UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL RODRIGO PORPINO MAFRA ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DA PODOPLANINA E DA TRIPTASE EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA E SUA RELAÇÃO COM PARÂMETROS CLINICOPATOLÓGICOS Natal/RN 2016 Rodrigo Porpino Mafra ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DA PODOPLANINA E DA TRIPTASE EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÍNGUA E SUA RELAÇÃO COM PARÂMETROS CLINICOPATOLÓGICOS Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Patologia Oral. Orientador: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto Natal/RN 2016 Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”. Mafra, Rodrigo Porpino. Análise da imunoexpressão da podoplanina e da triptase em carcinoma epidermóide de língua e sua relação com parâmetros clinicopatológicos / Rodrigo Porpino Mafra. – Natal, RN, 2016. 104 f. : il. Orientador: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto. Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia. 1. Carcinoma de células escamosas – Dissertação. 2. Linfangiogênese – Dissertação. 3. Mastócitos – Dissertação. 4. Imuno-histoquímica – Dissertação. I. Pinto, Leão Pereira. II. Título. RN/UF/BSO Black D65 DEDICATÓRIA DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais, Ronaldo e Marília, pelo amor, incentivo e apoio incondicional. Por serem as principais razões da minha luta pela concretização desse sonho. AGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOS Ao meu professor e orientador, Dr. Leão Pereira Pinto, exemplo de dedicação e amor à docência, por todas as suas contribuições na minha formação acadêmica. Agradeço seus ensinamentos, atenção e paciência durante a realização desse trabalho, sua compreensão nos momentos de dificuldade, assim como a confiança depositada em mim desde os tempos de iniciação científica. Minha gratidão, respeito e sincera admiração! Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, pelos valiosos conhecimentos transmitidos durante o curso: Dra. Lélia Batista de Souza, Dra. Roseana de Almeida Freitas, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira, Dra. Ana Miryam Costa de Medeiros, Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira, Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel e Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza. Ao professor Dr. Kênio Costa de Lima, por sua disponibilidade e contribuição nas análises estatísticas desta pesquisa. À Marianna, minha “irmã de orientação”, que enfrentou comigo vários desafios ao longo deste curso de Mestrado, em especial no decorrer das nossas pesquisas. À Amanda, pessoa que se faz admirar pela exímia dedicação, ética e senso de responsabilidade. Sua amizade foi um dos presentes que ganhei durante o curso. A todos os outros colegas de turma, Eduardo, Thalita, Luiz Arthur, Mara, Patrícia, Angélica, Hugo, Jefferson e Leorik, com quem vivenciei tantos momentos de aprendizado mútuo, alegrias e momentos difíceis que contribuíram para nosso crescimento pessoal. Aos doutorandos Marcelo, Andréia, Tiago, Maria Luíza (Malu), Viviane, Luciana, Salomão, Rafaella, Denise, Ana Luíza (Aninha), Roseane, Jadson, Melka, Natália, Laura, Laudenice, Vilson e Jamile, por tudo o que aprendi com vocês e pela nossa convivência agradável. Em especial à Clarissa, sempre gentil e disposta a ajudar seu “irmão mais novo”. Aos funcionários e técnicos da Disciplina de Patologia Oral da UFRN, Hévio, Gracinha, Idelzuíte, Sandrinha, Ricardo e Lourdinha, pela disponibilidade em auxiliar e dedicação ao trabalho. A todos os familiares e amigos que contribuíram de alguma forma para a finalização desta etapa, seja apoiando as minhas decisões, seja entendendo a minha distância. Em especial, às minhas irmãs (Gabriela e Ana Luíza), aos meus avós (Nicodemos e Maria Luíza), padrinhos (Marcelo e Patrícia) e grandes amigos (Álvaro, Jayme e Kelsiane). Aos amigos da Pró-Reitoria de Graduação, Arthur, Jussara, Marcelo e João Vicente, pelas adaptações na carga horária de trabalho e compreensão nos meus momentos de ausência, assim possibilitando a realização desse curso. À Liga Norte-Riograndense Contra o Câncer, por ter disponibilizado o material biológico e condições adequadas para a realização de parte dessa pesquisa. Obrigado por tudo! “Minha energia é o desafio, minha motivação é o impossível, e é por isso que eu preciso ser, à força e a esmo, inabalável”. (Augusto Branco) RESUMO RESUMO O carcinoma epidermóide de língua oral (CELO) apresenta um comportamento biológico agressivo, com elevada propensão ao desenvolvimento de metástases nodais. Nesse contexto, a linfangiogênese é considerada um fenômeno importante para a disseminação das células tumorais e pode sofrer influência de estímulos do microambiente. Os mastócitos têm sido relacionados à progressão de neoplasias malignas, no entanto, a sua influência na formação de vasos linfáticos ainda não está bem estabelecida. O propósito desta pesquisa foi avaliar, em uma série de casos de CELO (n=50), possíveis correlações entre a densidade linfática, a contagem de mastócitos e o perfil clinicopatológico, incluindo o estadiamento clínico TNM, a gradação histológica de malignidade (Bryne, 1998) e a presença/ausência de metástases nodais. A densidade linfática foi estabelecida como a média de vasos linfáticos imunomarcados pelo anticorpo anti-podoplanina (D2-40), identificados em cinco campos microscópicos (200x). Para a análise dos mastócitos, foram quantificadas as células imunorreativas ao anticorpo anti-triptase, em cinco campos (400x). Ambas as imunomarcações foram analisadas no centro tumoral e no front de invasão. A densidade linfática intratumoral (DLI) foi superior nos casos em estágios clínicos avançados (III-IV), quando comparados àqueles em estágios iniciais (I-II), assim como nos casos metastáticos em relação aos não-metastáticos (p<0,05). Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os casos de baixo grau e alto grau de malignidade no tocante à DLI (p>0,05). A densidade linfática peritumoral (DLP) e as contagens de mastócitos não demonstraram relações significativas com nenhum dos parâmetros clinicopatológicos avaliados (p>0,05). Também não foram encontradas correlações estatisticamente significativas entre as densidades linfáticas e as contagens de mastócitos, seja na região intratumoral (r = -0,004; p=0,977) ou na peritumoral (r = -0,154; p=0,285). Os resultados do presente estudo sugerem que os vasos linfáticos intratumorais podem contribuir em parte para a progressão do CELO, porém a DLP pode não ser suficiente para justificar diferenças no comportamento biológico do tumor. Isto sustenta a hipótese de envolvimento de outros mecanismos na disseminação metastática das células malignas, os quais complementariam os efeitos da linfangiogênese. Os mastócitos, ainda que realizem diversas funções pró- e antitumorais, parecem não influenciar diretamente o potencial de agressividade do CELO. Adicionalmente, é possível que a quantidade destas células não seja um fator determinante para a formação de vasos linfáticos. Palavras-chave: Carcinoma de Células Escamosas. Linfangiogênese. Mastócitos. Imuno-histoquímica. ABSTRACT ABSTRACT Oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) has an aggressive biological behavior, with a high propensity for the development of lymph node metastases. In this context, lymphangiogenesis is considered an important phenomenon for the spread of tumor cells and may be influenced by microenvironmental stimuli. Mast cells have been implicated in tumor progression, although their influence in the formation of lymphatic vessels is not well established. The aim of this study was to analyze, in a case series of OTSCC (n=50), possible correlations between lymphatic vessel density (LVD), mast cell count and clinicopathological features, including tumor-node-metastasis (TNM) stage, histological grade of malignancy (Bryne, 1998), and nodal metastasis. LVD was established as the mean number of lymphatic vessels immunostained by anti-podoplanin (D2-40) antibody, identified in five microscopic fields (200x). For the analysis of mast cells, tryptase-immunoreactive cells were quantified in five fields (400x). Both immunostainings were analyzed in the tumor center and invasion front. Intratumoral lymphatic density (ILD) was higher in cases in advanced clinical stages (III-IV), compared to those in initial stages (I-II), as well as in metastatic cases in respect of non-metastatic (p<0,05). There were no statistically significant differences between low-grade and high-grade malignancy cases with respect to ILD (p>0,05). Peritumoral lymphatic density (PLD) and mast cell counts showed no significant relations with any of the clinicopathological parameters evaluated (p>0,05). Also there were no significant correlations between LVD and mast cell counts, whether in intratumoral (r = -0,004; p=0,977) or peritumoral region (r = -0,154; p=0,285). The results of the present study suggest that intratumoral lymphatic vessels may contribute in part to the progression of OTSCC, although PLD may be insufficient to justify differences in biological behavior. This supports the hypothesis of involvement of other mechanisms in metastatic spread of malignant cells, which could complement the effects of lymphangiogenesis. Although mast cells perform several pro- and antitumoral functions, they do not appear to directly influence aggressiveness of OTSCC. In addition, the quantity of these cells may not be essential for lymphatic vessel formation. Key words: Squamous Cell Carcinoma. Lymphangiogenesis. Mast Cells. Immunohistochemistry. LISTA DE ILUSTRAÇÕES LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Representação esquemática dos processos de síntese, armazenamento e secreção da triptase pelos mastócitos............................................................ 49 Figura 2. Fotomicrografia evidenciando CELO de baixo grau de malignidade (HE, Barra = 200 µm)............................................................................................ 75 Figura 3. Fotomicrografia evidenciando CELO de alto grau de malignidade (HE, Barra = 100 µm)............................................................................................ 75 Figura 4. Fotomicrografia demonstrando a imunomarcação de vasos linfáticos pelo anticorpo anti-podoplanina (D2-40) no centro tumoral do CELO (HiDef; Barra = 100 µm)............................................................................................ 76 Figura 5. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação de vasos linfáticos pelo anticorpo anti-podoplanina (D2-40) no front de invasão do CELO (HiDef; Barra = 100 µm)............................................................................................ 76 Figura 6. Fotomicrografia evidenciando a imunoexpressão da triptase em mastócitos no centro tumoral do CELO (HiDef; Barra = 100 µm)............... 77 Figura 7. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da triptase em mastócitos no front de invasão do CELO (HiDef; Barra = 100 µm)............ 77 LISTA DE QUADROS E TABELAS LISTA DE QUADROS E TABELAS Quadro 1. Sistema de gradação histológica de malignidade no front de invasão proposto por Bryne (1998)............................................................................. 60 Quadro 2. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados no estudo......................... 62 Quadro 3. Variáveis dependentes elencadas para os testes estatísticos.......................... 65 Quadro 4. Variáveis independentes elencadas para os testes estatísticos....................... 65 Tabela 1. Distribuição absoluta e relativa dos casos de CELO, de acordo com os dados clínicos relacionados. Natal-RN, 2015................................................ 67 Tabela 2. Distribuição absoluta e relativa dos casos de CELO, de acordo com o estadiamento clínico e a gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal-RN, 2015................................................................................... 69 Tabela 3. Distribuição absoluta e relativa dos casos de CELO, de acordo com as metástases nodais e a gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal-RN, 2015................................................................................... 69 Tabela 4. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a densidade linfática nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação ao estadiamento clínico TNM. Natal-RN, 2015................................................. 70 Tabela 5. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a densidade linfática nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação à gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal-RN, 2015...... 71 Tabela 6. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a densidade linfática nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação às metástases nodais. Natal-RN, 2015............................................................... 71 Tabela 7. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a contagem de mastócitos nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação ao estadiamento clínico TNM. Natal-RN, 2015................................................. 72 Tabela 8. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma 73 dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a contagem de mastócitos nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação à gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal-RN, 2015..... Tabela 9. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a contagem de mastócitos nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação às metástases nodais. Natal-RN, 2015.......................................................... 73 Tabela 10. Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman (r) e significância estatística (p) para a densidade linfática em relação à contagem de mastócitos nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO. Natal-RN, 2015............................................................................ 74 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS  AE1/AE3 Refere-se a uma mistura de dois anticorpos (AE1 e AE3) capazes de identificar a maioria das citoqueratinas expressas pelas células epiteliais humanas.  AIDS Do inglês, acquired immune deficiency syndrome, traduzido como síndrome da imunodeficiência adquirida.  BSA Do inglês, bovin serum albumin, traduzido como albumina de soro bovino.  C3a Refere-se à anafilatoxina C3a, formada a partir da ativação do sistema complemento.  C5a Refere-se à anafilatoxina C5a, formada a partir da ativação do sistema complemento.  CD31 Do inglês, cluster of differentiation 31, traduzido como grupamento de diferenciação 31.  CELI(s) Carcinoma(s) epidermóide(s) de lábio inferior.  CELO Carcinoma epidermóide de língua oral.  CEO Carcinoma epidermóide oral.  CEP Comitê de Ética em Pesquisa.  c-Kit Refere-se ao receptor transmembrana tirosina-cinase codificado pelo proto- oncogene c-Kit.  CM Contagem de mastócitos.  CMI Contagem de mastócitos intratumorais.  CMP Contagem de mastócitos peritumorais.  CO Câncer oral.  D2-40 Refere-se ao anticorpo monoclonal anti-podoplanina.  DL Densidade linfática  DLI Densidade linfática intratumoral.  DLP Densidade linfática peritumoral.  DNA Do inglês, deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido desoxirribonucléico.  E6 Refere-se ao gene ou à proteína E6.  E7 Refere-se ao gene ou à proteína E7.  FcγRIII Refere-se a um receptor de alta afinidade para anticorpos IgG.  FcεRI Refere-se a um receptor de alta afinidade para anticorpos IgE.  FGF Do inglês, fibroblast growth factor, traduzido como fator de crescimento fibroblástico.  HE Refere-se à técnica histoquímica da hematoxilina e eosina.  HPV Do inglês, human papillomavirus, traduzido como papiloma vírus humano.  IgE Imunoglobulina do isótipo E.  IL Interleucina.  INCA Instituto Nacional do Câncer.  Ki-67 Refere-se ao antígeno celular Ki-67 ou ao anticorpo anti-Ki-67.  LYVE-1 Do inglês, lymphatic vessel hyaluran receptor-1, traduzido como receptor de hialuronana de vasos linfáticos-1.  MCP-1 Do inglês, monocyte chemoattractant protein-1, traduzido como proteína quimiotática de monócitos.  MMP Do inglês, matrix metalloproteinase, traduzido como metaloproteinase da matriz.  MVD Do inglês, microvessel density, traduzido como densidade microvascular.  OMS Organização Mundial de Saúde.  p53 Refere-se à proteína supressora tumoral p53.  PAF Do inglês, platelet-activating factor, traduzido como fator de ativação plaquetária.  PAMPs Do inglês, pathogen-associated molecular patterns, traduzido como padrões moleculares associados a patógenos.  PDGF Do inglês, platelet-derived growth factor, traduzido como fator de crescimento derivado de plaquetas.  PGE2 Prostaglandina E2.  pRb Do inglês, retinoblastoma protein, refere-se à proteína pRb.  PROX-1 Do inglês, prospero related homeobox gene-1, traduzido como fator de transcrição homeobox-1.  QA(s) Queilite(s) actínica(s).  SCF Do inglês, stem cell factor, traduzido como fator de células-tronco.  SGHM(s) Sistema(s) de gradação histológica de malignidade.  SPSS Refere-se ao programa Statistical Package for the Social Sciences.  TA Temperatura ambiente.  TGF-β Do inglês, transforming growth factor-β, traduzido como fator transformador de crescimento-β.  TLRs Do inglês, Toll-like receptors, traduzido como receptores semelhantes a Toll.  TNF-α Do inglês, tumor necrosis factor-α, traduzido como fator de necrose tumoral-α.  TNM Do inglês, tumor-node-metastasis, refere-se ao sistema de estadiamento clínico, que avalia: tamanho do tumor primário (T), envolvimento de linfonodos regionais (N) e envolvimento por metastases à distância (M).  TRIS-HCl Tris-hidroximetil-aminometano.  UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte.  UICC União Internacional Contra o Câncer.  UV Ultravioleta.  UVB Refere-se à radiação ultravioleta do tipo B.  VEGF Do inglês, vascular endothelial growth factor, traduzido como fator de crescimento endotelial vascular.  VEGF-C Refere-se à isoforma C do fator de crescimento endotelial vascular.  VEGF-D Refere-se à isoforma D do fator de crescimento endotelial vascular.  VEGFR-2 Do inglês, vascular endothelial growth factor-receptor 2, traduzido como receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular.  VEGFR-3 Do inglês, vascular endothelial growth factor-receptor 3, traduzido como receptor 3 do fator de crescimento endotelial vascular. LISTA DE SÍMBOLOS LISTA DE SÍMBOLOS  % Porcentagem.  α Do alfabeto grego, alfa.  β Do alfabeto grego, beta.  γ Do alfabeto grego, gama.  δ Do alfabeto grego, delta.  ε Do alfabeto grego, épsilon.  µm Micrômetro.  kDa Quilodálton.  Mm Milímetro.  mm2 Milímetros quadrados.  pH Potencial hidrogeniônico.  ºGL Graus Gay-Lussac.  ® Marca registrada. SUMÁRIO SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 27 2 REVISÃO DA LITERATURA....................................................................................... 30 2.1 CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL........................................................................... 30 2.1.1 Considerações Gerais....................................................................................................... 30 2.1.2 Carcinoma Epidermóide de Língua: Indicadores de Prognóstico............................... 38 2.2 LINFANGIOGÊNESE....................................................................................................... 40 2.3 MASTÓCITOS................................................................................................................... 45 3 PROPOSIÇÃO................................................................................................................. 55 4 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................. 57 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS............................................................................................ 57 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO................................................................................ 57 4.3 POPULAÇÃO.................................................................................................................... 57 4.4 AMOSTRA......................................................................................................................... 57 4.4.1 Critérios de Inclusão........................................................................................................ 58 4.4.2 Critérios de Exclusão....................................................................................................... 58 4.5 ESTUDO CLÍNICO........................................................................................................... 58 4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO.............................................................................................. 59 4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO............................................................................... 61 4.7.1 Método Imuno-histoquímico........................................................................................... 61 4.7.2 Análise do Perfil Imuno-histoquímico............................................................................ 63 4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................................. 64 5 RESULTADOS................................................................................................................. 67 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA............................................................................ 67 5.2 RESULTADOS MORFOLÓGICOS.................................................................................. 68 5.3 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS................................................................... 69 6 DISCUSSÃO..................................................................................................................... 79 7 CONCLUSÕES................................................................................................................. 86 REFERÊNCIAS............................................................................................................... 88 APÊNDICES..................................................................................................................... 97 ANEXO.............................................................................................................................. 103 INTRODUÇÃO 27 1 INTRODUÇÃO O carcinoma epidermóide é definido como uma neoplasia maligna originada do epitélio pavimentoso estratificado, que corresponde a mais de 90% dos tumores malignos que acometem a cavidade oral (HILLBERTZ et al., 2012; RUBACK et al., 2012). A despeito dos avanços obtidos no tratamento do carcinoma epidermóide oral (CEO), dados epidemiológicos evidenciam que esta neoplasia permanece associada a elevadas taxas de morbidade e mortalidade, constituindo um importante problema de saúde pública em nível mundial (LAMBERT et al., 2011). Diversos estudos têm analisado parâmetros clinicopatológicos associados ao potencial de agressividade do CEO, na busca de fornecer subsídios úteis na avaliação do prognóstico e planejamento terapêutico. Dentre os critérios avaliados nestas pesquisas, citam-se o estadiamento clínico TNM e a gradação histológica de malignidade (BRANDWEIN- GENSLER et al., 2005; SILVEIRA et al., 2007; OKADA, 2010; MATOS et al., 2012). Considerando os diferentes sítios da cavidade oral, o carcinoma epidermóide de língua oral (CELO) destaca-se pelo elevado potencial de invasão e tendência a metástases em linfonodos regionais (VASCONCELOS et al., 2014), as quais constituem o critério clinicopatológico mais relacionado ao prognóstico (NOGUTI et al., 2012). No microambiente tumoral, os vasos linfáticos neoformados funcionam como vias de disseminação das células malignas e podem contribuir para o desenvolvimento de metástases em linfonodos regionais (ALBRECHT; CHRISTOFORI, 2011; CIMPEAN; RAICA, 2015). Assim sendo, estudos têm investigado a expressão de proteínas envolvidas na linfangiogênese tumoral, com o objetivo de melhor compreender a influência deste fenômeno no curso clínico e prognóstico do CEO (ZHAO et al., 2008; OKADA, 2010; SOUSA et al., 2012). O principal método de estudo da linfangiogênese consiste na mensuração da densidade linfática (VAN DER AUWERA et al., 2008), através de reações imuno-histoquímicas com anticorpos que reconhecem proteínas expressas pelas células endoteliais linfáticas, a exemplo do VEGFR-3, LYVE-1 e D2-40 (LONGATTO FILHO et al., 2007; ALBRECHT; CHRISTOFORI, 2011). O anticorpo D2-40 é considerado um marcador de grande aplicabilidade para a distinção entre vasos sanguíneos e linfáticos, pela sua especificidade no reconhecimento da podoplanina humana (SCHACHT et al., 2005; SOUSA et al., 2012). A linfangiogênese sofre influência de estímulos inerentes à neoplasia e ao hospedeiro, a exemplo de substâncias liberadas por células tumorais e estromais. Neste contexto, 28 mencionam-se os mastócitos, células hematopoiéticas envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos, que armazenam numerosos mediadores químicos, incluindo a histamina, as proteases e os metabólitos do ácido araquidônico (ZAIDI; MALLICK, 2014). Em microscopia de luz, podem ser identificados através de colorações especiais ou reações imuno-histoquímicas (CHEEMA; RAMESH; BALAMURALI, 2012), principalmente pela expressão da proteína triptase, que é considerada o marcador mais confiável para esta finalidade (PYZIAK et al., 2013). Em relação ao papel dos mastócitos nas neoplasias malignas, é reconhecido que esta população celular contribui para a angiogênese, a degradação da matriz extracelular e a modulação da resposta imunológica, os quais podem favorecer o crescimento tumoral. Por outro lado, as referidas células também exercem ações antitumorais, mediadas por citocinas como IL-1 e IL-6 (DYDUCH; KACZMARCZYK; OKOŃ, 2012). Também é relatado que possuem a capacidade de sintetizar fatores linfangiogênicos, tais como VEGF-C e VEGF-D (KUNDER; ST JOHN; ABRAHAM, 2011; CIMPEAN; RAICA, 2015; MARONE et al., 2015). Entretanto, até o momento, não há estudos na literatura sobre a influência dessas células na formação de vasos linfáticos em carcinoma epidermóide oral. Tendo em vista a contribuição da linfangiogênese no desenvolvimento das metástases nodais, que constituem indicadores de prognóstico do CEO, torna-se relevante identificar fatores envolvidos neste processo. Portanto, o objetivo desta pesquisa consistiu em avaliar a imunoexpressão da podoplanina e da triptase em uma série de casos de CELO, no intuito de investigar se os mastócitos influenciam a linfangiogênese nesta neoplasia. Adicionalmente, buscou-se estabelecer associações entre a expressão destes marcadores e os parâmetros clinicopatológicos do tumor, de modo a contribuir para uma maior compreensão do comportamento biológico da lesão estudada. 29 REVISÃO DA LITERATURA 30 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL 2.1.1 Considerações Gerais O câncer oral (CO) corresponde ao sexto tipo de neoplasia maligna mais comum (ZINI; CZERNINSKI; SGAN-COHEN, 2010), sendo considerado um importante problema de saúde pública em nível mundial (INCA, 2014). Apesar dos avanços no tratamento desta neoplasia, mais de 50% dos casos de CO registrados anualmente resultam em óbito, em razão de os pacientes serem diagnosticados, em sua maioria, nos estágios avançados da doença (LAMBERT et al., 2011; VARGAS-FERREIRA et al., 2012). Na América do Sul, o Brasil destaca-se como o país com a maior incidência de CO, sendo estimada uma proporção de 8,3 casos a cada 100.000 habitantes (MAROCCHIO et al., 2010). De acordo com dados epidemiológicos do Instituto Nacional do Câncer (INCA), o CO é a quarta neoplasia maligna mais frequente em homens e a nona em mulheres, sendo previstos, para o ano de 2014, 11.280 casos no sexo masculino e 4.010 casos no sexo feminino. No estado do Rio Grande do Norte, para cada 100.000 habitantes, 230 seriam acometidos pela neoplasia em 2014 (INCA, 2014). O carcinoma epidermóide, também denominado carcinoma espinocelular e carcinoma de células escamosas, consiste em uma neoplasia maligna originada do epitélio de revestimento (BATISTA et al., 2010) que corresponde a mais de 90% dos tumores malignos da cavidade oral (BAGAN; SARRION; JIMENEZ, 2010; LAMBERT et al., 2011; MATOS et al., 2012; RUBACK et al., 2012; MONTERO; PATEL, 2015). Conforme a definição da Organização Mundial da Saúde (OMS), o carcinoma epidermóide oral (CEO) caracteriza-se como uma neoplasia de crescimento invasivo, com variados graus de diferenciação escamosa e tendência a metástases linfonodais precoces (JOHNSON et al., 2005). Com relação à etiologia do CEO, é reconhecida a participação de múltiplos fatores extrínsecos e intrínsecos que atuam de forma associada. Os fatores extrínsecos compreendem o tabagismo, o consumo de álcool e as infecções por vírus oncogênicos, a exemplo do papiloma vírus humano (HPV). Por sua vez, os fatores intrínsecos incluem alterações 31 genéticas, deficiências nutricionais e imunológicas (SCULLY; BAGAN, 2009; ALBUQUERQUE et al., 2011; HILLBERTZ et al., 2012; PIRES et al., 2013). A carcinogênese oral é um processo complexo e multifásico, relacionado a alterações genéticas cumulativas, que podem ser espontâneas ou provocadas por agentes de natureza física, química ou biológica. Algumas destas alterações envolvem os proto-oncogenes, que sob o efeito de carcinógenos, tornam-se oncogenes ativos, promovendo a proliferação, o crescimento e a sobrevivência celular. Os genes supressores tumorais, por sua vez, codificam proteínas reguladoras do ciclo celular, prevenindo a formação de tumores. Eventuais deleções, mutações ou mecanismos de inativação destes genes resultam na proliferação celular autônoma, que podem contribuir para a transformação maligna (SCULLY; BAGAN, 2009). Alterações nos genes de reparo do DNA e genes reguladores da apoptose também são mencionadas na literatura como envolvidas na etiologia do CEO (HILLBERTZ et al., 2012). O tabagismo e o etilismo são reconhecidos como os principais fatores etiológicos do CEO (BATISTA et al., 2010; KAMINAGAKURA et al., 2010; WARNAKULASURIYA, 2010; VARGAS-FERREIRA et al., 2012; MONTERO; PATEL, 2015). O consumo do tabaco, seja inalado ou mascado, resulta na liberação de agentes químicos como as nitrosaminas e os hidrocarbonetos policíclicos, os quais exercem ação iniciadora e promotora na carcinogênese oral (HILLBERTZ et al., 2012). Considera-se que o risco para o desenvolvimento do CEO é dose-dependente e proporcional ao tempo de consumo do tabaco (PETTI, 2009; ALBUQUERQUE et al., 2011). O álcool etílico, embora não esteja relacionado à fase de iniciação da carcinogênese oral, potencializa os efeitos do tabaco (VARGAS-FERREIRA et al., 2012). Sabe-se que produtos do metabolismo enzimático do álcool, a exemplo do acetaldeído, bem como determinados componentes das bebidas alcoólicas, exercem múltiplos efeitos mutagênicos sobre as células do epitélio oral (PETTI, 2009; JOHNSON; JAYASEKARA; AMARASINGHE, 2011). Além disso, o etanol atua como solvente, por facilitar a passagem de carcinógenos provenientes do tabaco através do epitélio oral (LAMBERT et al., 2011; VARGAS-FERREIRA et al., 2012). Silva, Amaral e Bulhosa (2010) acrescentam que os efeitos carcinogênicos do álcool etílico dependem do tempo de consumo, das doses ingeridas da substância e de sua possível associação ao tabagismo. Exemplifica-se que indivíduos com histórico de tabagismo e etilismo apresentam risco 38 vezes maior para o desenvolvimento do CEO, em comparação aos que não possuem esses hábitos (WARNAKULASURIYA, 2010). 32 A exposição crônica à radiação solar ultravioleta (UV), principalmente ao subtipo UVB, é mencionada como o principal fator etiológico do carcinoma epidermóide de lábio (BATISTA et al., 2010). Segundo Ikehata e Ono (2011), os raios UV são capazes de promover mutações em genes relacionados aos processos de proliferação celular, apoptose e reparo do DNA. Dessa forma, indivíduos que desempenham atividades expostas ao sol, a exemplo dos trabalhadores rurais, apresentam suscetibilidade aumentada ao desenvolvimento do carcinoma epidermóide de lábio inferior (CELI) (JOHNSON; JAYASEKARA; AMARASINGHE, 2011). A infecção pelo HPV, que tem um papel reconhecido na etiopatogenia dos carcinomas de colo uterino (VARGAS-FERREIRA et al., 2012) e orofaringe (JOHNSON; JAYASEKARA; AMARASINGHE, 2011; LAMBERT et al., 2011), tem sido investigada como um possível fator etiológico do CEO. Dentre os numerosos subtipos do vírus, o HPV-16 destaca-se como o mais frequentemente detectado em casos desta neoplasia. Presume-se que a ação oncogênica do referido vírus esteja relacionada às proteínas E6 e E7, por ele codificadas. E6 e E7 ligam-se, respectivamente, às proteínas supressoras tumorais p53 e pRb, e promovem sua inativação, consequentemente levando à perda do controle do ciclo celular (HILLBERTZ et al., 2012), dos mecanismos de apoptose e reparo do DNA (VARGAS-FERREIRA et al., 2012). De acordo com o conceito de vigilância imunológica, proposto por Macfarlane Burnet, o sistema imune possui a capacidade de reconhecer e eliminar clones de células malignas, contribuindo para prevenir a formação e o crescimento de tumores (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015). Desta forma, a redução da capacidade do sistema imunológico, que se verifica em condições como a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) e terapias imunossupressoras para transplantes de órgãos, contribui para o aumento da suscetibilidade ao desenvolvimento do CEO, possivelmente pelo prejuízo na função de vigilância (SILVA; AMARAL; BULHOSA, 2010). A qualidade da dieta também é reconhecida como um fator envolvido na etiologia do câncer oral. Sabe-se que as vitaminas A, C, E, carotenóides e sais de selênio contribuem para o funcionamento adequado do sistema imunológico, para a inibição da proliferação celular e da síntese endógena de carcinógenos, além de atuarem como antioxidantes. Sendo assim, o consumo de frutas frescas e vegetais, que constituem fontes destes nutrientes, exerce um papel protetor, reduzindo o risco de desenvolvimento de lesões potencialmente malignas e do CEO (AMARASINGHE et al., 2013). 33 De forma geral, o CEO acomete predominantemente indivíduos do sexo masculino, a partir da quinta década de vida, com histórico de tabagismo e consumo de álcool. Embora ocorra predileção por homens, tem sido reportado um aumento da incidência do CEO no sexo feminino (JOHNSON; JAYASEKARA; AMARASINGHE, 2011). Para alguns autores (MAROCCHIO et al., 2010; RUBACK et al., 2012; PIRES et al., 2013), tal fenômeno pode ser o resultado de mudanças no comportamento feminino, tais como a incorporação dos hábitos de tabagismo e etilismo. No que concerne à localização anatômica, alguns estudos apontam que as lesões de CEO apresentam predileção pela língua (LAMBERT et al., 2011; MATOS et al., 2012; VARGAS-FERREIRA et al., 2012; HERNÁNDEZ-GUERRERO et al., 2013; VASCONCELOS et al., 2014), mas pode haver acometimento de outras regiões, tais como o assoalho bucal, palato duro e gengiva (BATISTA et al., 2010; MAROCCHIO et al., 2010). Contudo, são relatadas variações geográficas, que refletem diferenças na exposição aos fatores de risco. Em países asiáticos, por exemplo, o sítio intraoral mais afetado é a mucosa jugal, o que pode representar uma consequência dos hábitos de mascar tabaco e betel, amplamente difundidos nestas localidades (HERNÁNDEZ-GUERRERO et al., 2013). Por outro lado, um estudo epidemiológico realizado em Israel (ZINI; CZERNINSKI; SGAN- COHEN, 2010) revelou maior acometimento do lábio inferior, possivelmente como resultado da intensa exposição solar relatada nesta população. Em relação ao CELO, o mesmo estudo identificou as bordas laterais como as regiões afetadas, que corresponderam a 75% das lesões envolvendo este sítio anatômico. Marocchio et al. (2010) conduziram um estudo retrospectivo da incidência do CEO em uma população brasileira, através da análise de 1.564 casos diagnosticados em serviço de referência em Patologia Oral. Os resultados revelaram maior acometimento de pacientes com idade entre 50 e 60 anos (26,9%), do sexo masculino (74%), sendo verificada uma proporção homem: mulher de aproximadamente 3:1. As lesões de CEO foram diagnosticadas com maior frequência na gengiva (23,1%), assoalho bucal (14,6%) e bordas laterais de língua (14,2%). Os autores destacaram ainda que, no decorrer dos últimos anos analisados no estudo, houve um aumento da frequência de lesões diagnosticadas com menor tamanho e tempo de evolução, sugerindo uma tendência crescente ao diagnóstico precoce do CEO. Em outro estudo realizado no Brasil, Pires et al. (2013) analisaram dados epidemiológicos de 346 casos de CEO diagnosticados em um serviço de referência em patologia oral no período de 2005 a 2012. Foi evidenciado um maior acometimento de pacientes do sexo masculino (67%), na quinta à sexta década de vida (46%). A língua foi o 34 principal sítio anatômico envolvido, em particular, nas bordas laterais (37%). Adicionalmente, os autores constataram uma elevada freqüência de tabagismo (80,1%) e consumo de álcool (70,2%) na amostra estudada, enaltecendo a relevância destes hábitos como fatores de risco do CEO. Em pesquisa realizada no México, Hernández-Guerrero et al. (2013) avaliaram 531 casos de CEO, diagnosticados em um hospital de referência no período de 1990 a 2008. Foi relatada uma discreta predileção do CEO pelo sexo masculino (58,4%), com predomínio de pacientes a partir da quinta década de vida (88,3%). As localizações anatômicas mais acometidas foram a língua (44,7%), os lábios (21,2%) e a gengiva (20,5%). Nas últimas décadas, vem sendo constatado um aumento significativo da prevalência do CEO em indivíduos com idade inferior a 40 anos (KAMINAGAKURA et al., 2010; ALBUQUERQUE et al., 2011). Conforme destacam Johnson, Jayasekara e Amarasinghe (2011), uma parcela significativa deste grupo etário relata pouco tempo de exposição ao tabagismo e etilismo, ou ainda, a ausência destes hábitos. Assim sendo, sugerem o envolvimento de outros fatores de risco em pacientes jovens, a exemplo da infecção pelo HPV e da predisposição genética. Matos et al. (2012) acrescentam que existem controvérsias acerca do comportamento do CEO em diferentes faixas etárias, sendo sugerido na literatura que a neoplasia apresenta um curso clínico mais agressivo nos jovens, em comparação aos pacientes mais velhos. Visando contribuir para um maior entendimento acerca desta neoplasia em jovens, um estudo caso-controle conduzido por Kaminagakura et al. (2010) avaliou 375 casos de CEO diagnosticados e tratados em um hospital de referência de São Paulo, Brasil. Na análise comparativa de um grupo de pacientes jovens, com idade máxima de 40 anos (n=125) e outro com indivíduos com idade superior a 50 anos, foi constatado um maior índice de recidivas nos pacientes jovens (p<0,05). Por outro lado, não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos estudados, em relação à taxa de sobrevida global em 5 anos. Em estudo recente, Fang et al. (2014) avaliaram aspectos clinicopatológicos do CEO em uma população da China, comparando um grupo de pacientes com idade máxima de 40 anos (n=15) e outro grupo constituído por indivíduos com mais de 40 anos (n=161). Foi constatado que, em comparação aos pacientes mais velhos, o grupo de jovens apresentou uma maior frequência de mulheres, sem histórico de tabagismo e etilismo. Assim, os autores sugeriram o envolvimento de outros fatores de risco neste grupo de pacientes. Adicionalmente, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos, no que concerne à gradação histológica de malignidade e à taxa de sobrevida global em 5 anos. Com 35 base nestes achados, os autores também concluíram que o prognóstico do CEO em pacientes jovens aparentemente não difere daquele observado em indivíduos com idade superior a 40 anos. O carcinoma epidermóide oral manifesta-se em padrões clínicos diversos, que variam de acordo com o estágio de progressão da doença. Em fases precoces, a neoplasia surge como uma lesão leucoplásica, eritroplásica ou eritroleucoplásica, geralmente sem sintomatologia dolorosa. Em fases mais avançadas, manifesta-se como uma lesão ulcerada de crescimento endofítico, com bordas elevadas e aspecto irregular, ou ainda, como uma massa exofítica exuberante, com superfície papilífera e coloração branca a vermelha (SILVA; AMARAL; BULHOSA, 2010). Outros possíveis sinais e sintomas incluem hemorragia, mobilidade dentária, disfagia, perda de peso, dificuldades na respiração e na fonação. Ressalta-se que a ausência de sintomatologia, comum nas lesões iniciais, contribui para que os pacientes demorem na procura por cuidados profissionais, sendo diagnosticados em estágios avançados da doença (BAGAN; SARRION; JIMENEZ, 2010). Do ponto de vista histopatológico, o CEO é caracterizado como uma proliferação de células epiteliais malignas, com graus variados de diferenciação escamosa (JOHNSON et al., 2005; SILVEIRA et al., 2007), exibindo pleomorfismo celular e nuclear, hipercromatismo, nucléolos proeminentes, aumento da relação núcleo-citoplasma, ceratinização individual e figuras de mitose, algumas das quais atípicas. Estas células malignas invadem o tecido conjuntivo subjacente, dispondo-se ora isoladamente, ora na forma de ilhas e cordões. É possível verificar, ainda, a presença de pérolas de ceratina, invasão angiolinfática, perineural e muscular, além de infiltrado inflamatório predominantemente linfocítico no estroma tumoral. (WOOLGAR; TRIANTAFYLLOU, 2011). O tratamento do CEO baseia-se na excisão cirúrgica com margens de segurança, compreendendo tecido sadio. Em alguns casos, particularmente nos estágios avançados da doença, a terapêutica cirúrgica pode ser associada à radio e/ou quimioterapia, com a finalidade de reduzir o volume tumoral (NOGUTI et al., 2012). Ressalta-se que, nos casos diagnosticados em estágios tardios, torna-se necessária a instituição de medidas terapêuticas mais agressivas, o que pode causar danos estéticos, funcionais e psicológicos (LAMBERT et al., 2011), além de comprometer a sobrevida dos pacientes (SILVA; AMARAL; BULHOSA, 2010). De acordo com Noguti et al. (2012), o desenvolvimento de metástases constitui um processo complexo que envolve perda de adesão entre as células neoplásicas, regulação da mobilidade celular e invasão, proliferação celular e transporte através dos vasos sanguíneos e 36 linfáticos. A presença de metástases em linfonodos regionais representa o mais importante indicador de prognóstico do CEO (VASCONCELOS et al., 2014; MONTERO; PATEL, 2015), reduzindo de forma significativa o tempo de sobrevida dos pacientes. O sistema de estadiamento clínico TNM, indicado para a classificação dos tumores malignos, foi desenvolvido entre os anos de 1943 e 1952 por Pierre Denoix. Na década de 1950, a União Internacional Contra o Câncer (UICC) e a Organização Mundial da Saúde (OMS) nomearam comitês para o aprimoramento deste sistema, o qual se encontra na sexta edição (SOBIN; WITTEKIND, 2002). Trata-se de um parâmetro amplamente aceito como indicador de agressividade dos CEOs, que representa uma ferramenta útil para a predição do prognóstico e o planejamento terapêutico (LOURENÇO et al., 2007; KREPPEL et al., 2010; NOGUTI et al., 2012; MONTERO; PATEL, 2015). Na classificação dos tumores malignos pelo sistema TNM, são analisados os critérios: tamanho do tumor primário (T), grau de envolvimento de linfonodos locais (N) e presença ou ausência de metástases à distância (M) (ARAÚJO JÚNIOR et al., 2008; KREPPEL et al., 2010; LAMBERT et al., 2011; NOGUTI et al., 2012), sugerindo-se que esta análise seja feita antes e após a ressecção cirúrgica (KREPPEL et al., 2010). Por meio da quantificação destes parâmetros, os tumores são classificados em estágios que variam do I ao IV. Considera-se que os estágios tardios (III e IV) estão relacionados a um pior desfecho clínico em comparação aos estágios I e II (ARAÚJO JÚNIOR et al., 2008; NOGUTI et al., 2012). Corroborando a associação entre o TNM e o prognóstico do CEO, o estudo de Kreppel et al. (2010) reportou taxa de sobrevida em 5 anos correspondente a 82,9% para os pacientes no estágio I, ao passo que, nos casos diagnosticados no estágio IVa, a sobrevida global em 5 anos foi estimada em 34,3%. A despeito do valor prognóstico do sistema de estadiamento TNM, Brandwein- Gensler et al. (2005) declaram que o curso clínico do CEO é imprevisível. Os autores mencionam que alguns casos de CEO diagnosticados em estágios iniciais (I e II), ainda que tratados de forma adequada, evoluem rapidamente para o óbito, não condizendo com a indicação clínica do TNM. Nesse sentido, diversos sistemas de gradação histológica de malignidade (SGHMs) têm sido propostos, com a finalidade de gerar subsídios morfológicos para a interpretação da agressividade do tumor, auxiliando na escolha do tratamento (VASCONCELOS et al., 2014). Em 1920, Broders propôs um SGHM baseando-se no parâmetro de diferenciação celular. Neste método, os espécimes de CEO foram classificados de forma semiquantitativa de acordo com o percentual de células indiferenciadas, em grau I (até 25% de células 37 indiferenciadas); grau II (26% a 50% de indiferenciação); grau III (51% a 75% de células indiferenciadas) e grau IV (indiferenciação em 76% a 100% do tumor). Posteriormente, Anneroth, Batsakis e Luna (1987) elaboraram o Sistema de Gradação Multifatorial, indicado exclusivamente para a análise de espécimes cirúrgicos de CEO. Os referidos autores adotaram critérios morfológicos relacionados à população celular tumoral e ao hospedeiro, conforme sugerido no método de Jakobsson et al. (1973) para a avaliação de carcinomas de laringe. Desta forma, os parâmetros propostos no Sistema de Gradação Multifatorial consistiram em: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear e número de mitoses (relativos ao tumor), além do padrão de invasão, estágio de invasão e resposta inflamatória (relativos ao hospedeiro). Bryne et al. (1989), baseando-se em modificações do Sistema de Gradação Multifatorial, introduziram um novo método de gradação histológica de malignidade para o CEO (Sistema de Gradação das Margens Invasivas), em que foi excluído o parâmetro estágio de invasão. De forma similar à classificação de Anneroth, Batsakis e Luna (1987), são atribuídos escores para cada um dos critérios morfológicos propostos (grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, número de mitoses, padrão de invasão e intensidade do infiltrado inflamatório), que uma vez somados, fornecem o grau de malignidade da lesão. Além disso, foi sugerido que as células neoplásicas situadas nas margens invasivas do tumor possuem maior tendência a sofrer metástases em comparação às células de outras áreas, sendo determinantes para o comportamento biológico do CEO. Em 1992, o Sistema de Gradação das Margens Invasivas foi simplificado, com a remoção do parâmetro número de mitoses. As justificativas para esta alteração foram o alto nível de discordância entre os examinadores, bem como a heterogeneidade dos tumores, nos quais as características morfológicas podem variar conforme o campo microscópico analisado. Também foi estabelecido que, para uma gradação histológica adequada, os espécimes de CEO deveriam ser avaliados em áreas representativas da lesão, apresentando dimensões mínimas de 15 mm x 5 mm x 5 mm (BRYNE et al., 1992). Reiterando a importância das margens invasivas no CEO, Bryne (1998) afirmou que a interface tumor-hospedeiro é sede de vários eventos biológicos relevantes para o comportamento da neoplasia, a exemplo da angiogênese, aumento da proliferação celular, alterações em moléculas de adesão e secreção de enzimas proteolíticas. Ademais, as células da referida região apresentam-se menos diferenciadas e com maior grau de dissociação, se comparadas a outras áreas do tumor. Dessa forma, as margens invasivas, desde então descritas 38 como front de invasão, podem fornecer informações adicionais acerca do comportamento biológico do CEO. O sistema de gradação histológica introduzido pela OMS (CARDESA et al., 2005) fundamentou-se no grau de diferenciação celular, classificando os espécimes de CEO em três categorias. Conforme este método, as lesões bem diferenciadas exibem arquitetura tecidual semelhante a um padrão normal de epitélio escamoso. Por sua vez, as lesões moderadamente diferenciadas apresentam certo grau de pleomorfismo nuclear, atividade mitótica e ceratinização discreta. Já as lesões pouco diferenciadas, caracterizam-se pelo predomínio de células imaturas, numerosas mitoses típicas e atípicas e mínima ceratinização. Lourenço et al. (2007) destacam que, com o uso deste sistema de gradação, existe a tendência dos tumores serem classificados, em sua maioria, como moderadamente diferenciados. A partir de um estudo retrospectivo de 292 casos de CEO, Brandwein-Gensler et al. (2005) propuseram a Avaliação Histopatológica de Risco, um SGHM fundamentado na análise de três parâmetros morfológicos na interface tumor-hospedeiro: invasão perineural, infiltrado linfocítico e pior padrão de invasão. Nessa metodologia, atribuem-se escores numéricos para cada um dos critérios histopatológicos, que são somados, de forma a se obter o escore de risco. Com base na pontuação obtida, os pacientes são classificados em baixo, intermediário e alto risco no que concerne às variáveis de desfecho clínico (recorrência local e sobrevida total). Como demonstrado pelos autores, casos de CEO com elevados escores de risco apresentam maior potencial para recidivas locais e menor taxa de sobrevida global, em relação a casos com menores pontuações de risco. Apesar de existirem numerosos estudos acerca de parâmetros morfológicos no CEO, a utilização dos SGHMs como marcadores de agressividade permanece como uma questão controversa (MATOS et al., 2012). Para Vasconcelos et al. (2014), a interpretação dos parâmetros microscópicos possui caráter subjetivo, o que pode justificar os resultados divergentes destes estudos. 2.1.2 Carcinoma Epidermóide de Língua: Indicadores de Prognóstico A respeito do CEO, considera-se que as lesões diagnosticadas em língua possuem prognóstico desfavorável, em decorrência de seu alto potencial invasivo e tendência a metástases linfonodais regionais (VASCONCELOS et al., 2014; MONTERO; PATEL, 2015). 39 Em 33% a 53% dos casos de CELO, verifica-se a presença de linfonodos cervicais metastáticos no momento do diagnóstico. A elevada frequência de metástases deve-se, em parte, ao rico suprimento de vasos linfáticos e feixes vásculo-nervosos nesse sítio anatômico (MATOS et al., 2012). Araújo Júnior et al. (2008), em análise retrospectiva de 130 casos de CEO, encontraram associação estatisticamente significativa entre a localização anatômica e o estadiamento clínico TNM, havendo predomínio das lesões de CELO nos estágios tardios (III e IV), e dos casos de CELI no estágio I (p<0,05). Adicionalmente, os autores verificaram correlação entre o estadiamento clínico TNM e o desfecho clínico da doença (p<0,05). Weijers et al. (2009) investigaram o valor prognóstico dos SGHMs propostos por Broders (1920) e Anneroth, Batsakis e Luna (1987), em uma amostra de 128 casos de CELO e assoalho bucal, diagnosticados nos estágios TNM I e II e tratados exclusivamente por excisão cirúrgica. Nesta pesquisa, não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas entre os referidos sistemas de classificação histopatológica e as variáveis de desfecho clínico (metástase regional, recidiva local e taxa de sobrevida em 5 anos). De posse destes resultados, os autores sugeriram que os sistemas de gradação estudados não são válidos como indicadores de prognóstico dos pacientes. Em uma análise retrospectiva de 30 casos de CELO, Silveira et al. (2007) investigaram possíveis associações entre a gradação histológica de malignidade e os parâmetros clínicos: estadiamento TNM, presença/ausência de metástases e o desfecho da doença (remissão/óbito). Para a avaliação morfológica, foi utilizada uma adaptação do sistema de gradação de malignidade de Bryne (1998), classificando como “baixo grau de malignidade” os casos com escores entre 4 e 8, e como “alto grau de malignidade”, aqueles com escores superiores a 8. Não foram verificadas associações estatisticamente significativas entre a gradação histológica e as variáveis clínicas, sendo sugerido pelos autores que o método empregado no estudo morfológico não é confiável para a predição do prognóstico da doença. Contudo, o estadiamento TNM e a ocorrência de metástases apresentaram associações significativas com o desfecho da doença, revelando-se eficientes marcadores de agressividade do CELO. Vasconcelos et al. (2014) avaliaram as características clinicopatológicas do CELO em 57 pacientes atendidos em um hospital de referência do Rio Grande do Norte, Brasil, com o propósito de esclarecer a associação entre estes parâmetros e o prognóstico da lesão. Na análise morfológica, os autores utilizaram uma metodologia semelhante à descrita por Silveira et al. (2007) e verificaram associação significativa entre a gradação histológica de 40 malignidade e o estadiamento clínico TNM. Contudo, o sistema de gradação avaliado não demonstrou relação com a ocorrência de metástases em linfonodos regionais e o desfecho clínico da doença. Por sua vez, o sistema TNM foi associado à ocorrência de metástases nodais, mas não ao desfecho clínico da doença. Dessa forma, os autores sugeriram que a gradação histológica, em associação ao estadiamento clínico, constituem parâmetros úteis para a compreensão do comportamento biológico do CELO, exercendo grande influência sobre o prognóstico dos pacientes. Matos et al. (2012) analisaram os parâmetros morfológicos e o escore de risco do SGHM proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005), em espécimes de CELO com metástases regionais (n=35) e isentos de metástases (n=27). Os autores não encontraram associação significativa entre o padrão de invasão e a presença de metástases nodais. Entretanto, os outros critérios morfológicos (invasão perineural e infiltrado linfocítico), bem como o escore de risco, relacionaram-se de forma significativa com a ocorrência de metástases (p<0,05), enaltecendo a relevância destes parâmetros como indicadores de agressividade do CELO. 2.2 LINFANGIOGÊNESE O sistema vascular linfático exerce um papel essencial no funcionamento das respostas imunológicas. Os antígenos microbianos que entram no organismo através da pele e das mucosas são capturados e processados pelas células dendríticas, as quais migram através dos vasos linfáticos e alcançam os linfonodos de drenagem, onde apresentam os antígenos às células T e B, possibilitando a expansão clonal e diferenciação das células efetoras (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015). Os vasos linfáticos também possuem grande importância na manutenção do equilíbrio hídrico corporal, na medida em que drenam o fluido e as macromoléculas dos tecidos para a circulação sanguínea (KARPANEN; ALITALO, 2008; WANG; OLIVER, 2010). Do ponto de vista estrutural, a rede vascular linfática diferencia-se da sanguínea em vários aspectos. Os capilares linfáticos, em comparação aos sanguíneos, possuem paredes mais delgadas e lúmens mais amplos, que tendem a entrar em colapso em condições de baixa pressão intersticial (ALBRECHT; CHRISTOFORI, 2011). Adicionalmente, são formados por uma única camada de células endoteliais, exibindo lâmina basal descontínua e com ausência 41 de pericitos, o que explica, em parte, a sua maior permeabilidade (WANG; OLIVER, 2010). Por fim, apresentam-se unidos à matriz extracelular por meio de fibras reticulares. Com o aumento do fluido intersticial, tais fibras distendem-se, ampliando o lúmen vascular e provocando o afastamento das células endoteliais. Como resultado, abrem-se espaços intercelulares, por meio dos quais ocorre a passagem de fluido intersticial para o interior dos vasos (BALUK et al., 2007). A formação da vasculatura linfática está relacionada a fenômenos ainda não completamente compreendidos. Durante a fase pré-natal, as células endoteliais venosas passam a expressar proteínas relacionadas ao desenvolvimento e função dos vasos linfáticos, a exemplo de LYVE-1, PROX-1 e VEGFR-3. Sob a ação do VEGF-C secretado pelos tecidos adjacentes, as referidas células migram, proliferam e formam sacos linfáticos primários, a partir dos quais germinam os vasos linfáticos. Com a germinação, originam-se plexos vasculares que se separam dos vasos sanguíneos, sofrem remodelação e maturação, originando a rede vascular linfática, a qual é constituída de uma rede capilar linfática e vasos linfáticos coletores (BALUK et al., 2007; KARPANEN; ALITALO, 2008). Durante a maturação do sistema linfático, Albrecht e Christofori (2011) destacam a contribuição de moléculas como podoplanina, angiopoietina-2, neutropilina-2 e efrina B2, além de vários fatores de transcrição. Também é sugerido que, no desenvolvimento embrionário, células mesenquimais precursoras sofrem diferenciação em células endoteliais linfáticas, assim contribuindo para a linfangiogênese (KARPANEN; ALITALO, 2008). Nos tecidos adultos em condições de normalidade, as células endoteliais são mantidas em estado de quiescência, que resulta da ação simultânea de fatores pró-linfangiogênicos, tais como VEGF-C e VEGFR-3, e anti-linfangiogênicos, a exemplo do fator transformador de crescimento-β (TGF-β) (MARTINS, 2012). Em quadros patológicos como doenças inflamatórias, reparo tecidual e crescimento de neoplasias malignas, os vasos linfáticos desenvolvem-se a partir de vasos pré-existentes, sob o estímulo de fatores pró- linfangiogênicos, crescendo ao longo do trajeto dos vasos sanguíneos (MARONE et al., 2015). O fenômeno de linfangiogênese em neoplasias malignas ainda não está completamente compreendido. Sugere-se que, em condições de hipóxia, as células do parênquima e do estroma tumoral são estimuladas a expressar fatores de crescimento, tais como os membros das famílias VEGF, FGF, PDGF e as angiopoietinas, contribuindo para a formação de novos vasos sanguíneos. Além de exercerem efeitos angiogênicos, as referidas moléculas aumentam a expressão de VEGF-C e VEGF-D, os quais estimulam a linfangiogênese. Os vasos 42 linfáticos neoformados, oriundos do brotamento de vasos pré-existentes, apresentam-se distribuídos nos ambientes intra e peritumoral (ALBRECHT; CHRISTOFORI, 2011). Os vasos linfáticos associados aos tumores malignos contribuem sobremaneira para o desenvolvimento das metástases, na medida em que funcionam como vias de disseminação das células neoplásicas, as quais ganham acesso à circulação linfática e são transportadas para linfonodos e órgãos distantes do tumor primário. Assim sendo, com o aumento do número de vasos linfáticos, eleva-se a possibilidade de as células malignas alcançarem a circulação linfática. Ademais, os vasos sanguíneos formados no ambiente tumoral tendem a ser imaturos e frágeis, resultando em uma elevada pressão do fluido intersticial e aumento da drenagem linfática, o que facilita o acesso das células neoplásicas aos vasos linfáticos. Acrescenta-se que os vasos linfáticos expressam diversas moléculas envolvidas na quimiotaxia e transporte de células do sistema imune, residentes nos tecidos periféricos, em direção aos linfonodos. As células malignas podem beneficiar-se destas propriedades, destacando-se do tumor primário e alcançando a circulação linfática (ALBRECHT; CHRISTOFORI, 2011). Nas pesquisas relacionadas à linfangiogênese tumoral, os vasos linfáticos podem ser identificados por meio de imuno-histoquímica, mediante a utilização de anticorpos capazes de reconhecer proteínas expressas pelas células endoteliais linfáticas, a exemplo do VEGFR-3, LYVE-1, PROX-1, desmoplaquina e podoplanina (VAN DER AUWERA et al., 2006; ALBRECHT; CHRISTOFORI, 2011). A podoplanina consiste em uma glicoproteína transmembranar de 38 kDa, constituída por 162 aminoácidos, sendo que nove destes compõem o domínio intracelular (WICKI; CHRISTOFORI, 2007). Desempenha funções biológicas variadas, que incluem a motilidade celular, regulação do desenvolvimento do sistema linfático, progressão tumoral e metástases (ASTARITA; ACTON; TURLEY, 2012). Considerando os diversos marcadores de células endoteliais, a referida proteína é expressa seletivamente no endotélio linfático, mas não em vasos sanguíneos, o que justifica a sua aplicabilidade na identificação e análise quantitativa de vasos linfáticos (VAN DER AUWERA et al., 2006). Além disso, a imunomarcação com anticorpos anti-podoplanina possibilita o reconhecimento de vasos linfáticos em tumores vasculares benignos e malignos, podendo assim contribuir para o diagnóstico dessas lesões (ORDÓÑEZ, 2006). A despeito da confiabilidade da podoplanina como marcador de células endoteliais linfáticas, há de se destacar que a referida proteína é expressa por diversos outros tipos celulares, a exemplo dos podócitos renais, ceratinócitos basais da pele e mucosas, células mioepiteliais, células alveolares tipo I, células glandulares mamárias, miofibroblastos, 43 condrócitos e células ependimais. A imunoexpressão da podoplanina também foi evidenciada em neoplasias malignas de localizações anatômicas variadas, incluindo os carcinomas de pele, cavidade oral e pulmão (ZUSTIN; SCHEUER; FRIEDRICH, 2010). Além da podoplanina, as células endoteliais linfáticas expressam uma sialoglicoproteína homóloga de 40 kDa, denominada M2A (SCHACHT et al., 2005; ZHAO et al., 2008). O anticorpo monoclonal D2-40, por possuir a capacidade de reconhecer a podoplanina e a M2A, inclusive nos tecidos emblocados em parafina, tem sido bastante utilizado em estudos imuno-histoquímicos acerca da linfangiogênese tumoral (SCHACHT et al., 2005). O principal método aplicado para o estudo da linfangiogênese consiste na mensuração da densidade linfática (DL) (VAN DER AUWERA et al., 2008). De forma análoga à determinação da densidade microvascular (DM) proposta por Weidner et al. (1991), identificam-se as três áreas do espécime com maior vascularização, sob microscopia de luz, em aumentos de 40x e 100x. Posteriormente, realiza-se a contagem de microvasos em cada área selecionada, sob aumento de 200x. O valor final, denominado DL alta, representa o maior número de microvasos em uma das áreas (microvasos/mm 2 ). Acrescenta-se que, na mensuração da DL, as células endoteliais linfáticas isoladas, bem como os grupos destas células, com ou sem lúmen evidente, são contabilizados como microvasos. Em 1998, Schor et al. propuseram a técnica de DM média, na qual é realizada a contagem de microvasos em 10 a 15 campos microscópicos aleatórios, sob aumento de 200x. Com a soma dos valores obtidos, calcula-se o valor médio de microvasos por campo microscópico, expressando o resultado como a média de microvasos ± desvio padrão. Diversos estudos têm avaliado a expressão imuno-histoquímica do D2-40 em neoplasias malignas, incluindo os carcinomas de mama (ZHAO et al., 2012), pulmão (JIN et al., 2012), estômago (WANG et al., 2010) e cavidade oral (ZHAO et al., 2008; SOUSA et al., 2012). De forma geral, estas pesquisas evidenciaram correlações positivas entre a DL e os parâmetros clinicopatológicos dos tumores, incluindo as metástases linfonodais regionais. Kyzas et al. (2005) avaliaram a DL por meio de imunomarcação com o anticorpo D2- 40, bem como a proliferação endotelial linfática, através de dupla marcação D2-40/Ki-67, em carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço (n=81). A amostra estudada apresentou elevados valores de DL intra e peritumoral, que revelaram associação estatisticamente significativa com a presença de metástases nodais (p<0,05). Adicionalmente, foi evidenciada correlação significativa entre a DL intratumoral e a invasão linfática (p<0,05), que ocorreu principalmente nos vasos duplamente imunopositivos para D2-40 e Ki-67. Com base nesses 44 achados, os autores sugeriram que a mensuração da DL intratumoral poderia ser utilizada como um parâmetro relacionado ao prognóstico do CEO. Longatto Filho et al. (2007), com o propósito de estudar a relação entre a DL (intra e peritumoral) e a ocorrência de metástases nodais, metástases à distância, além do prognóstico dos pacientes, avaliaram a imunoexpressão do D2-40 em espécimes de CEO (n=31). Para a mensuração da DL, adaptaram o método proposto por Weidner et al. (1991), definindo a área intratumoral como o estroma dentro de dois ou mais agregados neoplásicos e, a área peritumoral, como o tecido estromal em torno destas massas neoplásicas. Verificaram que, de forma genérica, os vasos linfáticos intratumorais exibiram estruturas mais desorganizadas que os peritumorais, semelhante ao visto por Albrecht e Christofori (2011). A DL peritumoral revelou associação significativa com a invasão linfática e o tempo de sobrevida (p<0,05). Contudo, a imunorreatividade das células tumorais ao D2-40 não demonstrou associação estatística com os parâmetros de agressividade do tumor (p>0,05). Diante destes achados, os autores sugeriram que a DL é um importante marcador prognóstico para o CEO. Visando melhor compreender a relação entre a linfangiogênese tumoral e os parâmetros clinicopatológicos do CEO, Zhao et al. (2008) estudaram a expressão imuno- histoquímica do D2-40 em 86 casos da referida neoplasia. Nesta pesquisa, os autores avaliaram a DL nas regiões intra e peritumoral conforme o método de Weidner et al. (1991), além da invasão linfática. Os resultados revelaram associação estatística entre a DL (intra e peritumoral) e a presença de metástases nodais no momento do diagnóstico (p<0,05). Além disso, o aumento da DL intratumoral apresentou associação significativa com a maior incidência de invasão linfática (intra e peritumoral) e com a recidiva do tumor (p<0,05). Dessa forma, os autores enfatizaram o papel dos vasos linfáticos intratumorais como vias de disseminação das células malignas, sugerindo que a mensuração da DL intratumoral poderia ser útil na avaliação do prognóstico dos pacientes portadores de CEO. Em estudo de 30 casos de CELO, com a finalidade de identificar fatores relacionados ao desenvolvimento de metástases cervicais, Okada (2010) analisou a DL com o uso do anticorpo D2-40, bem como a gradação histológica de malignidade, seguindo os critérios morfológicos de Anneroth, Batsakis e Luna (1987). Também avaliou a invasão linfática, por meio da identificação de células epiteliais malignas no interior dos vasos linfáticos, através de imunomarcação com o anticorpo AE1/AE3. Nesta pesquisa, não houve associação estatística entre a DL e a ocorrência de metástases cervicais. Entretanto, a invasão linfática e a gradação histológica de malignidade, conforme o sistema avaliado nesta pesquisa revelaram-se fatores 45 preditivos da ocorrência de metástases regionais, o que reforça a importância destes parâmetros para o prognóstico dos pacientes. Martins (2012) analisou as densidades linfáticas intra e peritumoral em espécimes de CELI (n=50), comparando 25 casos com metástases nodais regionais e 25 isentos de metástases. Neste estudo, foi avaliada a imunomarcação do D2-40 em 5 campos microscópicos no centro tumoral e 5 no front de invasão, sob aumento microscópico de 200x, seguindo uma adaptação da metodologia de Kyzas et al. (2006). As densidades linfáticas intra e peritumoral não demonstraram associações significativas com o estadiamento clínico TNM e as gradações histológicas de malignidade propostas por Bryne (1998) e pela OMS (CARDESA et al., 2005). Além disso, os casos metastáticos e não-metastáticos não revelaram diferenças estatisticamente significativas no que concerne à DL intra e peritumoral, sendo sugerido pela autora que a ocorrência de metástases nodais no CELI não está relacionada ao aumento do número de vasos linfáticos. Na pesquisa de Sousa et al. (2012), foi analisada a DL em uma série de casos de CEO (n=36) e nos linfonodos associados, com o uso do anticorpo D2-40. Os autores evidenciaram uma relação estatisticamente significativa entre a DL total e a localização anatômica dos tumores, verificando maior número de vasos linfáticos nos espécimes de língua e assoalho bucal (p<0,05). Além disso, os linfonodos metastáticos apresentaram maiores valores de DL em relação aos não-metastáticos, corroborando a influência da linfangiogênese no desenvolvimento de metástases. Por fim, a imunoexpressão da podoplanina no front invasivo do tumor revelou associação significativa com o grau histológico de malignidade, avaliado conforme o sistema de Bryne et al. (1992). Frente aos resultados obtidos, os autores sugeriram que a referida proteína poderia desempenhar um importante papel na progressão do CEO. 2.3. MASTÓCITOS Os mastócitos constituem células provenientes da medula óssea, que são liberadas para a circulação sanguínea como células progenitoras (WELLER et al., 2011). Podem ser encontrados em diversos tecidos, geralmente nas proximidades de vasos sanguíneos, nervos, sítios de inflamação e neoplasmas (ZAIDI; MALLICK, 2014). Têm como principal função o armazenamento de mediadores químicos da resposta inflamatória em grânulos secretores, 46 participando de forma significativa nas reações alérgicas e na defesa contra parasitas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013). Em 1878, Paul Ehrlich identificou e descreveu os mastócitos pela primeira vez, enfatizando o seu conteúdo de grânulos citoplasmáticos e reações tintoriais (WELLER et al., 2011). Do ponto de vista morfológico, as referidas células medem de 8 a 20 µm de comprimento, exibem formato redondo a alongado e armazenam numerosos grânulos metacromáticos (RIBATTI; CRIVELLATO, 2012). Os núcleos são esféricos, pequenos e frequentemente recobertos pelos grânulos secretores, o que dificulta a sua observação (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013). Os grânulos secretores ligados à membrana representam as organelas citoplasmáticas mais características dos mastócitos, apresentando-se constituídos por um elevado conteúdo de proteases, a exemplo da triptase, quimase, catepsina C, catepsina G e carboxipeptidase A3. Além dessas enzimas, também são encontrados fatores de crescimento, citocinas e histamina, embebidos em uma matriz de glicosaminoglicanos (RIBATTI; RANIERI, 2015). Adicionalmente, verifica-se no citoplasma a presença de corpos lipídicos, nos quais são armazenados os produtos do metabolismo do ácido araquidônico. Na superfície celular, os mastócitos expressam um receptor de alta afinidade por anticorpos IgE (FcεRI), que desempenha um papel fundamental nas reações alérgicas (RIBATTI; CRIVELLATO, 2012). Após serem geradas na medula óssea, as células precursoras dos mastócitos são recrutadas para os tecidos periféricos, onde proliferam e completam a sua diferenciação (SOUZA-FREITAS et al., 2011). A migração dessas células é induzida por citocinas e fatores de crescimento secretados por células endoteliais e fibroblastos. Dentre essas moléculas, é reconhecida a participação do fator de células-tronco (SCF), que se liga ao c-Kit, um receptor tirosina-cinase expresso na superfície celular dos mastócitos. Outros exemplos de moléculas relacionadas ao desenvolvimento dos mastócitos são as citocinas IL-3, IL-4 e IL-9 (RIBATTI; CRIVELLATO, 2012). Em cortes histológicos corados por técnicas histoquímicas de rotina, a população de mastócitos comumente não é identificada em sua totalidade (PYKIAK et al., 2013). Para efeito de estudo dessas células, recomenda-se o uso de colorações especiais, a exemplo do azul de toluidina e do Alcian Blue, ou ainda, de técnicas de imunomarcação de proteínas como triptase, quimase e carboxipeptidase A (CHEEMA; RAMESH; BALAMURALI, 2012). Conforme Pyziak et al. (2013), as técnicas imuno-histoquímicas constituem os meios mais adequados para a identificação dos mastócitos. 47 Os mastócitos desempenham um importante papel como células efetoras nas reações de hipersensibilidade imediata. Nesse processo, a exposição inicial ao alérgeno (antígeno multivalente) induz uma resposta imunológica de células TH2 e linfócitos B, com produção de anticorpos IgE, que se tornam ligados aos receptores FcεRI dos mastócitos. Em exposições posteriores, os antígenos são reconhecidos pelos anticorpos IgE previamente fixados aos mastócitos, resultando na agregação dos receptores FcεRI. Em seguida, são desencadeados eventos bioquímicos intracelulares que culminam com a exocitose do conteúdo dos grânulos secretores. Inicialmente, os mediadores pré-formados, a exemplo das aminas vasoativas e proteases, são liberados para o meio extracelular. Posteriormente, os mastócitos sintetizam e secretam citocinas e mediadores lipídicos (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015). Os mastócitos também podem ser ativados por estímulos independentes de IgE, que incluem mecanismos relacionados aos receptores semelhantes a Toll (TLRs) e ao c-Kit, a agregação de receptores FcγRIII por complexos antígeno-anticorpo, exposição a fragmentos de fibrinogênio e fibronectina (RIBATTI; CRIVELLATO, 2012), proteases, citocinas e frações do sistema complemento, a exemplo das anafilatoxinas C3a e C5a (WELLER et al., 2011). Além de participarem nas reações de hipersensibilidade imediata, os mastócitos desempenham importantes funções nas respostas imunológicas inatas e adquiridas a diversos patógenos, especialmente na defesa contra bactérias e parasitas (RIBATTI; CRIVELLATO, 2012; RIBATTI; RANIERI, 2015; VITTE, 2015). Similarmente a outros componentes celulares da imunidade inata, os mastócitos são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) através de receptores expressos na superfície celular e no citosol, a exemplo dos TLRs (WELLER et al., 2011). Em resposta ao reconhecimento dos PAMPs, os TLRs são ativados e podem induzir diferentes respostas efetoras nos mastócitos, incluindo a fagocitose dos microrganismos, a síntese e secreção de TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8 e quimiocinas. Adicionalmente, sabe-se que os mastócitos contribuem para a migração, maturação e funcionamento adequado das células dendríticas, as quais possuem grande relevância no desenvolvimento das respostas imunes adquiridas (RIBATTI; CRIVELLATO, 2012). De acordo com a localização anatômica e o conteúdo dos grânulos citoplasmáticos, os mastócitos são classificados em duas subpopulações distintas. Os mastócitos de mucosa constituem uma subpopulação encontrada principalmente na mucosa intestinal e nos espaços alveolares dos pulmões, cujos grânulos citoplasmáticos armazenam exclusivamente a triptase. O desenvolvimento desse grupo de mastócitos requer o estímulo da IL-3, produzida pelos 48 linfócitos T. Por sua vez, a subpopulação de mastócitos do tecido conjuntivo é caracterizada pela presença de diversas proteases nos grânulos citoplasmáticos, incluindo a triptase, a quimase e a carboxipeptidase, além de grandes quantidades de heparina e histamina. Esse subgrupo de mastócitos é encontrado na pele, na submucosa intestinal e nas membranas serosas (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015). A triptase consiste em uma serino-protease semelhante à tripsina, sendo produzida e armazenada em grandes quantidades nos grânulos citoplasmáticos dos mastócitos. Embora a enzima também seja sintetizada pelos basófilos, o conteúdo da triptase nessas células é 100 vezes inferior ao verificado nos mastócitos. Considera-se, portanto, que a produção de triptase no organismo humano é específica dos mastócitos. Os genes que codificam a triptase são encontrados no cromossomo 16p13.3 e compreendem cinco loci: TPSG1 (codifica a γ- triptase); TPSAB1 (codifica a α-triptase e a βI-triptase); TPSBII (codifica a βII-triptase e a βIII-triptase); TPSE1 (codifica a ε-triptase, que possui propriedades bioquímicas distintas da α- e β-triptase); TPSD1 (codifica a δ-triptase, sendo este último lócus gênico inativado na espécie humana) (VITTE, 2015). A principal protease encontrada nos mastócitos dos seres humanos é a β-triptase (RIBATTI; RANIERI, 2015), a qual apresenta estrutura tetramérica e encontra-se, em grande parte, armazenada nos grânulos secretórios, onde é estabilizada por proteoglicanos. Para que a referida enzima desempenhe suas funções, faz-se necessário que ocorra a degranulação dos mastócitos. A β-triptase também é sintetizada em sua forma monomérica e liberada de forma contínua para o meio extracelular, juntamente com a α-triptase, sem a dependência de estímulos para a degranulação. Por sua vez, a γ-triptase é produzida na forma de monômeros e ancorada na membrana dos grânulos secretórios, alcançando a membrana plasmática dos mastócitos após a degranulação (VITTE, 2015) (Figura 1). 49 Figura 1. Representação esquemática dos processos de síntese, armazenamento e secreção da triptase pelos mastócitos. Fonte: Adaptado de Vitte (2015). Os mastócitos podem acumular-se no estroma associado às neoplasias malignas (SOUZA-FREITAS et al., 2011), sendo recrutados e ativados no microambiente tumoral principalmente por produtos secretados pelas células neoplásicas. Uma das principais moléculas envolvidas nesses processos é o SCF, que interage com o receptor c-Kit, expresso pelos mastócitos, além do VEGF, FGF, MCP-1 e adenosina (RIBATTI; CRIVELLATO, 2012). Ressalta-se que as referidas células podem exercer influência sobre a progressão e o potencial metastático das neoplasias (PYZIAK et al., 2013), contribuindo com efeitos pró- e anti-tumorais, que se relacionam à habilidade de secreção de mediadores específicos em resposta a estímulos (DYDUCH; KACZMARCZYK; OKON, 2012). As ações pró-tumorais dos mastócitos incluem a produção de diversas moléculas indutoras da neoformação vascular (PYKIAK et al., 2013), dentre as quais se mencionam: VEGF, FGF, TGF-β, TNF-α, IL-8, triptase e quimase (DYDUCH; KACZMARCZYK; OKON, 2012). As células malignas, em condições de hipóxia, também podem liberar fatores angiogênicos, aumentando a vascularização local e a infiltração dos mastócitos (CHEEMA; RAMESH; BALAMURALI, 2012). 50 Salienta-se que a triptase secretada pelos mastócitos também contribui para a angiogênese, uma vez que estimula a proliferação de células endoteliais (RIBATTI; CRIVELLATO, 2012; RIBATTI; RANIERI, 2015). Além disso, a referida enzima pode atuar de forma indireta na degradação da matriz extracelular, por meio da ativação de formas latentes das MMPs (pró-MMP-1, -2, -3 e -9), bem como diretamente, através da degradação de substratos como a fibronectina e os colágenos dos tipos I e IV, assim contribuindo para a progressão tumoral (SOUZA-FREITAS et al., 2011). Marone et al. (2015) mencionam que os mastócitos sintetizam, de forma constitutiva, as proteínas VEGF-C e VEGF-D, as quais são consideradas os fatores linfangiogênicos mais potentes. No momento da ativação destas células, o VEGF-C e o VEGF-D são liberados para o microambiente tumoral e interagem com o receptor VEGFR-3, expresso na superfície das células endoteliais linfáticas, estimulando a maturação dos vasos linfáticos. De forma análoga, as referidas moléculas ativam o receptor VEGFR-2, expresso pelas células endoteliais sanguíneas, o que contribui na indução da angiogênese. Os autores acrescentam que os mediadores da família VEGF também exercem efeitos quimiotáticos, intensificando o recrutamento de mastócitos e outras células inflamatórias para o sítio tumoral. Destacando as evidências crescentes de participação dos mastócitos na linfangiogênese tumoral, Cimpean e Raica (2015) sugerem a realização de novas investigações, com o propósito de elucidar os mecanismos de ação destas células na vasculatura linfática, bem como a sua contribuição no desenvolvimento de metástases linfonodais regionais. Segundo Weller et al. (2011), os mastócitos são capazes de subregular a resposta imune mediada por células, através da liberação de mediadores como TNF-α, IL-4, IL-10, histamina, serotonina, PAF e PGE2. A histamina, em particular, estimula receptores H1 nas células neoplásicas, induzindo a sua proliferação, além de atuar sobre os receptores H2 nas células do sistema imunológico, suprimindo as suas funções (RIBATTI; RANIERI, 2015). Em contrapartida, os mastócitos também exercem efeitos antitumorais, mediados principalmente por citocinas como TNF-α, IL-1 e IL-6, que provocam efeitos inibitórios sobre o crescimento do tumor e contribuem para a apoptose das células neoplásicas (RIBATTI; RANIERI, 2015). Além disso, conforme Dyduch, Kaczmarczyk e Okoń (2012), as mesmas citocinas inibem a angiogênese e são capazes de recrutar células natural killer e linfócitos T para o sítio tumoral. Ainda de acordo com Dyduch, Kaczmarczyk e Okoń (2012), o significado biológico dos mastócitos nas neoplasias malignas está relacionado à sua localização (intra ou 51 peritumoral), sendo encontrada uma maior densidade dessas células nas áreas peritumorais. Os referidos autores afirmam que os mastócitos da região intratumoral exibem uma menor quantidade de grânulos citoplasmáticos, sugerindo que esta população celular apresenta uma atividade secretora menos intensa, em comparação aos mastócitos peritumorais. Considerando as múltiplas funções fisiológicas e patológicas desempenhadas pelos mastócitos, diversos estudos têm investigado a participação destas células em fenômenos relacionados ao desenvolvimento e progressão das neoplasias malignas. Com o objetivo de melhor compreender a relação entre os mastócitos e o fenômeno de angiogênese, Iamaroon et al. (2003) analisaram a imunoexpressão da triptase e a DM com o uso do marcador CD31, e compararam espécimes de CEO (n=26), displasia epitelial oral (n=6), hiperceratose (n=10) e mucosa oral normal (n=6). Nos casos de CEO, foi constatado um aumento na quantidade de mastócitos e na DM, variáveis estas que apresentaram uma correlação positiva e estatisticamente significativa (p<0,05). Contudo, os espécimes de CEO e displasia epitelial não demonstraram diferenças significativas, no que concerne à expressão da triptase e do CD31 (p<0,05). Os autores concluíram que os mastócitos estariam envolvidos na neoformação vascular e, possivelmente, na progressão da carcinogênese oral. Oliveira-Neto et al. (2007) avaliaram a expressão imuno-histoquímica da triptase e do c-Kit em espécimes de CEO (n=38), hiperceratose (n=26) e mucosa oral saudável (n=12). Em comparação à mucosa normal, os casos de CEO e hiperceratose apresentaram menores números de células imunopositivas para a triptase e o c-Kit (p<0,05). Adicionalmente, a expressão dos referidos marcadores não demonstrou relação significativa com os parâmetros clinicopatológicos do CEO, a exemplo do estadiamento clínico TNM e gradação histológica de malignidade (p>0,05). Foi sugerido pelos autores que, durante a progressão do CEO, ocorreriam falhas na migração dos mastócitos para os tecidos periféricos, que possivelmente estariam relacionadas a modificações no microambiente tumoral. Gomes et al. (2008) realizaram uma análise quantitativa dos mastócitos em CELIs (n=15), queilites actínicas (QAs) com displasia leve (n=13) e com displasia severa (n=13), bem como amostras de mucosa oral normal (n=6), visando encontrar possíveis diferenças relacionadas ao grau de displasia epitelial ou ao desenvolvimento do CEO. Os cortes histológicos, corados pela técnica do azul de toluidina, foram examinados em microscopia de luz sob aumento de 400x, procedendo-se à contagem de mastócitos no tecido conjuntivo, em cinco campos microscópicos, com o auxílio de retículo acoplado ao microscópio. Os resultados evidenciaram ausência de diferenças significativas na DM, em relação ao grau de displasia (p>0,05). Contudo, os casos de QA e CELI apresentaram maior DM, em 52 comparação aos espécimes de mucosa oral normal (p<0,05). Segundo os autores, tais achados sugerem a participação das referidas células no desenvolvimento das lesões estudadas. Em estudo imuno-histoquímico, Souza-Freitas et al. (2011) investigaram a expressão da triptase e da MMP-9 em CELIs (n=20), QAs (n=20) e espécimes de lábio normal (n=7). Verificaram uma maior DM nos carcinomas epidermóides, em comparação aos espécimes de QA e de lábio normal (p<0,05). Também relataram, nos carcinomas epidermóides, intensa expressão da MMP-9, que revelou associação significativa com a DM (p<0,05). Frente a esses achados, os autores sugeriram que, durante a carcinogênese de lábio, ocorre um aumento da população local de mastócitos. Adicionalmente, a triptase poderia participar da degradação da matriz extracelular, por meio da ativação da MMP-9, contribuindo de forma indireta na progressão do carcinoma epidermóide de lábio. Cheema, Ramesh e Balamurali (2012) realizaram uma análise quantitativa dos mastócitos em espécimes de CEO, utilizando a técnica histoquímica do azul de toluidina a 1%. Os casos foram classificados, de acordo com o SGHM da OMS (CARDESA et al., 2005), em bem diferenciados (n=40), moderadamente diferenciados (n=50) e pobremente diferenciados (n=12). Foi verificada uma relação estatisticamente significativa entre o grau de diferenciação do tumor e a DM, ocorrendo menor número destas células nos casos pobremente diferenciados (p<0,01). De forma semelhante a Oliveira-Neto et al. (2007), os autores concluíram que a redução da DM poderia resultar de modificações no microambiente tumoral, relacionadas à progressão da neoplasia. Adicionalmente, sugeriram que a densidade destas células pode constituir um marcador de progressão do CEO. Pyziak et al. (2013), com objetivos semelhantes aos de Iamaroon et al. (2003), realizaram um estudo imuno-histoquímico em espécimes de CEO (n=47), identificando mastócitos e vasos sanguíneos através da imunomarcação para a triptase e o CD31, respectivamente. Foi feita a contagem de mastócitos e vasos sanguíneos em microscopia de luz, sob aumento de 400x, considerando 5-7 campos consecutivos na região intratumoral. A contagem de mastócitos (CM) e a DM foram expressas, respectivamente, como os números médios de mastócitos e de vasos sanguíneos por mm 2 . De forma similar, a CM e a DM foram calculadas na área peritumoral dos casos de CEO, bem como em cortes histológicos de mucosa oral normal (n=12), que serviram como grupo-controle. Neste estudo, os espécimes de CEO apresentaram valores de CM e DM superiores aos da mucosa normal (p<0,05). Ademais, foi evidenciada correlação positiva entre a CM e a DM, nas regiões intratumoral e peritumoral (p<0,05), sugerindo que as referidas células podem participar da regulação da angiogênese no CEO. 53 Zaidi e Mallick (2014) realizaram uma análise qualitativa e quantitativa dos mastócitos em espécimes de CEO (n=60) e mucosa oral normal (n=40), empregando a coloração do azul de toluidina a 1%. Verificaram que a CM foi significativamente superior nos casos de CEO, sendo que estes também apresentaram maior proporção de mastócitos degranulados em relação aos espécimes de mucosa normal (p<0,05). Os autores enfatizaram a relevância dos mastócitos na progressão tumoral e sugeriram a realização de estudos adicionais acerca do papel destas células no CEO. 54 PROPOSIÇÃO 55 3 PROPOSIÇÃO O presente estudo teve como objetivo correlacionar a imunoexpressão das proteínas triptase e podoplanina em uma série de casos de CELO, assim como investigar possíveis associações entre os resultados obtidos e os parâmetros clinicopatológicos do tumor, incluindo o estadiamento clínico TNM, a gradação histológica de malignidade e a presença ou ausência de metástase nodal regional. Pretendeu-se, através desse experimento, obter informações adicionais sobre o papel dos mastócitos na linfangiogênese e a influência dessa população celular no comportamento biológico da lesão estudada. 56 MATERIAL E MÉTODOS 57 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS O Projeto de pesquisa referente a este trabalho foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Liga Norte-Riograndense Contra o Câncer para a análise de seu conteúdo, recebendo a devida aprovação conforme Parecer Nº 1.094.634 (ANEXO 1). 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO A presente pesquisa consistiu em uma análise retrospectiva descritiva, caracterizada pela observação, análise e registro da expressão imuno-histoquímica da triptase pelos mastócitos e mensuração da densidade linfática com o uso do marcador D2-40, em espécimes teciduais de CELO. 4.3 POPULAÇÃO Nesta pesquisa, a população foi constituída pelos casos de CELO diagnosticados e registrados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal-RN, no período de 2003 a 2014. 4.4 AMOSTRA A amostra foi intencional, constituída de 50 espécimes teciduais de CELO fixados em formol a 10%, emblocados em parafina e arquivados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal-RN. Os dados de interesse para o estudo foram obtidos a 58 partir dos prontuários dos pacientes, que permaneceram no referido serviço, bem como o material biológico resultante da terapêutica cirúrgica. As informações obtidas foram registradas em fichas previamente elaboradas para a finalidade especificada (APÊNDICE B). 4.4.1 Critérios de inclusão Foram incluídos espécimes de CELO tratados por excisão cirúrgica, sem radioterapia e/ou quimioterapia prévia, com material biológico suficiente para a gradação histológica de malignidade e avaliação imuno-histoquímica. Foram selecionados somente os casos que apresentaram prontuários médicos adequadamente preenchidos, contendo os dados clínicos necessários ao estudo. Para efeito de seleção dos casos, a presença de metástase nodal foi confirmada através dos laudos anatomopatológicos. 4.4.2 Critérios de exclusão Foram excluídos da amostra todos os casos de CELO que não se ajustaram às exigências dos critérios de inclusão. 4.5 ESTUDO CLÍNICO As informações clínicas de interesse para a presente pesquisa, tais como idade, sexo, estadiamento clínico TNM e presença/ausência de metástases nodais, foram obtidas a partir dos prontuários médicos dos pacientes portadores de CELO e transcritas em fichas previamente elaboradas (APÊNDICE B). Para a análise do estadiamento clínico, foram considerados os parâmetros descritos na sexta edição da Classificação TNM dos Tumores Malignos (SOBIN; WITTEKIND, 2002). 59 4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO Os espécimes teciduais dos casos selecionados, fixados em formol a 10% e incluídos em parafina, foram submetidos a cortes histológicos de 5 µm de espessura, estendidos em lâminas de vidro e corados pela técnica histoquímica da hematoxilina e eosina (HE). A referida técnica seguiu o protocolo do Laboratório de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN, conforme descrito a seguir:  Xilol I (15 minutos);  Xilol II (15 minutos);  Álcool etílico absoluto I (3 minutos);  Álcool etílico absoluto II (3 minutos);  Álcool etílico absoluto III (3 minutos);  Álcool etílico absoluto IV (3 minutos);  Água corrente (5 a 10 minutos);  Hematoxilina de Harris (5 a 10 minutos);  Água corrente (5 a 10 minutos);  Eosina de Lison (3 a 4 minutos);  Álcool etílico absoluto (4 passagens);  Xilol I (3 minutos);  Xilol II (3 minutos);  Xilol III (3 minutos);  Montagem em resina Permount® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA). Após a confecção das lâminas, os cortes histológicos foram examinados em microscópio óptico (Olympus CX31, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN), sob aumentos de 100x e 400x, para a análise da gradação histológica de malignidade no front de invasão tumoral, com base nos parâmetros do sistema proposto por Bryne (1998) (Quadro 1). 60 Quadro 1. Sistema de gradação histológica de malignidade no front de invasão proposto por Bryne (1998). Parâmetros Morfológicos ESCORE DE MALIGNIDADE 1 2 3 4 Grau de Ceratinização Altamente ceratinizado (mais de 50% das células) Moderadamente ceratinizado (20 a 50% das células) Mínima ceratinização (5 a 20% das células) Nenhuma ceratinização (0 a 5% das células) Pleomorfismo Nuclear Pouco pleomorfismo nuclear (mais de 75% de células maduras) Moderado pleomorfismo nuclear (50 a 75% de células maduras) Intenso pleomorfismo (25 a 50% de células maduras) Pleomorfismo nuclear extremo (0 a 5% das células maduras) Padrão de Invasão Bordas infiltrativas bem delimitadas Cordões, bandas e/ou trabéculas sólidas infiltrativas Pequenos grupos ou cordões de células infiltrativas (N>15) Dissociação celular difusa e pronunciada, em pequenos grupos e/ou células individuais (N<15) Infiltrado Inflamatório Intenso Moderado Escasso Ausente Nesta forma de avaliação, foi atribuído um escore de 1 a 4 para cada critério morfológico analisado, e em seguida, somados os escores correspondentes a cada parâmetro, obtendo-se os escores finais de malignidade. Os casos com escores finais compreendidos entre 4 e 8 foram classificados como de baixo grau de malignidade, e aqueles com escore igual ou superior a 9, classificados como de alto grau de malignidade, de acordo com o estudo de Silveira et al. (2007). Ressalta-se que os aspectos histomorfológicos foram avaliados por dois examinadores previamente treinados para esta finalidade, em um estudo cego. Nos casos de discordância na avaliação entre os examinadores, as lâminas foram reexaminadas por estes avaliadores em conjunto, de forma a se obter um resultado consensual. Os dados referentes à gradação histológica de malignidade foram devidamente registrados em fichas previamente elaboradas para esta análise (APÊNDICES C e D). 61 4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO 4.7.1 Método Imuno-histoquímico Todos os espécimes teciduais selecionados, fixados em formol a 10% e incluídos em parafina, foram submetidos a cortes histológicos de 3 µm de espessura e estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas e preparadas com adesivo à base de organosilano (3- aminopropyltriethoxisilano, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Em seguida, foram submetidos à técnica da imunoperoxidase, com a utilização dos anticorpos monoclonais anti- podoplanina (D2-40) e anti-triptase (Quadro 2). Como controle positivo para os anticorpos D2-40 e anti-triptase, foram utilizados cortes histológicos de tonsilas. Por sua vez, o controle negativo consistiu na substituição dos anticorpos primários por albumina de soro bovino (BSA) a 1%, em solução tampão. A técnica utilizada seguiu o protocolo descrito a seguir:  Desparafinização, reidratação e recuperação antigênica em solução Trilogy (Cell- Marque, CA, USA), na concentração de 1:100, em panela Pascal (30 minutos);  Bloqueio da peroxidase endógena tecidual em solução de peróxido de hidrogênio a 3% (10 volumes), por 15 minutos, à temperatura ambiente (TA);  Lavagem em água corrente (5 minutos);  Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);  Duas passagens em solução Tween 20 (1%) em TRIS-HCl (tris-hidroximetil- aminometano, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), pH 7,4 (5 minutos cada);  Bloqueio das ligações inespecíficas em solução de proteína Block (Thermo Scientific, Runcorn, UK) por 5 minutos, TA;  Duas passagens em solução Tween 20 (1%) em TRIS-HCl, pH 7,4 (5 minutos cada);  Incubação dos cortes com os anticorpos primários (Quadro 2);  Duas passagens em solução Tween 20 (1%) em TRIS-HCl, pH 7,4 (5 minutos cada);  Incubação com os reagentes do sistema de visualização HiDef (HiDef DetectionTM HRP Polymer System, Cell-Marque, CA, USA): o Aplicação do HiDef Detection Amplifier, por 15 minutos, TA; o Duas passagens em solução Tween 20 (1%) em TRIS-HCl, pH 7,4 (5 minutos cada); 62 o Aplicação do HiDef Detection HRP Polymer Detector, por 15 minutos, TA;  Duas passagens em solução Tween 20 (1%) em TRIS-HCl, pH 7,4 (5 minutos cada);  Revelação da reação com a solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina (Liquid DAB + Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) em câmara escura, por 5 minutos, TA;  Lavagem em água corrente (5 minutos);  Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);  Contracoloração com Hematoxilina de Mayer (5 minutos), TA;  Lavagem em água corrente (5 minutos);  Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);  Desidratação em cadeia ascendente de etanóis: o Álcool etílico 80º GL (2 minutos), TA; o Álcool etílico 95º GL (2 minutos), TA; o Álcool etílico absoluto I (5 minutos), TA; o Álcool etílico absoluto II (5 minutos), TA; o Álcool etílico absoluto III (5 minutos), TA;  Diafanização em três banhos de xilol (2 minutos cada);  Montagem em resina Permount® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA). Quadro 2. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados no estudo. Especificidade Clone Fabricante Diluição Recuperação Antigênica Incubação Podoplanina D2-40 Dako 1 : 400 Trilogy, 1:100, Pascal, 30 min Overnight (18 h) Triptase AA1 Dako 1 : 100 Trilogy, 1:100, Pascal, 30 min 60 min 63 4.7.2 Análise do Perfil Imuno-histoquímico Todos os espécimes submetidos ao processamento imuno-histoquímico foram escaneados pelo Scanner Panoramic MIDI (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str.Budapest, Hungary, H-1121) e as imagens obtidas foram visualizadas através do software Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str.Budapest, Hungary, H-1121). Com o auxílio deste programa, as imunomarcações da podoplanina e da triptase foram analisadas por um único examinador previamente treinado, em dois momentos distintos. Destaca-se que o estudo imuno-histoquímico foi do tipo cego, no qual o avaliador não tinha acesso aos dados clínicos dos casos estudados. A densidade linfática foi analisada de forma quantitativa, seguindo uma adaptação da metodologia adotada por Kyzas et al. (2006). Sob aumento de 200 µm, foram selecionados os 10 campos microscópicos com maior número de microvasos imunomarcados pelo D2-40 (5 no centro tumoral e 5 no front de invasão). Teve-se o cuidado de restringir os campos peritumorais a uma extensão máxima de 500 µm além do front de invasão. Em seguida, foram obtidas fotomicrografias dos campos selecionados, sob aumento de 100 µm. Com o auxílio do programa Imaging Processing and Analysis in Java (ImageJ®, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA), foram quantificados os vasos linfáticos em cada campo selecionado previamente. Os valores médios de microvasos linfáticos localizados em campos intratumorais e peritumorais corresponderam à densidade linfática intratumoral (DLI) e à densidade linfática peritumoral (DLP), respectivamente (Quadro 3). Com base nos critérios de Weidner et al. (1991), as células com imunopositividade para o D2-40, assim como os grupos celulares imunorreativos, com ou sem lúmen evidente, também foram contabilizadas como microvasos. Além disso, os grupos de células endoteliais que pudessem constituir secções diferentes de um mesmo microvaso foram considerados microvasos distintos no processo de contagem. Os dados obtidos na mensuração da DLI e da DLP foram anotados em fichas apropriadas para esta análise (APÊNDICE D). A análise dos mastócitos também foi realizada de forma quantitativa, com base em uma adaptação do método utilizado por Souza-Freitas et al. (2011). Os mastócitos foram identificados como células de citoplasma acastanhado, independentemente da intensidade da coloração. Com o auxílio do programa de visualização citado anteriormente, sob aumento de 100 µm, foram selecionados os 10 campos microscópicos (5 no centro tumoral e 5 no front de 64 invasão) com maior imunorreatividade. Posteriormente, sob aumento de 50 µm, foram obtidas fotomicrografias de cada campo selecionado, nos quais se procedeu à contagem de células com imunopositividade para a triptase. Assim como na análise da DLP, teve-se o cuidado de restringir os campos peritumorais a uma extensão máxima de 500 µm além do front de invasão. Por meio da utilização do programa Imaging Processing and Analysis in Java (ImageJ®, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA), foram quantificados os mastócitos em cada campo microscópico fotografado previamente. A contagem de mastócitos intratumorais (CMI) foi expressa como a média das referidas células por campo intratumoral. De forma análoga, para a determinação da contagem de mastócitos peritumorais (CMP), foi calculada a média de células triptase-positivas, considerando os campos selecionados no front de invasão (Quadro 3). Os dados obtidos foram anotados em fichas apropriadas para esta análise (APÊNDICE E). 4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados obtidos com a coleta dos dados clinicopatológicos e imuno-histoquímicos foram registrados em planilhas eletrônicas Excel (Microsoft Office 2013 for Windows) e posteriormente exportados para o programa Statistical Package for the Social Sciences (versão 20.0; SPSS Inc., Chicago IL, USA), onde foram submetidos aos testes estatísticos descritos abaixo. Para avaliar a relação entre o estadiamento clínico TNM e as demais variáveis estudadas, os casos pertencentes aos estágios I e II foram reunidos em um único grupo, bem como os casos nos estágios III e IV (Quadro 4). No intuito de associar as variáveis qualitativas estadiamento clínico e metástase nodal com os dados referentes à gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998), utilizou-se o teste Exato de Fisher. Os dados obtidos com a quantificação dos vasos linfáticos e mastócitos, variáveis quantitativas discretas, foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov, que revelou ausência de distribuição normal. Portanto, para a análise de possíveis diferenças nas densidades linfáticas e contagens de mastócitos em relação aos parâmetros estadiamento clínico, gradação histológica de malignidade e presença/ausência de metástase nodal, foi utilizado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. Por sua vez, as correlações entre as 65 densidades linfáticas e contagens de mastócitos, tanto em nível intratumoral quanto peritumoral, foram avaliadas por meio do teste de correlação de Spearman (r). Com o propósito de avaliar a concordância intraexaminador nas análises imuno- histoquímicas da podoplanina e da triptase, foi calculado o coeficiente Kappa (K). Para a densidade linfática e a contagem de mastócitos, foram obtidos valores de 0,822 e 0,846, respectivamente, que denotaram excelente concordância. Em todos os testes estatísticos realizados no presente estudo, foi estabelecido um nível de significância de 5% (p<0,05). Quadro 3. Variáveis dependentes elencadas para os testes estatísticos. Variável Classificação Escala de Medida Densidade linfática intratumoral Quantitativa discreta Número de vasos linfáticos intratumorais imunorreativos ao anticorpo D2-40 por campo microscópico Densidade linfática peritumoral Quantitativa discreta Número de vasos linfáticos peritumorais imunorreativos ao anticorpo D2-40 por campo microscópico Contagem de mastócitos intratumorais Quantitativa discreta Número de mastócitos intratumorais imunorreativos ao anticorpo anti-triptase por campo microscópico Contagem de mastócitos peritumorais Quantitativa discreta Número de mastócitos peritumorais imunorreativos ao anticorpo anti-triptase por campo microscópico Quadro 4. Variáveis independentes elencadas para os testes estatísticos. Variável Classificação Categorias Estadiamento clínico (TNM) Qualitativa ordinal 1. Estágio I/II 2. Estágio III/IV Gradação histológica (BRYNE, 1998) Qualitativa ordinal 1. Baixo grau de malignidade 2. Alto grau de malignidade Metástase nodal Qualitativa nominal mutuamente exclusiva 1. Ausente 2. Presente 66 RESULTADOS 67 5 RESULTADOS 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA Os dados clínicos dos 50 casos de CELO analisados nesta pesquisa encontram-se detalhados na Tabela 1. Tabela 1. Distribuição absoluta e relativa dos casos de CELO, de acordo com os dados clínicos relacionados. Natal-RN, 2015. VARIÁVEIS n % SEXO Masculino 32 64,0 Feminino 18 36,0 IDADE ≤ 50 anos 7 14,0 > 50 anos 43 86,0 TABAGISMO * Sim 37 74,0 Não 7 14,0 ETILISMO ** Sim 23 46,0 Não 15 30,0 ESTADIAMENTO CLÍNICO Estágio I e II 17 34,0 Estágio III e IV 33 66,0 METÁSTASE NODAL Ausente 24 48,0 Presente 26 52,0 TOTAL 50 100 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. * Informação não estava disponível em 6 casos. ** Informação não estava disponível em 12 casos. 68 Conforme verificado na Tabela 1, a análise dos dados revelou maior acometimento de indivíduos do sexo masculino (64%), com uma proporção de 1,7:1 em relação ao sexo feminino. A maioria dos pacientes apresentava idade superior a 50 anos, com uma média de 64,3 ± 14,7 anos. A sexta década de vida foi a faixa etária mais acometida, correspondendo a 28% dos casos. Em relação aos fatores de risco, verificou-se predomínio de pacientes com histórico de tabagismo e etilismo. No que concerne ao estadiamento clínico TNM, o estágio III foi o mais prevalente (n=19; 38%). Ao classificar o estadiamento clínico dos casos em duas categorias, observou-se um predomínio dos estágios III/IV (n=33; 66%) em relação aos estágios I/II (n=17; 34%). 5.2 RESULTADOS MORFOLÓGICOS A análise morfológica revelou características inerentes ao CELO, destacando-se o pleomorfismo celular e nuclear, alterações na relação núcleo-citoplasma, hipercromatismo nuclear, disceratose e nucléolos proeminentes, além de figuras de mitose típicas e atípicas. As células tumorais invadiam o tecido conjuntivo na forma de ilhas, ninhos e cordões, por vezes crescendo isoladamente ou em pequenos grupos. Pérolas córneas e invasão perineural também constituíram achados frequentes. Constatou-se, ainda, a presença de infiltrado inflamatório mononuclear escasso a intenso no estroma neoplásico. No tocante ao sistema de gradação histológica de malignidade proposto por Bryne (1998), a maioria dos casos foi classificada como alto grau de malignidade (n=38; 76%) (Figura 3) em relação ao baixo grau de malignidade (n=12; 24%) (Figura 2). Em relação ao estadiamento clínico, verificou-se, tanto nos casos diagnosticados em estágios I/II quanto naqueles em estágios III/IV, predomínio do alto grau de malignidade. O teste Exato de Fisher demonstrou ausência de associação estatisticamente significativa entre o estadiamento clínico TNM e o grau histológico de malignidade (p=0,728) (Tabela 2). 69 Tabela 2. Distribuição absoluta e relativa dos casos de CELO, de acordo com o estadiamento clínico e a gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal-RN, 2015. Estadiamento clínico Gradação histológica Total n (%) p (1) Baixo grau n (%) Alto grau n (%) Estágio I e II 5 (29,4) 12 (70,6) 17 (100,0) 0,728 Estágio III e IV 7 (21,2) 26 (78,8) 33 (100,0) Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. (1): Teste Exato de Fisher. Ao comparar a gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998) entre casos com e sem metástases nodais, foi constatado que os casos não-metastáticos, em sua maioria (n=17; 70,8%), exibiram alto grau de malignidade. Do mesmo modo, a maior parte dos casos com metástase (n=21; 80,8%) foi classificada como alto grau. O teste exato de Fisher não revelou associação estatisticamente significativa entre a metástase nodal e o grau histológico de malignidade destas lesões (p=0,514) (Tabela 3). Tabela 3. Distribuição absoluta e relativa dos casos de CELO, de acordo com as metástases nodais e a gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal-RN, 2015. Metástase nodal Gradação histológica Total n (%) p (1) Baixo grau n (%) Alto grau n (%) Ausente 7 (29,2) 17 (70,8) 24 (100,0) 0,514 Presente 5 (19,2) 21 (80,8) 26 (100,0) Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. (1): Teste Exato de Fisher. 5.3 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS A análise dos espécimes submetidos à marcação imuno-histoquímica com o anticorpo anti-podoplanina (D2-40) revelou expressão desta proteína em todos os casos. Do ponto de vista morfológico, os vasos linfáticos do centro tumoral apresentaram uma arquitetura fina e lúmens inconspícuos (Figura 4). Por sua vez, os vasos linfáticos localizados no front de 70 invasão exibiram, em sua maioria, lúmens abertos e bem delimitados, com estrutura mais regular que os vasos intratumorais (Figura 5). Considerando os 50 casos avaliados, a DLI exibiu valores compreendidos no intervalo de 6,20 a 19,20 (mediana=10,10), enquanto a DLP variou de 7,20 a 22,80 (mediana=12,20). No que concerne ao estadiamento clínico TNM, os casos de CELO diagnosticados nos estágios I e II apresentaram valores de DLI variando de 6,40 a 18,40 (mediana=8,30). No grupo de tumores em estágios III e IV, a DLI situou-se no intervalo de 6,20 a 19,20 (mediana=10,80). Considerando o front de invasão, os carcinomas nos estágios I e II revelaram DLP entre 9,00 e 19,20 (mediana=10,40), ao passo que os casos nos estágios III e IV exibiram valores de DLP entre 7,20 e 22,80 (mediana=13,40). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos em relação à DLI (p=0,009). Por outro lado, a DLP não apresentou diferenças estatisticamente significativas entre os referidos grupos (p=0,124) (Tabela 4). Tabela 4. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a densidade linfática nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação ao estadiamento clínico TNM. Natal-RN, 2015. Região Estadiamento clínico N Mediana Q25-Q75 Média dos postos Soma dos postos U p (1) Intratumoral Estágio I/II 17 8,30 7,10-9,90 17,97 305,50 152,50 0,009 Estágio III/IV 33 10,80 8,60-13,10 29,38 969,50 Peritumoral Estágio I/II 17 10,40 10,20-13,30 21,09 358,50 205,50 0,124 Estágio III/IV 33 13,40 10,10-17,10 27,77 916,50 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. (1): Teste de Mann-Whitney. No tocante à gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998), os tumores de baixo grau apresentaram valores de DLI compreendidos no intervalo de 7,00 a 12,80 (mediana=8,70), enquanto nos carcinomas de alto grau, a DLI variou de 6,20 a 19,20 (mediana=10,35). No front de invasão, os tumores de baixo grau revelaram DLP variando de 9,60 a 18,00 (mediana=10,30) e os tumores de alto grau, valores situados no intervalo de 7,20 a 22,80 (mediana=13,35). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não haver diferenças estatisticamente significativas entre os grupos em relação às densidades linfáticas intra (p=0,199) e peritumoral (p=0,114) (Tabela 5). 71 Tabela 5. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a densidade linfática nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação à gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal-RN, 2015. Região Gradação histológica n Mediana Q25-Q75 Média dos postos Soma dos postos U p (1) Intratumoral Baixo grau 12 8,70 7,25-10,70 20,79 249,50 171,50 0,199 Alto grau 38 10,35 7,85-12,57 26,99 1025,50 Peritumoral Baixo grau 12 10,30 9,90-12,50 19,71 236,50 158,50 0,114 Alto grau 38 13,35 10,20-16,85 27,33 1038,50 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. (1): Teste de Mann-Whitney. A análise da DLI demonstrou, para os casos sem metástase nodal, valores que variaram de 6,40 a 18,40 (mediana=8,70). Nos tumores com metástase nodal, constataram-se valores de DLI entre 6,20 e 19,20 (mediana=11,00). Na região peritumoral, os casos não- metastáticos revelaram densidades linfáticas que variaram de 7,20 a 22,20 (mediana=10,35) e os casos metastáticos, valores entre 8,60 e 22,80 (mediana=13,50). Por meio do teste não- paramétrico de Mann-Whitney, constatou-se que a DLI foi superior nos casos com metástase nodal (p=0,025). As diferenças entre as lesões metastáticas e não-metastáticas em relação à DLP não foram estatisticamente significativas (p=0,066) (Tabela 6). Tabela 6. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a densidade linfática nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação às metástases nodais. Natal-RN, 2015. Região Metástase nodal n Mediana Q25-Q75 Média dos postos Soma dos postos U p (1) Intratumoral Ausente 24 8,70 7,20-10,87 20,69 496,50 196,50 0,025 Presente 26 11,00 8,45-13,45 29,94 778,50 Peritumoral Ausente 24 10,35 10,05-14,00 21,56 517,50 217,50 0,066 Presente 26 13,50 10,35-17,35 29,13 757,50 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. (1): Teste de Mann-Whitney. Os mastócitos foram identificados por meio de marcação imuno-histoquímica com o anticorpo anti-triptase, que revelou a expressão desta proteína em todas as lesões constantes do presente estudo. A imunorreatividade restringiu-se ao citoplasma das referidas células, as 72 quais de forma geral, exibiam intensa marcação acastanhada, aspecto granular e núcleos vesiculosos. Por vezes, o citoplasma apresentava uma coloração mais clara, sem grânulos evidentes, sugerindo o fenômeno de degranulação. Os mastócitos apresentaram morfologia variável, incluindo células ovoides, estreladas e fusiformes encontradas no estroma tumoral, bem como no interior de ilhas neoplásicas (Figuras 6 e 7). Em relação ao estadiamento clínico TNM, a análise quantitativa dos mastócitos revelou, para as lesões nos estágios I e II, valores de DMI que variaram de 3,80 a 14,20 (mediana=7,80), enquanto que, nos casos em estágios avançados (III e IV), a DMI exibiu valores entre 3,40 e 18,60 (mediana=9,40). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney não revelou diferenças estatisticamente significativas (p=0,320). No nível do front de invasão, os tumores com estadiamento I e II revelaram DMP situada no intervalo de 5,40 a 18,80 (mediana=11,80), ao passo que, nos casos de CELO nos estágios III a IV, a DMP variou de 5,80 a 24,80 (mediana=11,40). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney demonstrou não existir diferenças estatisticamente significativas (p=0,667) (Tabela 7). Tabela 7. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a contagem de mastócitos nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação ao estadiamento clínico TNM. Natal-RN, 2015. Região Estadiamento clínico n Mediana Q25-Q75 Média dos postos Soma dos postos U p (1) Intratumoral Estágio I/II 17 7,80 3,80-14,20 22,65 385,00 232,00 0,320 Estágio III/IV 33 9,40 3,40-18,60 26,97 890,00 Peritumoral Estágio I/II 17 11,80 5,40-18,80 26,74 454,50 259,50 0,667 Estágio III/IV 33 11,40 5,80-24,80 24,86 820,50 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. (1): Teste de Mann-Whitney. Nos casos de CELO de baixo grau de malignidade, os valores mínimo e máximo da DMI foram de 5,80 e 16,80, respectivamente (mediana=7,50). Por sua vez, as lesões de alto grau apresentaram valores de DMI entre 3,40 e 18,60 (mediana=9,00). Conforme evidenciado pelo teste não-paramétrico de Mann-Whitney, as diferenças entre esses grupos não foram estatisticamente significativas (p=0,666). A análise da densidade de mastócitos no front de invasão apresentou resultados semelhantes. Os casos de baixo grau de malignidade revelaram valores de DLP entre 5,80 e 18,20 (mediana=11,50), e as lesões de alto grau, uma variação de 73 5,40 a 24,80 (mediana=11,60). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney evidenciou ausência de diferenças estatisticamente significativas entre esses grupos (p=0,811) (Tabela 8). Tabela 8. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a contagem de mastócitos nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação à gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal-RN, 2015. Região Gradação histológica n Mediana Q25-Q75 Média dos postos Soma dos postos U p (1) Intratumoral Baixo grau 12 7,50 6,30-13,95 27,08 325,00 209,00 0,666 Alto grau 38 9,00 6,45-10,30 25,00 950,00 Peritumoral Baixo grau 12 11,50 8,65-14,40 24,63 295,50 217,50 0,811 Alto grau 38 11,60 8,70-14,97 25,78 979,50 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. (1): Teste de Mann-Whitney. A análise quantitativa dos mastócitos na região intratumoral evidenciou valores de DMI entre 3,40 e 15,80 (mediana=7,60) para os casos sem metástase nodal, enquanto as lesões metastáticas apresentaram DMI variando de 3,80 a 18,60 (mediana=11,50). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney demonstrou ausência de diferenças estatisticamente significativas (p=0,061). Dentre os tumores isentos de metástases nodais, a DMP variou de 5,40 a 18,80 (mediana=12,00), ao passo que, nos casos metastáticos, houve uma variação de 5,80 a 24,80 (mediana=11,30). De forma semelhante, o teste não-paramétrico de Mann- Whitney revelou não haver diferenças estatisticamente significativas entre os casos de CELO metastáticos e não-metastáticos, em relação à DMP (p=0,497) (Tabela 9). Tabela 9. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para a contagem de mastócitos nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO, em relação às metástases nodais. Natal-RN, 2015. Região Metástase nodal n Mediana Q25-Q75 Média dos postos Soma dos postos U p (1) Intratumoral Ausente 24 7,60 5,65-11,40 21,48 515,50 215,50 0,061 Presente 26 11,50 7,70-11,92 29,21 759,50 Peritumoral Ausente 24 12,00 8,25-14,50 26,96 647,00 277,00 0,497 Presente 26 11,30 9,30-16,20 24,15 628,00 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. (1): Teste de Mann-Whitney. 74 Foram avaliadas, ainda, possíveis correlações entre as densidades de vasos linfáticos e de mastócitos, nas regiões intra e peritumoral, considerando todos os 50 casos de CELO incluídos no presente estudo. O teste de correlação de Spearman (r) demonstrou não haver correlação estatisticamente significativa entre as imunomarcações da podoplanina e da triptase, quer seja na região intra (r = -0,004; p=0,977) ou peritumoral (r = -0,154; p=0,285) (Tabela 10). Tabela 10. Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman (r) e significância estatística (p) para a densidade linfática em relação à contagem de mastócitos nas regiões intratumoral e peritumoral do CELO. Natal-RN, 2015. Localização n r p (1) Intratumoral 50 -0,004 0,977 Peritumoral 50 -0,154 0,285 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN. (1): Teste de Correlação de Spearman. 75 Figura 2. Fotomicrografia evidenciando CELO de baixo grau de malignidade (HE; Barra = 200 µm). Figura 3. Fotomicrografia evidenciando CELO de alto grau de malignidade (HE; Barra = 100 µm). 76 Figura 4. Fotomicrografia demonstrando a imunomarcação de vasos linfáticos pelo anticorpo anti- podoplanina (D2-40) no centro tumoral do CELO (HiDef; Barra = 100 µm). Figura 5. Fotomicrografia evidenciando a imunomarcação de vasos linfáticos pelo anticorpo anti- podoplanina (D2-40) no front de invasão do CELO (HiDef; Barra = 100 µm). 77 Figura 6. Fotomicrografia evidenciando a imunoexpressão da triptase em mastócitos no centro tumoral do CELO (HiDef; Barra = 100 µm). Figura 7. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da triptase em mastócitos no front de invasão do CELO (HiDef; Barra = 100 µm). 78 DISCUSSÃO 79 6 DISCUSSÃO Nas últimas décadas, a despeito dos avanços nas técnicas de tratamento do CEO, o prognóstico deste tumor permanece sombrio, sendo reportada uma taxa de sobrevida global em 05 anos inferior a 50% (WARNAKULASURIYA, 2010). Considerando a alta morbidade e mortalidade do CEO, vários autores têm investigado critérios clínicos e morfológicos desta neoplasia, correlacionando-os ao prognóstico do tumor. Nesse contexto, visa-se obter informações adicionais sobre o potencial de agressividade das lesões, de modo a selecionar tratamentos apropriados para cada caso. Os principais parâmetros investigados nestas pesquisas são: localização anatômica do tumor, estadiamento clínico TNM, gradação histológica de malignidade e presença de metástase nodal regional no momento do diagnóstico (LING; MIJITI; MOMING, 2013; RODRIGUES et al., 2014; THIAGARAJAN et al., 2014; VASCONCELOS et al., 2014). Do ponto de vista epidemiológico, o CEO acomete principalmente homens a partir da quinta década de vida, com histórico de fumo e etilismo (JOHNSON; JAYASEKARA; AMARASINGHE, 2011; VARGAS-FERREIRA et al., 2012). Em concordância com estes autores, a presente pesquisa evidenciou predileção dos casos de CELO por indivíduos do sexo masculino com idade superior a 60 anos, muitos dos quais relataram os hábitos mencionados anteriormente. Fronie et al. (2013) referem que os efeitos carcinogênicos do tabaco e do álcool são potencializados pelo tempo de exposição a estes agentes, o que explica a maior ocorrência da neoplasia em indivíduos de idade avançada. Estudos recentes, no entanto, têm demonstrado um aumento da frequência do CEO em grupos etários mais jovens e em mulheres. Este fenômeno é atribuído a mudanças no estilo de vida destes pacientes, que incluem a crescente incorporação dos hábitos de tabagismo, etilismo e exposição a agentes biológicos (PIRES et al., 2013; BODNER et al., 2014). Na amostra estudada, verificou-se uma maior incidência de casos diagnosticados nos estágios TNM III e IV. Lesões de CELO são comumente diagnosticadas em estágios avançados, o que se relaciona, em parte, à demora dos pacientes na busca por tratamento, bem como à pouca prática do exame intraoral pelos cirurgiões-dentistas (PANZARELLA et al., 2014). Destaca-se que, nos estágios tardios, os pacientes tendem a apresentar maiores taxas de invasão dos tecidos adjacentes, metástases regionais e à distância, bem como elevada tendência ao desenvolvimento de tumores secundários (WOOLGAR; TRIANTAFYLLOU, 2011; NOGUTI et al., 2012). 80 Para o estudo morfológico, optamos por utilizar o SGHM preconizado por Bryne (1998), por estarmos em conformidade com a autora no tocante à relevância do front de invasão no comportamento biológico do CEO. Evidenciamos uma elevada ocorrência de casos classificados como alto grau de malignidade, que constituíram mais de 70% da amostra. Na análise da relação entre o estadiamento clínico TNM e a gradação histológica de malignidade, foi possível verificar um predomínio de casos de alto grau de malignidade, em estágios iniciais (I-II) e avançados (III-IV) do tumor. Corroborando estes achados, o estudo de Lindenblatt et al. (2012) constatou ausência de associação estatisticamente significativa entre a gradação histológica de Bryne (1998) e outras variáveis clinicopatológicas, incluindo o estadiamento clínico TNM, metástases nodais e desfecho da doença. Por outro lado, Vasconcelos et al. (2014) evidenciaram maior frequência de casos de baixo e alto grau de malignidade, respectivamente, nos estágios iniciais e avançados, sendo esta associação estatisticamente significativa. Os casos de CELO, em sua maioria, foram classificados em alto grau de malignidade conforme o sistema de Bryne (1998), independente da presença/ausência de metástase nodal no momento do diagnóstico. A ausência de associação estatisticamente significativa entre o grau histológico de malignidade (BRYNE, 1998) e as metástases nodais, verificada no presente estudo, confirma os resultados de pesquisas prévias (SILVEIRA et al., 2007; LINDENBLATT et al., 2012; VASCONCELOS et al., 2014; SAWAZAKI-CALONE et al., 2015). Outros SGHMs, a exemplo dos propostos pela OMS (CARDESA et al., 2005) e por Brandwein-Gensler et al. (2005), têm sido avaliados em estudos clinicopatológicos (MATOS et al., 2012; LING; MIJITI; MOMING, 2013; RODRIGUES et al., 2014; THIAGARAJAN et al., 2014; KOLOKYTHAS et al., 2015). A variabilidade nos resultados destas pesquisas pode ser atribuída, em parte, ao caráter subjetivo dos parâmetros analisados nos diferentes métodos de gradação histológica, que pode ocasionar divergências entre os examinadores. Conforme Johnson et al. (2005), não existem sistemas de gradação histológica de malignidade universalmente aceitos e que se relacionem de forma consistente com a ocorrência de metástases nodais no CEO. Sendo assim, o estadiamento clínico parece apresentar uma maior relevância no comportamento biológico desta neoplasia. O conhecimento dos fenômenos biológicos envolvidos na progressão de neoplasias malignas é de suma importância para a seleção de medidas terapêuticas adequadas. Neste contexto, estudos têm buscado elucidar os complexos mecanismos associados ao processo de metástase. Considerando que no CEO os vasos linfáticos constituem a principal via de 81 disseminação das células neoplásicas (AGARWAL et al., 2014), a linfangiogênese possivelmente contribui para o desenvolvimento de metástases nodais neste tumor (KYZAS et al., 2005; SARKIS et al., 2010). As células malignas também podem desempenhar um importante papel na disseminação linfática, tendo em vista que são capazes de simular vias moleculares relacionadas à migração de células dendríticas para os linfonodos de drenagem (MITEVA et al., 2010; ALBRECHT; CHRISTOFORI, 2011). Uma vez estabelecidas nestes órgãos, as células tumorais podem causar hiperplasia dos vasos linfáticos, um processo que parece não depender da linfangiogênese induzida no tumor primário (RUDDELL et al., 2008). A análise da imunoexpressão da podoplanina revelou vasos linfáticos de morfologias diversas. No front de invasão tumoral, a maior parte destes vasos exibiu lúmen aberto e bem delimitado. Por sua vez, os vasos linfáticos do centro tumoral apresentaram-se colapsados, com arquitetura irregular e lúmen inconspícuo, o que de acordo com Albrecht e Christofori (2011), pode refletir a alta pressão intratumoral a que estão expostos. As características morfológicas dos vasos linfáticos, evidenciadas na presente pesquisa, revelam concordância com os achados de Longatto Filho et al. (2007), Sousa et al. (2012) e Agarwal et al. (2014). Levando em consideração a arquitetura irregular dos vasos linfáticos intratumorais, Longatto Filho et al. (2007) sugerem que tais vasos apresentam uma contribuição limitada na disseminação metastática. De outro modo, defendem que os vasos linfáticos localizados no front de invasão desempenham um papel mais relevante no desenvolvimento das metástases nodais. Em consonância com estas hipóteses, os experimentos de Martins (2012) e Sousa et al. (2012) evidenciaram ausência de relação estatisticamente significativa da DLI com o estadiamento clínico TNM e a presença/ausência de metástase nodal. Não obstante, o presente estudo evidenciou que os casos de CEO em estágios avançados (III-IV), bem como aqueles com presença de metástases nodais, apresentaram DLI significativamente superior à dos casos nos estágios iniciais e não-metastáticos. Tais achados revelam concordância com estudos anteriores (ZHAO et al., 2008; ZHANG et al., 2011). Na presente pesquisa, a DLP exibiu valores mais elevados em casos de CELO nos estágios avançados (III-IV). Adicionalmente, os casos metastáticos apresentaram maior DLP em relação aos isentos de metástases. Contudo, as diferenças ora relatadas não apresentaram significância estatística, de forma semelhante ao verificado por Martins (2012) e Sousa et al. (2012). Por sua vez, Zhao et al. (2008) demonstraram relação significativa entre elevados valores de DLP e a presença de metástases nodais no momento do diagnóstico, o que sugere a relevância dos vasos linfáticos do front de invasão no potencial de agressividade do CELO. A 82 despeito da divergência de resultados entre os estudos, acrescenta-se que a indução da linfangiogênese não constitui o único mecanismo envolvido na disseminação metastática, tendo em vista que tumores malignos também são capazes de invadir vasos linfáticos preexistentes (SLEEMAN; SCHMID; THIELE, 2009). As densidades linfáticas do centro tumoral e front de invasão do CELO também não se associaram de forma significativa ao grau histológico de malignidade, avaliado por meio do sistema de Bryne (1998). Tais resultados estão de acordo com pesquisas realizadas previamente, nas quais foram adotados outros métodos de gradação histológica (LONGATTO FILHO et al., 2007; ZHAO et al., 2008; SOUSA et al., 2012; ALAEDDINI et al., 2015). Deste modo, supõe-se que os vasos linfáticos intra e peritumorais parecem não exercer grande influência sobre aspectos morfológicos do CELO. Com base nos achados pertinentes às densidades linfáticas, sugere-se uma possível associação dos vasos linfáticos intratumorais com o desenvolvimento de metástases em linfonodos regionais na amostra estudada. A despeito de suas características arquiteturais, os referidos vasos podem servir como condutores para as células neoplásicas, contribuindo para o seu estabelecimento nos linfonodos de drenagem. Além disso, o aumento da quantidade de vasos linfáticos peritumorais parece não se relacionar de forma direta a parâmetros clinicopatológicos do CELO. Há de se ressaltar que as neoplasias malignas dispõem de outros meios que propiciam a disseminação metastática, citando-se a migração das células tumorais em direção a estímulos quimiotáticos dos linfonodos (MITEVA et al., 2010; ALBRECHT; CHRISTOFORI, 2011), bem como a indução da linfangiogênese nestes órgãos (RUDDELL et al., 2008). Tumores malignos são constituídos por uma população diversificada de elementos estromais, que incluem células inflamatórias e endoteliais, fibroblastos, miofibroblastos, além das células neoplásicas. Os eventos biológicos mediados por estes componentes influenciam o crescimento tumoral, assim podendo contribuir para o desenvolvimento de metástases (ALAEDDINI et al., 2015). O aumento da população de mastócitos no microambiente tumoral tem sido reportado em neoplasias malignas de variadas localizações, a exemplo dos carcinomas colorretais (MARECH et al., 2014), de mama (XIANG et al., 2010), pulmão (CARLINI et al., 2010), colo uterino (UTRERA-BARILLAS et al., 2010) e cavidade oral (PYZIAK et al., 2013). Em estudo imuno-histoquímico, foi verificada elevação na densidade destas células em carcinomas epidermóides de lábio, em comparação a espécimes de QA e mucosa labial 83 normal. Para Souza-Freitas et al. (2011), tais achados sugerem uma possível contribuição dos mastócitos na carcinogênese labial. Mastócitos podem ser identificados em secções histológicas através de colorações especiais ou marcações imuno-histoquímicas. Alguns autores têm analisado a presença das referidas células em tumores malignos empregando a técnica do azul de toluidina a 1% (CHEEMA; RAMESH; BALAMURALI, 2012; ZAIDI; MALLICK, 2014; ALAEDDINI et al., 2015). É válido ressaltar que este corante detecta proteínas armazenadas nos grânulos citoplasmáticos e, portanto, pode não ser eficaz na identificação de mastócitos degranulados. Considerando que a triptase é uma enzima expressa pelas diferentes subpopulações de mastócitos (PYZIAK et al., 2013), optamos pela avaliação imuno-histoquímica desta proteína para efeito de análise destas células. O acúmulo de mastócitos no tecido neoplásico, possivelmente, ocorre mediante o recrutamento de células progenitoras através dos vasos sanguíneos situados nas proximidades do tumor. Mastócitos oriundos de tecidos vizinhos saudáveis também podem migrar para a região peritumoral (MALTBY; KHAZAIE; MCNAGNY, 2009; VIDAL et al., 2013). Cheema, Ramesh e Balamurali (2012) analisaram quantitativamente os mastócitos em espécimes teciduais de CEO com variados graus histológicos de malignidade, classificados de acordo com os critérios propostos pela OMS (CARDESA et al., 2005). Conforme relataram estes autores, os CEOs pobremente diferenciados exibiram densidades de mastócitos significativamente inferiores, quando comparados aos casos bem diferenciados e moderadamente diferenciados, o que poderia ser atribuído a falhas no recrutamento de mastócitos para o tecido neoplásico. Em contrapartida, o presente estudo não revelou diferenças estatisticamente significativas nas contagens de mastócitos entre os casos de baixo e alto grau de malignidade. Alaeddini et al. (2015) quantificaram estas células em espécimes de CEO, classificados de acordo com os critérios da Avaliação Histopatológica de Risco (BRANDWEIN-GENSLER et al., 2005). Os autores demonstraram não existir diferenças significativas nas contagens de mastócitos dos casos de CEO categorizados em “baixo grau” e “grau intermediário/alto”, o que corrobora em parte os achados desta pesquisa. Os mastócitos podem participar de diversos fenômenos envolvidos no crescimento de neoplasias malignas, a exemplo da liberação de fatores angio/linfangiogênicos e enzimas proteolíticas que contribuem para a degradação da matriz extracelular. Também é reconhecido o seu papel na regulação de respostas imunológicas antitumorais (MARONE et al., 2015). Destarte, um dos objetivos da presente pesquisa foi investigar a relação entre estas células 84 inflamatórias e os parâmetros clinicopatológicos do CELO. Foi verificado que as contagens de mastócitos, seja no centro tumoral ou front de invasão, não apresentaram relações estatisticamente significativas com o estadiamento clínico TNM, nem com as metástases nodais. Tais achados corroboram as conclusões de Oliveira-Neto et al. (2007) e sugerem que estas células não influenciaram de forma direta a progressão dos CELOs estudados. As discrepâncias entre os estudos podem resultar, em parte, da seleção de amostras heterogêneas. Alguns autores (PYZIAK et al., 2013; ZAIDI; MALLICK, 2014) analisaram a presença dos mastócitos em casos de CEO de variadas localizações anatômicas. A variabilidade nos métodos de contagem dos mastócitos também pode ocasionar resultados divergentes. Por exemplo, Oliveira-Neto et al. (2007) e Souza-Freitas et al. (2011) quantificaram as referidas células com o auxílio de retículo para estereologia acoplado a microscópio óptico. Pyziak et al. (2013), por sua vez, procederam à contagem dos mastócitos utilizando programas de computador adequados a esta finalidade. Ainda que os mastócitos tenham sido avaliados em relação ao seu potencial de induzir a linfangiogênese em tumores malignos (UTRERA-BARILLAS et al., 2011; RAICA et al., 2013), a contribuição destas células inflamatórias na formação de vasos linfáticos no CEO ainda não foi investigada. No presente estudo, a ausência de correlação estatisticamente significativa entre as densidades linfáticas e as contagens de mastócitos sugere que os efeitos biológicos das referidas células podem não ser determinantes para o processo de linfangiogênese. Considerando os resultados contrastantes reportados na literatura, assim como os achados da presente pesquisa, sugere-se a realização de estudos adicionais, com amostras mais amplas, visando proporcionar maiores esclarecimentos no tocante à influência dos mastócitos nos parâmetros clinicopatológicos do CEO, bem como a sua contribuição na linfangiogênese tumoral. 85 CONCLUSÕES 86 7 CONCLUSÕES Com base nos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que: 1. A densidade de vasos linfáticos do centro tumoral possivelmente influencia o desenvolvimento de metástases nodais. De outra forma, a densidade linfática peritumoral parece não ter relação direta com os parâmetros clinicopatológicos do carcinoma epidermóide de língua oral. 2. As contagens de mastócitos no front de invasão e centro tumoral não apresentaram relações estatisticamente significativas com o estadiamento clínico TNM nem com o desenvolvimento de metástases nodais. Apesar de desempenharem variadas funções pró- e antitumorais, os mastócitos não influenciaram de forma direta a progressão dos CELOs na amostra estudada; 3. Considerando a ausência de correlação estatisticamente significativa entre as densidades linfáticas e contagens de mastócitos, sugere-se que a quantidade destas células não seja um fator determinante para a linfangiogênese tumoral. 87 REFERÊNCIAS 88 REFERÊNCIAS ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2015. 552 p. AGARWAL, D. et al. Characterization, Localization and Patterning of Lymphatics and Blood Vessels in Oral Squamous Cell Carcinoma: A Comparative Study Using D2-40 and CD-34 IHC Marker. J Clin Diag Res. v.8, n.10, p.ZC86-ZC89, 2014. ALAEDDINI, M. et al. Association of Stromal Factors With the Histologic Risk Assessment Model in Oral Squamous Cell Carcinoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2015. No prelo. ALBRECHT, I.; CHRISTOFORI, G. Molecular mechanisms of lymphangiogenesis in development and cancer. Int J Dev Biol. v.55, n.4-5, p.483-494, 2011. ALBUQUERQUE, R.P. et al. A pioneering epidemiological study investigating the incidence of squamous cell carcinoma of tongue in a Portuguese population. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. v.17, n.4, p.e550-554, 2012. AMARASINGHE, H.K. et al. Diet and risk of oral potentially malignant disorders in rural Sri Lanka. J Oral Pathol Med. v.42, n.9, p.656-662, 2013. ANNEROTH, G.; BATSAKIS, J.; LUNA, M. Review of the literature and a recommended system of malignancy grading in oral squamous cell carcinoma. Scand J Dent Res. v.95, n.3, p.229-249, 1987. ARAÚJO JÚNIOR, R.F. et al. Prognostic significance of the anatomical location and TNM clinical classification in oral squamous cell carcinoma. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. v.13, n.6, p.E344-347, 2008. ASTARITA, J.L.; ACTON, S.E.; TURLEY, S.J. Podoplanin: emerging functions in development, the immune system, and cancer. Front Immunol. v.3, p.1-11, 2012. BAGAN, J.; SARRION, G.; JIMENEZ, Y. Oral cancer: clinical features. Oral Oncol. v.46, n.6, p.414-417, 2010. BALUK, P. et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. v.204, n.10, p.2349-2362, 2007. BATISTA, A.C. et al. Distinctive clinical and microscopic features of squamous cell carcinoma of oral cavity and lip. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. v.109, n.3, p.e74-79, 2010. BODNER, L. et al. Oral squamous cell carcinoma in patients twenty years of age or younger – review and analysis of 186 reported cases. Oral Oncol. v.50, n.2, p.84-89, 2014. 89 BRANDWEIN-GENSLER, M. et al. Oral squamous cell carcinoma: histologic risk assessment, but not margin status, is strongly predictive of local disease-free and overall survival. Am J Surg Pathol. v.29, n.2, p.167-178, 2005. BRODERS, A.C. Squamous-cell epithelioma of the lip. A study of five hundred and thirty-seven cases. J Am Med Assoc. v.74, n.10, p.656-664, 1920. BRYNE, M. et al. New malignancy grading is a better prognostic indicator than Broders´grading in oral squamous cell carcinomas. J Oral Pathol Med. v.18, n.8 p.432- 437, 1989. BRYNE, M. et al. Malignancy grading of the deep invasive margins of oral squamous cell carcinomas has high prognostic value. J Pathol. v.166, n.4, p.375-381, 1992. BRYNE, M. Is the invasive front of an oral carcinoma the most important area for prognostication? Oral Dis. v.4, n.2 p.70-77, 1998. CARDESA, A. et al. Squamous cell carcinoma. In: BARNES, L. et al. World Health Organization classification of tumors: pathology and genetics of head and neck tumors. IARC. Press: Lyon, p.118-121, 2005. CARLINI, M.J. et al. Mast cell phenotypes and microvessels in non-small cell lung cancer and its prognostic significance. Hum Pathol. v.41, n.5, p.697-705, 2010. CHEEMA, V.S.; RAMESH, V.; BALAMURALI, P.D. The relevance of mast cells in oral squamous cell carcinoma. J Clin Diagn Res. v.6, n.10, p.1803-1807, 2012. CIMPEAN, A.M.; RAICA, M. Lymphangiogenesis and Inflammation–Looking for the “Missing Pieces” of the Puzzle. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). v.63, n.6, p.415-426, 2015. DYDUCH, G.; KACZMARCZYK, K.; OKOŃ, K. Mast cells and cancer: enemies or allies? Pol J Pathol. v.63, n.1, p.1-7, 2012. FANG, Q.G. et al. Tongue squamous cell carcinoma as a possible distinct entity in patients under 40 years old. Oncol Lett. v.7, n.6, p.2099-2102, 2014. FRONIE, A. et al. Squamous cell carcinoma of the oral cavity: clinical and pathological aspects. Rom J Morphol Embryol. v.54, n.2, p.343-348, 2013. GOMES, A.P. et al. Comparative analysis of the mast cell density in normal oral mucosa, actinic cheilitis and lip squamous cell carcinoma. Braz Dent J. v.19, n.3, p.186-189, 2008. HERNÁNDEZ-GUERRERO, J.C. et al. Prevalence trends of oral squamous cell carcinoma. Mexico City´s General Hospital experience. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. v.18, n.2, p.e306-311, 2013. HILLBERTZ, N.S. et al. Viral and molecular aspects of oral cancer. Anticancer Res. v.32, n.10, p.4201-4212, 2012. 90 IAMAROON, A. et al. Increase of mast cells and tumor angiogenesis in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med. v.32, n.4, p.195-199, 2003. IKEHATA, H.; ONO, T. The mechanisms of UV mutagenesis. J Radiat Res. v.52, n.2, p.115-125, 2011. INCA. Estimativa 2014: Incidência de Câncer no Brasil. 2014. Disponível em: . Acesso em: 12 jan. 2015. JAKOBSSON, P.A. et al. Histologic classification and grading of malignancy in carcinoma of the larynx. Acta Radiol Ther Phys Biol. v.12, n.1, p.1-8, 1973. JIN, S. et al. Clinicopathological significance of lymphatic vessel density marked by D2- 40 and E-cadherin expression in non-small-cell lung cancer. Med Oncol. v.29, n.5, p.3157-3161, 2012. JOHNSON, N. et al. Squamous cell carcinoma. In: BARNES, L. et al. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Head and Neck Tumours. IARC Press: Lyon, p.168-176, 2005. JOHNSON, N.W.; JAYASEKARA, P.; AMARASINGHE, A.A. Squamous cell carcinoma and precursor lesions of the oral cavity: epidemiology and aetiology. Periodontol. 2000. v.57, n.1, p.19-37, 2011. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 12. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. 538 p. KAMINAGAKURA, E. et al. Case-control study on prognostic factors in oral squamous cell carcinoma in young patients. Head Neck. v.32, n.11 p.1460-1466, 2010. KARPANEN, T., ALITALO, K. Molecular biology and pathology of lymphangiogenesis. Annu Rev Pathol. v.3, p.367-397, 2008. KOLOKYTHAS, A. et al. Squamous cell carcinoma of the oral tongue: histopathological parameters associated with outcome. Int J Oral Maxillofac Surg. v.44, n.9, p.1069-1074, 2015. KREPPEL, M. et al. Prognostic value of the sixth edition of the UICC´s TNM classification and stage grouping for oral cancer. J Surg Oncol. v.102, n.5, p.443-449, 2010. KUNDER, C.A.; ST JOHN, A.L.; ABRAHAM, S.N. Mast cell modulation of the vascular and lymphatic endothelium. Blood. v.118, n.20, p.5383-5393, 2011. KYZAS, P.A. et al. Evidence for lymphangiogenesis and its prognostic implications in head and neck squamous cell carcinoma. J Pathol. v.206, n.2, p.170-177, 2005. 91 KYZAS, P.A. et al. Dysadherin expression in head and neck squamous cell carcinoma: association with lymphangiogenesis and prognostic significance. Am J Surg Pathol. v.30, n.2, p.185-193, 2006. LAMBERT, R. et al. Epidemiology of cancer from the oral cavity and oropharynx. Eur J Gastroenterol Hepatol. v.23, n.8, p.633-641, 2011. LINDENBLATT, R.C. et al. Oral squamous cell carcinoma grading systems – analysis of the best survival predictor. J Oral Pathol Med. v.41, n.1, p.34-39, 2012. LING, W.; MIJITI, A.; MOMING, A. Survival pattern and prognostic factors of patients with squamous cell carcinoma of the tongue: a retrospective analysis of 210 cases. J Oral Maxillofac Surg. v.71, n.4, p.775-785, 2013. LONGATTO FILHO, A. et al. How useful is the assessment of lymphatic vascular density in oral carcinoma prognosis? World J Surg Oncol. v.5, n.140, p.1-9, 2007. LOURENÇO, S.Q.C. et al. Classificações histopatológicas para o carcinoma de células escamosas da cavidade oral: revisão de sistemas propostos. Rev Bras Cancerol. v.53, n.3, p.325-333, 2007. MALTBY, S.; KHAZAIE, K.; MCNAGNY, K.M. Mast cells in tumor growth: angiogenesis, tissue remodelling and immune-modulation. Biochim Biophys Acta. v.1796, n.1, p.19-26, 2009. MARECH, I. et al. Possible biological and translational significance of mast cells density in colorectal cancer. World J Gastroenterol. v.20, n.27, p.8910-8920, 2014. MAROCCHIO, L.S. et al. Oral squamous cell carcinoma: an analysis of 1,564 cases showing advances in early detection. J Oral Sci. v.52, n.2, p.267-273, 2010. MARONE, G. et al. Mast cells and basophils in inflammatory and tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Eur J Pharmacol. 2015. No prelo. MARTINS, A.R.L.A. Imunoexpressão de VEGF-C, VEGF-3, HIF-1α e mensuração da densidade linfática em carcinomas epidermóides de lábio inferior metastáticos e não-metastáticos: uma relação com parâmetros clinicopatológicos e prognósticos. 221 f. Tese (Doutorado em Patologia Oral). Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Natal, 2012. MATOS, F.R. et al. Analysis of inflammatory infiltrate, perineural invasion, and risk score can indicate concurrent metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue. J Oral Maxillofac Surg. v.70, n.7, p.1703-1710, 2012. MITEVA, D.O. et al. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ Res. v.106, n.5, p.920-931, 2010. MONTERO, P.H.; PATEL, S.G. Cancer of the oral cavity. Surg Oncol Clin N Am. v.24, n.3, p.491-508, 2015. 92 NOGUTI, J. et al. Metastasis from oral cancer: an overview. Cancer Genomics Proteomics. v.9, n.5, p.329-335, 2012. OKADA, Y. Relationships of cervical lymph node metastasis to histopathological malignancy grade, tumor angiogenesis, and lymphatic invasion in tongue cancer. Odontology. v.98, n.2, p.153-159, 2010. OLIVEIRA-NETO, H.H. et al. Decrease in mast cells in oral squamous cell carcinoma: possible failure in the migration of these cells. Oral Oncol. v.43, n.5, p.484-490, 2007. ORDÓÑEZ, N.G. Podoplanin: a novel diagnostic immunohistochemical marker. Adv Anat Pathol. v.13, n.2, p.83-88, 2006. PANZARELLA, V. et al. Diagnostic delay in oral squamous cell carcinoma: the role of cognitive and psychological variables. Int J Oral Sci. v.6, n.1, p.39-45, 2014. PETTI, S. Lifestyle risk factors for oral cancer. Oral Oncol. v.45, n.4-5, p.340-350, 2009. PIRES, F.R. et al. Oral squamous cell carcinoma: clinicopathological features from 346 cases from a single oral pathology service during an 8-year period. J Appl Oral Sci. v.21, n.5, p.460-467, 2013. PYZIAK, L. et al. Immunohistochemical analysis of mast cell infiltrates and microvessel density in oral squamous cell carcinoma. Pol J Pathol. v.64, n.4, p.276-280, 2013. RAICA, M. et al. Interplay between mast cells and lymphatic vessels in different molecular types of breast cancer. Anticancer Res. v.33, n.3, p.957-963, 2013. RIBATTI, D.; CRIVELLATO, E. Mast cells, angiogenesis, and tumour growth. Biochim Biophys Acta. v.1822, n.1, p.2-8, 2012. RIBATTI, D.; RANIERI, G. Tryptase, a novel angiogenic factor stored in mast cell granules. Exp Cell Res. v.332, n.2, p.157-162, 2015. RODRIGUES, P.C. et al. Clinicopathological prognostic factors of oral tongue squamous cell carcinoma: a retrospective study of 202 cases. Int J Oral Maxillofac Surg. v.43, n.7, p.795-801, 2014. RUBACK, M.J. et al. Clinical and epidemiological characteristics of patients in the head and neck surgery department of a university hospital. São Paulo Med J. v.130, n.5, p.307-313, 2012. RUDDELL, A. et al. Dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging of tumor- induced lymph flow. Neoplasia, v.10, n.7, p.706-713, 2008. SARKIS, S.A. et al. Immunohistochemical expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) in oral squamous cell carcinoma in relation to proliferation, apoptosis, angiogenesis, and lymphangiogenesis. Head Neck Oncol. v.2, n.13, p.1-8, 2010. 93 SAWAZAKI-CALONE, I. et al. The prognostic value of histopathological grading systems in oral squamous cell carcinomas. Oral Dis. v.21, n.6, p.755-761, 2015. SCHACHT, V. et al. Up-regulation of the lymphatic marker podoplanin, a mucin-type transmembrane glycoprotein, in human squamous cell carcinomas and germ cell tumors. Am J Pathol. v.166, n.3, p.913-921, 2005. SCHOR, A.M. et al. Assessment of vascularity in histological sections: effects of methodology and value as an index of angiogenesis in breast tumours. Histochem J. v.30, n.12, p.849-856, 1998. SCULLY, C.; BAGAN, J. Oral squamous cell carcinoma: overview of current understanding of aetiopathogenesis and clinical implications. Oral Dis. v.15, n.6, p.388- 399, 2009. SILVA, C.C.; AMARAL, B.; BULHOSA, J.F. Carcinoma Espinocelular da Língua – Factores de Risco e Importância do Reconhecimento de Lesões Pré-Malignas. Rev Port Estomatol Med Dent Cir Maxilofac. v.51, n.1, p.49-55, 2010. SILVEIRA, E.J. et al. Correlation of clinical, histological, and cytokeratin profiles of squamous cell carcinoma of the oral tongue with prognosis. Int J Surg Pathol. v.15, n.4, p.376-383, 2007. SLEEMAN, J.; SCHMID, A.; THIELE, W. Tumor lymphatics. Semin Cancer Biol. v.19, n.5, p.285-297, 2009. SOBIN, L.H.; WITTEKIND, C. TNM Classification of Malignant Tumors. 6. ed. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc., 2002. SOUSA, S.F. et al. Lymphangiogenesis and podoplanin expression in oral squamous cell carcinoma and the associated lymph nodes. Appl Immunohistochem Mol Morphol. v.20, n.6, p.588-594, 2012. SOUZA-FREITAS, V. et al. Mast cells and matrix metalloproteinase 9 expression in actinic cheilitis and lip squamous cell carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. v.112, n.3, p.342-348, 2011. THIAGARAJAN, S. et al. Predictors of prognosis for squamous cell carcinoma of oral tongue. J Surg Oncol. v.109, n.7, p.639-644, 2014. UTRERA-BARILLAS, D. et al. The role of macrophages and mast cells in lymphangiogenesis and angiogenesis in cervical carcinogenesis. Exp Mol Pathol. v.89, n.2, p.190-196, 2010. VAN DER AUWERA, I. et al. First international consensus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid human tumours. Br J Cancer. v.95, n.12, p.1611-1625, 2006. 94 VARGAS-FERREIRA, F. et al. Etiologic factors associated with oral squamous cell carcinoma in non-smokers and non-alcoholic drinkers: a brief approach. Braz Dent J. v.23, n.5, p.586-590, 2012. VASCONCELOS, M.G. et al. Squamous cell carcinoma of the tongue: clinical and morphological analysis of 57 cases and correlation with prognosis. J Bras Patol Med Lab. v.50, n.5, p.359-363, 2014. VIDAL, M.T. et al. Density of mast cells and microvessels in minor salivary gland tumors. Tumour Biol. v.34, n.1, p.309-316, 2013. VITTE, J. Human mast cell tryptase in biology and medicine. Mol Immunol. v.63, n.1, p.18-24, 2015. WANG, X.L. et al. Different significance between intratumoral and peritumoral lymphatic vessel density in gastric cancer: a retrospective study of 123 cases. BMC Cancer. v.10, p.1-11, 2010. WANG, Y.; OLIVER, G. Current views on the function of the lymphatic vasculature in health and disease. Genes Dev. v.24, n.19, p.2115-2126, 2010. WARNAKULASURIYA, S. Living with oral cancer: Epidemiology with particular reference to prevalence and life-style changes that influence survival. Oral Oncol. v.46, n.6, p.407-410, 2010. WEIDNER, N. et al. Tumor angiogenesis and metastasis – correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med. v.324, n.1, p.1-8, 1991. WEIJERS, M. et al. Malignancy grading is no better than conventional histopathological grading in small squamous cell carcinoma of tongue and floor of mouth: retrospective study in 128 patients. J Oral Pathol Med. v.38, n.4, p.343-347, 2009. WELLER, C.L. et al. Mast cells in health and disease. Clin Sci (Lond). v.120, n.11, p.473-484, 2011. WICKI, A.; CHRISTOFORI, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. v.96, n.1, p.1-5, 2007. WOOLGAR, J.A., TRIANTAFYLLOU, A. Squamous cell carcinoma and precursor lesions: clinical pathology. Periodontol 2000. v.57, n.1, p.51-72, 2011. XIANG, M. et al. Mast cell tryptase promotes breast cancer migration and invasion. Oncol Rep. v.23, n.3, p.615-619, 2010. ZAIDI, M.; MALLICK, A. A study on assessment of mast cells in oral squamous cell carcinoma. Ann Med Health Sci Res. v.4, n.3, p.457-460, 2014. ZHANG, Z. et al. Survey of risk factors contributed to lymphatic metastasis in patients with oral tongue cancer by immunohistochemistry. J Oral Pathol Med. v.40, n.2, p.127- 134, 2011. 95 ZHAO, D. et al. Intratumoral lymphangiogenesis in oral squamous cell carcinoma and its clinicopathological significance. J Oral Pathol Med. v.37, n.10, p.616-625, 2008. ZHAO, Y.C. et al. Peritumoral lymphangiogenesis induced by vascular endothelial growth factor C and D promotes lymph node metastasis in breast cancer patients. World J Surg Oncol. v.10, n.165, p.1-9, 2012. ZINI, A.; CZERNINSKI, R.; SGAN-COHEN, H.D. Oral cancer over four decades: epidemiology, trends, histology, and survival by anatomical sites. J Oral Pathol Med. v.39, n.4, p.299-305, 2010. ZUSTIN, J.; SCHEUER, H.A.; FRIEDRICH, R.E. Podoplanin expression in human tooth germ tissues and cystic odontogenic lesions: an immunohistochemical study. J Oral Pathol Med. v.39, n.1, p.115-120, 2010. 96 APÊNDICES 97 APÊNDICE A - Solicitação de dispensa do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. 98 APÊNDICE B - Ficha de coleta dos dados referentes aos pacientes portadores de carcinoma epidermóide de língua oral. FICHA CLÍNICA Nº DO PRONTUÁRIO: ________ DATA DE NASCIMENTO: ____/____/____ IDADE: ______ SEXO: ( ) MASCULINO ( ) FEMININO TABAGISMO: ( ) SIM ( ) NÃO ETILISMO: ( ) SIM ( ) NÃO LOCALIZAÇÃO ANATÔMICA: ________________________________________ ESTADIAMENTO CLÍNICO: T___ N___ M___ EXCISÃO CIRÚRGICA: ( ) SIM ( ) NÃO DATA: ___/___/___ RADIOTERAPIA: ( ) SIM ( ) NÃO INÍCIO: ___/___/___ QUIMIOTERAPIA: ( ) SIM ( ) NÃO INÍCIO: ___/___/___ Nº DO BLOCO: ___________________ BIÓPSIA: ( ) EXCISIONAL ( ) INCISIONAL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO: ___________________________________ METÁSTASE NODAL: ( ) SIM ( ) NÃO DATA: ___/___/___ METÁSTASE À DISTÂNCIA: ( ) SIM ( ) NÃO DATA: ___/___/___ OBSERVAÇÕES: ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 99 APÊNDICE C - Ficha para coleta de dados referentes à gradação histológica de malignidade, segundo o sistema de Bryne (1998). Nº Grau de ceratinização Pleomorfismo nuclear Padrão de invasão Infiltrado inflamatório Escore total Gradação histológica 100 APÊNDICE D - Ficha para coleta de dados referentes à densidade linfática, a partir de imunomarcação com o anticorpo D2-40, nos carcinomas epidermóides de língua oral. Nº DO CASO: _______ REGIÃO INTRATUMORAL: Número de vasos linfáticos Campos microscópicos Total Média 1 2 3 4 5 REGIÃO PERITUMORAL: Número de vasos linfáticos Campos microscópicos Total Média 1 2 3 4 5 101 APÊNDICE E - Ficha para coleta de dados referentes à contagem de mastócitos, identificados como células imunomarcadas pelo anticorpo anti-triptase, nos carcinomas epidermóides de língua oral. Nº DO CASO: _______ REGIÃO INTRATUMORAL: Número de mastócitos Campos microscópicos Total Média 1 2 3 4 5 REGIÃO PERITUMORAL: Número de mastócitos Campos microscópicos Total Média 1 2 3 4 5 102 ANEXO 103 ANEXO - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte-Riograndense Contra o Câncer. 104