores químicos tais como, etefon e sulfometuron-metil (CAPUTO et al., 2007). No entanto, apesar da aplicação de inibidores químicos apresentarem alguns resultados satisfatórios, a sua aplicação encarece substancialmente o custo de produção. Sendo assim, a caracterização funcional dos dois cDNAs com homologia a PKCI e SHAGGY, previamente prospectados em bibliotecas subtrativas é de extrema importância. Com isso os resultados obtidos têm a possibilidade de gerar ferramentas moleculares para a 18 criação de variedades com maior teor de sacarose e com características que aumente sua produtividade na região Nordeste. 19 2- OBJETIVOS 2.1- OBJETIVO GERAL: Caracterizar funcionalmente dois cDNAs com homologia a PKCI e SHAGGY identificados previamente em bibliotecas subtrativas associadas ao processo de floração em cana-de-açúcar. 2.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS:  Realizar um estudo filogenético das sequências os cDNAs PKCI e SHAGGY;  Construir cassetes de superexpressão nas orientações senso e antissenso, utilizando cDNAs PKCI e SHAGGY identificados em bibliotecas subtrativas;  Produzir plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) transgênicas contendo os cassetes de superexpressão na orientação senso e antissenso;  Verificar a influência da superexpressão destes cDNAs nas orientações senso e antisenso no fenótipo de plantas transgênicas de tabaco. 20 3- METODOLOGIA 3.1- Coleta de Material Vegetativo Os meristemas apicais e folhas das variedades de cana-de-açúcar com floração precoce e tardia foram coletados na Usinas Estivas no município de Arez, Rio Grande do Norte durante o ano de 2009. As coletas aconteceram mensalmente e sempre no mesmo local de plantio estabelecido previamente. Os meristemas posteriormente foram processados no Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG) e armazenados em freezer -80ºC para extração de DNA e posterior análise de southern blot. 3.2- Análises in silico A identidade das sequências obtidas nas bibliotecas foi confirmada por BLAST (National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, Md) (ALTSCHUL et al., 1990). As análises in silico foram realizadas por meio de comparações contra diferentes bancos de dados de diferentes organismos utilizando a ferramenta BLASTx. Foram pesquisados os bancos do National Center for Biotechnology Information (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nihgov), o banco do genoma de A. thaliana (http://www.arabidopsis.org/Blastx), e os bancos de dados de arroz e milho disponíveis no The Institute for Genomic Research (TIGR; http://www.tigr.orghttp://www.tigr.org), respectivamente no Rice Genome Annotation Database (http://tigrblast.tigr.org/tgi_maize/index.cgi), no The TIGR Maize Database (http://maize.tigr.org/) e no Computational Biology and Functional Genomics Laboratory (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html). As sequências protéicas foram analisadas por alinhamentos múltiplos através do programa T-coffee (NOTREDAME et al., 2000). Obtidas as seqüências devidamente alinhadas, os domínios funcionais para cada sequência foram pesquisados utilizando o programa Conserved Domain Database (CDD: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml). Para a análise filogenética, as sequências peptídicas resultantes dos alinhamentos múltiplos 21 foram convertidas para o formato ALN para então serem utilizadas nas reconstruções filogenéticas. Foi utilizado o programa PROTTEST (Tree based Consistency Objective Function For AlignmEnt Evaluation) (POSADA & BUCKLEY, 2004) para a escolha o modelo matemático de substituição mais adequado para a estimativa da evolução protéica. Já para as construções dos dendogramas foi utilizando o programa MEGA 5.0 (TAMURA et al., 2011), fazendo uso do método de Maximum Likelihood (Máxima Verossimilhaça) para 500 replicas de bootstraps com os parâmetros: modelo de substituição JTT, para PKCI e WAG, para SHAGGY, escolhidos através do programa ProtTesT; tratamento de gaps por deleção completa. 3.3- Construção de cassetes pZP211/PKCI e pZP211/SHAGGY Os cDNAs PKCI e SHAGGY foram selecionados dentre alguns clones identificados anteriormente nas bibliotecas subtrativas para floração (FURTADO, 2007). Estes foram agora amplificados, utilizando primers específicos, de modo a obter-se o cDNA completo a ser utilizado na construção dos cassetes de superexpressão. Em seguida, os clones obtidos foram sequenciados para confirmar a sequência nucleotídica amplificada. Após essa etapa, esses cDNAs foram fusionados, cada um ao promotor forte constitutivo CaMV35S (promotor do vírus do mosaico da couve-flor), em um vetor intermediário pBC (Stratagene). O promotor CaMV35S foi retirado do vetor PKCS42 utilizando as enzimas de restrição BamHI e HindIII, em seguida foi clonado no vetor intermediário pBC nos sítios de restrição correspondentes. Obtido o clone contendo este promotor, a próxima etapa foi transferir os cDNAs para esse vetor intermediário na orientação senso e antissenso em relação à região promotora. Na construção com orientação senso para ambos cDNAs foi utilizada à enzima de restrição NotI, e na orientação antissenso para o cDNA PKCI foram utilizadas as enzimas de restrição SacII e SpeI e para o cDNA SHAGGY as enzimas NotI e SpeI, de modo a direcionar a ligação do cDNA ao plasmídeo contendo o promotor 35S. As orientações senso e antissenso foram confirmadas somente por sequenciamento no caso do cDNA PKCI e para o cDNA SHAGGY foi confirmada através de análise de restrição e sequenciamento. O cassete de superexpressão contendo o promotor 22 CaMV35S+PKCI nas duas orientações foram subclonados no vetor binário pZP211 utilizando os sítios enzimáticos de SacI e SalI. Já o cassete CaMV35S+SHAGGY na orientação senso foi tratado com T4 DNA Polimerase e subclonado no vetor binário pZP211 no sítio de SmaI e KpnI. Enquanto que o cassete CaMV35S+SHAGGY na orientação antissenso foi subclonado no vetor pZP211 nos sítios de restrição de HindIII e EcoRI (Figura 7). Fígura 7. Representação esquemática da construção dos cassetes de superexpressão. Os cDNAs PKCI e SHAGGY foram individualmente retirados do vetor pGEM T-easy, e clonados no vetor pBC, assim como o promotor CaMV35S foi retirado do vetor PKCS42 e clonado também no pBC. Os cassetes contendo região promotora e cDNA (35S+PKCI e 35+SHAGGY) foram transferidos, individualmente, para o vetor binário pZP211 previamente digerido. Na representação foram omitidas as enzimas de restrição descritas no texto. 3.3.1- Obtenção das Bactérias Competentes DH10B Para obtenção das bactérias competentes DH10B, foi inicialmente feito um pré-inóculo de uma colônia dessa bactéria em 5 mL de meio LB e esse pré- inóculo foi mantido em agitação em incubadora (Tecnal – TE 421) a 37ºC durante toda a noite. Posteriormente, essa cultura foi transferida para um erlemeyer de dois litros contendo 250 mL de meio LB, onde ficou em agitação 23 na velocidade de 220 rpm, por 1 hora, a 37ºC em incubadora (Tecnal – TE 421). Após esse tempo, foi realizada a medida da densidade óptica (DO) em 600 nm no espectofotômetro (SP-1105 Bel Photonics), e após as bactérias atingirem a DO de 0,8, esta cultura foi distribuída em 5 tubos cônico de 50 mL previamente gelados, cada um contendo o volume de 45 mL da cultura, onde foram mantidos em gelo por 15 minutos e, posteriormente, centrifugados (Centrifuga Eppendorf - 5804R) a 2.544 g, 4ºC durante 15 minutos. O sobrenadante foi então descartado e o sedimento contendo células bacterianas de cada tubo foi ressuspendido agora em 45 mL de água ultrapura gelada. Esses tubos foram centrifugados por 15 minutos a 2.544 g a 4ºC (Centrifuga Eppendorf - 5804R), decorrido esse tempo, o sobrenadante foi descartado e o sedimento contendo as células foi agora ressuspendido em 25 mL de água ultrapura gelada. Esses tubos foram centrifugados por mais 15 minutos a 2.544 g a 4ºC (Centrifuga Eppendorf - 5804R), e em seguida o sobrenadante foi descartado e o sedimento contendo as células bacterianas foi ressuspendido em 5 mL de glicerol 10% gelado. Os tubos foram agora centrifugados por 15 minutos a 2.544g a 4ºC (Centrifuga Eppendorf - 5804R), sendo então o sobrenadante foi descartado e o sedimento de apenas um dos tubos foi ressuspendido em 750 µL de glicerol 10% e, em seguida transferidos para os outros tubos, até que todo o volume ficasse em um único tubo. Em seguida, este volume foi aliquotado em tubos de microcentrífuga 1,5 mL contendo 55 µL. Essas bactérias competentes foram mantidas a -80ºC. 3.3.2- Ligação e transformação em células eletrocompetentes DH10B Para realizar a clonagem das construções, foi adicionado respectivamente: 12,5 ng/L dos plasmídeos e 50 ng das amostras de inserto a ser clonado (razão em massa de 1 vetor : 4 partes inserto), 1X de tampão 10X T4 DNA ligase e 400 unidades/L da enzima T4 DNA ligase (NEB Biolabs) no volume final de 20 L, incubou-se a 16 °C durante 12-18 horas. 24 Decorrido o tempo de ligação, esse produto foi precipitado com glicogênio (2 mg/mL), 1/10 Volume de 3 M de acetato de sódio (NaOAc - pH 5,2) e 2 Volume de etanol 100%, ficando incubado por uma hora em freezer - 20°C. Decorrido esse tempo, as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 12.066,43 g (centrífuga MiniSpin - Eppendorf), o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com 100 μL de etanol 70%, centrifugado, desta vez, por 5 minutos, seco a temperatura ambiente e ressuspendido em 12 μL de água ultra-pura. Em seguida, 4 μL da reação de ligação foram utilizados para transformar 55 μL de células eletrocompetentes DH10B de E. coli por eletroporação em Eletroporador Cellject UNO- HYBAID 1800 V (1 mm), segundo instruções do fabricante. As células transformadas foram incubadas a 37 °C e 180 rpm, por 1 hora. Em seguida, as células foram plaqueadas em placas de Petri de 15 cm, contendo meio LB sólido acrescido do antibiótico específico de seleção (25 μg/mL de clorofenicol para o vetor pBC, e 100 μg/mL de espectromicina para o vetor pZP211) e 40 μL de solução de X-gal (40 μg/mL). As placas foram incubadas a 37 °C por 16 horas e, posteriormente, mantidas a 4ºC até a extração de DNA plasmidial. 3.3.3- Extração do DNA plasmidial em pequena escala (minipreparação de plasmídeos) Para isolamento de plasmídeos e seleção de clones positivos, foi utilizado um protocolo clássico de lise alcalina (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). Nesse protocolo utilizam-se três soluções: a solução I é composta por Tris-HCl 50 mM pH 8.0, EDTA 10mM pH 8.0 e RNAse 10 µg/mL; a solução II é composta por NAOH 200 mM e SDS 1%; a solução III é composta por acetato de potássio 5 M pH 5,5. Os seguintes procedimentos foram realizados: uma colônia de bactérias foi inoculada em tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de meio LB líquido com antibiótico correspondente e incubada por 16 horas sob agitação a 37ºC em incubadora (Tecnal – TE 421). Uma alíquota de 3 mL do conteúdo foi transferido para microtubos de 1,5 mL e centrifugados por 5 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido e essa operação foi repetida até que todo o volume do inóculo fosse centrifugado. As 25 células que se sedimentaram no tubo foram ressuspendidas em 150 µL da solução I. Em seguida foi adicionado 150 µL da solução II e os tubos foram incubados por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, foi adicionado 150 µL da solução III e os tubos foram centrifugados por 15 minutos, 19.500 g a 4ºC. O sobrenadante foi transferido para outro microtubo, foi adicionado 400 µL de isopropanol e centrifugado durante 10 minutos, 19.500 g a temperatura ambiente (centrifuga mini-spin eppendorf). O precipitado foi lavado com 100 µL de etanol 70% por 5 minutos, seco a temperatura ambiente e ressuspendido em 50 µL de água ultrapura. 3.3.4- Digestão dos vetores recombinantes A fim de se confirmar a ligação correta do inserto no plasmídio, 500-1 µg do DNA plasmidial foi digerido por 2 horas em estufa a 37ºC com as enzimas de restrição. Para as construções contendo o cDNA PKCI , tanto na orientação senso como na antissenso, foi usada a enzima HindIII. Já a construção contendo o cDNA SHAGGY foi digerida com a enzima de restrição SacI. As reações foram preparadas para um volume final de 20 μL. O produto da digestão foi separado em gel de agarose 0,7%. 3.3.5- Minipreparação para sequenciamento O precipitado de células foi ressuspendido em agitador de tubo tipo vórtex com 240 L de GET 3,5 M (solução I – estocado a 4°C) aplicado em cada poço da placa. Centrifugaram-se a 20°C 2.544 g por 9 minutos (centrífuga eppendorf– 5804R). Descartou-se o sobrenadante e inverteu-se a placa sobre papel absorvente por 5 minutos. Adicionaram-se a cada poço 80 L de solução GET, selou-se a placa com o adesivo simples, agitou-se no vórtex, até ressuspender as células. Acrescentaram-se 2 L de RNAse (10mg/mL) a cada poço de uma microplaca de 250 L de polipropileno de fundo redondo (Tipo Elisa). Transferiram-se 80 L das células ressuspendidas para a microplaca de 250 L, já contendo a RNAse (10 mg/mL). Em seguida, foi adicionado a cada 26 poço, 80 L de solução II (NaOH 0,2 N e SDS 1%). Selaram-se e misturaram- se 30X por inversão. As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos. Posteriormente, a placa foi centrifugada por alguns segundos até que a solução desprendesse do adesivo. Após a centrifugação foi adicionado 80 L de solução III (acetato de potássio: KOAc 5 M a 4°C), selou-se e misturaram-se 30X por inversão. Incubou-se à temperatura ambiente por 10 minutos. Centrifugou-se por alguns segundos para o desprendimento da solução no adesivo. Logo a pós o adesivo foi retirado e as placas incubas em estufa a 90°C por 30 minutos. Em seguida, as placas foram submetidas a um choque térmico por 10 minutos no gelo. Centrifugaram-se a 20°C 2.544 g por 9 minutos (centrífuga eppendorf– 5804R). O sobrenadante foi transferido completamente para a placa Millipore (MAGVN22) e centrifugaram-se a 20°C 2.544 g por 6 minutos (centrífuga eppendorf– 5804R). Adicionou-se 100 L de isopropanol ao filtrado. Selou-se com um adesivo resistente a álcool e misturaram-se 30X por inversão. As placas foram centrifugadas a 20°C, 2.544 g por 45 minutos (centrífuga eppendorf– 5804R). Descartou-se o sobrenadante e acrescentaram-se 200 L de etanol 70% estocado a 4°C. Centrifugaram-se a 20°C, 2.544 g por 5 minutos. O sobrenadante foi removido, e as placas foram centrifugadas invertidas sobre papel absorvente até atingir a rotação de 144 g a 20°C (centrífuga eppendorf– 5804R) e esperou-se a evaporação do álcool à temperatura ambiente por 1 hora. Após, as amostras foram ressuspendidas em 60 L de água ultrapura. As placas foram seladas e mantidas à temperatura ambiente durante a noite. Logo após esse período, as placas foram armazenadas em freezer a -20°C. 3.3.6- Eletroforese em Gel de Agarose Preparou-se um gel de agarose com concentração de 0,7% contendo tampão TAE (Tris 40 mM, Acetato 20 mM e EDTA 1 mM) 1X e 0,5 μg/mL de brometo de etídio. A corrida procedeu-se a uma corrente elétrica variando entre 90-110 mA e uma voltagem entre 120-130 V por 1 hora e 30 minutos (SAMBROOK et al., 2001). 27 3.3.7- Reação de sequenciamento Para a reação de sequenciamento, adicionaram-se em tubos para PCR os seguintes reagentes: 100-200 ng de DNA; 4 L de Et Mix (GE Healthcare); 3,2 pmol de primer T7 e água ultrapura para completar os 10 L de volume final. As reações de PCR utilizaram o seguinte programa no termociclador (MJ research): 95ºC durante 2 segundos, 95ºC por 20 segundos, 45ºC por 15 segundos, 60ºC durante 1 minuto, sendo repetidos por 30 ciclos a partir da segunda etapa. Decorrido esse tempo, as amostras foram precipitadas adicionando 1/10 do volume de acetato de amônia (7,5 M) e 2 volumes de etanol absoluto, agitadas por 3 vezes, incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos e coberta por papel alumínio. Em seguida, a placa foi centrifugada por 30 minutos em 2.544 g (Centrífuga Eppendorf – 5804R) a 4ºC. Depois o sobrenadante foi descartado, e adicionaram-se 150 μL de etanol 70% para lavagem do precipitado. Este foi agora submetido à centrifugação a 4ºC na velocidade de 2.544 g por 10 minutos (Centrífuga eppendorf – 5804R). Por fim, o sobrenadante foi descartado e as amostras foram ressuspendidas em 10 μL de loading buffer (EDTA1 mM, formamida 70% - GE). Os produtos das reações foram fracionados em um sequenciador capilar MegaBACE 1000 (GE HEALTHCARE) (voltagem de injeção 2 KV, injeção de 120 segundos, tempo de corrida 100 minutos, voltagem de corrida 9 KV) e os eletroferogramas foram visualizados através do programa MegaBACES ScoreCard. 3.4- Transformação genética de plantas utilizando os cassetes de superexpressão pelo sistema de Agrobacterium tumefaciens 28 Plantas tabaco foram transformadas utilizando o sistema de A. tumefaciens carregando os cassetes de superexpressão. A metodologia utilizada para a transformação de tabaco foi a partir de discos foliares. A cepa de A. tumefaciens utilizada foi a LBA4404 que deriva da cepa selvagem Ach5 da família octopina, e possui o plasmídio Ti desarmado pAL4404, derivado de pTiAch5 (OOMS et al., 1982). Esse plasmídio contém uma deleção de todo o T-DNA, mas possui os genes responsáveis pelo catabolismo de octopina e de transferência conjugativa. 3.4.1- Preparação de células eletrocompetentes de A. tumefaciens Células de uma linhagem de A. tumefaciens desarmada (LBA4404) foram previamente cultivadas overnight em estufa a 28ºC, em meio LB sólido contendo o antibiótico rifampicina a 50 μg.mL-1 utilizado para a seleção. Uma colônia do cultivo foi inoculada em 5 mL de meio LB líquido e cultivada por 48 horas em incubadora a 28ºC com agitação de 200 rpm (Tecnal-TE-420). Decorrido o período de incubação, transferiu-se a cultura para um erlemeyer de 2 L contendo 200 mL de meio LB líquido. Em seguida, a cultura foi incubada novamente a 28ºC com agitação de 200 rpm até atingir a D.O. em 600 nm entre 0,5 e 1. Posteriormente, dividiu-se a cultura em quatro tubos cônicos de 50 mL e incubou-se em gelo por 15 minutos. Em seguida, a cultura foi centrifugada a 4ºC por 2.544 g por 15 minutos (centrífuga eppendorf– 5804R). O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido vagarosamente em 25 mL de tampão HEPES 1 mM, mantido a 4ºC, sendo em seguida centrifugado a 4ºC por 2.544 g por 15 minutos. O processo foi repetido por mais uma vez e depois de centrifugado e descartado o sobrenadante, o precipitado foi ressuspendido delicadamente em 5 mL de glicerol 10% previamente gelado, e em seguida centrifugado a 4ºC por 2.544 g por 15 minutos. Descartou-se o sobrenadante e o sedimento foi ressuspendido novamente em glicerol 10% a 4ºC, agora em um volume final de 200 µL. Os conteúdos dos tubos foram misturados e alíquotas de 25 µL foram distribuídas em tubos de 1.5 mL, armazenando-se em seguida em freezer - 80ºC. 29 3.4.2- Transformação por eletroporação de células de A. tumefaciens A transformação das células competentes por eletroporação foi realizada conforme SAQLAN (2008) com algumas modificações. Adicionou-se aproximadamente 1 μg do DNA plasmidial purificado à suspensão de células competentes e incubou-se o tubo no gelo por 2 minutos. Em seguida, a suspensão (25 μL) foi transferida para uma curveta de eletroporação, mantida em gelo. A curveta foi posicionada no eletroporador (Eletroporador Cellject UNO- HYBAID) e três pulsos elétricos (400 Ω a 2,5 kV) foram aplicados em intervalos de 15 segundos. Imediatamente após os pulsos, adicionou-se 1 mL de meio LB, sendo a suspensão transferida para um tubo cônico de 15 mL e incubada a 28ºC sob agitação de 200 rpm por 3 horas. Decorrido o período, as células de A. tumefaciens submetidas à eletroporação foram cultivadas por 48 horas em estufa a 28ºC, em meio LB sólido com os antibióticos de seleção: 50 μg.mL-1 de rifampicina (resistência cromossomal) e 100 μg.mL-1 de espectinomicina (resistência no plasmídio). 3.4.3- PCR para triagem de A. tumefaciens transformantes O produto da extração de DNA plasmidial de A. tumefaciens (utilizando o mesmo método de extração para E. coli descrito no item 3.3.1) foi submetido à técnica de PCR para amplificação da sequência do gene que confere resistência a canamicina (nptt) presente no vetor pZP211. Para isso, os primers “forward” Kan-F (5’ GCTTGGGTGGAGAGGCTATTCG 3’) Kan-R (5’GCCATGTGTCACGACGAGATCC3’) foram utilizados. As amostras foram submetidas ao programa descrito na Tabela 1. A seguir, realizou-se análise em gel de agarose 0,7% submetido à eletroforese. 30 Tabela 1. Programa para amplificação do gene nptII Processo Temperatura Tempo Número de ciclos Desnaturação Inicial 95° C 5 min 1 Desnaturação 95° C 2 min 35 Anelamento 57° C 1 min 35 Extensão 72° C 1 min 35 Extensão final 72° C 10 min 1 3.4.4- Transformação genética de Nicotiana tabacum As colônias de A. tumefaciens contendo a construção de interesse armazenadas em estoque glicerol 50% foram previamente cultivadas por 48 horas em estufa a 28ºC, em meio LB sólido com os antibióticos espectromicina (100 μg.mL-1) e rifampicina (50 μg.mL-1). A seguir, as colônias isoladas foram cultivadas a 28ºC sob agitação de 200 rpm por 48 horas, em 10 mL de meio LB líquido com antibióticos de seleção. Decorrido esse tempo, esta cultura foi sedimenta por 5.500 g por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento contendo as células bacterianas foi ressuspendido em 10 mL de Meio MS líquido (MS5524 Sigma). A suspensão bacteriana foi mantida à temperatura ambiente até o momento do co-cultivo. Plântulas de N. tabacum (SR1) cultivadas in vitro que apresentavam em média 7 cm de comprimento e folhas com 4 a 5 mm de diâmetro, foram utilizadas como material para excisão dos explantes (disco foliares). Os discos foliares foram mantidos em meio MS líquido até o momento do co-cultivo. A seguir os explantes foram transferidos para uma placa de Petri contendo 10 mL da suspensão bacteriana, sendo o co- cultivo incubado por 5 minutos a temperatura ambiente. Decorrido esse tempo, o excesso de cultura bacteriana foi retirada dos explantes com auxílio em papel filtro estéril. Logo após, os explantes foram transferidos para placas contendo meio MS sólido para co-cultivo no escuro por aproximadamente 48 horas, a 24±1°C. Os explantes também foram incubados em placa com A. tumefaciens sem o vetor sendo estes utilizados como controle negativo. Outros explantes 31 também foram inoculados com A. tumefaciens contendo apenas o vetor sem as construções, sendo, portanto, o controle positivo. 3.4.5- Indução de calos Após o período de incubação no escuro os discos foliares de N. tabacum foram transferidos para meio de indução de calos: meio MS contendo 100 mg.L-1 de cefotaxima, 1 mg.L-1 do fitoregulador BAP (6-Benzilaminopurina), e 0,1 mg.L-1 do fitorregulador NAA (Ácido naftaleno acético) e incubados em câmara de crescimento (crescimento com intensidade luminosa de 30 μmol.m- 2.s-1, fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 23 ±1ºC). A cada 15 dias os explantes foram transferidos para um novo meio de cultivo, a fim de conservar a ação do antibiótico e dos fitorregulador. 3.4.6- Alongamento, enraizamento e seleção de transformantes com antibiótico de seleção (canamicina) Os brotos regenerados foram excisados e transferidos para meio de alongamento e enraizamento: meio MS sólido contendo apenas antibiótico de seleção (50 mg.L-1 de canamicina). Para a extração de DNA, utilizou-se material foliar obtido de plântulas bem desenvolvidas e resistentes ao antibiótico de seleção. 3.4.7- PCR para confirmação da transformação O produto da extração de DNA genômico de N. tabacum foi então submetido à reação de PCR com primers específicos (KanF e KanR) conforme a tabela 1 para confirmar a integração da construção e do gene nptII ao genoma vegetal. A análise da amplificação foi realizada em gel de agarose 0,7% submetido à eletroforese. 32 3.4.8- Análise fenotípica dos transgênicos As plantas transgênicas foram transferidas para vasos contendo húmus e vermiculita da proporção de 2:1 e aclimatadas em casa de vegetação (crescimento com intensidade luminosa de 30 μmol.m-2.s-1, fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 23±1ºC). O crescimento das plantas foi acompanhado e as variações fenotípicas analisadas. Para tanto, foi analisada a geração T1 e a progênie T2 para os transgênicos contendo os cassetes de superexpressão para o cDNA PKCI (orientação senso e antisenso). Já para o cDNA SHAGGY apenas a geração hemizigota foi analisada. Do total de plantas transgênicas obtidas foram analisadas seis para cada construção com relação à altura total da planta, altura média de internos, área foliar total, morfologia das flores e número de ramos laterais em estágio adulto reprodutivo. Para a padronização do estágio de desenvolvimento dos tecidos, empregou-se o índice de plasticron (ERICKSON & MICHELINE, 1957), onde a folha de índice de plasticron PI=0 foi definida como a primeira folha com comprimento maior que 5 cm e onde PI=1 é a imediatamente abaixo PI=0. A altura da planta foi estimada pela distância entre a base da planta, próxima ao substrato, até a base da folha PI=3. Neste mesmo intervalo, foi obtida a altura média de internos. A área foliar total foi calculada pelo somatório das áreas das folhas PI=6 a PI=15 (as dez maiores), estimada pelo método não destrutivo descrito por FRANCIS e outros (1969), que utiliza a equação: Af= C x L x 0,6813 Onde: Af = área foliar (m2); C = comprimento da folha (distância entre o ponto de inserção da folha no caule e a extremidade oposta da mesma); L = largura da folha (maior dimensão perpendicular ao eixo do comprimento); 33 0,6813 = fator de forma para folhas de tabaco que é a média dos fatores obtidos Romano (2001). 3.4.9- Análises estatísticas Nas análises morfológicas dos trangênicos foram utizados o teste estatístico de análise de variância ANOVA e o Test t (t Student). As representações gráficas utilizadas para expressar os dados foram realizadas utilizando o programa GraphPad. 3.5- Análise de DNA por Southern blot 3.5.1- Extração de DNA vegetal Para obtenção de DNA genômico a amostra foi macerada em nitrogênio líquido com PVPP (0,5 g/g de amostra) e transferida para tubos cônicos de 15 mL. Foi adicionado à amostra 6 mL de tampão CTAB (CTAB 2% (p/v); NaCl 1,4 M; Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM; β-mercaptoetanol 0,2% (v/v)) por grama de amostra macerada e realizada duas extrações de fenol-clorofórmio por 5 minutos a 5.500 g. Essas extrações consistiram na adição de clorofórmio no mesmo volume que o da amostra, centrifugação e remoção do sobrenadante para novo tubo cônico de 50 mL. Em seguida, foi realizada mais uma extração com clorofórmio por 5 minutos a 5.500 g. O sobrenadante foi transferido para tubo novo e adicionado 2/3 volumes de isopropanol. O tubo foi incubado por 10 minutos em temperatura ambiente e posteriormente centrifugado por 10 minutos a 5.500 g. O material precipitado foi lavado com etanol 70% por 5 minutos a 5.500 g e ressuspendido em 100 µL de água ultrapura livre de DNAses. 34 3.5.2- Eletroforese em gel de agarose e transferência alcalina para membrana Para separação dos fragmentos gerados após digestão enzimática do DNA genômico, foi realizada uma eletroforese em gel de agarose 0,7% durante 12-16 horas sob voltagem e amperagem que variaram de 15 – 25 V, 10-30 mA. Foram utilizados 15 µg de DNA genômico para digestão enzimática com as respectivas endonucleases de restrição: EcoRI, HindIII, PstI e BamHI. Após a eletroforese, o gel foi fotodocumentado. Para transferência para membrana, foram utilizadas as seguintes soluções: hidrólise – HCl 0,25 N; desnaturação – NaOH 0,4 N e NaCl 0,6 M e neutralização – Tris 0,5 M pH 8,0 e de NaCl 1 M. O gel foi imerso em solução de hidrólise por 30 minutos com leve agitação, em seguida transferido para solução de desnaturação por 60 minutos (2 X 30 min.) com leve agitação. O gel foi invertido e foi montado o sistema de transferência por capilaridade utilizando a membrana de nylon Hybound N (GE). A transferência foi realizada por 16 horas adicionando-se solução de desnaturação quando necessário. Decorrido esse tempo, esse sistema foi desmontado e a membrana foi imersa em solução de neutralização por 30 minutos com leve agitação e em seguida o DNA foi fixado à membrana por 1 min em luz ultravioleta e em seguida em estufa a 80ºC por duas horas. 3.5.3- Produção da sonda para marcação radioativa O vetor pGEM T-easy contendo o cDNA amplificado por PCR foi digerido com a enzima de restrição EcoRI, e separado através de eletroforese em gel de agarose 1% durante 30 a 50 minutos sob voltagem de 100 V 100 mA. O fragmento foi purificado utilizando o kit GFX de acordo com as recomendações do fabricante (GE). A sonda foi marcada utilizando P32 seguindo as recomendações do fabricante do kit MegaPrime (GE). Essa etapa de hibridização, lavagem e exposição foi realizada pelo laboratório GATE da profa. Dra. Marie-Anne Van Sluys, IB-USP. 35 RESULTADOS 4.1- Análise in sílico Os cDNAs scPKCI e scSHAGGY prospectados anteriormente em biblioteca subtrativas de cDNA utilizando ápices meristemáticos apicais foram analisados in silico utilizando algumas ferramentas da bioinformática. Para essa análise foram selecionadas algumas sequências homólogas para esses cDNAs em diferentes bancos de dados de plantas. Os domínios funcionais semelhantes aos genes ortólogos foram analisados a fim de se verificar a conservação das proteínas. Além disso, uma análise filogenética foi realizada com o intuito de verificar as relações evolutivas das proteínas em diferentes grupos de plantas. 4.1.1- Protein kinase C inhibitor-like (PKCI) Para o cDNA scPKCI foi possível identificar 18 homólogos nessa análise nos diferentes bancos de dados analisados com E-value inferior a 10-30. Através dos alinhamentos realizados entre as sequências homólogas encontradas em diferentes espécies foi examinado a conservação diferentes espécies vegetais. Dentre as sequências de proteínas PKCI analisadas, uma sequência homóloga de Sorghum bicolor (sorgo) foi a que apresentou a maior conservação de aminoácidos quando comparado a proteína PKCI de cana-de- açúcar, a qual apresentou identidade de 97,5% e 100% de similaridade (Tabela 2). O menor índice de identidade foi verificado para uma sequência homóloga de A. thaliana com 64,5%. Já a menor similaridade de 88,1% foi encontrada em um homólogo de N. tabacum. Na tabela 2, é apresentada a identidade e similaridade dessas sequências e demais sequências protéicas analisadas. Todas as sequências analisadas apresentaram domínios funcionais que continham pequena variação na sua localização. 36 Tabela 2. Alinhamento em pares das sequências de cDNA similares a scPKCI. . Organismo, código de acesso no banco de dados, índice identidade, similaridade, e-value das seqüências analisadas através do BLASTp (bl2seq). G. Max (Glycine max): Soja; P. sitchensis (Picea sitchensis): Conífera; V.vinifera (Vitis vinifera): Uva; S. moellendorffii (Selaginella moellendorffii): Pteridófita; C.reinhardtii Chlamydomonas reinhardtii): alga; M. truncatula (Medicago truncatula) Com a finalidade de analisar a conservação entre todas as sequências selecionas, foi realizado um alinhamento múltiplo entre as 18 sequências homólogas selecionadas mais um grupo externo selecionado para enraizar a árvore gênica como pode ser observado na figura 8. O alinhamento múltiplo mostra uma boa conservação entre os aminoácidos e apresenta o motivo HxHxHxx conservado (x corresponde a um resíduo hidrofóbico). Esse domínio é uma assinatura para essa família de proteínas e corresponde a um sítio de ligação a zinco (zinc-binding). Organismo Acesso Identidade Similaridade E-value A.thaliana 1 AT3G56490.1 79.8% 98.3% 1.6e-40 A.thaliana 2 AT5G48545.1 79.8% 98.3% 3.4e-40 A.thaliana 3 AT4G16566.1 78.5% 98.1% 4.6e-32 A.thaliana 4 AT5G48545.2 64.9% 92.1% 1.2e-38 O.sativa 1 LOC_Os03g20630.2 93.3% 100.0% 4.1e-48 O.sativa 2 LOC_Os06g45660 74.6% 94.7% 7e-38 N.tabacum 1 TC87128 80.0% 96.7% 3.1e-42 N.tabacum 2 TC113073 68.6% 88.1% 4.1e-34 Z.mays 1 TC486444 95.0% 99.2% 1.3e-46 S.bicolor 1 Sb01g036830 97.5% 100.0% 3.2e-48 S.bicolor 2 Sb03g037730 75.4% 91.8% 1.2e-36 M. truncatula Medtr6g017890 80.2% 96.7% 6.3e-40 P. sitchensis 1 TC106936 80.8% 96.7% 2.4e-44 P. sitchensis 2 TC94327 69.3% 93.0% 5.7e-34 P. sitchensis 3 gi|116792646 78.9% 95.6% 5.7e-40 G.max gi|255632137 80.2% 95.9% 1.8e-40 S. moellendorffii gi|302776372 71.0% 96.0% 4.2e-32 V.vinifera gi|225439125 82.4% 96.6% 2.1e-41 C.reinhardtii gi|159476202 58.2% 86.9% 4.9e-30 37 Figura 8. Resultados do alinhamento múltiplo para seqüências homólogas a PKCI visualizado através do programa ClustalX. Em vermelho é mostrado o motivo HxHxHxx, presente em todas as proteínas analisadas com exceção da seqüência protéica da homóloga A. thaliana_3. Todos organimos presentes na tabela 2 estão com suas sequencias presentes nesse alinhamento. 38 Para compreender melhor a relação evolutiva do cDNA PKCI nos organismos trabalhados, realizou-se uma análise filogenética entre as sequências homólogas (Figura 9). Apesar de existirem muitas sequências de diferentes espécies de plantas disponíveis nos bancos de dados, apenas um número pequeno de plantas apresentaram sequências com similaridade para PKCI. Provavelmente, esse pequeno número decorrente da disponibilidade desta sequência nos bancos de dados. Figura 9. Dendograma para as proteínas homólogas a scPKCI. O clado destacado de preto correspondente a região onde a proteína PKCI (scPKCI) foi posicionada. Os números acima da linha são os valores de bootstrap para 500 repetições. As proteínas representadas são dos seguintes organismos: O. sativa (LOC_Os03g20630.2 e LOC_Os06g45660), Z. mays (TC486444); A. thaliana (AT3G56490.1, AT5G48545.1, AT4G16566.1 e AT5G48545.2); M. truncatula (Medtr6g017890) N. tabacum (TC87128 e TC113073); S. bicolor (Sb01g036830 e Sb03g037730); P. sitchensis 1 (TC106936, TC94327 e gi|116792646); G.max (gi|255632137); S. moellendorffii (gi|302776372); V.vinifera (gi|225439125); C. reinhardtii (gi|159476202). Apesar das poucas sequências encontradas nos bancos de dados foi possível observar no dendograma gerado uma mistura de sequências de 39 plantas monocotiledôneas e eucotiledôneas. A proteína scPKCI de cana-de- açúcar agrupou-se em um clado junto com sequências de outras monocotiledôneas e gimnospermas. 4.1. 2- GLYCOGEN SYNTHASE KINASE3 /GSK3 (SHAGGY) As análises in silico para o cDNA SHAGGY foram realizadas utilizando 40 sequências similares, além do grupo externo, com ponto de corte a um E- value inferior a 10-30. Os cDNAs apresentaram valores de identidade extremos variando com menor e maior porcentagem Zea mays (milho) entre 67,8% em e 97,5%. Muitas outras sequências foram encontradas para um mesmo organismo tendo em vista que as proteínas SHAGGY fazem parte de uma superfamília de proteínas (Tabela 3). No entanto, os organismos que apresentaram mais de uma sequência homóloga, tiveram essas sequências alinhadas e apenas uma sequência das que apresentaram identidades entre si superiores a 97% foi utilizada. 40 Tabela 3. Alinhamento em pares das sequências de cDNA similares ao scSHAGGY Organismo Acesso Identidade Similaridade E-value A. thaliana 1 AT5G14640.1 84,6% 94.4% 1.1e-181 A. thaliana 2 AT3G05840.2 84.1% 96.1% 1.5e-144 A. thaliana 3 AT5G14640.2 84.1% 96.1% 1.5e-144 A. thaliana 4 AT5G26751.1 86.1% 95.8% 1.6e-146 A. thaliana 5 AT3G05840.1 83.9% 95.8% 1.7e-143 A. thaliana 6 AT1G09840 73.5% 88.8% 8.4e-124 A. thaliana 7 AT1G57870.2 74.7% 89.2% 8.7e-135 A. thaliana 8 AT4G00720.1 74.2% 89.7% 2e-125 O. sativa 1 LOC_Os01g14860 94.1% 99.0% 3.6e-176 O. sativa 2 LOC_Os01g19150 78.5% 93.4% 1.2e-149 O. sativa 3 LOC_Os05g04340 83.2% 94.4% 1e-158 O. sativa 4 LOC_Os03g62500 75.2% 92.1% 5.4e-143 O. sativa 5 LOC_Os05g11730 77.4% 92.5% 1.8e-135 N.tabacum 1 TC81612 86.1% 96.1% 3e-152 N.tabacum 2 TC112186 85.6% 96.8% 4.1e-152 N.tabacum 3 TC80106 82.2% 92.7% 3.3e-143 N.tabacum 4 TC95772 76.1% 89.9% 6e-130 N.tabacum 5 TC100406 81.4% 94.6% 2.9e-118 L.esculentum 1 TC219654 85.0% 96.1% 3.1e-148 L.esculentum 2 TC230385 85.3% 95.4% 8.4e-88 L.esculentum 3 TC227641 80.5% 91.5% 7.9e-149 L.esculentum 4 TC232424 78.4% 93.2% 3.1e-131 S.bicolor TC123905 77.4% 91.3% 1.9e-130 Z.mays 1 TC506901 97.5% 99.5% 7.5e-182 Z.mays 2 TC486574 67.8% 88.0% 1.7e-84 Z.mays 3 TC469590 75.2% 88.2% 3.8e-137 Z.mays 4 TC471234 77.9% 92.4% 6.2e-134 M.truncatula 1 TC148736 81.8% 93.3% 1.1e-152 M.truncatula 2 TC149437 83.9% 95.6% 2.5e-162 M.truncatula 3 TC145913 86.9% 96.8% 1.7e-153 M.truncatula 4 TC142499 89.4% 97.1% 2e-145 M.truncatula 5 TC142354 79.6% 93.7% 2.6e-138 P. sitchensis 1 TC92929 83.8% 93.0% 8.6e-157 P. sitchensis 2 TC85433 77.9% 90.4% 2e-146 P. sitchensis 3 TC90832 81.3% 93.6% 4.4e-146 P. sitchensis 4 TC85053 77.5% 89.0% 1.9e-134 S.tuberosum TC351757 84.8% 96.8% 5.3e-159 T.aestivum 1 AB281487.1 94.8% 98.8% 3.4e-185 T.aestivum 2 BAF36565.1 94.3% 98.5% 3.1e-184 T.aestivum 3 XM_002515172.1 90.4% 98.9% 1.3e-164 A.fumigatus XP_747565.1 65.5% 84.5% 3e-99 Organismo, código de acesso no banco de dados, índice de identidade analisados através do BLASTp (bl2seq) e similaridade. A.fumigatus(Aspergillus fumigatus): fungo; S.tuberosum (Solanum tuberosum): batata; T. aestivum (Triticum aestivum): trigo. 41 A presença de sequências homólogas à proteína SHAGGY, um fator de transcrição, foi verificada em todos os bancos de dados dos genomas de plantas. Nos domínios analisados, observa-se uma conservação no tamanho e na sequência desses domínios. Esta conservação sugere que esta deva ter um papel importante na manutenção de processos vitais em plantas. O alinhamento múltiplo realizado para análise da conservação de aminoácidos é apresentado na figura 10 e apresenta as regiões conservadas entre as sequências. Destacado no quadrado vermelho, encontra-se as regiões de assinatura do sítio ativo de SHAGGY e seus subdomínios V, VIa, VIb, VII, VIII, IX, X e XI com regiões conservadas. Embora algumas sequências homólogas apresentem substituição de aminoácidos significativa como: a de M. truncatula 1, na sequência de cana-de-açúcar (scSHAGGY) observa-se um elevado grau de conservação de no sítio ativo quando comparado com as demais sequências. É um exemplo de conservação a presença do subdomínio do qual fazem parte os aminoácidos GVCKRD, impotante sítio para atividade das proteínas SHAGGY. 42 Figura 10. Resultados do alinhamento múltiplo para seqüências homólogas a scSHAGGY visualizado através do programa ClustalX. Em vermelho é mostrado o sítio ativo e seus subdomínios (V, VIa, VIb, VII, VIII, IX, X e XI) presente em todas as proteínas analisadas. Todos organimos presentes na tabela 3 estão com suas sequencias presentes nesse alinhamento. 43 Na figura 10, é apresentada o dendograma obtido a partir de sequências proteicas similares à scSHAGGY em alguns grupos plantas. Essa árvore, gerada pelo método da máxima verossimilhaça (maximum likelihood), ilustra que a sequência de cana-de-açúcar presente no clado destacado na cor preta agrupou juntamente com outras sequências de monocotiledôneas e que diverge de outro ramo principal com um bootstrap de alto grau de confiabilidade, 96. Neste outro ramo, sequências de arroz, O. sativa, uma monocotiledônea, estão juntas a outras sequências de várias eucotiledôneas, com bootstraps também confiáveis. A presença da sequência de arroz junto à eucotiledôneas pode estar relacionada a eventos de duplicações gênicas nesta espécie vegetal. Ainda é possível visualizar a formação de vários clados distintos com a presença de sequências de um mesmo organismo como A. thaliana e O. sativa, provavelmente por essa sequência se tratar de uma superfamília. 44 Figura 11. Dendograma para as proteína homólogas a scSHAGGY. O clado destacado de preto correspondente a região onde a proteína SHAGGY (scSHAGGYI) foi posicionada. As proteínas representadas são dos seguintes organismos: A. thaliana (AT5G14640.1, AT3G05840.2, AT5G14640.2, AT5G26751.1, AT3G05840.1, AT1G09840, AT1G57870.2 e AT4G00720.1); O. sativa (LOC_Os01g14860, LOC_Os01g19150 OC_Os05g04340, LOC_Os03g62500 e LOC_Os05g11730); N. tabacum (TC81612, TC112186, TC80106, TC95772 e TC100406); L. esculentum (TC219654, TC230385, TC227641 e TC232424) S.bicolor (TC123905); Z.mays (TC506901, TC486574, TC469590 e TC471234); M.truncatula (TC148736, TC149437, TC145913, TC142499 e TC142354); P. sitchensis (TC92929, TC85433, TC90832 e TC85053); S.tuberosum (TC351757); T. aestivum (AB281487.1, BAF36565.1 e XM_002515172.1) A. fumigatus (XP_747565.1). 45 4.2- Construção dos cassetes de expressão, pZP211/PKCI e pZP211/SHAGGY para a análise funcional em plantas de tabaco Com o intuito de estudar a função dos cDNAs PKCI e SHAGGY identificados previamente nas bibliotecas subtrativas (FURTADO, 2007), foram construídos cassetes de expressão utilizando o vetor pBC como vetor intermediário. Nesse vetor, foram clonados o promotor forte CaMV35S e os cDNAs em construções separadas. Para o cDNA PKCI, foram obtidas as construções na orientação senso e antissenso (Figura 12). Esse cDNA apresenta um tamanho aproximado de 600 pares de bases (pb), já o promotor CaMV35S possui um tamanho de 800 pb. A construção foi confirmada quando o vetor foi digerido com as enzimas SalI e SacI e liberou um fragmento de 1.400 pb indicado com seta vermelha na figura 12A . Nesta figura está representado o perfil de migração eletroforética em gel de agarose dos produtos de restrição obtidos com as enzimas SalI e SacI dos potenciais clones contendo a construção do cDNA PKCI na orientação antissenso. No poço 7, está representado o perfil de migração do clone não digerido enquanto que, no poço 8, é representado o perfil de migração do mesmo clone agora digerido. A presença de um fragmento de 1.400 pb indicado com a seta vermelha na figura 12A confirma o tamanho correspondente ao esperado para o cassete de superexpressão. Os poços 1 e 2 são controles negativos (poço 1 amostra do DNA do vetor pBC não digerido e poço 2 o DNA vetor pBC digerido). Já o cassete contendo o cDNA PKCI na orientação senso pode ser visualizado nos poços 15 (cDNA PKCI não digerido) e 16 ( cDNA PKCI digerido) (Figura 12A). No poço 16 da figura 12A, observa a liberação do inserto na orientação senso correspondendo ao tamanho de fragmento esperado. Essas construções foram confirmadas também por meio do sequenciamento automático de DNA. A construção do cDNA SHAGGY foi obtida na orientação senso e antissenso. O cDNA SHAGGY apresenta um tamanho aproximado de 1.600 pb. Esse cDNA contém três sítios de restrição para a enzima SacI. A Figura 12B representa o perfil de migração eletroforética dos fragmentos de restrição em um gel de agarose para esta construção. O poço 3 corresponde ao clone não digerido, e o poço 4 corresponde ao clone digerido com a enzima de 46 restrição SacI. No poço 4, visualizam-se três fragmentos correspondentes: ao vetor pBC contendo o promotor CaMV35S (4.200 pb) e dois fragmentos do cDNA SHAGGY de 1.200 pb e 400 pb. As setas vermelhas na figura 12B indicam os fragmentos correspondentes ao tamalho esperado para o cassete. A orientação senso foi definida através do padrão da digestão enzimática e confirmada por sequenciamento. Já a orientação antissenso foi definida apenas por sequenciamento. Figura 12- Perfil de migração eletroforética dos produtos de restrição de SalI e SacI dos cassetes de superexpressão no vetor intermediário pBC. As amostras foram separadas em gel de agarose 0,7 %. Nos dois géis a letra M corresponde ao marcador Ladder 1Kb (Fermentas). Da esquerda para direita estão sequencialmente organizados como amostra não digerida seguida da amostra digerida. A) Na porção superior estão os clones de PKCI para construção na orientação antissenso. E na porção inferior os clones para o cassete de superexpressão do PKCI na orientação senso. Os números 1 e 11 e 2 e 12 correspondem ao controle negativo, o vetor pBC sem inserto (não digerido e digerido, respectivamente). Os clones 8 (orientação senso) e 16 (orientação antissenso) tiveram a construção confirmada. B) O clone número 4 foi o que apresentou o padrão de bandas esperado com os fragmentos menores (1.200pb e 400 pb) correspondendo ao cDNA SHAGGY digerido, e o fragmento maior de 4.200 pares de bases, correspondendo ao vetor pBC+CaMV35S. A B ≈ 1.400 pb ≈ 1.400 pb 47 Depois destas construções terem sido clonadas no vetor intermediário, estes cassetes foram transferidos para o vetor binário pZP211 (Figura 13A). Em azul, é representada a sequência do gene da beta-galactosidase (LacZ); já em vermelho, tem-se a sequência codificadora do gene de resistência para neomicina fosfotrasferase II (nptII), que degrada o antibiótico canamicina conferindo, portanto, aos organismos resistência a esse antibiótico; na cor verde, representa-se a sequência do promotor CaMV35S, promotor do vírus do mosaico da couve flor; a cauda poli-A é representada na cor amarela; e a borda direita do T-DNA é representada na sigla RB, enquanto que a esquerda está representada na sigla LB. Os cassetes contendo o cDNA PKCI foram clonados nos sítios de SalI e SacI, como esquematizado na figura 13B e 13C, e a construção contendo o cDNA SHAGGY na orientação senso foi clonada no sítio de SmaI e HindIII, após ter sido retirado com HindIII e SacII e tratado com T4 DNA polimerase para gerar ponta cega (Figura 13D). Enquanto que a construção do cDNA SHAGGY na orientação antissenso foi clonada nos sítios de HindIII e EcoRI do pZP211, visualização na figura 13E. 48 E. Figura 13. Esquema das construções no vetor binário pZP211. A) Plasmídio pZP211 vazio. Borda direita (RB) e Borda esquerda (LB) do T-DNA, ∆: sítios de clonagem múltipla, LacZ: seqüência do gene da beta-galactosidase, CaMV35S: promotor do vírus do mosaico da couve flor, nptII: seqüência codificadora do gene na neomicina fosfotransferase II (confere resistência a canamicina). B. Construção pZP211/PKCI na orientação senso. C. Construção pZP211/PKCI na orientação antissenso. D. Construção pZP211/SHAGGY na orientação senso. E. Construção pZP211/SHAGGY na orientação antissenso. B . C . D. A . 49 4.3- Transformação genética de plantas utilizando os cassetes de superexpressão através sistema de A. tumefaciens 4.3.1 Confirmação de transformação de A. tumefaciens LBA4404 Os cassetes de superexpressão obtidos foram utilizados na transformação genética em células de A. tumefaciens LBA4404. Uma reação de PCR foi realizada utilizando primers específicos para a sequência codificadora do gene da neomicina fosfotransferase II (nptII). Na figura 14, é apresentado um gel de agarose com a confirmação da transformação de A. tumefaciens com os cassetes de superexpressão. O resultado mostrou que um fragmento de 450 pb foi amplificado, o que corresponde ao tamanho do gene nptII, sequência esta presente no vetor pZP211. Figura 14. Perfil de migração dos produtos de PCR para a amplificação do gene nptII a partir do DNA plasmidial extraído de LBA4404. M: marcador Ladder 1Kb (Fermentas). Os poços 1 e 16 são controles negativos (DNA genômico de LBA4404 não submetida a transformação por eletroporação). Poços de 2 a 7 pZP211/PKCI na orientação senso, poços 8 a 16 pZP211/PKCI na orientação antissenso. Já os poços de 17 a 31 correspondem a pZP211/SHAGGY. As amostras de 16 a 22 correspondem ao pZP211/SHAGGY senso e as manostras de 23 a 31, pZP211/SHAGGY antissenso. O fragmento amplificado, nptII confirma a transformação de A. tumefaciens. 50 4.3.2- Transformação dos discos foliares e regeneração dos transformantes Após a confirmação da cepa de A. tumefaciens contendo o cassete de superexpressão de interesse, a próxima etapa realizada foi a transformação dos discos foliares de Nicotiana tabacum com estes cassetes de superexpressão pZP211/PKCI, nas orientações senso e antissenso e pZP211/SHAGGY na orientação senso. Foram, ainda, realizados uns experimentos de controle positivo contendo apenas o plasmídio pZP211 com o T-DNA sem a construção, e controle negativo com explantes submetidos a A. tumefaciens na ausência do plasmídio. Estes foram mantidos em placas com meio de cultura MS e com agentes de seleção e fitorreguladores descritos anteriormente na metodologia. Foi realizada a transformação dos discos com os cassetes de superexpressão. Após quatro semanas observou-se a indução da formação de calos. Na figura 15, é possível visualizar a sequência de eventos durante o processo de transformação. A figura 15A contém disco foliares de tabaco que foram infectados apenas com a agrobactéria sem cassete de expressão. Como pode ser visto, neste controle, não houve formação de calos. Nos ensaios contendo os cassetes de superexpressão depois de 30-50 dias após a infecção com agrobactéria, houve a formação de novas gemas de onde se formaram novas plântulas (Figura 15B). Estas foram então transferidas para novos potes com meio MS na ausência de fitorreguladores de modo a induzir o enraizamento destas plântulas, mantendo-se sempre o agente de seleção canamicina. Após algumas semanas, observou-se o desenvolvimento do sistema radicular nos tabacos transformados (Figura de 15C a 15G). 51 Figura 15. Plantas transformadas com os cassetes de superexpressão. A. Discos foliares inoculados com LBA4404. B. Desenvolvimento de gemas nos discos foliares. C. Tabaco tipo selvagem SR1 (WT). D. Tabaco WT, inoculado com agrobactéria sem cassete de superexpressão em meio contendo canamicina. E. Tabaco transgênico contendo o cassete de superexpressão PKCI na orientação senso (35S::PKCI/S) em meio contendo canamicina. F. Tabaco transgênico contendo o cassete de superexpressão de PKCI na orientação antissenso (35S::PKCI/AS) em meio contendo canamicina. G. Tabaco transgênico contendo o cassete de superexpressão 35S::SHAGGY/S em meio contendo canamicina. 4.3.3- Caracterização Molecular dos Transformantes Dentre 120 brotos totais submetidos ao processo de seleção com o agente de seleção canamicina, 25 enraizaram, sendo 13 explantes contendo a construção de 35S::PKCI/S (cassete PKCI orientação senso) e 12 explantes contendo 35S::PKCI/AS (cassete PKCI na orientação antissenso). Com a finalidade de averiguar se os cassetes de superexpressão 35S::PKCI/S e 35S::PKCI/AS estavam integrados nessas linhagens, foi realizada uma extração de DNA genômico das plantas. Este DNA genômico foi agora submetido a uma reação de PCR utilizando os primers específicos para o gene nptII presente no cassete de superexpressão. Na figura 16, é apresentado o produto obtido desta reação de PCR separado em gel de agarose. Nesse gel, é observada uma amplificação de um fragmento em torno de 450 pb 52 correspondente a presença do gene da neomicina fosfotransferase II (nptII) presente nos cassetes de superexpressão. Este resultado confirma que estas plantas contêm o cassete de superexpressão. Com isso, neste gel temos a confirmação de 7 plantas na orientação senso e 7 na orientação antissenso. Figura 16. Perfil eletroforético dos produtos de PCR utilizando primers para a amplificação do gene nptII em plantas resistentes a canamicina sumetidas a transformação com pZP211/PKCI senso e antissenso. M: marcador Ladder 1kb (Fermentas). WT: controle negativo. Do número 1 ao 13 amostras submetidas a PCR a partir de DNA genômico de plântulas submetidas a transformação utilizando cassetes na orientação senso. Já as amostras de 14 a 25 são de plântulas submetidas à transformação na orientação antissenso. Com relação à construção do cDNA SHAGGY na orientação senso (35S::SHAGGY/S), foram obtidas um total de 78 plântulas e destas 10 enraizaram e desenvolveram-se em meio contendo canamicina e posteriormente foram aclimatadas em casa de vegetação. Já para a construção do cDNA SHAGGY na orientação antissenso (35S::SHAGGY/AS), ainda não foi obtida até o momento nenhuma planta transgênica por que as transformações ainda estão sendo realizadas. 4.4- Padrão molecular dos genes scPKCI e scSHAGGY Considerando a complexidade do genoma da cana-de-açúcar, outro aspecto analisado foi o padrão molecular dos genes alvos deste estudo. Para isso, foi realizado um Southern blot utilizando o DNA genômico das linhagens com floração precoce e com florescimento tardio cultivadas no estado do Rio Grande do Norte (Figura 17). Para o gene scPKCI, pôde-se observar o mesmo padrão de bandas entre os dois genótipos para as quatro enzimas de restrição utilizadas. O padrão de bandas das amostras de DNA genômico 1, 2, 3 e 4, ≈ 700 pb 53 correspodem a disgestão do DNA genômico da variedade precoce digerido com as enzimas de restrição EcoRI, BamHI, PstI, e HindIII, respectivamente. Já as amostras 5, 6, 7 e 8, correspodem ao padrão de bandas obitido para o produto da digestão do DNA genômico da viaridade de cana-de-açúcar precoce, hibridizado com a sonda scPKCI e digerido com as enzimas de restrição EcoRI, BamHI, PstI, e HindIII, respectivamente. Figura 17: Padrão de bandas gerados para a sonda scPKCI através Southern blot. Padrão de bandas obtido para a sonda scPKCI utilizando as enzimas de digestão: EcoRI, BamHI, PstI, e HindIII. Amostras 1, 2, 3 e 4 correspondem ao DNA genômico da variedade precoce, enquando que as amostras 5, 6, 7 e 8, correspode ao DNA genômico da variedade tardia. M= Marcador Ladder 1 Kb (Fermentas). As setas indicam o tamanho dos fragmentos do marcador em pares de bases. 10000 pb 8000 pb 6000 pb 5000 pb 4000 pb Variedade Precoce Variedade Tardia 54 5- DISCUSSÃO A floração corresponde a um período na vida da planta onde mudanças na expressão gênica e na fisiologia são extremamente importantes para seu sucesso (HASTINGS & FOLLET, 2001). Muitos trabalhos têm sido publicados a respeito desse tema com plantas modelo, o entanto, poucos trabalhos foram realizados com membros da família Poaceae e, em especial, com plantas de cana-de-açúcar. Quase tudo que se sabe a respeito da floração em gramíneas é baseado nas espécies que apresentam valor agronômico tais como: O. sativa e Z. mays (YANO et al., 2002; COLASANTI & COVENA, 2009). Além disso, muito do que se sabe sobre o florescimento tem como base a abundância de informações geradas pelas vias genéticas e moleculares de uma pequena planta modelo dicotiledônea, A. thaliana (LAURIE et al., 2004; TURCK et al., 2008). O que emergiu a partir dos estudos com A. thaliana foi uma rede complexa de genes e vias metabólicas, alguns dos quais também são encontrados conservados nas gramíneas. Por outro lado, as descobertas recentes mostram que gramíneas também têm desenvolvido mecanismos exclusivos para regular esse processo de floração. Já com relação à cana-de- açúcar (Saccharum spp.) não existem na literatura estudos moleculares relacionados à expressão e caracterização de genes reguladores do processo floral. Em espécies de gramíneas como a cana-de-açúcar a parte vegetativa é colhida para a produção de sacarose que acumula em seu colmo. Durante a safra, a floração é indesejável, pois os níveis de sacarose diminui na transição para o florescimento devido ao desvio carbono assimilados para a produção de sementes, além da planta entrar em um processo de senescimento. Em todas as gramíneas, a manipulação da transição do tempo de floração é uma característica extremamente importante para maximizar o rendimento dessas plantas com o ambiente (COLASANTI & COVENA, 2009). Um dos obstáculos para a caracterização de genes em gramíneas se deve à complexidade do genoma desse grupo de plantas. Em cana-de-açúcar que apresenta um genoma octaploíde, a tarefa se torna bem mais difícil pois cada gene pode apresentar de 8 a 10 alelos (WACLAWOVSKY et al., 2010). 55 Além da complexidade genômica, a cana-de-açúcar apresenta um ciclo de vida longo de aproximadamente um ano quando atinge a idade adulta reprodutiva. Isso dificulta uma análise de segregação genética em um curto período de tempo. Muitos pesquisadores têm utilizado algumas plantas modelos para a caracterização de genes de outras espécies que apresentam ciclo de vida longo. Com isso, eles têm conseguido caracterizar a função de muitos genes e analisar com menor espaço de tempo a expressão desses genes e os fenótipos produzidos. FRANKE e colaboradores (2000) superexpressaram o gene Ferulate 5-hydrolase (F5H) de A. thaliana em plantas de N. tabacum e Populus tremula e verificaram que a proteína codificada por esse gene modifica a deposição de lignina nessas plantas. A superexpressão da proteína OSARP (O. sativa Antiporter-Regulating Protein) de arroz (planta monocotiledônea) em N. tabacum (planta dicotiledônea), mostrou a função do gene OsARP na compartimentarização de Nasup(+) em vacúolos citoplasmáticos (UDDIN et al., 2008). BHATTI e outros colaboradores (2008) também caracterizaram a função do gene OsLOL2 (Rice LSD1-like), homólogo de LSD1 de A. thaliana, no combate da bactéria Pseudomonas syringae quando este gene foi superexpresso em N. tabacum e as plantas transgênicas apresentaram resistência a esta bactéria. Outro trabalho utilizando um gene para uma MAPK (Mitogen-activated protein kinase) de milho, ZmSIMK1, e superexpressa em A. thaliana resultou em resistência das plantas transgênicas ao estresse salino. Além disso, essas plantas transgênicas tiveram os genes RD29A e P5CS1 (marcadores de estresse salino) regulados negativamente, caracterizando, portanto a função de ZmSIMK1 na tolerância ao estresse salino (GU et al., 2010). CHEN e GUO (2008) superexpressaram uma proteína relacionada à resistência a doenças e estresse salino, Osmotin promoter binding protein 1 (OPBP1) de tabaco, em arroz e verificaram que as plantas de arroz transgênicas desenvolveram resistência aos patógenos Magnaporthe oryzae e Rhizoctonia solani. Muitos outros trabalhos são descritos na literatura onde genes de plantas monocotiledôneas foram expressos em plantas dicotiledôneas e com isso permitiram a caracterização funcional de muitos genes. 56 Neste trabalho, foram construídos cassetes de superexpressão nas orientações senso e antissenso para dois cDNAs prospectados anteriormente em bibliotecas subtrativas de ápices meristemáticos de cana-de-açúcar: scPKCI e scSHAGGY (FURTADO, 2007). Como mencionado acima, esses cassetes foram superexpressos em plantas de N. tabacum para a caracterização das suas funções. A proteína PKCI (Protein Kinase C Inhibitor) tem sido bem descrita em animais. Porém, na literatura, existe apenas um único trabalho em plantas utilizando milho como modelo (ROBINSON et al., 1995). A análise de agrupamento gerada em nosso trabalho mostrou que a proteína PKCI é conservada em alguns grupos de plantas desde gimnospermas a angiospermas. Foi verificado ainda que a proteína de cana-de-açúcar é bem conservada quando comparada com as demais sequências. Além disso, constatamos a presença do motivo HxHxHxx característico para as proteínas deste grupo (MOZIER, 1991; GURANOWSKI et at., 2011). Para testarmos se esta proteína de cana-de-açúcar é funcional, foram construídos os cassetes de superexpressão e introduzidos em plantas de N. tabacum. A análise morfológica mostrou redução do tamanho médio nas plantas transgênicas 35S::PKCI/S quando comparado a plantas selvagens e as plantas contendo a construção 35S::PKCI/AS. Além disso, essa mesma diferença foi observada com relação à área foliar média das plantas. Entretanto, quando comparado a altura média dos entrenós não foi visualizada nenhuma diferença significativa. Também foi observado que as plantas 35S::PKCI/AS apresentaram um número de ramificações bem maior do que as plantas selvagens ou as plantas contendo o cassete 35S::PKCI/S e que, o cassete 35S::PKCI/S provavelmente estabilizou o crescimento e a floração, enquanto que as plantas contendo 35S::PKCI/AS e as selvagens continuaram a se desenvolver e a florescer. Esses resultados sugerem que a superexpressão de PKCI ou a provável redução na expressão do gene endógeno com a construção em antissenso altere o desenvolvimento normal das plantas. Estas características devem ser analisadas nas próximas progênies, assim como em nível molecular. 57 Com relação à progênie T2 das plantas transgênicas foi observado que as plantas contendo o cassete 35S::PKCI/S apresentaram o início do desenvolvimento mais rápido do que as plantas 35S::PKCI/AS. Porém, com o tempo, as plantas apresentavam desenvolvimento semelhante entre si e padrão diferenciado de segregação com relação a tamanho quando comparado aos controles da mesma idade. Esses resultados mostram uma segregação fenotípica esperada para a progênie T2 nas plantas transgênicas para os cassetes de superexpressão PKCI. Porém esses dados devem ser analisados quando obtidas as linhagens transgênicas homozigotas na progênie T3. Este estudo testou a hipótese do papel do gene scPKCI na processo de floração em cana-de-açúcar. ROBINSON e colaborados (1995) observaram que as proteínas PKCI e 14-3-3 interagiam para exercer um papel inibitório sobre a proteína PKC. No trabalho de prospecção das bibliotecas subtrativas de ápice meristemático de cana-de-açúcar, foi também prospectado a proteína 14-3-3, estes resultados sugerem uma possível interação destas duas proteínas durante a transição do ápice meristemático vegetativo para o meristema reprodutivo (FURTADO, 2007). PAUL e colaboradores (2009) propõem a participação da proteína 14-3-3 no processo de florescimento, uma vez que foi observado tanto em Solanum lycopersicon como em A. thaliana que a proteína 14-3-3 interage com o gene FT. Ensaios de duplo-híbrido com isoformas da proteína 14-3-3 foram realizados e foi observado que uma série de proteínas interagia com 14-3-3, como as proteínas PHYB, FT e outros ativadores relacionados à função de remodelamento do meristema apical (PAUL et al., 2009). A interação da proteína 14-3-3 com a proteína FT também foi verificada em arroz onde foi observado que a isoforma da família 14-3-3, GF14c , interagiu com Hd3a um homólogo da proteína FT de A. thaliana. Além disso, foi visto que essa associação entre as proteínas 14-3-3 e Hd3a levou ao acúmulo citoplasmático de Hd3a (PURWESTRI et al., 2009). A interação de 14- 3-3 com Hd3a, um florígeno de arroz, reforça a hipótese da participação de 14- 3-3 na floração. Foi verificado que a proteína 14-3-3 também interagiu com a proteína CO através de ensaio de co-imunoprecipitação, sugerindo-se a sua participação associada a um sensor de luz com uma via central de regulação da transição para floração (PAUL, FOLTA & FERL, 2008). Neste trabalho não 58 pode ser descartada uma possível interação dos genes scPKCI, scSHAGGY e sc14-3-3 em cana-de-açúcar nesse processo. GENDRON & WANG (2007) mostraram que a proteína 14-3-3 também está relacionada com a sinalização por brassinosteróides. Além disso, uma proteína da família GSK3/shaggy-like kinases (GSK) já foi descrita como sinalizadora da via de brassinosteróides (ROZHON et al., 2010). O gene scSHAGGY homólogo a família multigênica SHAGGY-like kinases foi analisado utilizando ferramentas in silico e foi observada uma conservação da proteína nos diversos grupos de organismos desde fungos até os grupos de plantas. Nas análises realizadas foram identificados os domínios bem conservados em vários grupos de plantas. Além disso, alguns trabalhos em plantas mostram que essa família multigênica está envolvida em vários processos fisiológicos. Por exemplo, PIAO e colaboradores (2001) superexpressaram o gene AtSK2-2 de A. thaliana e verificaram que as plantas transgênicas apresentaram resistência a uma condição de estresse salino. Em cana-de-açúcar foi observado que outro membro da família SHAGGY-like kinases, SuSk, teve sua expressão aumentada em resposta ao estresse salino (PATADE & RAI, 2010). Além do papel relacionado com o estresse salino foi verificado que uma GSK3/shaggy-like kinases (GSK) de A. thaliana tem uma papel importante na sinalização da via de brassinosteróides (ROZHON et al., 2010). 59 6. CONCLUSÕES  Os cDNAs PKCI e SHAGGY estão conservados em vários grupos de plantas e parecem exercer função crucial no desenvolvimento destas;  A superexpressão do cDNA PKCI de cana-de-açúcar e a redução na expressão do gene endógeno com a construção em antissenso altera o desenvolvimento normal de plantas de tabaco transgênico;  A superexpressão do cDNA SHAGGY de cana-de-açúcar em plantas de N. tabacum parece alterar a morfologia do gineceu das flores de tabaco transgênico;  O cDNA PKCI parece estar distribuído dentro do genoma de cana-de- açúcar nas mesmas posições em ambas variedades precoce quanto das variedades tardia. 60 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS Os resultados deste trabalho consistem nos primeiros resultados da superexpressão de genes relacionados com floração em cana-de-açúcar. Até então, não existem trabalhos publicados sobre a genética molecular da floração utilizando cana-de-açúcar como alvo. Nossos resultados e os dados existentes na literatura com outras plantas modelo sugerem uma possível interação de scPKCI e scSHAGGY com outras proteínas. Essa hipótese será testada com os ensaios de duplo-híbrido em levedura. Além disso, as linhagens de plantas transgênicas para todas as construções estão sendo obtidas na progênie T3. Com esta descendência, pretende-se confirmar os fenótipos observados, assim como analisar o padrão de expressão de alguns dos genes chaves associados ao processo de florescimento nas plantas transgênicas. Tendo sido obtidas as linhagens T3, alguns ensaios fisiológicos poderão ser realizados de modo a averiguar o comportamento das plantas transgênicas em respostas a fatores ambientais e hormonais, tais como variação de fotoperíodo, aplicação de brassinosteróides, os quais influenciam no tempo de floração. Além disso, estão sendo obtidas plantas transgênicas 35S::SHAGGY/AS para analisar o efeito fenotípico da diminuição dos níveis de expressão de scSHAGGY. As análises dos níveis de expressão dos genes scPKCI e scSHAGGY e dos genes chaves da floração nas plantas transgênicas por pela técnica de PCR em tempo real já estão sendo realizadas. Além disso, os ensaios in vivo utilizando a metodologia de duplo-híbridos estão em andamento para analisar a interação proteína-proteína para esses genes. Esses experimentos permitirão o fechamento dos resultados para a caracterização funcional destes dois cDNAs. 61 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALTSCHUL, S.F.; GISH, W.; MILLER, W.; MYERS, E.W.; LIPMAN, D.J. Basic local alignment search tool. Journal Molecular Bioliology. v. 215, p. 403- 4101, 1990. ARÉVALO, R.A. Mejoramento varietal. Obtencion de nuevas variedades por via sexual. Memoria anual, estación experimental agrícola de Tucumán, n.30, p.45-59, 1968. AMASINO, R.M. Vernalization, competence and the epigenetic memory of winter. The Plant Cell, v. 16, p. 2553-2559, 2004. AMASINO, R.M. Vernalizacion and flowering time. 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