UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA Programa de Pós-Gradu e Biologia Molecular ação em Genética PROSPECÇÃO DE GENES ASSOCIADOS AO PROCESSO DE FLORAÇÃO EM TOMATEIRO Daiane Cristina Cabral Ferreira Natal –RN Fevereiro – 2008 ii Daiane Cristina Cabral Ferreira PROSPECÇÃO DE GENES ASSOCIADOS AO PROCESSO DE FLORAÇÃO EM TOMATEIRO Dissertação apresentada ao Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para a obtenção de Título de Mestre em Genética no programa de Genética e Biologia Molecular Orientadora: Dr.ª Katia Castanho Scortecci Natal –RN Fevereiro – 2008 iii Ferreira, Daiane Cristina Cabral Prospecção de genes associados ao processo de floração em tomateiro XIV; 79 páginas Dissertação Mestrado – Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Departamento de Biologia Celular e Genética. 1. Floração 2. Lycopersicon 3. Genes da floração I. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Departamento de Biologia Celular e Genética. Comissão Julgadora: Prof. Dr. Lázaro Eustáquio Pereira Peres Departamento de Ciências Biológicas / USP-SP Profª. Drª. Adriana Ferreira Uchôa Departamento de Genética e Biologia Celular / UFRN-RN Profª. Drª. Katia Castanho Scortecci Orientadora iv Resumo A floração é controlada por condições ambientais e fatores endógenos que se associam numa rede de mecanismos genéticos bastante complexos. Análises de genes chaves da floração foram feitas primariamente em Arabidopsis thaliana tem fornecido grande conhecimento sobre mecanismos genéticos que controlam diferentes aspectos do desenvolvimento floral. Existem muitos homólogos descritos em diversas outras espécies, inclusive em plantas de interesse agronômico como o tomateiro. Nesta planta, as variações genéticas naturais relacionadas com a floração podem ter origem em diferentes genes expressos durante o desenvolvimento. Com isso, o objetivo deste trabalho foi de prospectar genes associados ao processo de floração utilizando a variação genética natural existente entre L. esculentum cv Micro-tom e L. pimpinellifolium, aplicando-se a metodologia de biblioteca subtrativa e análise de expressão por qPCR em tempo real. Os resultados obtidos permitiram uma identificação de alguns genes que possam ser associados à floração nestas espécies. Foram encontrados nas bibliotecas subtrativas genes relacionados tanto com o desenvolvimento vegetativo quanto genes ligados ao desenvolvimento reprodutivo, além de muitos genes não identificados em bancos de dados. Foram analisadas as expressões de três genes por qPCR. As análises sugerem uma provável associação do gene da histona H2A com a floração em L. pimpinellifolium, além de ter sido identificado também um gene desconhecido que pode ser outro fator chave na transição do meristema floral nessa espécie. Para os dados de expressão do gene fator de elongação 1-Į, outro gene resultante da subtração de uma biblioteca com mensagens vegetativas, não foi encontrada ligação com a vfloração. Visando-se melhor caracterizar este evento fisiológico em tomateiro, devem-se realizar estas análises para os outros genes identificados. Palavras-chave: Floração, Lycopersicon, Genes da floração. vi Abstract Flowering is a process marked by switch of shoot apical meristem to floral meristem, and it involves a complex regulation by endogenous and environmental factors. Analyses of key flowering genes have been carried out primarily in Arabidopsis thaliana and have provided a foundation for understanding the underlying molecular genetic mechanisms controlling different aspects of floral development. Several homologous have been found in other species, but for crops species such as tomatoes this process is not well known. The aim of this work was to use the genetic natural variation associated to the flowering process and use molecular tools such as subtractive libraries and real time PCR in order to identify and analyze the expression from genes that may be associated to flowering in these two species: L. esculentum cv Micro-Tom and L. pimpinellifolium. Our results showed there were identified many genes related to vegetative and possibly to the flowering process. There were also identified many sequences that were unknown. We’ve chosen three genes to analyze the expression by real time PCR. The histone H2A gene gave an expression higher in L. pimpinellifolium, due to this the expression of this gene may be associated to flowering in this specie. It was also analyzed the expression of an unknown gene that might be a key factor of the transition to flowering, also in L. pimpinellifolium. For the elongation factor 1-Į expression, the expression results were not informative, so this gene may have a constitutive expression in vegetative and flowering state. The results observed allowed us to identify possible genes that may be related to the flowering process. For further results it will be necessary a better characterization of them. vii Aos meus inestimáveis pais e a minha querida irmã viii Agradecimentos Agradeço à Prof.ª Dr.ª Katia Castanho Scortecci pela orientação e amizade durante todo o projeto. Ás professoras do LBMG, Lucymara F. Agnez, Sílvia Batistuzzo de Medeiros e Adriana Ferreira Uchôa. Dedico importante agradecimento à Prof.ª Dr.ª Marie Anne Van Sluys pela hospitalidade e oportunidade de trabalhar no Laboratório de Biologia Molecular de Plantas (GaTE lab)/USP. A todos os colegas do GaTE lab que me conquistaram com tanto carinho, em especial a Marisa M. Moura pela imprescindível orientação e linda amizade que cultivamos. Agradeço aos colegas e amigos do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG)/UFRN por todos os ótimos momentos, especialmente: Denise, Fabíola, Giva, Jefferson, Joana, Jule, Leonam, Thayse e Viviane. Um belíssimo agradecimento a Daniel, minha vida, por todo o apoio. Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. ix Lista de abreviaturas BLAST: conjunto de programas de alinhamentos de seqüências (do inglês, Basic Local Alignment Search TooL) CDD: Conserved Domain Database - Banco de domínios conservados do NCBI cDNA: DNA complementar DNA: ácido desoxirribonucléico DNAse: desoxirribonuclease dNTP: desoxinucleotídeo trifosfato EST: seqüências diferencialmente expressas (do inglês, Expressed Sequence Tags) GA: Giberelina Lp: Lycopersicon pimpinellifolium MT: Lycopersicon eculentum cv Micro-tom MADS-box: genes homeóticos das plantas com o nome derivado das primeiras letras das famílias gênicas que foram encontrados, Mcm1(levedura), Agamous (planta), Deficiens (planta) e SRF (humano) Mb: milhões de bases NCBI: National Center for Biotechnology Information RNAm: RNA mensageiro PCR: reação em cadeia da polimerase (do inglês, polymerase chain reaction) RNA: ácido ribonucléico rpm: rotações por minuto RT: transcriptase reversa (do inlgês, reverse transcriptase) UV: luz ultravioleta X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-E-D-galactosídeo xLista de figuras Figura 1. Diagrama com os sinais que promovem o desenvolvimento floral em A. thaliana thaliana............................................................................................................3 Figura 2. Atuação do fotoperíodo na floração...............................................................7 Figura 3. Esquema do modelo ABC.............................................................................10 Figura 4. O modelo de morfogênese floral..................................................................11 Figura 5. Modelo do crescimento e organização da arquitetura de A. thaliana (A) e tomate (B)...................................................................................................................15 Figura 6. Esquema descrevendo a metodologia para cultivo e coleta do material seguida neste trabalho................................................................................................20 Figura 7. Etapas de construção da Biblioteca Subtrativa............................................33 Figura 8. Eletroforese em gel de agarose desnaturante das amostras de RNA de Lycopersicon esculentum cv Micro-Tom (MT) e de Lycopersicon pimpinellifolium (Lp).............................................................................................................................43 Figura 9. Classificação funcional dos clones obtidos na biblioteca subtrativa que resultou das mensagens específicas de MT reprodutivo quando subtraídas de MT vegetativo...................................................................................................................48 Figura 10. Classificação funcional dos clones obtidos na biblioteca subtrativa que resultou das mensagens específicas de MT vegetativo quando subtraídas de MT reprodutivo.................................................................................................................49 Figura 11. Classificação funcional dos clones obtidos na biblioteca subtrativa que resultou das mensagens específicas de Lp reprodutivo quando subtraídas de Lp vegetativo...................................................................................................................50 Figura 12. Classificação funcional dos clones obtidos na biblioteca subtrativa que xi resultou das mensagens específicas de Lp vegetativo quando subtraídas de Lp reprodutivo.................................................................................................................51 Figura 13. Classificação funcional dos clones obtidos na biblioteca subtrativa que resultou das mensagens específicas de Lp vegetativo quando subtraídas de MT vegetativo...................................................................................................................52 Figura 14. Classificação funcional dos clones obtidos na biblioteca subtrativa que resultou das mensagens específicas de MT vegetativo quando subtraídas de Lp vegetativo...................................................................................................................53 Figura 15. Classificação funcional dos clones obtidos na biblioteca subtrativa que resultou das mensagens específicas de Lp reprodutivo quando subtraídas de MT reprodutivo.................................................................................................................54 Figura 16. Classificação funcional dos clones obtidos na biblioteca subtrativa que resultou das mensagens específicas de MT reprodutivo quando subtraídas de Lp reprodutivo.................................................................................................................54 Figura 17. Detecção do produto amplificado por qPCR das diferentes amostras de L. pimpinellifolium e L. esculentum................................................................................58 Figura 18. Expressão relativa do gene para a histona H2A em L. pimpinellifolium e L. esculentum cv Micro-Tom...........................................................................................59 Figura 19. Detecção do produto do gene histona H2A amplificado por qPCR das diferentes amostras de L. pimpinellifolium e L. esculentum.......................................60 Figura 20. Expressão relativa do gene amplificado pelo primer 5...............................63 Figura 21. Expressão relativa do gene EF 1- Į............................................................64 xii Lista de tabelas Tabela 1. Teste de eficiência de ligação de adaptadores.............................................29 Tabela 2. Componentes da primeira hibridização........................................................31 Tabela 3. Bibliotecas subtrativas construídas.............................................................44 Tabela 4. Genes identificadas nas bibliotecas e agrupados na classe metabolismo...45 Tabela 5. Genes identificadas nas bibliotecas e agrupados na classe de genes envolvidos com a transcrição.....................................................................................46 Tabela 6. Genes identificadas nas bibliotecas e agrupados na classe de genes envolvidos com a tradução.........................................................................................46 Tabela 7. Genes identificadas nas bibliotecas e agrupados na classe metilação e compactação do DNA.................................................................................................46 Tabela 8. Genes identificadas nas bibliotecas e agrupados na classe de genes mitocondriais e do cloroplasto....................................................................................46 Tabela 9. Genes identificadas nas bibliotecas e agrupados na classe de genes não conhecidas ou não identificadas nos bancos de dados..............................................46 xiii SUMÁRIO 1. Introdução...............................................................................................................1 1.1 A floração..............................................................................................................1 1.2 Genes envolvidos na regulação da floração.....................................................4 1.3 A floração em tomateiro....................................................................................12 2. Objetivos...............................................................................................................18 2.1 Objetivo Geral.....................................................................................................18 2.2 Objetivos Específicos........................................................................................18 3. Material e Métodos...............................................................................................19 3.1 Coleta do material..............................................................................................19 3.2 Competência bacteriana....................................................................................20 3.3 Construção de Biblioteca subtrativa de cDNA................................................21 3.3.1 Extração de RNA total.....................................................................................22 3.3.2 Síntese do cDNA .............................................................................................24 3.3.2.1 Síntese da 1ª fita de cDNA...........................................................................24 3.3.2.2 Síntese da 2ª Fita de cDNA..........................................................................25 3.3.3 Purificação do cDNA dupla fita......................................................................26 3.3.4 Digestão com RsaI..........................................................................................26 3.3.5 Ligação dos adaptadores...............................................................................27 3.3.6 Hibridização Subtrativa...................................................................................30 3.3.7 PCR de Supressão..........................................................................................31 3.3.8 Clonagem e Transformação Bacteriana........................................................34 3.3.9 Extração do DNA plasmidial em pequena escala (Mini-prep de seqüênciamento)......................................................................................................35 xiv 3.4 Reação de seqüênciamento..............................................................................37 3.5 Mineração dos dados.........................................................................................38 3.6 Determinação do padrão de expressão usando Quantificação Absoluta por qPCR..........................................................................................................................38 3.6.1 Síntese do cDNA para o qPCR.......................................................................39 3.6.2 Quantificação Absoluta por qPCR.................................................................40 4. Resultados e Discussão......................................................................................42 4.1 Extração de RNA total, Obtenção do cDNA e Construção da Biblioteca Subtrativa..................................................................................................................42 4.2 Determinação da expressão de genes encontrados nas bibliotecas subtrativas usando Quantificação Absoluta por qPCR........................................56 5. Conclusões...........................................................................................................65 6. Referências Bibliográficas..................................................................................66 11. INTRODUÇÃO 1.1 A floração A floração é um evento no programa de desenvolvimento da planta marcado pela conversão do meristema caulinar vegetativo em estruturas reprodutivas, sendo controlada por múltiplos caminhos que respondem a diferentes sinais ambientais e fisiológicos (SIMPSON e DEAN, 2002; BOSS et al., 2004). Esse é um acontecimento crucial no ciclo de vida da planta e envolve uma regulação bastante complexa em vários níveis (AMASINO, 2005a), estando dependente de um contínuo e preciso monitoramento das condições ambientais. Estudos envolvendo a identificação e caracterização de muitos genes associados ao processo da floração vem possibilitando consideráveis descobertas de suas ações sobre o desenvolvimento meristemático e identidade dos órgãos florais. Tais estudos partiram, principalmente, de análises de mutantes em Arabidopsis thaliana e Antirrhinum majus (GEORGIADY, WHITKUS e LORD, 2002). Com isso, o desenvolvimento das flores passou a ser compreendido como um processo que envolve múltiplas etapas, incluindo a indução e transição para um meristema apical reprodutivo, através da verificação dos sinais exógenos e endógenos, o estabelecimento da identidade dos órgãos, seguido pela diferenciação das estruturas florais (ZIK e IRISH, 2003). Dentre os fatores externos conhecidos até o momento e que influenciam esse processo estão: o fotoperíodo (comprimento da noite), a qualidade de luz (composição do espectro), vernalização (exposição a longos períodos de frio), temperatura ambiental, quantidade de água e nutrientes. Quanto aos fatores endógenos participantes dessa regulação, podem-se citar fatores hormonais, metabólitos, o estado nutricional, dentre outros (LEVY e DEAN, 1998; MOURADOV, CREMER e COUPLAND, 2002; WILLMANN e POETHIG, 2005). 2Apesar de muitos estudos fisiológicos, genéticos e bioquímicos estarem sendo desenvolvidos, ainda permanece difícil definir um mecanismo universal para a transição floral, o modelo mais aceito sugere, na planta A. thaliana, uma regulação multifatorial (luz, temperatura, hormônios e metabólitos primários) que atua na transição dependendo da fisiologia e do estado de desenvolvimento da planta (BERNIER, TRESCA e JOLLES, 1998). Segundo Komeda (2004), existem diversas observações que fortalecem a hipótese de que a floração é um caminho dependente de fatores repressores e promotores presentes durante o desenvolvimento. Esse evento tem sido criteriosamente estudado no modelo vegetal A. thaliana e, é bem provável que muitos dos mecanismos genéticos para a identidade do meristema floral descobertos nessa planta representem processos gerais que tenham sido elaborados de diferentes modos pelo reino vegetal. Isso pode ser revelado por estudos que determinam semelhanças entre mutantes em genes ortólogos de diferentes espécies (HECHT et al., 2005; BLÁZQUEZ et al., 2006). O caminho genético da floração em A. thaliana, identificado até o momento, mostra associação de, pelo menos, quatro vias metabólicas: a fotoperiódica, a da giberelina, a autônoma e a via de vernalização (KOORNNEEF et al. 1998a; BLÁZQUEZ, 2000a; MOURADOV et al., 2002; KOMEDA, 2004 AMASINO, 2005b), onde são propostas regulações positivas e negativas (FIGURA 1). De acordo com Koornneef et al. (2004), as análises genéticas de mutantes de A. thaliana com floração tardia e precoce têm identificado aproximadamente 100 genes envolvidos em múltiplas rotas genéticas que controlam o processo de floração. Levy e Dean (1998) relatam que esse processo envolve a ação seqüencial de genes que mudam o destino do meristema vegetativo para o floral (genes de identidade meristemática floral) e genes que direcionam a formação de várias partes florais (genes de identidade do órgão). 3ff Sépalas Pétalas Estames Carpelo Figura 1. Diagrama com os sinais que promovem o desenvolvimento floral em A. thaliana thaliana. As setas e traços indicam, respectivamente, relações de indução e repressão da expressão gênica. Cada gene está indicado pela abreviatura do nome. As letras X (na rota dos nutrientes) e Y (na rota da giberelina) se referem a fatores até então desconhecidos (ADAPTADO DE BLÁZQUEZ, 2000a). 41.2 Genes envolvidos na regulação da floração Os estudos moleculares da floração sugerem que haja uma interação entre vários aspectos do ciclo de vida da planta e, de acordo com Blázquez et al. (2006), para a formação das flores a planta requer uma associação simultânea de vários programas do desenvolvimento: (I) a especificação da posição correta para a nova flor; (II) o estabelecimento da simetria e polaridade nas estruturas em desenvolvimento; (III) o controle da divisão celular para determinar o tamanho da flor e o número dos órgãos florais e (IV) o programa que determina a identidade da flor. Esses caminhos para a indução floral regulam, quantitativamente, um conjunto de genes: os integradores florais – APETALA1 (AP1); FLOWERING LOCUS T (FT); LEAFY (LFY); e SUPPRESSOR OF CONSTANS1 (SOC1) – que transmitem sinais de indução floral para os genes da identidade meristemática, e estes então desencadeiam a morfogênese floral (SIMPSON e DEAN, 2002). Yamaguchi et al. (2005) mencionam um novo membro do caminho de integração floral, o gene TWIN SISTER OF FT (TSF), que é homólogo ao FLOWERING LOCUS T (FT) de A. thaliana, e, segundo Michaels et al. (2005), atua juntamente com o FT e SOC1 integrando, pelo menos em parte, sinais da via do fotoperíodica e da vernalização. A habilidade que os sinais indutivos da floração têm de alterarem o desenvolvimento da planta foi revelada ser dependente da competência do ápice meristemático em responder a esses sinais, e isso envolve intimamente a alteração transcricional do fator LEAFY (LFY) (ARAKI, 2001; SIMPSON e DEAN, 2002; BLÁZQUEZ et al., 1997; PARCY, 2005). Sua interação com o gene do caminho de integração floral SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1 (SOC1) foi verificada por Moon et al. (2005) através de duplos mutantes de função reduzida, revelando que tais genes apresentam funções independentes e que se sobrepõem na determinação do tempo de floração e na iniciação floral. Recentes estudos têm indicado 5haver uma regulação do tempo de floração por parte dos membros de uma grande família de fatores transcricionais chamada HEME ACTIVATOR PROTEIN (HAP), que atuam através da regulação de SOC1 e FT (CAI et al., 2007). O LFY também atua como repressor transcricional de outros genes da identidade meristemática e ativador de genes homeóticos tais como o TERMINAL FLOWER 1 (TFL1), que é requerido pelo meristema floral para a determinação de onde as flores serão formadas e controla quando essa formação irá acontecer (CONTI E BRADLEY, 2007; PARCY et al., 2002; ALVAREZ et al., 1992). Esse gene também sofre uma regulação negativa pelo APETALA1 (AP1), um outro integrador floral que atua localmente para especificar a identidade do meristema floral e para determinar o desenvolvimento de sépalas e pétalas (MANDEL et al., 1992; LILJEGREN et al., 1999). Um outro gene que está sob a regulação indireta do LFY é o CRABS CLAW (CRC), isso foi verificado por Lee et al. (2005) quando encontraram sítios de ligação para a proteína LFY no promotor de CRC. Bowman e Smyth (1999) detectaram uma forte expressão de CRC no carpelo e nectário, indicando sua ação no desenvolvimento dessas estruturas florais, e, segundo FOURQUIN et al. (2007), alguns aspectos desse controle do desenvolvimento reprodutivo feminino têm sido conservados entre muitos grupos das angiospermas nas quais foram encontrados ortólogos de CRC. De acordo com Molinero-Rosales et al. (2004), as condições ambientais são avaliadas e servem como sinais para a via de fotoperíodo e de vernalização, enquanto que, a via autônoma e a via dependente de giberelina são consideradas constitutivas, que promovem ou reprimem a floração, independentemente do comprimento do dia. A alternância de claro e escuro, isto é, o fotoperíodo, modula a resposta da floração em uma grande variedade de plantas e envolve complexas interações entre sinais ambientais e o mecanismo de manutenção do ritmo circadiano (1997; HAYAMA e COUPLAND, 2003; THOMA, 2006). Atuando nessa rota fotoperíodica estão os produtos dos genes CONSTANS (CO), FT, and GIGANTEA (GI) que 6promovem a floração em resposta a fotoperíodo de dias longos na planta A. thaliana (KOORNNEEF et al., 1991). Em relação à via fotoperiódica, Blázquez (2000a) descreve que a luz é percebida por fotorreceptores nas folhas, sinais são translocados para o ápice meristemático onde estimulam a transição floral, e a planta pode responder de acordo com a alternância de luz e escuro. Em A. thaliana, uma planta de dia longo, foi identificado pelo menos nove receptores fotosensíveis, incluindo cinco fitocromos (phyA–phyE), dois criptocromos (cry1 e cry2), e duas fototropinas (phot1 e phot2), que atuam na regulação de muitas de suas respostas a luz (SCHEPENS, DUEK e FANKHAUSER, 2004; LIN e SHALITIN, 2003; MOCKLER et al., 2003). Plantas que florescem em resposta a um comprimento do dia que exceda certa duração (fotoperíodo crítico), num ciclo de 24 horas, são denominadas como plantas de dias longos ou de noites curtas, e quando a floração é promovida quando as plantas são mantidas em fotoperíodos inferiores a um determinado valor crítico a classificação é de plantas de dias curtos ou noites longas (VAZ, SANTOS e ZAIDAN, 2004). Corbesier e Coupland (2005) acrescentam que plantas de dia longo florescem apenas, ou mais rapidamente, quando expostas a mais do que certo número de horas de luz num ciclo diário (comprimento crítico do dia); plantas de dia curto florescem apenas, ou mais rapidamente, se o comprimento do dia é mais curto que o comprimento crítico do dia, e plantas de dia neutro florescem independente das condições de fotoperíodo (FIGURA 2). 7Figura 2. A atuação do fotoperíodo na floração. Plantas de dias curtos necessitam passar por períodos mais longos com pouca luz para florescer, ao contrário das plantas de dias longos que florescem apenas quando expostas a uma maior quantidade de luz do que de escuro. As plantas de dias neutros florescem independentes do fotoperíodo. Cor amarela representa quantidade de luz e a cor azul, a quantidade de escuro. Em condições de dias curtos, plantas de A. thaliana que receberam aplicação exógena de giberelina (GA) tiveram a floração acelerada (WILSON et al., 1992; BLÁZQUEZ, 2000b). O papel desse fitohormônio foi confirmado por Richards et al. (2001) quando verificaram que mutantes deficientes em GA apresentavam uma diminuição no tamanho e uma floração tardia, mas com aplicação de GA foram restaurados o crescimento e o tempo de floração normais. Um outro fitohormônio que está atuando também no processo da transição floral é o etileno. Achard et al. (2007) mostraram que a ativação do etileno é uma rota de sinalização que reduz os níveis de GA ativa e isso promove a acumulação de DELLAs, uma família de proteínas nucleares que reprimem o crescimento regulando GA (RICHARDS et al., 2001). Essa acumulação conduz a uma repressão de LFY e SOC1 o que leva a um retardo no tempo da floração. Para assegurar que a fase reprodutiva ocorra em condições favoráveis, algumas plantas, entre elas alguns ecótipos de A. thaliana, requerem passar pelo processo de 8vernalização, que é uma exposição a prolongados períodos a baixa temperatura (HENDERSON, SHINDO e DEAN, 2003; AMASINO, 2005b). Nessa planta, a vernalização resulta na inativação do FLOWERING LOCUS C (FLC), um fator transcricional do tipo MADS- box que inibe a transição floral por reprimir a expressão de genes integradores florais AGAMOUS LIKE20 (AGL20) e FOWERING LOCUS T (FLT) (SAMACH et al., 2000; MICHAELS et al., 2005; HE e AMASINO, 2005; HENDERSON e DEAN, 2004); esse silenciamento é mantido de uma maneira mitoticamente estável pelo resto do ciclo de vida da planta, estabelecendo uma memória celular, (AMASINO, 2004; SCHMITZ e AMASINO, 2007). Bernier e Périlleux (2005) relatam que a vernalização é percebida pelo ápice meristemático apical (SAM) e primórdios foliares, e isso foi verificado com a aplicação de um tratamento frio e suprimento de nutrientes necessários em ápices cortados, induzindo, assim, a transição floral. Essa resposta a vernalização envolve, assim, modificações epigenéticas como remodelagem da cromatina, acetilação de FLC, metilação de histonas e até mesmo do DNA (KOORNNEEF et al.,1998b; ZIK e IRISH, 2003; AMASINO, 2005a). A vernalização age juntamente com uma via autônoma (associação de genes com fatores internos que atuam como promotores ou inibidores da indução floral) convergindo no gene FLC (MICHAELS e AMASINO, 1999; SHELDON et al., 1999). Simpson (2004) acrescenta que os componentes do caminho autônomo exibem um padrão geral de expressão que se destaca em locais de ativa proliferação celular, e compondo tal via estão os genes FCA (MACKNIGHT et al., 1997; PAGE et al.,1999; QUESADA et al., 2003), FPA (SCHOMBURG et al., 2001), FLK (LIM et al., 2004; MOCKLER et al., 2004), FVE (AUSIN et al., 2004; KIM et al., 2004), FLD (SANDA e AMASINO, 1996; YANG e CHOU, 1999; HE et al., 2003), LD (LEE et al., 1994; AUKERMAN et al., 1999), FY (SIMPSON et al., 2003; HENDERSON et al., 2005) e RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6 (REF6; NOH et al., 2004), que promovem a floração pela repressão de FLC. 9Todos os caminhos que estão induzindo a floração culminam na formação e organização das peças florais e esse processo de morfogênese foi extensivamente estudado no início da década de 90, por Coen e Meyerowitz (1991) que categorizaram mutantes genéticos de A. thaliana e A. majus dentro de três classes, A, B, e C. Com posteriores análises funcionais propuseram um modelo denominado “Modelo ABC” para a morfogênese floral. Grande parte dos genes que especificam a identidade dos órgãos nas plantas, os genes homeóticos, pertencem à classe de genes MADS-box, codificantes para fatores transcricionais que apresentam o domínio MADS-box (MICHAELIS e AMASINO, 1999; THEISSEN et al., 2000), e um domínio de ligação ao DNA altamente conservado (BECKER e THEISSEN, 2003). Jack (2001) cita que o modelo ABC postula a existência de três atividades para prover o desenvolvimento da arquitetura floral em A. thaliana, referidas pela função das três classes de genes da identidade dos órgãos florais, classes A, B e C; essa flor consiste de quatro tipos de órgãos com uma disposição em anéis concêntricos ou verticilos florais - seqüência de sépalas, pétalas, estames e carpelos - de fora para dentro, como apontado na figura 3. A identidade dos órgãos em cada verticilo é promovida por uma interação entre os genes e fatores transcricionais de cada classe, com a principal função dos genes da identidade meristemática floral sendo de ativar genes que especificam a identidade dos órgãos florais. Nesse sentido, a classe de genes A [APETALA1 (AP1) e APETALA2 (AP2) em A. thaliana] especifica as sépalas no primeiro verticilo; a atividade dos genes das classes A em combinação com os da classe B [APETALA3 (AP3) e PISTILLATA (PI)], especificam as pétalas no segundo verticilo; classes dos genes B e C, conferido pelo gene AGAMOUS (AG) da classe C, agem juntos para especificar os estames no terceiro verticilo; e finalmente a classe de genes C opera sozinho para especificar a localização dos carpelos no quarto verticilo, e, além disso, os genes das classes A e C são antagônicos, inibindo suas funções simultaneamente nos verticilos individuais (ECKARDT, 2003; KRIZEK e FLETCHER, 2005) (FIGURA 3). 10 S E SE Figura 3. Esquema do Modelo ABC proposto por Meyerowitz e Coen (1991). A função dos genes da classe A está representada pelo retângulo em rosa, a dos genes B pelo retângulo azul e C pelo amarelo. S – sépalas, P – pétalas, E – estames e Ca – carpelo. (ADAPTADO DE KANNO et al., 2007). Posteriormente, esse modelo foi estendido para incluir os genes da classe D, que especifica a identidade dos óvulos dentro do carpelo (COLOMBO et al., 1995; ANGENENT e COLOMBO, 1996; THEISSEN et al., 2000). Kramer e Hall (2005) sugerem que os genes das classes C e D seriam parálogos, cujo ancestral sofreu duplicação antes da radiação nas angiospermas, onde D teria uma função que parece estar relacionada principalmente com a identidade do óvulo, mas apresenta também alguma relação com C uma vez que confere identidade a tecidos que se desenvolvem junto com o carpelo. Um grupo adicional de genes da identidade do órgão floral, os genes da classe E [SEPALLATA (SEP); THEISSEN, 2001] estão envolvidos na especificação das pétalas, estames e carpelo (PELAZ et al., 2000; HONMA, e GOTO, 2001; KRIZEK e FLETCHER, 2006), e, segundo Eckardt (2003), há evidências de que proteínas codificadas pelos genes da classe C interagem com as da classe E. Assim, o modelo ABC foi renomeado para modelo ABCDE do desenvolvimento floral onde todos os genes, exceto AP1, são da família dos MADS-box genes. Uma grande proporção desses fatores florais de A. thaliana estão representados em outras espécies. (FERRARIO et al., 2004) (FIGURA 4). Através da evolução desses genes, 11 provavelmente pelo mecanismo de duplicação gênica seguido pela diversificação de ambas as regiões codante e regulatória, as plantas tem adquirido modificações nos seus padrões de desenvolvimento (NG e YANOFSKY, 2001) e estudos com genes ortólogos codificantes para essas proteínas têm possibilitado avanços no entendimento do desenvolvimento floral em diversas espécies de interesse. igura esquema A F 4. Modelo de morfogênese floral. O corresponde ao Modelo clássico ABC e o B, ilustra o Modelo ABCDE, em ambos estão strados as associações dos genes para determinar o desenvolvimento das peças florais; os números orrespondem a cada verticilo floral: 1 – sépalas; 2 – pétalas; 3 – estames; 4 - carpelo e 5 – óvulos DAPTADO DE THEISSEN, 2001). Mecanismos moleculares que governam a floração em plantas agronomicamente spécies. Porém, existem evidências que sugerem que o processo de floração em A. thaliana pode n ilu c (A importantes, tais como o tomate, são ainda pouco compreendidas em comparação a planta modelo para a genética vegetal A. thaliana (MOLINERO-ROSALES et al., 1999), e os estudos nessa planta têm sido importantes para ampliar tais conhecimentos para diversas outras e ão ser completamente adequado para outras espécies. A disponibilidade de bancos de dados com seqüências genômicas e de Marcas de Seqüências Expressas (em inglês A Verticilos florais Sépalas Pétalas Estames Carpelos Sépalas Pétalas Estames Carpel os Óvul os B 12 Expressed Sequence Tags - ESTs) de diferentes espécies vem sendo utilizada para estudos comparativos do caminho da floração entre plantas modelos e espécies de interesse, o que pode conduzir a identificações sobre o padrão da conservação e diversificação no controle desse processo em diversas famílias. Segundo Dielen et al. (2001) a transição floral em tomate tem sido pouco estudada, provavelmente por ocorrer muito cedo após a germinação, o que tornaria difícil a manipulação, especialmente pelos tratamentos que são esperados com o decorrer da floração. 1.3 A floração em tomateiro A família Solanaceae compreende aproximadamente 90 gêneros distribuídos no mundo todo, e dentre as espécies com maior importância econômica se encontram o tomate, a batata e o tabaco, que pertencem aos respectivos gêneros: Lycopersicon, Lycopersicon e Nicotiana. O tomate écies que foram familiarizadas e é muito utilizado em pesquisas genéticas e moleculares devido, em parte, a características inerentes da iro possui um grande número de esp espécie, como genoma diplóide de tamanho pequeno (950 Mb), tolerância a intercruzamentos, facilidade para transformação genética e disponibilidade de recursos genéticos bem- caracterizados (VAN DER HOEVEN et al., 2002). No gênero Lycopersicon há 9 espécies selvagens de tomate que evoluíram em locais distintos e possuem determinadas variações genéticas naturais, como o número de flores produzidas por inflorescência. Essa variação é ressaltada como uma das características mais importantes do tomate, já que é um pré-requisito para a formação de frutos e isso garante o sucesso reprodutivo da espécie. Em relação a essa característica pode-se identificar a espécie Lycopersicon pimpinellifolium que, diferente do tomateiro cultivado (Lycopersicon esculentum), é conhecida por possuir inflorescência com 15- 30 flores. 13 Durante a floração uma importante característica de propriedade agronômica é a arquitetura do broto nas plantas, e isso é o resultado de modificações no padrão de ramificações que são determinados pela ação de genes específicos, o que pode ser exemplificado pela comparação do desenvolvimento em tomate e A. thaliana (FIGURA 5). Essas duas plantas pertencem a famílias diferentes (tomate - Solanaceae e A. thaliana - assiBr caceae) que divergiram cedo na radiação de plantas dicotiledôneas (KU et al., 2000). A arquitetura do crescimento vegetativo observada em A. thaliana é simples (monopodial), na qual o meristema apical é indeterminado e ativo ao longo do ciclo de vida da planta originando metâmeros vegetativos, cada um composto de um inter-nó muito curto, folhas em roseta, e um broto; e quando ocorre a transição para florescer, esse meristema se transforma em um meristema de inflorescência, dando origem a uma inflorescência com parte caulinar, inter-nós e flores (GILIBERTO et al., 2005) (FIGURA 5A). Todos os apêndices (folhas, ramos laterais, e botões florais) são claramente laterais. O tomate apresenta as fases vegetativa e reprodutiva se alternando regularmente ao longo do seu crescimento simpodial (PNUELI et al., 2001). Pnueli et al. (1998) enfatizam que nesse tipo de crescimento o broto primário é finalizado por uma inflorescência do tipo cimose após a produção de 8 a 12 folhas, dependendo da cultivar. O crescimento continua com o desenvolvimento de brotos laterais se formando abaixo da inflorescência, sendo repetido o padrão de três folhas e uma inflorescência terminal no broto, e assim sucessivamente (FIGURA 5B). Neste tipo de inflorescência um número previsível de flores é produzido consecutivamente pelo meristema de inflorescência que então cessa sua atividade (SZYMKOWIAK e IRISH, 1999). De acordo com Carmel-Goren et al. (2003) esse segundo broto que aparece axilarmente é denominado de unidade simpodial, que formará três nodos vegetativos, terminando numa inflorescência. Conforme Atherton e Harris (1986) em tomate os brotos individuais da inflorescência terminal são classificados como determinado e indeterminado dependendo da capacidade do sistema de brotos continuarem o 14 desenvolvimento simpodial. Nas cultivares indeterminados, o crescimento reprodutivo, uma vez iniciado, continua ao longo da vida da planta e nas cultivares determinados existe um período no qual ocorre floração seguido por um período que o crescimento dos frutos é dominante. Pnueli et al. (1998) verificou a ocorrência de um caráter determinado no crescimento da inflorescência em certas plantas mutantes de tomate que possuíam o alelo SELF PRUNING (SP) recessivo. A mutação no gene self pruning foi identificada na Flórida em 1914 e está presente em todos os cultivares atuais de tomateiro industrial. Pnueli et al. (2001) cita que essa mutação confere uma aceleração na finalização nos sistemas de unidades dos brotos que é então finalizado por duas inflorescências sucessivas, formando-se um broto principal com brotos laterais, com todos os brotos tendo um crescimento limitado o que leva a formação de uma constituição compacta fechada e uma frutificação homogênea. Além disso, tais plantas apresentam inter-nós curtos, mais flores formadas por inflorescência, controle da dominância apical relaxada, aceleração na germinação das sementes, e plantas mais propensas ao tratamento com o hormônio auxina. Então a presença de um crescimento determinado é uma característica genética muito importante no desenvolvimento de modernas técnicas agrícolas para essa planta, já que tal caráter facilita a colheita mecânica. 15 Figura 5. Modelo do crescimen arquitetura de A. thaliana (A) e tomate (B). representa o meristema vegetativo primário e I, II e III são os segmentos simpodiais em crescimento produtivo (ADAPTADO DE PNUELI et al., 1998). dato e organização J re Ainda se conhece muito pouco sobre o processo de floração e frutificação em tomateiro. studos recentes tem resultado na descrição de alguns mutantes, e na caracterização de P), OSALES et al., 1999; MOLINERO-ROSALES et al., 2004, respectivamente). O gene S E alguns genes envolvidos com o processo de floração, como o SELF PRUNING (S FALSIFLORA (FA) e SINGLE FLOWER TRUSS (SFT) (PNUELI et al., 1998; MOLINERO- R P p pa do controle da alternância regular entre as fases vegetativa e reprodutiva ao longo da composição dos brotos no tomate, estabelecendo assim o hábito de crescimento determinado, quando a mutação ocorre nos dois genes, e indeterminado, quando apenas um dos alelos está mutado (CARMEL-GOREN et al., 2003; PNUELI et al., 1998). Este gene é homólogo ao TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) e FLOWERING LOCUS T (FT) de A. thaliana, e é membro de uma família gênica composta de, no mínimo, seis genes (CARMEL-GOREN et al., 2003). Pnueli et al. (1998) indicou que o controle da identidade meristemática na inflorescência de tomate envolve interações genéticas de SP e vários outros genes regulatórios, como o FA, mostrando que este último interage com o SP promovendo o desenvolvimento normal do meristema simpodial. Um outro gene que age como um regulador da identidade meristemática artici 16 e do tempo de floração em tomate é o FALSIFLORA (FA) (ALLEN e SUSSEX, 1996; MOLINERO-ROSALES et al., 1999), ele atua num caminho similar ao gene da identidade floral LEAFY (LFY) de A. thaliana, mas com um padrão de expressão diferente. O gene SINGLE FLOWER TRUSS (SFT) promove floração em tomate, estando também envolvido na regulação da identidade do meristema floral, tanto quanto no número e identidade dos órgãos florais (MOLINERO-ROSALES et al., 2004). Molinero-Rosales et al. (2004) afirmam que plantas apresentando o fenótipo mutante sft tem uma inflorescência que perdeu a identidade meristemática floral depois da produção de uma ou duas flores, ocorrendo uma reversão do programa de desenvolvimento vegetativo, onde a posição da próxima flor é ocupada pelo broto vegetativo. É importante salientar que o isolamento e caracterização funcional destes genes foram realizados na espécie de interesse comercial Lycopersicon esculentum Mill., espécie esta que já foi bem modificada pelo homem durante o processo de melhoramento vegetal, e deve então apresentar perdas de vários genes em seu genoma. Sendo o tomate uma das hortaliças mais difundidas no mundo, tanto por área cultivada quant o melhoramento vegetal é a floração. Porém o por valor comercial, e o Brasil um dos maiores produtores mundiais para industrialização, torna-se de extrema importância estudos desenvolvidos para o melhoramento dessa espécie, visando uma otimização na sua produção e colheita. E um dos aspectos do desenvolvimento com excepcional importância para , tal evento ainda é pouco investigado nessa espécie. As variações genéticas naturais encontradas entre os diversos cultivares de tomate tem recebido um grande destaque em relação a estudos genéticos, podendo ter tanto origem unigênica quanto multigênica, e se apresentando como ferramentas biológicas de elevado potencial para o melhoramento. Assim, para uma melhor compreensão dos elaborados mecanismos que estabelecem ligação com a floração e utilizá-las como potenciais ferramentas 17 para a otimização da produção do tomateiro, é imprescindível considerar as variações naturais existentes nos diferentes cultivares (selvagens ou que tenham sido menos modificados pelo homem) do gênero Lycopersicon, avaliando características ligadas ao tempo e tipo de floração, número de flores produzidas e muitos outros aspectos envolvidos no desenvolvimento. Entender a base genética e fisiológica e os mecanismos que determinam essas variações possibilitará conduzir propostas para prospectar, isolar e caracterizar genes que possam estar associados tanto com a indução floral quanto com a identidade meristemática, e com isso ampliar o conhecimento sobre aspectos do desenvolvimento do tomateiro. Essa proposta pode ser veiculada com a aplicação de ferramentas moleculares que possibilitem encontrar possíveis fatores envolvidos no aspecto em estudo. Para isto, nesse trabalho foi realizada a construção e análise de bibliotecas subtrativas, nas quais componentes endógenos que geram as variações genéticas naturais encontradas no gênero Lycopersicon, considerando a floração e número de flores produzidas, podem ser comparados de plantas induzidas e não induzidas à floração. Outra metodologia aplicada para estudar genes alvos foi a análise da expressão por PCR quantitativa em tempo real. Então, com a identificação de possíveis genes envolvidos na floração em tomateiro, abrem-se possibilidades de viabilizar o aumento do número de flores em diferentes cultivares dessa planta, além de ampliar os conhecimentos sobre características presentes durante todo o seu desenvolvimento e contribuir com avanços na identificação dos modos pelos quais as plantas evoluíram seu processo de desenvolvimento floral. Tais conhecimentos também poderão ser usados como base para estudos em outras plantas da mesma ou de outras espécies. 18 2. Objetivos 2.1 Objetivo Geral Identificar genes da floração diferencialmente expressos durante a transição do meristema vegetativo para o floral em espécies do gênero Lycopersicon. 2.2 Objetivos Específicos ¥ Construir bibliotecas subtrativas das mensagens provenientes dos gêneros de tomate Lycopersicon esculentum cv Micro-Tom e Lycopersicon pimpinellifolium ; ¥ Fazer o sequenciamento dos clones; ¥ Identificar genes que possam estar associados ao processo de indução floral e identidade meristemática em tomateiro, resultantes das bibliotecas subtrativas; ¥ Determinar a identidade dos cDNAs obtidos por meio de buscas em Bancos de Dados de genomas seqüenciados; ¥ Analisar a expressão de alguns genes identificados nas bibliotecas subtrativas por PCR quantitativa (qPCR) em tempo real. 19 3. Material e Métodos aterial chidas com substrato vermiculita e rra vegetal na proporção de 1:1 e fertilizante NPK (4:14:8) proporção sólido comercial na ricante. As bandejas nas quais os copos plásticos foram depos ados receberam água a cada dois dias e a umidade durante a germinação foi mantida usando (FIGU 4-26ºC, com co ç lementada com luz aquarilux, estabelecendo um foto aproxi omercial seguind induzid spécies. O acompanhamento do número de folhas desenv d induzid tativo e reprodutivo), uma vez que a primeira flor aparece no meristema depois da produção de 7 a 8 folhas (MOLINERO-ROSALES et al., 1999). Então, o meristema vegetativo (não induzido) foi coletado das plantas que aprese tavam até 8 folhas e o meristema reprodutivo (induzido) foi coletado seguindo modifi ções que ocorrem na região meristemática antes da produção das flores; essa região aprese ta-se com um maior número de tricomas e com botões florais em início de desenvolvimento. Os materiais foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer -80º 3.1 Coleta do m Sementes de Lycopersicon esculentum cv Micro-Tom e Lycopersicon pimpinellifolium CNPH 418 foram germinadas em potes de plástico preen te quantidade indicada pelo fab it filme plástico para cobrir as bandejas até que as primeiras plântulas brotassem RA 6). As plantas foram crescidas na sala de crescimento a temperatura de 2 ndi ões de luz fluorescente branca comp período de 12 horas, e umidade máxima 93% e mínima 55%. Após a produção de madamente 5 folhas, as plantas foram adubadas com fertilizante NPK líquido c o recomendações do frabicante. Tecido meristemático apical foi isolado de plantas as e não induzidas dessas duas e olvi as foi usado como padrão para indicar o momento da coleta do material vegetal o e não induzido (meristema apical vege n ca n C para posterior extração de RNA. 20 trabalho. 3.2 Competência bacteriana Para obtenção das bactérias eletrocompetentes Escherichia coli cepa DH10B, inicialmente foi feito um pré-inóculo de uma colônia desta bactéria em 5 mL de meio líquido LB (LURIA-BERTANI; SAMBROOK e RUSSEL, 2001) e esse pré-inóculo foi mantido em agitação de 180 rpm, a 37ºC (Tecnal – TE 421), durante toda a noite (16 horas). Posteriormente, essa cultura foi transferida para um erlenmeyer contendo 250mL de meio LB, sem antibiótico, onde permaneceu a 37ºC sob agitação de 220 rpm (Tecnal – TE 421) até que a medida de absorbância em 600nm tivesse alcançado valores em torno de 0,8, essa medida foi realizada Figura 6. Esquema descrevendo a metodologia para cultivo e coleta do material seguida neste Extração de RNA 21 em espectofotômetro. A cultura foi distribuída em 5 tubos de polipropileno de 50 mL, reviamente gelados, cada um contendo o volume de 45 mL da cultura, mantendo-se no gelo or 15 minutos e, posteriormente, centrifugados (centrifuga Eppendorf - 5804R) a 4.000 rpm, 4ºC durante 15 min. O sobrenadante foi, então, descartado e o precipitado de células cterianas de cada tubo foi ressuspendido em 45 mL de água milli-Q estéril, previamente sfriada. Nova centrifugação foi realizada por 15 min a 4.000 rpm a 4°C. Decorrido este mpo, o sobrenadante foi descartado e o precipitado de células agora foi ressuspendido em 25 L de água milli-Q gelada. Os tubos passaram, então, por mais uma centrifugação de 15 utos a 4.000 rpm a 4°C, o sobrenadante foi descartado e o precipitado de células agora foi ssuspendido em 5 mL de glicerol 10% gelado. Outra centrifugação de 15 min 4.000 rpm e °C, foi realizada e, em seguida, o sobrenadante foi descartado, sendo o precipitado de todos s tubos ressuspendidos em um volume final de 750 μl de glicerol 10% gelado. Deste volume e bactéria eletrocompetentes, foram aliquotados 55 μL em tubos de microcentrífuga 1,5 mL, reviamente gelados, que, então, foram armazenadas a -80°C até o momento do uso. al ubtrativa de cDNA A hib p p ba re te m min re 4 o d p Toda a manipulação foi realizada em câmara de fluxo de ar laminar, com uso de materi estéril. 3.3 Construção de Biblioteca s ridização subtrativa foi baseada na metodologia de PCR de supressão proposta por Diatenko et al. (1996), seguindo as instruções do Kit Clonetech PCR-SelectTM cDNA Subtraction (Clontech), que permite a amplificação seletiva de seqüências diferencialmente expressas a partir de cDNA dupla fita. Para isso, primeiramente foi obtido o RNA total do ápice meristemático de dois tipos de tomate (Lycopersicon esculentum cv Micro-Tom e de Lycopersicon pimpinellifolium), tanto no desenvolvimento vegetativo (denominado não 22 induzido), quanto no início do desenvolvimento reprodutivo (denominadas induzido). Em seguida, a primeira fita do cDNA foi sintetizada a partir do RNA total, utilizando o Kit Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis, o qual é um método baseado em PCR para produzir cDNA de alta qualidade a partir de nanogramas de RNA total (item 3.3.2). Essa primeira fita foi digerida com a enzima Rsa I para gerar moléculas curtas de cDNA com pontas cegas nos adaptadores 1 e 2R (primers CDS IIA e SMART IIA) os quais serão necessárias para os passos posteriores (item 3.3.6 e 3.3.7 - Hibridizações e PCR de Subtração). Após a digestão, a população de cDNA tester (cDNA que contém transcritos específicos ou diferencialmente expressos) digerida, foi dividida em duas alíquotas, cada uma das quais foi ligada a um adaptador diferente 1 ou 2R (item 3.3.5). Os dois passos seguintes consistiram em duas hibridizações: durante a primeira hibridização, as duas alíquotas de cDNA tester com os respectivos adaptadores foram hibridizadas separadamente com excesso de cDNA driver digerido (cDNA referência para que seja retirado apenas o que não hibridizar). Os dois produtos dessa primeira hibridização foram, em seguida, misturados em presença de excesso de driver e hibridizados novam .3.1 Extração de RNA total ara a extração do RNA total, meristemas apicais de Lycopersicon esculentum cv Micro- To ente (item 3.3.6). 3 P m de Lycopersicon pimpinellifolium - nos estágios de indução (meristema apical reprodutivo) e não indução (meristema apical vegetativo) - foram triturados em nitrogênio líquido, utilizando almofariz e pistilo, até se obter um pó fino. Utilizou-se um almofariz para cada planta, das quais foram triturados de 3 a 6 meristemas provenientes de plantas induzidas e 3 a 6 meristemas de não induzidas. Após o tecido ter sido triturado, foi transferido para tubos de polipropileno de 15mL e, imediatamente, foram adicionados 1-2 mL do reagente TRIZOL. O volume do reagente 23 utilizado seguiu a proporção de 1 mL para cada 100 mg de tecido. A suspensão foi agitada em um agitador de tubos durante 10 segundos e, após a homogeneização, foi novamente esfriado em nitrogênio líquido, para romper as células. Em seguida, esse material foi descongelado e mantido a temperatura ambiente por 5 minutos. Após esse tempo, foi adicionado 1 mL de clorofórmio em cada tubo, feita uma agitação por 15 segundos no agitador de tubos, e mantido em temperatura ambiente por 10 min. Os tubos foram, então, centrifugados (centrífuga Eppendorf - 5840R) a 5.000 rpm por 15 min, a 4ºC. A fase aquosa foi recuperada e transferida para um novo tubo já contendo 2,5 mL de isopropanol absoluto, que foi agitado e mantido a temperatura ambiente por 10 min para precipitar os ácidos nucléicos. Este material foi, então, centrifugado (centrífuga Eppendorf – 5840R) em 5.000 rpm por 15 min a 4ºC para recuperar o RNA total. O sobrenadante foi descartado e, no precipitado formado, foram adicionados aproximadamente 200 μL de etanol 70% (diluído em água tratada com DEPC- Dietil pirocarbonato), por duas vezes, seco em temperatura ambiente por, aproximadamente, 10 minutos, ressuspendido em 60 μL de água milli-Q tratada com DEPC 0,1%. Este material foi armazenado em freezer -80ºC até ser utilizado. As amostras foram quantificadas em espectofotômetro, obtendo a absorbância a 260 nm e c artir da seguinte fórmula: [RNA] = D.O. x valor da diluição x cor o p/ RNA (40) = μg/mL. A qualidade do RNA total extraído foi constatada po alculando a concentração a p reçã r espectofotometria (Abs260/Abs280) e por meio de uma eletroforese em gel desnaturante de agarose 1,2%, na presença de formaldeído e contendo 0,5 ȝg/mL de brometo de etídio (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). 24 3.3.2 Síntese do cDNA A partir do RNA total extraído das amostras de plantas L. esculentum cv Micro-Tom e de L. pimpinellifolium, induzidas e não induzidas, foi sintetizado o cDNA, referente a cada uma dessas amostras, utilizando-se, inicialmente, o Kit Super SMARTTM cDNA Synthesis (Cat.#: K1054-1, PT3656-1 – PR22685), de acordo com as recomendações do fabricante (Clonetch). A metodologia SMART (Switching Mechanism At 5’ end of the RNA Transcript) se baseia na utilização de primers com adaptadores para ambas as extremidades do mRNA. O primeiro adaptador contém uma seqüência poli-T, que serve como primer para a transcrição reversa. Ao término da reação, a transcriptase reversa irá adicionar várias citosinas na extremidade 5’ do cDNA devido a atividade de transferase terminal intrínseca a esta enzima. O segundo adaptador hibridiza-se com a seqüência de citosinas, criando, assim, um molde estendido para a transcriptase reversa; a reação de transcrição reversa continuará a síntese de cDNA até chegar ao final do segundo adaptador. O cDNA de fita simples obtido por esta reação possui seqüências de adaptadores em ambas as extremidades. Devido aos adaptadores possuírem sítios de cDNA, foram utilizados 2 μg de RNA total (tester e driver) primer SMART CDS IIA (12 ȝM - 5’- AAGC GTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTG- 3’), primer SMART IIA (12 ȝM - 5’- AAGC GTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG- 3’) e água milli-Q, tratada previamente com DEPC, para completar o volume de 4,5 ȝL. As setas na seqüência dos dois primers, CDS IIA e de alinhamento de primer, é possível a amplificação do cDNA mediante a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), durante a síntese da segunda fita. 3.3.2.1 Síntese da 1ª fita de cDNA Para a síntese da primeira fita , A A 25 SMAR estrição da enzima Rsa I. As amostras foram mantidas a 72ºC por 2 minutos. Decorrido este tempo, foi adicionado a cada amostra: tampão 5X First-Stran T IIA, indicam o sítio de r d (250 mM de Tris-HCl pH 8,3, 30 mM de MgCl2 e 375 mM de KCl), 10 mM de dNTP, 10 mM de DTT, 1 ȝL de PowerScript Reverse transcriptase (Clontech), e água milli-Q, tratada previamente com DEPC, para completar o volume de 10 μL. A mistura foi homogeneizada e os tubos foram incubados a 42ºC por 90 minutos; em seguida, adicionou-se 0,2 mM de EDTA e o tubo foi armazenado em freezer -20ºC. 3.3.2.2 Síntese da 2ª Fita de cDNA A síntese do cDNA de dupla fita também seguiu a metodologia do Kit Super SMARTTM através de LD-PCR (Long Distance-PCR). A primeira fita serviu como molde para a seguinte reação (foram feitas 4 reações): 0,6 μL de cDNA fita simples, 1,5 μL de tampão da enzima 10X Advantage 2 PCR (Clonetech), 10 mM de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 3,6 μM PCR Primer IIA (5’- AGCAGTGGCAACGCAGACT- 3’), 0,3 μL de 50X Advantege Polymerase Mix (Clontech) e água com DEPC para completar 25 μL. As amostras foram agitadas e colocadas em termociclador (MJ research – PTC 200) seguindo o programa para a LD-PCR: 30 ciclos de 5ºC por 5 segundos, 65ºC por 5 segundos e 68ºC por 6 minutos. ação do número ótimo de ciclos da reação, com o tuito de se evitar o efeito overcycling, o que pode gerar artefatos entre o cDNA de dupla fita amplif , sem 9 Durante esta PCR houve a padroniz in icado. O overcycling é verificado pela presença de um forte rastro na reação de cDNA controle as bandas distintas características no gel de agarose. Para isso, então, 5 μL de cada amostra foram coletados nos ciclos 21, 24 e 27. Estas amostras foram analisadas em gel de 1,2% agarose, contendo 0,5 ȝg/mL de brometo de etídio. Após a padronização, foi realizada 26 a reação do LD-PCR com o número de 24 ciclos, num volume de 50 μL para cada uma das amostras. 3.3.3 Purificação do cDNA dupla fita Para a purificação dos cDNAs tester e dirver, foi utilizado o Kit GFX PCR Purification (Amersham Bioscience). Inicialmente, 50 ȝL de cDNA obtido na etapa anterior foram ansferidos para um novo tubo de 1,5 mL, onde foram acrescentados 500 μL de tampão de captur coluna GFX. Em seguida, a coluna foi centrifugada or 30 segundos a uma velocidade de 13.400 rpm (centrífuga MiniSpin - Eppendorf). O material o tub tr a, esta mistura foi transferida para a p d o coletor foi descartado e foram adicionados na coluna 500 ȝL de tampão de lavagem. Em seguida foi realizada uma nova centrifugação de 30 segundos a velocidade de 13.400 rpm. Após esta etapa, a coluna foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL, onde foram adicionados 100 ȝL de água milli-Q com DEPC, mantido por um minuto a temperatura ambiente, posteriormente este tubo foi centrifugado por um minuto a velocidade de 13.400 rpm. O material coletado (amostra) foi analisada em gel de agarose 1,2% (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). 3.3.4 Digestão com RsaI As bibliotecas subtrativas foram construídas segundo o protocolo Clontech PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit User Manual (Cat. #: K1804-1, PT1117-1 – PR22926). Para a ligação dos adaptadores o cDNA foi digerido pela enzima de restrição Rsa I, 87 ȝL dos cDNAs tester e driver obtidos por LD-PCR e purificados foram misturados com 10 ȝL do 10X tampão de restrição para Rsa I e 30 U de Rsa I, a qual reconhece o sítio GTĻAC 27 (presentes nos primers utilizados para a LD-PCR), gerando pontas cegas. A mistura foi homogeneizada e incubada a 37ºC por 3 horas. Os tubos receberam os números 1 (MT produtivo), 2 (MT vegetativo), 3 (Lp vegetativo) e 4 (Lp reprodutivo). Os produtos desta digest tendo 0,5 ȝL/mL brometo de etídio. Em eguida, os produtos da digestão foram purificados novamente, utilizando o Kit GFX PC re ão foram analisados em gel de agarose 1,2%, con s R rific aptador diferente (adaptador 1 e adaptador 2R). Ambos os adaptadores possuem sítios e alinhamento para o PCR Primer 1 (5’- CTAATACGACTCACTATAGGC- 3’). O Adaptador 1 ’- CT GGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT- 3’) possui um sítio ara o alinhamento do Nested PCR Primer 1 (5’- TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT- 3’), enqua imer 2R (5’- AGCG pu ation (Amersham Bioscience), como descrito anteriormente, precipitados em 2 volumes de etanol 95% gelado, em presença de 70 ȝL de acetato de amônia (4 M), centrifugados por 20 minutos a 13.400 rpm (centrífuga MiniSpin - Eppendorf). Em seguida, o precipitado foi lavado em 100 ȝL de etanol 80% gelado, novamente centrifugado por 5 minutos e, então ressuspendido em 6,7 ȝL de água milli-Q com DEPC. 3.3.5 Ligação dos adaptadores Neste passo, a população de cDNA de cada amostra foi dividida para ser utilizada como driver (utilizado como cDNA referência) ou como tester (utilizado como cDNA que será ligado aos adaptadores), esse último foi dividido em duas populações, cada uma das quais foi ligada a um ad d (5 AATACGACTCACTATAG p nto o Adaptador 2R (5’- CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGA GGT- 3’) possui sítio de alinhamento para o Nested PCR Pr TGGTCGCGGCCGAGGT- 3’). Unicamente as seqüências destacadas, nos adaptadores, encontram-se pareadas com as seqüências complementares. Estes adaptadores foram ligados nas extremidades 5’ dos cDNAs digeridos com a enzima Rsa I, segundo o seguinte protocolo: 2 28 ȝL do cDNA tester digerido foram diluídos em 4 PL de água milli-Q com DEPC. Desta diluição, 2 ȝL foram misturados com 2 ȝL do Adaptador 1 (10 ȝM), 2 ȝL do tampão de ligação 5X, 1 ȝL de T4 DNA Ligase (400 U/ ȝL) e água para completar um volume de 10 ȝL; outros 2 ȝL foram misturados com 2 ȝL do Adaptador 2R (10 ȝM), 2 ȝL do tampão de ligação 5X, 1 ȝL de T4 DNA Ligase (400 U/ ȝL) e água para completar um volume de 10 ȝL. Adicionalmente, foi montado um tubo que foi utilizado como controle com cDNA não subtraído, ligado com os dois tipos de adaptadores (1 e 2R). Para isso foram misturados, em um novo tubo, 2 ȝL da mistura de tester com o Adaptador 1 com 2 ȝL da mistura de tester com o Adaptador 2R, 2 ȝL do tampão de ligação 5X, 1 ȝL de T4 DNA Ligase (400 U/ ȝL) e água para completar um volume de 10 ȝL. Cada reação foi homogeneizada e incubada a 16ºC durante a noite. Para parar a reação, 1 ȝL de EDTA/glicogênio 0,2 M foi adicionado a cada tubo e as amostras foram aquecidas a 72ºC por 5 ase. Foi feita uma diluição do controle não subtraído te em 1000 ȝL de água milli-Q com DEPC. Todas as amostras foram estocadas a -20ºC. minutos para inativar a enzima lig com 1 ȝL des Para verificar a eficiência da ligação dos adaptadores aos cDNAs, foi realizado um teste com PCR, no qual a amplificação de uma seqüência conhecida, a partir de primers específicos Forward e Reverse, foi comparada com a amplificação da mesma seqüência utilizando os primers específicos Forward, Reverse, e os Nested Primers 1 e 2R, que alinham nos Adaptadores 1 e 2R, respectivamente. Este teste foi utilizado para verificar se os adaptadores ligaram em, pelo menos, 25% dos cDNAs, ao comparar a intensidade das bandas geradas entre as duas reações de PCR. A seqüência selecionada para a realização deste teste foi o gene endógeno que codifica para uma enzima de reparo. Para este teste, foram preparados 6 reações de PCR diferentes, as quais são resumidas na Tabela 1. As seis reações foram feitas para cada amostra estudada MTR, MTV, LPR e LPV, ligadas aos dois adaptadores diferentes. Para tal, utilizou-se 1 ȝL da ligação diluída em 200 ȝL 29 de H2O, onde foram adicionados o tampão para reação de PCR 10X, 10 mM de dNTP, 50X Advantege cDNA Polymerase e água milli-Q DEPC estéril. Tabela 1. Teste de eficiência de ligação de adaptadores. Cada uma das 6 reações foi realizada para as amostras 1 (MT reprodutivo), 2 (MT vegetativo), 3 (Lp vegetativo) e 4 (Lp reprodutivo). As condições da PCR foram: 94ºC por 10 segundos, 65ºC por 30 segundos, e 68ºC por 2 min e 30 segundos, repetidos por 30 ciclos. As amostras foram analisadas em gel de agarose 1,2% contendo 0,5 ȝg/mL de brometo de etídio. Reações Componentes 1 2 3 4 5 6 Tester ligado ao Adaptador 1 1 ȝL 1 ȝL 1 ȝL - - - Tester ligado ao Adaptador 2R - - 1 ȝL 1 ȝL 1 ȝL CR Primer 1 1 ȝL 1 ȝL - - - - Nested PCR Primer 2R - - - 1 ȝL 1 ȝL - Primer endógeno-Forward 1 ȝL - 1 ȝL 1 ȝL - 1 ȝL Primer endógeno-Reverse - 1 ȝL 1 ȝL - 1 ȝL 1 ȝL Nested P Master Mix 22 ȝL 22 ȝL 22 ȝL 22 ȝL 22 ȝL 22 ȝL Volume Total 25 ȝL 25 ȝL 25 ȝL 25 ȝL 25 ȝL 25 ȝL 30 3.3.6 Hibridização Subtrativa Uma vez verificada a ligação dos adaptadores, foram realizadas as duas reações de digerido com Rsa I (item 3.3.4) foi hibridizações. Na primeira hibridização o cDNA driver dividido em dois tubos, conforme apresentado na Tabela 2, cada um contendo 1,5 ȝL do cDNA driver das amostra 1 (MT reprodutivo), 2 (MT vegetativo), 3 (Lp vegetativo) e 4 (Lp reprodutivo). Estes tubos foram levados para o termociclador (M ch – PTC 200) cujo ciclo de hibridizaçã te: 98ºC por 1,5 minutos e 8h. Após e se período, procedemos, imediatamente, a segunda hibridização subtrativa. Em quatro novos tubos foram adicionados 1,0 ȝL do cDNA driver de cada amostra correspondentes a da primeira ȝL e tampão de ibrid g téril, com tura foram de rados a 9 or 1,5 minut e, guida, foi ndo cDNA drive des do da ost , , o cDNA tester da amostra correspondente ligados aos adaptadores 1 e 2R, ficando todas as reações de cada amostra em um único tubo, os quais foram incubados a 68ºC por um período de 16 h. , foram adicionado 00 ȝ de tampão d 0 mM HEPES pH Nacl, 0,2 mM EDTA pH 8, b r a e o. O tubo foi incubado a o a to J resear o foi o seguin 68ºC por s hibridização, digerido com Rsa I, 1,0 d h ização 4X e á ua, es DEPC. 1,5 ȝL desta mis snatu 8ºC p os em se adicionado ao tubo conte r natura de ca am ra 1, 2 3 ou 4 Decorrido este tempo s 2 L e diluição (2 6,6, 20 mM 0) ao tu o contendo o p oduto d segunda hibridização homogeneizad 68ºC p r 7 min adicion is e es cado a -20ºC. 31 Tabela ridização. Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 2. Componentes da primeira hib MT reprodutivo MT vegetativo Lp vegetativo Lp reprodutivo Componentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 1 Tubo 2 cDNA Driver digerido 1,5 ȝL 1,5 ȝL 1,5 ȝL 1,5 ȝL 1,5 ȝL 1,5 ȝL 1,5 ȝL 1,5 ȝL com Rsa I Tester ligado a Adaptador 1 Tester ligado a 1,5 ȝL - 1,5 ȝL - 1,5 ȝL - 1,5 ȝL - Adaptador 2R - 1,5 ȝL - 1,5 ȝL - 1,5 ȝL - 1,5 ȝL Tampão de Hibridização 4X 1,0 ȝL 1,0 ȝL 1,0 ȝL 1,0 ȝL 1,0 ȝL 1,0 ȝL 1,0 ȝL 1,0 ȝL Volume Total 4,0 ȝL 4,0 ȝL 4,0 ȝL 4,0 ȝL 4,0 ȝL 4,0 ȝL 4,0 ȝL 4,0 ȝL 3.3.7 PCR de Supressão Após a segunda hibridização subtrativa, foi realizada uma amplificação por meio de PCR de Supressão (última etapa da construção da biblioteca subtrativa). Na primeira reação de PCR oi realizada uma amplificação utilizando o PCR Primer 1, comum para ambos os adaptadores (1 e 2R). Para isto, inicialmente foi preparado um Master Mix para três reações contendo 1 X de tampão de reação de PCR 10X, 2,5 mM de MgCl2, 0,4 mM de dNTPs, 10 ȝM de PCR Prime f r 1, Taq Polimerase Advantage (Clonetch) e água estéril para completar 24,0 ȝL. Em seguida foi dicionado a cada reação 1,0 ȝL do produto da segunda hibridização diluído (Tubo 1), ou 1,0 L do cDNA controle não subtraído e ligado a ambos os adaptadores (Tubo 2- Controle 1) ou ,0 ȝL de um cDNA controle provido pelo Kit (Tubo 3 – Controle 2). As reações foram agitadas a ȝ 1 32 brevemente e colocadas no termociclador a 75°C por 5 minutos para extensão dos adaptadores. Logo iniciad com 2 30 s 94°C, 30 °C a 72 o a R, f s de cada tubo 8 ȝL que fo a e e a D a drão de a ȝL de cada tubo da primeira PCR foram diluídos adicionando-se 27 ȝL de água estéril. Deste material diluído foi utilizado 1,0 ȝL para realizar a segunda PCR. Na segunda reação de PCR foram preparados o Master Mix para três reações contendo os seg mpo por reaçã pa ão d PCR MgC (2,5 mM), rimer 1 (10 ȝM), de Nested PCR Primer 2R (10 ȝM), dNTPs (0,4 mM), 0,5 ȝL de se (Invitrogen) ua stéril completar ȝL e foram a aos tubos 1,0 ȝL dos produtos da primeira PCR diluídos. As amostras foram itador de tubos e colocadas no termociclador onde foi iniciada a PCR de 15 egu 0 o C m o alisados em ge de 2,0% agarose contendo 0,5 ȝg/mL de brometo de etídio, 8 ȝL de cada amostra. Os produt dos utilizando o kit GFX PCR Purification System (Amersham ioscience) e estocados a -20°C. após, foi a a PCR 7 ciclos de egundos a segundos a 66 e 1,5 minutos °C. Terminad reação de PC oram retirado ram an lisadas m gel d 2,0% garose. epois de analis do o pa mplificação, 3,0 uintes co nentes o: 1X tampão ra reaç e 10X, l2 Nested PCR P Taq Polimera e ág e para 24,0 em seguida dicionados agitadas no ag ciclos de 30 s ndos a 94°C, 3 segund s a 68° e 1,5 inutos a 72°C. F ram an l os da reação foram purifica B As etapas seguidas durante a construção da biblioteca subtrativa estão ilustradas na Figura 7. 33 Figura 7. Etapas de construção da Biblioteca Subtrativa. 34 3.3.8 Clonagem e Transformação Bacteriana Os produtos da PCR de Supressão foram ligados ao vetor plasmidial pGEM-TEasy (Promega). Para a reação de ligação foram utilizados 15 ȝL do cDNA subtraído amplificado, mpão de ligação, 12,5 ng do vetor pGEM-Teasy, 1 ȝL da enzima Ligase (seguindo protocolo o fabricante) e H2O milli-Q estéril para completar um volume final de 20 ȝL. As ligações foram cubadas em 16ºC por cerca de 16-20 horas. Os tubos receberam os números 1, 3, 5, 7, 9, 11, 3 e 15, que correspondem as seguintes bibliotecas subtrativas: tubo 1 (B1)- MT vegetativo ontra MT reprodutivo, tubo 3 (B3)- MT reprodutivo contra MT vegetativo, tubo 5 (B5)- Lp egetativo contra Lp reprodutivo, tubo 7 (B7)- Lp reprodutivo contra Lp vegetativo, tubo 9 (B9)- T vegetativo contra Lp vegetativo, tubo 11 (B11)- Lp vegetativo contra MT vegetativo, tubo 13 13)- MT reprodutivo contra Lp reprodutivo, tubo 15 (B15)- Lp reprodutivo contra MT produtivo. O produto da ligação foi precipitado com glicogênio (20 mg/mL), acetato de sódio aOAc) (7,5 M) e etanol 100 %, ficando incubado por uma hora em freeze -20°C. Decorrido ste tempo, as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 13.400 rpm (centrífuga MiniSpin do foi lavado com 100 ȝL de etanol 70 %, centrifugado, desta vez, por 5 minutos, seco a temperatura ambiente e ressuspendido em 12 ȝL de água milli-Q. Em seguida, 4 ȝL da reação de ligação foram utilizados para transforma ta d in 1 c v M (B re (N e - Eppendorf), o sobrenadante foi descartado e o precipita r 55 ȝL de células eletrocompetentes DH10B de E. coli por eletroporação em Eletroporador Cellject UNO- HYBAID 1800 V (1 mm), segundo instruções do fabricante. As células transformadas foram, imediatamente, ressuspendidas em 1 mL de meio LB e incubadas a 37° C, 180 rpm, por 1 hora. Em seguida, as células foram plaqueadas em placas de Petri de 15 cm contendo meio LB sólido acrescido com 100 ȝg/mL de ampicilina e 40 ȝL de solução de X-gal 35 (40 m incubadas a 37°C por 16 horas e, posteri rmente, mantidas a 4ºC até a extração de DNA plasmidial. g/mL em dimetilformamida). As placas foram o 3.3.9 Extração do DNA plasmidial em pequena escala (Mini-prep de sequênciamento) Nesta etapa, as colônias brancas obtidas foram colocadas para crescer em placas de 96 poços contendo 1mL de meio LB líquido com 100 ȝg/mL de ampicilina. Estas foram seladas com adesivos (“Adhesive Plate Sealer” – AB Gene e “Adhesive Sealing Films for Microplates” – Simport) e, com agulha flambada, um furo foi feito em cima de cada poço, para aeração das bactérias. A placa foi levada a uma incubadora horizontal com agitação, a 37 ºC com agitação de 220 rpm (Tecnal – TE 421) por um período de aproximadamente 22 h. Foram feitas culturas permanentes do inóculo utilizando 100 ȝL da cultura e 100 ȝL de Glicerol 100% e estocadas a 0° C ressuspensão completa das células. Esse material foi centrifugado a 4.000 rpm por 9 minutos, –8 . Desta cultura permanente, 100 ȝL foram plaqueados em placas de Petri de 15 cm contendo meio LB sólido com 100 ȝL/mL de ampicilina, incubadas invertidas a 37°C por 16 horas. Foi feita extração de DNA plasmidial das colônias para confirmar a presença de inserto por digestão com 15 ȝL do DNA, 25 ȝL de tampão 10X , 100 ȝg de BSA, 3 U da enzima EcoR I e água até completar 25 ȝL, mantida a 37ºC por 16 horas. O resultado da digestão foi corrido num gel de agarose 0,7% contendo 0,5 ȝg/mL brometo de etídeo. Uma vez realizada a estocagem das culturas, foi dado início ao protocolo de extração do DNA plasmidial com uma centrifugação por 2 minutos a 4.000 rpm (Centrifuga Eppendorf - 5804R). O adesivo foi removido e o sobrenadante descartado, a placa foi invertida sobre papel absorvente por 5 minutos. Adicionou-se 240PL de GTE (50 mM de glicose, 25 mM de Tris-HCl pH 8,0 e 10 mM de EDTA) em cada poço, a placa foi selada e feita uma agitação vigorosa até 36 o sobrenadante descartado, a placa invertida sobre papel absorvente por 5 minutos e, logo após, foram adicionados 80 ȝL de GTE. A placa foi selada e agitada novamente por 2 minutos ara ressuspensão das células. Em seguida, foram transferidos 80 ȝL desta suspensão para uma n dicionado a cada poço 80 ȝL NaOH/SDS (0,2 N de NaOH, 1% de SDS), a placa foi selada com adesivo, invertida 30 vezes para homogeneização, e incubada em tempe ado e ao precipitado foram dicio p ova placa de polipropileno de fundo U contendo 2,5 ȝL de RNAse (10 mg/mL). Posteriormente foi a ratura ambiente por 10 minutos. Decorrido este tempo foram adicionados 80 ȝL de uma solução de KOAc 5M gelada, selou-se novamente a placa para misturar 30 vezes por inversão e foi, então, incubada em temperatura ambiente por 10 minutos. O adesivo foi removido, e a placa levada à estufa a 90°C. Após 30 minutos, foi colocada no gelo por 10 minutos e depois centrifugada por 9 minutos a 4.000 rpm a 20°C. Em seguida, todo o volume de cada poço (180 PL) foi transferido agora para uma placa Filtro Millipore (Sartorius - Minisart), previamente fixada no topo de uma placa de polipropileno com fundo em “V”, de maneira que os poços ficassem alinhados. Centrifugando-se este conjunto por 6 minutos a 4.000 rpm a 20ºC, o precipitado ficou retido nas placas Millipore, enquanto a fase aquosa contendo o DNA foi filtrada para as placas com fundo em “V”. A placa Millipore foi descartada e ao filtrado foram adicionados 90 ȝL de isopropanol para a precipitação do DNA plasmidial. A placa foi selada com adesivo, invertida por 30 vezes e uma nova centrifugação foi efetuada por 45 minutos, 4.000 rpm a 20ºC. Após esta etapa, o sobrenadante foi descart a nados 200 ȝL de etanol 70% gelado seguido de uma centrifugação por 5 minutos a 4.000 rpm a 20ºC. O sobrenadante foi novamente descartado, a placa foi invertida sobre papel absorvente e permaneceu a temperatura ambiente por 60 minutos para secar o precipitado. Decorrido este tempo, o DNA precipitado foi ressuspendido em 60 ȝL de água milli-Q e a integridade e concentração das amostras foram verificadas em gel de agarose 0,7 % contendo 0,5 ȝg/mL de brometo de etídio. 37 3.4 Reação de seqüênciamento Em cada reação de PCR com placas de 96 poços se utilizou 200-300 ng de DNA plasmidial, 4 ȝL de E.T. “kit” (Armesham), 3,2 ȝM do primer M13 Forward (GibcoBRE) e água milli-Q para completar um volume final de 10 μL. O “kit” é composto por uma mistura pronta de reagentes que contém: dNTPs, dideoxinucleosídeos (ddNTPs) com marcadores fluorescentes, tampão, cloreto de magnésio e a enzima Taq polimerase. As reações de PCR utilizaram o seguinte programa no termociclador (MJ research): 95 ºC durante 2 segundos, 95 ºC por 20 segundos, 45 ºC por 15 segundos, 60 ºC durante 1 min, sendo repetidos por 30 ciclos a partir da segunda etapa. Decorrido este tempo, as amostras foram precipitadas adicionando 1/10 do volume de acetato de amônia (7,5 M) e 2 volumes de etanol absoluto, agitadas por 3 vezes, incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos e coberta por papel alumínio. Em seguida, a placa foi centrifugada por 30 minutos em 4.000 rpm (Centrífuga eppendorf – 5804R) a 4ºC. Depois o sobrenadante foi descartado, e foram adicionados 150 ȝL de etanol 70% para lavagem do precipitado. Este foi agora submetido à centrifugação a 4ºC na velocidade de 4.000 rpm por 10 minutos. Por fim, o sobrenadante foi descartado e as amostras foram ressuspendidas em 10 ȝL de loading buffer (1 mM EDTA, 70% formamida). Os produtos das reações de seqüênciamento foram fracionados e visualizados gerando cromatogramas em um seqüenciador capilar MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences) (voltagem de injeção 2 KV, injeção de 120 segundos, tempo de corrida 100 min, voltagem de corrida 9 KV). 38 3.5 Mineração dos dados A identidade das seqüências obtidas nas bibliotecas foi confirmada por BLAST (National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, Md) (ALTSCHUL et al., 1990). Essas análises in silico foram realizadas por meio de comparações contra diferentes bancos de dados de diferentes organismos utilizando o BLASTn. Foram pesquisados os bancos do National Center for Biotechnology Information (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nihgov), o banco do genoma de A. thaliana (http://www.arabidopsis.org/Blast), e e dos bancos de dados de arroz e milho disponíveis no The Institute for Genomic Research (TIGR; http://www.tigr.org), respectivamente no Rice Genome Annotation Database http:(( //tigrblast.tigr.org/tgi_maize/index.cgi) e no The TIGR Maize Database (http://maize.tigr.org/). 3.6 Determinação do padrão de expressão usando Quantificação Absoluta por qPCR A análise do padrão de expressão dos genes que codificam para histona H2A, fator de elongação 1-Į (EF-1-Į) e uma seqüência que não foi identificada nos bancos de dados, foi realiza floração. Os cDNAs utilizados nos experimentos de qPCR foram obtidos a partir de amostras de mRNA extraídos de diferentes tecidos da planta (hipocótilo, meristema apical vegetativo, meristema apical reprodutivo, folha, caule e raiz) (ver ite 3.3.1 extração de RNA). As da por PCR quantitativa em tempo real (qPCR). Essa análise foi desenvolvida comparativamente usando os cDNAs dos dois cultivares de tomateiro utilizados nesse trabalho, com a finalidade de interligar a expressão dos genes em estudo e o envolvimento dos mesmos no processo da 39 conce medidas no espectofotômetro (Abs B220 B-AbsB750B; NanoDropntrações dos mRNAs foram ® -Vis) e variaram de 12,9 ng/μL a 1130,3 ng/μL, dependendo do tecido. Poster ND-1000 UV iormente, esse mRNA foi tratado com TURBO DNA-free Kit (Ambion – Cat #AM1907), seguindo as normas do fabricante. A ausência de contaminação por DNA genômico nesse mRNA foi confirmada através de uma PCR utilizando um primer para um gene endógeno (gene RPL2 - ribosomal protein large 2). Para essa reação foram usados: 300ng de mRNA, água destilada, ultrafiltrada e autoclavada, tampão de PCR 1X, 1,5mM MgCl2, 10 mM de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 5μM de cada iniciador e Taq Polymerase Recombinan” (Invitrogen Brasil Cat#11615-010). Sempre foi feito um controle negativo contendo todos os reagentes menos a amostra de DNA, para garantir a ausência de qualquer tipo de contaminação e o controle positivo com uma amostra de DNA genômico 366 ng. Todas as reações foram feitas em um termociclador “Gene Amp PCR Sytem 2400“ (Applied Biosystem, Foster ity, Califórnia), com o seguinte programa de PCR: 94ºC por 5 minutos, seguidos de 30 ciclos r 10 minutos e então resfriado a 4ºC. C a 94ºC por 30 segundos, 53 ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto, um passo final a 72ºC po 3.6.1 Síntese do cDNA para o qPCR O protocolo seguido para a síntese de cDNA foi o Higth-Cpacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems), sendo utilizado no 2X RT master mix a RNaseOUT Recombinate Ribonuclease Inhibitor (40 U/20μL da reação) para proteger o mRNA e melhorar a produção total do cDNA. O programa de amplificação usado no termociclador foi: 25ºC por 10 minutos, seguido de um ciclo a 37ºC por 120 minutos, um passo final a 85ºC por 5 segundo e então esfriado a 4ºC. 40 3.6.2 Quantificação Absoluta por qPCR O qPCR foi realizado no equipamento 7300 Real Time PCR Systems (Applied Biosystems). Uma reação de 25μL foi preparada utilizando 12,5 μL de SYBR®Green PCR Master Mix (Applied Biosystems P/N4344463), 6,5 μL de primer mix e 6, 25μL do cDNA diluído 10X da amostra. A concentração final de cada primer usado foi de 5μM (5pmol/μL) e a quantidade final da amostra de cDNA analisada foi equivalente a 200ng de mRNA. Todas as amostras foram amplificadas em duplicata sobre os seguintes parâmetros: ativação da Taq a 95ºC durante 5 minutos por 1 ciclo, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95ºC por 15 segundos e anelamento e extensão por 1 minuto a 53ºC. Os produtos de PCR para cada primer foram submetidos a uma análise da curva de dissociação que foi feita a 53-95ºC para certificar de que a fluorescência resultante foi originada de um único produto de PCR, e não representa primer dimer (auto-alinhamento dos primers) formado durante o PCR ou um produto não específico. Controles contendo todos os reagentes, menos o cDNA, também foram incluídos em duplicatas para identificar qualquer sinal produzido pela amplificação de qualquer contaminação de DNA ou primer dimer formado durante a reação. Os dados obtidos foram norma gene de referência com expressão constitutiva, o RPL2. tão, em todas as placas de qPCR eram aplicadas cada uma das amostras em duplic e SYBR®Green ao DNA dupla fita. Nessa análise é definido um ponto de orte (threshold) para a fase exponencial de amplificação do gene, que foi determinado lizados (HUGGETT et al., 2005) para o En ata com o primer de interesse, amostras com o primer para o gene RPL2, também em duplicata, e as duplicatas sem amostra, para servirem como controle negativo. O sinal de fluorescência para o SYBR®Green foi normalizado com o corante de referência (ROX) incluso no PCR Master Mix, obtendo-se a taxa do sinal normalizado definida como Rn. Os produtos de PCR detectados foram medidos pelo monitoramento do aumento da fluorescência causado pela ligação do corant c 41 manua ciclos requerido para alcançar o threshold é hamado de valor Ct (threshold cycle) (KUBISTA et al., 2006). A expressão relativa do transc lmente como 0,4606450. O número de c rito do gene alvo para o gene de referência foi determinada pela seguinte equação: expressão relativa = [2^(Ct gene referência1 - Ct gene alvo1) + 2^(Ct gene referência2 - Ct gene alvo2)]/2. Foram realizadas três reações de PCR quantitativa em tempo real para as amostras de L. esculentum e três reações para L. pimpinellifolium, usando, respectivamente, os primers 2, 5 e 10. Todos os procedimentos para montagem das placas foram realizados em capela de fluxo laminar. Os primers para o qPCR foram desenhados usando as seqüências provenientes de seqüenciamento das diferentes bibliotecas. Todos eles foram testados por PCR para confirmar a amplificação desejada (banda única quando o resultado da PCR foi visualizado num gel de agarose 2%). O primer 2 foi desenhado a partir de uma seqüência presente na biblioteca B13, o qual foi identificado pelo Blast como similar ao gene histona H2A; o desenho do primer 5 foi feito da seqüência de um clone analisado na biblioteca B5, que não teve similaridade com nenhuma outra seqüência no banco de dados, e o primer 10 foi desenhado partindo de uma seqüência identificada na biblioteca B3, a qual as análises revelaram ser o gene para o fator de elongação 1-Į. A metodologia da PCR em tempo real foi adaptada do manual: Sequence Detection Systems, Applied Biosystem, Chemistry Guide. 2003 e os experimentos foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular de Plantas (GaTE lab)/USP. 42 5. Conclusões - Analisando as bibliotecas subtrativas construídas foram encontrados genes que podem estar associados à floração e genes relacionados com processos vegetativos no desenvolvimento do tomateiro; - Os experimentos de qPCR em tempo real revelaram a histona H2A como sendo um provável gene chave envolvido na característica da maior produção de flores em L. pimpinellifolium; - O gene desconhecido que foi amplificado pelo primer 5 pode estar associado com a percepção de sinais, uma vez que sua expressão aumenta mais que três vezes no meristema apical reprodutivo de L. pimpinellifolium. Podendo ser um dos genes chaves a atuar durante a transição floral dessa planta. - Os dados encontrados para o gene do fator de elongação 1-Į não são conclusivos para o evento fisiológico da floração. 43 Referências Bbliográficas ACHARD, P.; BAGHOUR, M.; CHAPPLE, A.; HEDDEN, P.; VAN DER STRAETEN, D.; floral transition via DELLA-dependent regulation of floral meristem-identity genes. 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