ADRIANE TRINDADE MEDEIROS LIMA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE E ANTIINFLAMATÓRIO DE GALACTOMANANA DO FUNGO Tylopilus ballouii NATAL 2009 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA ADRIANE TRINDADE MEDEIROS LIMA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE E ANTIINFLAMATÓRIO DE GALACTOMANANA DO FUNGO Tylopilus ballouii NATAL Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Profa. Dra. Edda Lisboa Leite        2009 Agradeço à excelente mestre, mãe, amiga, e principalmente a Mulher Edda Lisboa Leite, minha orientadora, por ter me aceitado e me incentivado sempre nesta caminhada, pela simplicidade, generosidade e ética com qual transmite todos os seus conhecimentos e por expressá-los com tamanha humildade. Aprendi com a primavera a deixar-me cortar e voltar sempre inteira”. Cecília Meireles À minha família. Em especial a minha mãe, pelo seu incentivo para que eu voltasse aos estudos, pela educação transmitida com carinho e amor, pelos valores ensinados durante todos esses anos e pela sabedoria da luz divina que lhes foi dada para orientar e encaminhar seus filhos para a luz da sabedoria humana. A minha existência não teria sentido algum sem a tua presença constante na minha vida. A minha vozinha Expedita pelas suas constantes orações em minha intenção e ao meu avô Beto por suas palavras carinhosas sempre que ligo para saber como eles estão. A minha alma sempre fica alimentada quando falo com vocês. Ao meu filho Anthony motivo pelo qual busco sempre o melhor para poder oferecê- lo de maneira incondicional. A minha mãe de Natal (RN). Dona Fátima que cuida de mim desde que comecei a minha graduação por ter dedicado seu valioso tempo na minha recuperação. Amo muito você. E claro a Denise por aceitar sem ciúmes (raridade) tamanha dedicação de sua mãe para comigo. A Alfredo Luis “In memória” pelo grande homem, médico, amigo e mestre brilhante que me inspirou na escolha da minha profissão. Mestre querido tua grandeza e elevação espiritual foram percebidas e sentidas por todos aqueles que tiveram a oportunidade de estarem ao seu lado. “A Biologia é pura arte, nós somos seus admiradores e DEUS o maior dos artistas”. Alfredo Luis- -Fred -Dr. Formiga. A Marília por todos os momentos bons e difíceis que passamos nestes dois anos de mestrado e principalmente pela imensa força que me deu há um ano, momento que mais precisei e até pensei em desistir. Obrigada nêga, tu és uma pessoa de grande personalidade e que estimo muito. A Monique, companheira de experimentos. Tenho muito orgulho de ter conhecido uma pessoa tão especial como você. Torço pelas suas vitorias que serão muitas. A Almino pela tranqüilidade e sensatez que sempre fez questão de nós passar. E a sua valiosa ajuda com seus conhecimentos histológicos. Obrigada, boa sorte no seu projeto e vê se não erra meu nome nos agradecimentos. A Alisson, pequeno grande homem. Obrigada pela paciência nestes últimos momentos da realização deste trabalho. A Thuane pela sua amizade e excelentes ajudas na realização dos experimentos in vivo. A Luiza (lulu), Karhen e sua mãe Dona Raimunda pelas conversas prazerosas e grandes conselhos passados nas várias caronas que me deram no trajeto de volta para casa. Amei conhecé-las! A Leonardo, o cara. Obrigada por toda ajuda com as formatações, onde sou lenta demais, e em especial por ter me dado a oportunidade de conhecê-lo melhor fazendo com que eu aprendesse que neste mundo não devemos nunca pré-julgar os outros pelas opiniões de outrem. Sua autenticidade é maravilhosa. A Thiago, Kahena, Lissandra, Maria Emília e Celina que apesar de não termos compartilhado muito tempo juntos no dia-dia do laboratório, não deixaram de ter sua importância nesta jornada. A todos do departamento que contribuíram em alguma parte neste trabalho, em especial a Cleisyvan, Norberto, Mariana, Nedinaldo e Ana Katarina. A Virginia e a Sheila que com palavras de incentivo para minha amiga Carol, também me ajudaram a continuar lutando pelos meus objetivos. Muitas vezes quando agimos com pureza no coração, mesmo que indiretamente podemos acrescentar muito aos nossos semelhantes. A Carol Perez amiga que quero levar para sempre em meu coração, pois pessoas como você neste mundo estão em extinção. Valeu Carol tudo que passamos foi para o nosso engrandecimento tenha certeza, pois nada acontece por acaso. Adoloo ocê! A turma da limpeza Jonas, Ângela e seu Raimundo pela ajuda no biotério e no laboratório tornando o ambiente mais agradável de trabalhar. A turma da secretaria, Ricardo, Rogério e Olívia, por sempre nos atenderem de maneira educada e prestativa. A todos os meus amigos fora da universidade pela compreensão das ausências do nosso convívio. É bom saber que fazemos falta! Márcia, Marina, Camila, Vanda, Jaíra, Eruska, obrigada pelo carinho. Ao casal mais lindo e especial do Jiqui, Tereza e Junior e sua irmã Mariney e netinho Gabriel pelos momentos de descontração nas caminhadas pelos quarteirões com nossos amigos LayKa, fofinha,Duque e Princesinha. Ao meu eterno e mais fiel amigo Lion pelo amor sem cobranças. Os cincos anos que passei com a sua existência foram muitos felizes, principalmente quando chegava à casa arrasada e o primeiro que ia me receber era você sempre com muita felicidade. A Roberta Godone por me apresentar a umas das pessoas mais ilustres do Departamento da Bioquímica, a professora Dilma Lima, exemplo de determinação, competência e sabedoria. Professora Dilma, minha eterna gratidão por todo apoio que me deste. A Thiago Dk pelo auxilio técnico no meu computador que insistia em quebrar nos momentos em que eu mais precisava. A minha cunhada Ellen Fabiana por me proporcionar momentos maravilhosos na leitura de livros, fontes não científica, os quais foram também muito importantes para escrita deste projeto. A professora Luciana Da Matta por ter me despertado o interesse pela Bioquímica nas suas excelentes aulas da graduação. A professora Selma Jerônimo pela compreensão, oportunidade que me foi dada e principalmente pela ética com a qual conduz os seus atos. Aos vários amigos do Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia, em especial a Bianca e ao professor Iure que me auxiliaram na coleta e na pesquisa dos fungos. A Creuza, uma página seria pouco para agradecer-te. És uma pessoal de beleza única, com infinitas qualidades, obrigada por estar sempre ao meu lado, me incentivando, se preocupado, me aconselhando, sentirei saudades da nossa convivência e dos nossos banquetes. A Capes pela concessão de bolsa em parte do meu trabalho e a UFRN pela disponibilidade do espaço físico. Pelo simples bom dia, pelas conversas informais ou de ajuda no trabalho de rotina ou nas fases preliminares do projeto ou ajudas em formas de “dicas” para os experimentos. Enfim, por tudo e por não ter estado sozinho, venho agradecer a todos que contribuíram direta ou indiretamente para este trabalho. E em especial ao meu GRANDE amigo JESUS CRISTO por proporcionar sempre na minha vida a oportunidade de conviver com pessoas iluminadas. Por estar sempre ao meu lado nos bons e maus momentos e sempre usar as pessoas certas para representá-lo em corpo. A ti Senhor todo Honra e toda Glória. “De todos os bens que a sabedoria nos faculta como meio de obter a nossa felicidade, o da amizade é de longe o maior”. Epicuro, 341-270 a.C "É melhor tentar, ao invés de sentar-se e nada fazer; É melhor falhar, mas não deixar a vida passar; Eu prefiro na chuva caminhar, do que em dias tristes em casa me esconder; Prefiro ser feliz, embora louco, do que viver infeliz em são conformismo". Martin Luther King RESUMO Polímeros da parede celular de fungos são conhecidos por possuírem muitas atividades biológicas como suas ações antiinflamatórias, antioxidante e antitumoral. Polissacarídeos de diferentes pesos moleculares obtidos de cogumelos podem ativar os leucócitos, estimular a atividade fagocítica, citotóxica e antimicrobiana, incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio. No presente estudo, foi investigada a característica química dos polissacarídeos extraídos de Tylopilus ballouii sua atividade antioxidante in vitro e a sua atividade antiinflamatória no modelo de inflamação aguda. Os resultados mostraram que foram extraídos predominantemente polissacarídeos e esses consistiram primariamente de manose e galactose e possui quantidades variáveis de xilose e fucose. As análises de infravermelho mostraram a possível interação entre estes polissacarídeos e proteínas. Além disso, seu peso molecular é de cerca de 140 kDa. A atividade antioxidante foi testada com relação ao “seqüestro” sobre os radicais superóxido e hidroxila, atividade antioxidante total e peroxidação lipídica. Com relação à inibição da formação dos radicais superóxido e hidroxila, os polissacarídeos atingiram um IC50 de 1,64 e 1,25 mg/ml, respectivamente. Os resultados do ensaio de peroxidação lipídica mostraram que os polissacarídeos de Tylopilus ballouii apresentam um IC50 de 1,65 mg/ml. Além disso, a atividade antiinflamatória mostrou que eles agem reduzindo o edema em 32,8, 42 e 56% nas doses de 30, 50 e 70 mg/kg, respectivamente. Assim, estes resultados podem indicar o possível uso dos polissacarídeos de Tylopilus ballouii como antiinflamatório e antioxidante. Palavras-chave: Polissacarídeos; Cogumelo; radicais livres; inflamação. ABSTRACT Polymers of mushroom cellular wall are recognized for presenting a lot of biological activities such as anti-inflammatory, antioxidant and anti-tumoral action. Polysaccharides from mushrooms of different molecular mass obtained mushrooms can activate leucocytes, stimulate fagocitic, citotoxic and antimicrobial activity including oxygen reactive species production. In this study were investigated chemical characteristics, in vitro antioxidant activity and anti-inflammatory action in an acute inflammation model of the polysaccharides extracted from Tylopilus ballouii. Results showed that were mainly extracted polysaccharides and that it primarily consisted of mannose and galactose with variable amounts of xylose and fucose. Infrared analysis showed a possible interation between this polysaccharides and proteins. In addition, molecular mass was about 140KDa. Antioxidant activity was tested by superoxide and hydroxyl radical scavenging assay, total antioxidant activity and lipid peroxidation assay. For superoxide and hydroxyl radical generation inhibition, polysaccharides have an IC50 of 2.36 and 0.36 mg/mL, respectively. Lipid peroxidation assay results showed that polysaccharides from Tylopilus ballouii present an IC50 of 3.42 mg/mL. Futhermore, anti-inflammatory assay showed that polysaccharides cause an paw edema decreasing in 32.8, 42 and 56% in 30, 50 and 70 mg/Kg dose, respectively. Thus, these results can indicate a possible use for these polysaccharides from Tylopilus ballouii as an anti-inflammatory and antioxidant. Keywords: Polysaccharides; Mushroom; free radicals, inflammation. LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Mecanismo de interação entre as células sanguíneas a partir de um estímulo tecidual (injúria vascular). 19 FIGURA 2 Processo de formação de espécie reativa de oxigênio (EROS) 20 FIGURA 3 Representação esquemática da conformação induzida por temperatura da solução de lentinana a 137 °C 29 FIGURA 4 Estrutura parcial da galactomana e suas respectivas unidades monossacarídicas. 30 FIGURA 5 Fungo Tylopilus ballouii 34 FIGURA 6 Organograma da metodologia 37 FIGURA 7 Esquema de obtenção do composto do fungo T. ballouii 42 FIGURA 8 Percentual dos constituintes açúcares totais e proteínas após extração de T. balloui 52 FIGURA 9 Cromatografia descendente em papel do hidrolisado dos polissacarídeos de T. ballouii utilizando como padrão monossacarídeos. A: Sistema solvente Acetato de etila: Piridina: água. B: Sistema solvente Butanol: Ácido acético: água 53 FIGURA 10 Cromatografia em HPLC da fração polissacarídica do fungo T. ballouii e eluição em gradiente de água e acetonitrila. 54 FIGURA 11 Perfil dos polissacarídeos do fungo T. ballouii em cromatografia gel filtração. 55 FIGURA 12 Espectro de Infravermelho dos polissacarídeos do fungo T. ballouii. 56 FIGURA 13 Espectros de RMN de 1H obtidos das frações de polissacarídeos de T. balloui. 58 FIGURA 14 Efeito antiinflamatório dos polissacarídeos de T. ballouii no modelo de edema plantar induzido por carragenana. 60 FIGURA 15 Efeito antiinflamatório dos polissacarídeos de T. ballouii (70 mg/kg) e antiinflamatórios como diclofenaco de sódio e 61 indometacina no modelo de edema plantar induzido por carragenana. FIGURA 16 Análises histológicas (HEX200) da pata de animais com edema plantar induzido por carragenana. A- Controle positivo; B – Tylopilus SP (30 mg/kg); C – Tylopilus SP (50 mg/kg); D – Tylopilus SP (70 mg/kg); E- Diclofenaco de sódio; F- Indometacina; G- Controle negativo 62 FIGURA 17 Efeito dos polissacarídeos de Tylopilus ballouii sobre a viabilidade celular no lavado peritoneal de camundongos Swiss 63 FIGURA 18 Efeito inibitório dos radicais superóxido pelos polissacarídeos do fungo T. balloui 64 FIGURA 19 Efeito inibitório dos radicais hidroxilas pelos polissacarídeos do fungo T. ballouii 65 FIGURA 20 Capacidade antioxidante total dos polissacarídeos do fungo T. ballouii 66 FIGURA 21 Inibição da Peroxidação Lipídica da membrana da gema de ovos pelos polissacarídeos do fungo T. balloui 67 LISTA DE TABELAS TABELA 1 Fontes usuais de alguns polissacarídeos 25 TABELA 2 Homo- e heteropolissacarídeos produzidos por fungos filamentosos 27 TABELA 3 Análise da composição centesimal do fungo T .balloui 51 TABELA 4 Composição monossacarídica dos polissacarídeos do fungo T. ballouii 54 TABELA 5 Sinais de hidrogênio (H) nos espectros de RMN de 1H encontrados na literatura e na fração de polissacarídeos de T. ballouii. 57 TABELA 6 Valores de IC50 de polissacarídeos de T. balloui 68 LISTA DE ABREVIATURAS µg Micrograma OH • Radical hidroxila ARA Arabinose CDP Cromatrografia descendente em papel COX Ciclooxigenase COX- 1 Ciclooxigenase 1 COX-2 Ciclooxigenase 2 EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético EPS Exopolissacarídeos EROS Espécies Reativas do Oxigênio FUC Fucose g Grama GAL Galactose GL Glicose h Hora HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência i.p Via intraperitoneal IFN-α Interferon α IFN-γ Interferon β IL-1 Interleucina 1 IL-1ß Interleucina 1ß IL-6 Interleucina 6 IL-8 Interleucina 8 IV infravermelho MAN Manose MDA Malonildialdeíldo ml Mililitro mM Milimolar N Normal NADH Nicotinamina adenina dinucleotídeo NBT Nitroblue tetrazolium O2•− Radical ânion superóxido ºC Graus centígrados PBS Tampão salina fosfato PG Prostaglandina RMN Ressonância magnética nuclear TNFα Fator de Necrose Tumoral α TR Tempo de retenção Vf Volume final Vi. Volume inicial Vp Volume da pata XIL Xilose α Alfa β Beta δ Deslocamento químico em PPM ÍNDICE Página RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS... 1- INTRODUÇÃO 19 1.1 INFLAMAÇÃO. 19 1.2 RADICAIS LIVRES. 20 1.3 ASPECTOS GERAIS DOS FUNGOS 22 1.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DOS POLISSACARÍDEOS DOS FUNGOS 23 1.5 GALACTOMANANAS 29 1.6..GÊNERO TYLOPILUS 31 2 - OBJETIVOS. 33 2.1 – Objetivo Geral. 33 2.2 – Objetivo Específicos. 33 3 – MATERIAIS E MÉTODOS 34 3.1 - Materiais 34 3.1.1 - Fungo. 34 3.1.2 – Animais 35 3.1.3 - Outros materiais 35 3.1.4 - Aparelhos 36 3.2 - Metodologia 37 3.2.1 – Composição centesimal 38 3.2.1.1 – Determinação da fração cinza. 38 3.2.1.2 – Determinação de lipídeos 38 3.2.1.3 – Determinação de proteínas 39 3.2.1.4 – Determinação de fibra 40 3.2.1.5. – Determinação de Umidade 40 3.2.1.6 – Determinação de Carboidratos. 41 3.2.2 – Obtenção dos polissacarídeos do fungo T.balloui 41 3.2.3 – Caracterização química 43 3.2.3.1- Análises Colorimétricas. 43 3.2.3.2 – Cromatografia Descendente em Papel 3.2.3.3 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 43 43 3.2.3.4 – Determinação da massa molecular 44 3.2.3.5 – Análise de Infravermelho 44 3.2.3.6 – Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 3.2.4 – Atividade Antiinflamatória 44 3.2.4.1 – Avaliação do efeito do composto de T.ballouii em um modelo de edema induzido por carragenana 44 3.2.4.2 – Análises Histológicas 46 3.2.5 – Atividade Citotóxica 46 3.2.5.1 – Determinação da viabilidade celular ex vivo 3.2.6 – Atividade antioxidante 46 47 3.2.6.1 – Radicais superóxidos. 47 3.2.6.2 – Radicais hidroxilas 47 3.2.6.3 – Atividade antioxidante total 47 3.2.6.4 – Peroxidação lipídica 3.2.7. Cálculo do IC50 48 48 3.2.8 - Análise Estatística 49 4 - RESULTADOS 50 4.1 – Extração 50 4.2 – composição monossacarídica 4.3 - Análises Químicas. 51 52 4.4 - Composição monossacarídica do precipitado 2 52 4.5– Determinação da massa molecular. 55 4.6- Espectroscopia de Infravermelho. 55 4.10 - Determinação da viabilidade celular ex vivo 4.11 - Atividade Antioxidante 4.12 - Seqüestro de Radicais Superóxidos 63 63 63 4.13 - Radicais hidroxilas 64 4.14 - Atividade antioxidante total 66 4.15 - Peroxidação lipídica 5- DISCUSSÃO 6-CONCLUSÕES REFERÊNCIAS 67 69 74 17 1. INTRODUÇÃO 1.1. INFLAMAÇÃO A inflamação é uma resposta à infecção, antígenos ou estímulo lesivo e tem por função destruir os agentes irritantes e potencializar o reparo tecidual (NATHAN, 2002; SHERWOOD; TOLIVER, 2004). Diferentes tipos de respostas podem ser mediados por este processo inflamatório, entretanto os quatros sinais clínicos da inflamação aguda são sempre observados como: dor, rubor, calor e tumor (BRUNE; HINZ, 2004). Apesar de ser um mecanismo de defesa, a inflamação pode ser prejudicial por reações de hipersensibilidades fatais ou de lesionar os órgãos de maneira progressiva e permanente (MITCHELL et al., 2006). No processo inflamatório, duas fases podem ser caracterizadas, são elas: - A fase aguda que é de curta duração sendo caracterizada por formação do edema e respostas vasculares e celulares. As respostas vasculares ocorrem com a inflamação após a lesão. A vasoconstricção é seguida imediatamente pela vasodilatação das arteríolas e vênulas que suprem à área. Como resultado, a área torna-se congesta causando o rubor (eritema) e calor associado com a inflamação aguda. Estas respostas são acompanhadas do aumento da permeabilidade capilar e extravasamento dos fluidos para dentro dos tecidos (edema). A resposta celular da inflamação aguda é marcada pelo movimento dos leucócitos para a área da lesão ou trauma (MITCHELL et al., 2006). - A fase crônica de longa duração sendo caracterizada por infiltrado de células mononucleares, incluindo macrófagos, linfócitos e plasmócitos, por destruição tecidual induzida pela persistência do agente nocivo ou pelas células inflamatórias, e pelas tentativas de cicatrização com a substituição do tecido lesado por tecido conjuntivo, efetuado através da proliferação de pequenos vasos (ALLER et al., 2006; KUMAR et al., 2005). Dos mediadores envolvidos no processo inflamatório podem ser citadas a ação do sistema complemento, sistema de coagulação, sistema cinina, hormônios, com efeito, na angiogênese, processos de reparo e resposta imunológica humoral e celular (HAVSTEEN, 2002). O recrutamento de células durante a inflamação depende da liberação de mediadores locais, a histamina e a serotonina que estão 18 entre os primeiros mediadores liberados durante o processo inflamatório (LUSTER et al., 2005). Posteriormente a esta resposta fisiológica ocorre à formação das prostaglandinas, leucotrienos dentre outros. As prostaglandinas e os leucotrienos são metabólitos do ácido araquidônico produzidos pela ciclooxigenase (COX) 1 e ciclooxigenase (COX) 2 bem como pela lipooxigenase. A enzima COX-1 é expressa de forma constitutiva em células e tecidos de mamíferos enquanto a COX-2 geralmente está presente em tecidos de mamíferos em baixos níveis, mas é altamente induzível e têm seus níveis aumentados perante um ou mais estímulos, tais como citocinas e fatores de crescimento. As prostaglandinas são importantes mediadores inflamatórios com diversas propriedades vasoativas, de contração de músculo liso e quimiotáxicas (CHANDRASEKHARAN; SIMMONS, 2004). A quimioatração de leucócitos no sítio lesado, por exemplo, é uma das principais características do processo inflamatório (FIGURA 1). A migração adequada e em tempo hábil de leucócitos da microcirculação para o foco inflamatório é uma das etapas fundamentais deste processo. Nesta etapa, os leucócitos sanguíneos são ativados, se aderem à superfície das células endoteliais através de receptores de superfície como as selectinas e os carboidratos, produzindo uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (EROS) no tecido inflamatório. Os macrófagos e neutrófilos produzem EROS como primeira linha de defesa contra bactérias, vírus e outras partículas estranhas ao organismo. Essa produção também acelera a formação de eicosanóides e citocinas, que podem estender a resposta inflamatória (MITCHELL et al., 2006). Esta reação pode ser importante como mecanismo de defesa, entretanto, um excesso na formação de EROS pode levar à oxidação e perda da função de moléculas essenciais como, ácidos nucléicos, lipídeos de membrana, grupos sulfidrílicos de proteínas e enzimas (HADDAD, 2002). 19 FIGURA 1. Mecanismo de interação entre as células sanguíneas a partir de um estímulo tecidual (injúria vascular). Por diapedese, os leucócitos migram para os sítios da inflamação e são ativados aderindo às células endoteliais que são induzidas imediatamente a liberarem os conteúdos dos seus grânulos estocados (corpos de Weibel-Palace) compostos de P-selectinas e Fatores de Von Willebrand (FVW) os quais desempenham um papel importante na adesão plaquetária. O acúmulo de fibrina é determinado por este processo inflamatório formando um envoltório ao redor do local, evitando a progressão da infecção. Fonte: http://www.medstudents.com.br/original/revisao/selectin/selectin1.jpg 1.2. RADICAIS LIVRES Os radicais livres podem ser definidos como qualquer espécie química capaz de existência independente, que possui um ou mais elétrons desemparelhados em seu orbital, sendo altamente reativos e capazes de atacar biomoléculas. (MARRONI, MARRONI, 2002). A formação de EROS é uma conseqüência natural do metabolismo aeróbico e é parte integrante para a manutenção da homeostase do oxigênio nos tecidos (CASTRO; FREEMAN, 2001). Cerca de 1-3% do oxigênio consumido pelos organismos aeróbicos são convertidos em EROS (SOHAL; WEINDRUCH, 1996). Desta forma, a maioria dos radicais livres é derivado do metabolismo do oxigênio (BANERJEE; DASGUPTA, 2005). 20 Os EROS mais comumente formado são o radical ânion superóxido (O2•−) e o radical hidroxila (OH•) (WILSON et al., 2001). O O2•− é formado quando um elétron é adicionado a uma molécula de oxigênio, e é considerado o tipo menos reativo de EROS. Depois do O2•− ser produzido, ele dispara uma cascata de eventos rápidos que criam outros radicais livres, finalmente encerra na formação de água (KOHEN; NYSKA, 2002). Na formação desses radicais, (FIGURA 2) o radical hidroxila OH• é descrito como o mais reativo (DROGE, 2002). O peróxido de hidrogênio (H2O2) apesar de não ser considerado um radical livre verdadeiro, por ser capaz de atravessar a membrana nuclear, e induzir danos na molécula de DNA por meio de reações enzimáticas (ANDERSON, 1996). FIGURA 2. Processo de formação de espécie reativa de oxigênio (EROS). Fonte: SCHEIBMEIR et al., 2005 A formação de radicais livres também ocorre em circunstâncias patológicas, células corporais e tecidos são constantemente ameaçados por prejuízos causados por eles. Destes, um dos principais parece ser a peroxidação lipídica que resulta em danos à membrana celular como troca na carga líquida, mudanças de pressão osmótica e consequetemente lise celular (GRACE, 1994; WALLE, 2004). 21 Radicais livres podem agir sobre vários mediadores inflamatórios contribuindo para a inflamação comprometendo a função celular (NIJVELDT et al., 2001), além de estarem ligados com processos de envelhecimento corporal (DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004). O excesso de radicais é potencialmente prejudicial para a manutenção celular, quando a lesão é pronunciada ou persistente, a resposta compensatória torna-se insuficiente para corrigir o desequilíbrio do estado de oxi-redução, dando origem ao estresse oxidativo. Mecanismos efetivos foram desenvolvidos pelos organismos vivos para evitar este dano, como os antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos (MANSON, 2003). O mecanismo enzimático inclui as enzimas superóxido desmutase que elimina o radical superóxido, bem como catalase e glutationa peroxidase para a remoção de H2O2. Enzimas antioxidantes desempenham um papel fundamental no equilíbrio do corpo e são essenciais na manutenção das funções fisiológicas. A maioria dessas enzimas antioxidantes é induzida sob a inflamação, trauma ou outras condições de estresse, e essa indução representam o mecanismo-chave para o corpo em resposta a uma variedade de estressores (CASTRO; FREEMAN, 2001; MCCORD, 2000). Os antioxidantes não enzimáticos incluem algumas vitaminas como ácido ascórbico, vitamina E, carotenóides, compostos fenólicos e polifenólicos e outros produtos naturais e sintéticos. Antioxidantes são compostos que podem retardar ou inibir a oxidação de lipídios ou outras moléculas, evitando o início ou propagação das reações de oxidação em cadeia (DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004). A busca por compostos bioativos para desenvolver novos medicamentos vem atraindo nos últimos anos, a atenção da comunidade científica. O emprego de antioxidantes sintéticos na indústria de alimentos tem sido alvo de questionamentos quanto à sua inocuidade e, devido a isso, pesquisas estão voltadas para a descoberta de compostos naturais que exibam esta propriedade funcional, atuando sozinhos ou sinergisticamente com outros aditivos (YANISHLIEVA et al., 2006). Dentre as fontes de antioxidantes naturais podem ser citados os cereais, os cogumelos, as ervas e as sementes de frutas cítricas (YANISHLIEVA et al., 2006; ELMASTAS et al., 2007). 22 1.3. ASPECTOS GERAIS DOS FUNGOS Os fungos são organismos eucariontes heterotróficos que obtêm sua energia pela ruptura de moléculas orgânicas, podendo ocupar diversos nichos ecológicos, atuando tanto como parasitas, sapróbios ou então estabelecendo relações simbióticas, por exemplo, com algas, formando os líquens (TORTORA et al., 2000). Os fungos constituem um reino diferenciado das plantas e animais por várias características, dentre as quais, a mais marcante é o modo de nutrição absortiva. Entre os demais caracteres está incluída a formação de estruturas vegetativas filamentosas, as hifas, que constituem o micélio e estruturas especializadas para reprodução sexuada e assexuada próprias para cada grupo taxonômico. Embora a maioria dos fungos forme micélios bem desenvolvidos, alguns como as leveduras são unicelulares e por isso não formam micélios (ALEXOPOULOS et al., 1996). Com relação ao tamanho, grande parte dos fungos é microscópica e por habitarem os mais diversos substratos, eles são na sua maioria desconhecidos (HYDE, 1997). Essa falta de conhecimento se acentua mais nas regiões tropicais. Rossman (1997) considera que os microfungos tropicais representam um universo praticamente inexplorado da biodiversidade. Dos macrofungos conhecidos grande parte está incluída no filo Basidiomycota. Entre as 30.000 espécies desse filo estão presentes várias espécies de cogumelos comestíveis e os venenosos, os gasteromicetos, as orelhas - de - pau, bem como dois grupos fitopatogênicos importantes, as ferrugens e os carvões. Os membros desse filo têm papel preponderante na decomposição de substratos vegetais. (RAVEN et al., 2001). Os corpos de frutificação são denominados cogumelos e são conhecidos desde a antiguidade, quando o homem já os utilizava com finalidades terapêuticas, alimentar e religiosa (MELITO, 1999). Vários relatos na literatura têm comprovado que o valor nutritivo dos cogumelos é considerado de qualidade para uma dieta balanceada (MANZI et al., 1999). O crescente interesse no estudo dos fungos está relacionado à essencial importância destes nas diversas cadeias tróficas e na possibilidade de aplicação comercial em distintas áreas como na nutrição, na saúde humana e animal, no tratamento de águas residuais, dentre outras (KIRK et al. 2001). Substâncias como 23 antibióticos, antioxidantes, antiinflamatórios, esteróides, ácidos orgânicos produzidos por algumas espécies de fungos têm um importante destaque na indústria farmacêutica. É o caso dos fungos do gênero Penicillium, que são produtores de antibióticos; da cravagem do centeio, Claviceps purpurea, que contém vários alcalóides, entre eles ergonovina e ergotamina, que atuam como vasoconstritores e dos produtores de β-D-glucanas, Botryosphaeria rhodina, Sclerotium glucanicum, entre vários outros (ROSADO et al., 2003; WISBECK; FURLAN; NINOW, 2003; MAZIERO; CAVAZZONI; BONONI, 1999). A utilização desses organismos pode ser através do seu material celular (biomassa) ou então de macromoléculas isoladas. Há uma forte tendência em se explorar comercialmente a biomassa fúngica para isolamento de seus componentes celulares e consequentemente de seus principais constituintes, tais como enzimas, nucleotídeos, proteínas, lipídeos e principalmente polissacarídeos (BELEM; LEE, 1998; BEROVIČ et al., 2003; CAMERON et al., 1988; KOLLÁR et al., 1992; PAVLOVA et al., 2005). A biomassa excedente da produção industrial de antibióticos por Penicillium chrysogenum, além de ser aproveitada para ração e ou no preparo de fertilizantes (MUZARELI et al., 2000), também vem se mostrando uma fonte viável de polissacarídeos do tipo glucanas já que estas apresentam atividades antitumorais e antiinflamatórias (WANG et al., 2007). Trabalhos recentes têm dado grande ênfase a compostos bioativos de fungos, além de seus polissacarídeos, compostos fenólicos e proteínas com ação sobre o sistema imune e como potente antioxidante (SANTOS et al., 2004; CUI et al., 2005). 1.4. ATIVIDADE BIOLOGICA DOS POLISSACARÍDEOS DE FUNGOS Os polissacarídeos são os biopolímeros mais amplamente distribuídos na natureza (ZAIKOV, 2005). São constituídos por resíduos de monossacarídeos unidos uns aos outros por ligações glucosídicas e em comparação com outros biopolímeros, como proteínas e ácidos nucléicos, oferecem uma maior capacidade para transportar informação biológica, devido a sua variabilidade estrutural 24 (SHARON; LIS, 1993). Polissacarídeos bioativos isolados de fontes naturais estão demonstrados na TABELA 1. Os polissacarídeos bioativos de fungos podem ser estruturais, excretados ao meio como exopolissacarídeos (EPS) ou localizarem-se no citoplasma, exercendo a função de reserva energética (KRCMAR et al., 1999; NELSON; COX, 2002). Os polissacarídeos estruturais isolados da parede celular fúngica têm sido caracterizados como homopolímeros, heteropolímeros ou, ainda, encontram-se ligados aos resíduos de proteínas formando complexos polissacarídeo-proteína (KIM et al., 2003; ZHANG et al., 2002). A parede celular é uma camada relativamente rígida que fornece suporte osmótico e determina o formato da célula, além de estar relacionada a eventos de sinalização celular, adesão e digestão extracelular (MAGNELLI et al., 2005). Estruturalmente, a parede celular dos fungos é muito semelhante à parede celular de vegetais, entretanto, sua composição química é distinta. Os polissacarídeos correspondem a cerca de 80% a 90% da composição química da parede celular dos fungos, sendo os outros componentes: proteínas, lipídios, polifosfatos e íons inorgânicos que constituem a matriz de sustentação (GORIN; BARRETO-BERGTER, 1983; MADIGAN et al., 1997; LIPKE; OVALLE, 1998; CABIB et al., 2001). Quitina, glucanas, galactomananas e proteínas são compostos mais freqüentes, embora sua quantidade varie entre as diferentes espécies de fungos (ADAMS, 2004). Baseados nas interações entre as diversas moléculas constituintes da parede celular dos fungos, especialmente a composição dos polissacarídeos, diferentes associações foram relatadas, como a de celulose-glicogênio, celulose- glucana, celulose-quitina, quitosana-quitina, quitina-glucana, manana-glucana (ou polissacarídeos contendo manose-glucana), manana-quitina e poligalactosamina- galactana (GORIN; BARRETO-BERGTER, 1983). Diante dos resultados provenientes da caracterização química dessas macromoléculas, alguns autores propõem a sua utilização como marcadores para a classificação taxonômica de fungos filamentosos, leveduras e liquens (CARBONERO et al., 2003,2005; PESSONI et al. 2005; TEIXEIRA et al., 1995). 25 TABELA 1. Fontes usuais de alguns polissacarídeos. Fonte: DA CUNHA et al., 2009. Os EPS são definidos como polissacarídeos extracelulares, produzidos por alguns fungos e bactérias, os quais são encontrados ligados à superfície das células ou são excretados para o meio extracelular, na forma de limo (SUTHERLAND, 1998). Nos fungos, os EPS constituem uma importante percentagem da biomassa, participando com mais de 75% dos polissacarídeos constituintes da parede da hifa (BARBOSA et al., 2004). Fungos produtores de EPS desempenham papel importante no processo de degradação de xenobióticos, uma vez que imobilizam as enzimas extracelulares. O gel formado por estes biopolímeros impede a desidratação da hifa e permite adesão entre as células ou a adesão destas às superfícies, além de selecionar moléculas do meio (MAZIERO et al., 1999). 26 Os EPS produzidos por fungos também podem ser heteropolissacarídeos ou homopolissacarídeos. Em relação aos heteropolissacarídeos de EPS, foi descrita uma galactomanana com cadeia principal encontrada em Collybia maculata (LIM et al., 2005). Considerando-se o grande número de fungos encontrados na natureza e a possibilidade de terem em sua composição endopolissacaríedos e exopolissacarídeos com diferentes aplicações medicinais, estudos estão sendo realizados para verificar o potencial dessas macromoléculas como antioxidantes, antimutagênicos, anticoagulantes, antitrombóticos e imunomoduladores (FREIMUND et al., 2003; CORRADI DA SILVA et al., 2006; ZHANG et al., 2005). Alguns fungos produtores de exopolissacarídeos, sua composição monomérica e o tipo de ligação glucosídica estão sumarizados na (TABELA 2), onde pode se observar que as principais estruturas descritas são de glucanas e mananas. 27 TABELA 2. Homo- e heteropolissacarídeos produzidos por fungos filamentosos. Fonte: BARBOSA et al., 2004. 28 Dos polissacarídeos biologicamente ativos encontrados nos fungos as glucanas são os homopolissacarídeos mais comuns. Glucanas são polímeros de glucose amplamente distribuídos na natureza e classificadas conforme o tipo de ligação glucosídica [α, β] da cadeia principal. As β-D-glucanas dos fungos são polissacarídeos com função estrutural na parede celular do micélio, das frutificações, ou também podem ser exopolissacarídeos. (BROWN; GORDON, 2001; PELOSI et al., 2003). A característica estrutural é considerada um fator fundamental para a atividade das β-glucanas, principalmente no sistema imunológico (BROWN; GORDON, 2001). Esta, por sua vez, pode atuar por meio do aumento da atividade de células T e células T helper, indução da atividade citotóxica de macrófagos peritoneais, aumento das proteínas de fase aguda e da sensibilidade à histamina, estimulação da atividade da interleucina IL-1 em monócitos humanos, dentre outras ações (OKA et al., 1996; POUTSIAKA et al., 2003; FORTES; NOVAES, 2006; CHEN; SEVIOUR, 2007; MORADALI et al, 2007). As β-glucanas são reconhecidas pelo sistema imune inato de vertebrados através de receptores de superfície celular, designados primariamente para o controle de patógenos fúngicos (ADEREM; ULEVITCH, 2000). Três receptores celulares de β-glucanas (CR3, dectin-1 e lactosilceramida) foram identificados e caracterizados quanto a sua função (ZIMMERMAN et al., 1998; ROSS et al., 1999; BROWN ; GORDON, 2001, 2003). Os CR3 são receptores celulares responsáveis por diversas atividades in vitro e in vivo, estimulando a secreção de citocinas (TNF-α, IFN-α, IFN-γ e IL-6) em células natural killer, principalmente, na presença de patógenos (ROSS et al., 1999). Os receptores do tipo dectin-1, de monócitos e macrófagos, possuem um ligante para polissacarídeos exógenos e outro ligante co-estimulatório para células T. Alguns estudos demonstraram que esses receptores celulares e também o lactosilceramida de linfócitos reconhecem β-glucanas, principalmente com estrutura do tipo β-(1→3) e β-(1→6) (ZIMMERMAN et al., 1998; BROWN; GORDON, 2003). Muitos medicamentos utilizados em neoplasias apresentam como efeito colateral uma ação imunossupressora, que pode culminar em infecção e septicemia. Devido à capacidade das β-D-glucanas em estimular o sistema imunológico, elas podem ser utilizadas como adjuvantes desses quimioterápicos no tratamento de 29 pacientes imunocomprometidos (BOHN; BEMILLER, 1995; LEE et al., 2001; LEUNG et al., 2006; SUGAWARA et al., 2004; ZHANG et al., 2005). Além das glucanas outros polissacarídeos bioativos, como os heteropolissacarídeos também estão sendo investigados com o intuito de determinar suas atividades biológicas. De acordo com Zhang et al. (2007), manoglucanas, galactomananas e glucomananas, obtidas da biomassa de basidiomicetos, também podem apresentar atividades importantes para a indústria farmacêutica e alimentícia. As atividades desses polissacarídeos fungicos parecem estar relacionadas à estrutura química da cadeia principal da glucana na forma de hélice tríplice (FIGURA 3), à freqüência e complexidade das cadeias laterais e à sua massa molecular (SCHMID et al., 2007). FIGURA 3. Representação esquemática da conformação induzida por temperatura da solução de lentinana a 137 °C. Fonte: WANG et al., 2008 1.5. GALACTOMANANAS Galactomananas são polissacarídeos de reserva de parede celular encontradas em maior quantidade na natureza. Além disso, é um dos sistemas sobre o qual se tem maior conhecimento acerca da biossíntese (BUCKERIDGE; DIETRICH, 1996; LIMA, 2000). As galactomananas são polissacarídeos neutros, comumente encontrados no endosperma das sementes de algumas leguminosas, porém também podem ser obtidas a partir de outras fontes como leveduras e fungos (ANDRADE et al., 1999). 30 As galactomananas são ramificadas, pouco densas e solúveis em solução aquosa, são compostas de uma cadeia principal formada por unidades monossacarídicas de β-D-manopiranose unidas por ligações glicosídicas (1→4), substituídas em O-6, por unidades monossacarídicas de α-D-galactopiranose (FIGURA 4), em graus variados, dependendo da espécie (DAAS et al., 2000; SIERAKOWSKI et al., 2000; CUNHA et al., 2009). Na natureza, o grau de ramificação das galactomananas varia de polímeros em que quase todas as unidades de manose apresentam ramificação com galactose a polímeros em que nenhuma ramificação é detectada. O nível e a distribuição de galactose sobre a cadeia principal ocupam um papel importante nas propriedades físico-químicas do polímero (BUCKERIDGE; DIETRICH, 1990; BUCKERIDGE; DIETRICH, 1996; LIMA, 2000). A solubilidade em água tende a aumentar com o aumento de galactose, mas devido às grandes interações internas (pontes de hidrogênio), isso normalmente não é verificado, sendo observado um aumento da viscosidade da solução contendo a galactomanana que é considerado um bom espessante (SIERAKOWSKI et al. 2000). FIGURA 4. Estrutura parcial da galactomana e suas respectivas unidades monossacarídicas. Legenda: Man: manose, Gal: galactose. Fonte: SIERAKOWAKI et al., 2000. As galactomananas são muito empregadas pelas indústrias farmacêutica, cosmética e alimentícia. Estudos relatam que galactomananas podem interferir na inflamação (CRAY et al., 2009), na geração de radicais livres (NAKAMURA et al., 31 1998) e na coagulação (PIRES et al., 2001). Também são usados no tratamento de diabetes mellitus reduzindo o pico de concentração sanguínea de glicose que ocorre após a ingestão de alimentos (REYNOLDS, 1989; WANDE et al., 1994; BRUNETON, 1991). 1.6. GÊNERO TYLOPILUS Os representantes do gênero Tylopilus pertence à ordem Boletales, a qual é bem conhecida na Europa, América do Norte e várias regiões tropicais, mas apenas nas últimas décadas têm registros de estudos na América do Sul. Esses registros são concentrados com base em documentação de fungos em florestas de altitude (HALLING; MUELLER, 1999; HALLING; MUELLER, 2002). A diversidade de Boletales no Brasil é muito pouco conhecida, em comparação com outros países, onde este grupo tem sido mais intensamente estudado (HALLING, 1989; HALLING; FRANCO-MOLANO, 1996; HALLING; MUELLER, 2002; WATLING, 2001). Alguns registros foram realizados para esse gênero durante a primeira metade do século XX (RICK, 1907, 1960), e outros foram feitos na região amazônica na década de 1980 (SINGER et al., 1983). Publicações sobre Boletales estão sendo adicionadas ao conhecimento desse grupo no Brasil (SINGER; ARAUJO, 1986; PUTZKE; PEREIRA, 1994; WATLING; MEIJER, 1997; GIACHINI et al., 2000; BASEIA; ADAUTO, 2002). Tylopilus é um gênero de fungos micorrízicos e seu membro mais conhecido são os boletos Bitter (Tylopilus felleus), única espécie encontrada na Europa e Tylopilus chromapes, espécie comestível encontrada na América do Norte (SINGER; ARAUJO, 1979). Este grupo de fungos foi descritos pela primeira vez por Singer e Araujo na América Central e ainda são pouco conhecido nas florestas tropicais da América do Sul (SINGER, 1984). Tylopilus ballouii caracteriza-se por apresentar a superfície do píleo alaranjada quando fresca e os esporos elipsóides. No entanto, a coloração se destaca apenas nos espécimes jovens e desaparece com a idade e se torna um marrom pálido. O seu registro de ocorrência é relatado na América do Norte, América Central (Costa Rica) e do Sul (Guiana) (HENKEL, 1999, 2001). Como a 32 maioria dos boletos é simbiontes ectomicorrízicos obrigatórios, a sua distribuição biogeográfica depende da distribuição de suas plantas hospedeiras. A invasão de novas áreas geográficas de uma planta hospedeira e seus fungos simbiontes deve ocorrer simultaneamente (RICHARDSON; RUNDE, 1998). Considerando a carência de levantamento sobre a diversidade dos fungos no Brasil, especialmente para o Nordeste e a importância destes como fonte de moléculas bioativas, além da rápida degradação das formações vegetais nativas que abrigam ampla variedade destes organismos, estudos intensivos são necessários para o conhecimento dessa biodiversidade com possíveis potenciais biotecnológicos. Tylopilus ballouii é um fungo nativo da América do Norte e não têm registro em regiões tropicais (HEINEMANN, 1954), e está ausente da lista de espécies de gênero Tylopilus na Amazônia (SINGER; IVORY 1983). 33 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL Este trabalho tem como objetivo geral extrair, caracterizar e avaliar o efeito dos polissacarídeos presentes no corpo de frutificação do fungo Tylopilus ballouii na inflamação e no sequestro de radicais livres. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Para alcançar o objetivo geral, as seguintes estratégias foram propostas: • Extrair os polissacarídeos presentes no corpo de frutificação do fungo Tylopilus ballouii; • Determinar a composição centesimal e caracterizar a estrutura dos polissacarídeos por métodos químicos e espectroscópicos; • Realizar bioensaio utilizando os polissacarídeos extraídos de Tylopilus ballouii em ratos Wistar para avaliar sua ação na inflamação, bem como, analisar histologicamente o efeito deste composto neste modelo; • Avaliar o potencial citotóxico dos polissacarídeos do fungo Tylopilus ballouii; • Analisar o efeito in vitro dos polissacarídeos sobre a geração de radicais livres. 34 3. MATERIAS E MÉTODOS 3.1. MATERIAIS 3.1.1. Fungo O composto polissacarídico utilizado nesse estudo foi obtido dos corpos de frutificação do fungo Tylopilus ballouii (Figura 5). A coleta do material foi realizada durante o período chuvoso de janeiro/ 2008 a junho/ 2008, no Parque Estadual das Dunas, Reserva da Biosfera da Mata Atlântica Brasileira (05º46'S - 35º12'O), localizado no Estado do Rio Grande do Norte, no município de Natal. A análise e coleta do material foram realizadas pelo Prof. Dr. Iuri Goulart Baseia do Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia da UFRN. Classificação taxonômica: Reino: Fungi Filo: Basidiomycota Classe: Agaricomycetes Ordem: Boletales Família: Boletaceae Gênero: Tylopilus. Espécie: Tylopilus ballouii FIGURA 5. Fungo Tylopilus ballouii 35 3.1.2. Animais A atividade antiinflamatória dos polissacarídeos do fungo T. ballouii foi avaliada no modelo de edema plantar utilizando-se ratos da linhagem Wistar com aproximadamente dois meses de idade, pesando entre 150 – 200 g, obtidos do biotério do Departamento de Bioquímica - UFRN. Para a atividade citotóxica através do ensaio de viabilidade celular ex vivo, foram utilizados camundongos da linhagem Swiss, do biotério do Departamento de Bioquímica - UFRN. Todos os animais utilizados na fase experimental foram mantidos em gaiolas individuais, submetidos à água e dieta ad libitum em condições controladas de iluminação (ciclo 12h claro/escuro) e temperatura constante a 25º C. Os animais foram acondicionados no laboratório, por no mínimo, 2 h antes dos testes e utilizados uma única vez para os experimentos. Os ensaios foram desenvolvidos de acordo com as normas vigentes. 3.1.3. Outros Materiais • Ácido acético, acetona, metanol, etanol, n-butanol, cloreto de sódio, tiossulfato de sódio da Reagen Quimibrás Indústrias Químicas S.A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). • Hidroximetilamino metano, carragenana, coomasie brilliant blue R 250 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA). • NADH, azul de tripan, nitroazul de tetrazolio, fenazim metossulfato, molibdato de amônio, ácido tricloroacético, ácido 2-tiobarbitúrico 98%, ácido ascórbico 99%, 1,2-diaminoetano, ácido isobutírico, piridina, metil e tolueno da Aldrich Chemical Co. Inc. (Millwaukee, WI, EUA). • Papéis Whatman n.º 1 e 3 MM foram obtidos da W & R Balston Ltd. (Maidstone, Inglaterra). • Cloridrato de xilazina a 2% e cloridrato de ketamina 5% (Köning do Brasil, Ltda) • Ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido fosfórico da Merck (Darmstadt, Alemanha). 36 3.1.4. Aparelhos Além dos aparelhos usuais de laboratório podemos destacar: • Agitador orbital mod. 255-B da FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil). • Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil). • Centrífuga refrigerada RC 2-B da Ivan Sorvall Inc. (Norwalk, CO, EUA). • Espectrofotômetros Varian - Series 634 da Varian Techtron PPTY Ltd. (Springvale, Vico, Austrália) e Hitachi U-2000 (Tóquio, Japão). • Evaporador rotatório Evapo-Mix da Buchler Instruments (Fort Lee, NJ, EUA). • Espectrômetro de infravermelho modelo FT1 6PC da Perkin Elmer (EUA). 37 3.2. MÉTODOS Organograma geral O estudo detalhado da estrutura e atividade de biomoléculas requer muitas vezes o seu isolamento. A partir da obtenção dos corpos de frutificação do fungo T. ballouii foi realizada a primeira etapa desse processo (extração). O polissacarídeo resultante foi usado para estudo das atividades biológicas e caracterizações químicas. No esquema abaixo temos representado uma visão geral dos experimentos realizados neste trabalho. Corpos de frutificação de Tylopilus ballouii Polissacarídeos Caracterização químicai í i Atividade antiinflamatória, antioxidante e citotoxicidade celular i i ii l i , i i i i i l l Dosagens químicas Análise de infravermelho Ressonância Magnética nuclear do H1 Composição monossacarídica Massa molecular í i li i l Composição centesimal Atividades biológicasi i i l i FIGURA 6. Organograma da metodologia 38 3.2.1. Composição Centesimal Para a determinação dos teores de cinza, proteínas, fibras e umidades foram utilizados os métodos descritos pela AOAC (1984). Para a determinação de lipídeos utilizou-se o método descrito por BLIGH e DYER (1959). O conteúdo de carboidratos do fungo foi calculado por diferença. Todas as determinações foram realizadas em triplicata. 3.2.1.1. Determinação da fração cinza A fração cinza foi determinada de acordo com o método gravimétrico através da incineração da matéria orgânica total. Amostras de 2 g do fungo pulverizado foram pesadas e colocadas em cadinhos de porcelana previamente tarados e o material foi incinerado em bico de Busen até ponto de carvão; a seguir os cadinhos foram colocados em mufla a 550ºC até adquirir cor uniforme (esbranquiçada) que vai do cinza ao branco, sem pontos de carvão. Os cadinhos contendo a amostra foram retirados da mufla quando a temperatura atinge 50ºC e colocados em dessecador para esfriar e, posteriormente, foram pesados. A diferença de peso encontrada nas amostras utilizadas após incineração fornece o teor de cinzas. 3.2.1.2. Determinação de Lipídeos Para quantificação dos lipídeos foram pesadas 3,0 g do fungo pulverizado e colocadas em erlenmeyer com rolha, sendo adicionados 10 mL de clorofórmio, 20 mL de metanol e 8 mL de água destilada. Em seguida, os erlenmeyers foram arrolhados hermeticamente e colocados em agitador rotativo (rumbeira) durante 30 minutos. Após esse período foram adicionados 10 mL de clorofórmio e 10 mL de sulfato de sódio a 1,5%, os tubos foram arrolhados novamente e agitados durante 2 minutos e deixados em repouso para separar as camadas. Foram retirados 13 mL da camada inferior que continha clorofórmio e lipídeos para um tubo cônico de 30 mL com rolha esmerilhada e adicionou-se 1 g de sulfato de sódio anidro. O tubo foi arrolhado e agitado para remover os traços de água, o material foi filtrado e 5 mL transferidos para um becker de 50 mL previamente pesado e levado à estufa a 105º 39 C até completa evaporação do solvente, depois foi resfriado em dessecador. Os beckers foram pesados e o percentual de lipídeos foi calculado a partir do teor encontrado nos 5 mL, relacionando com o peso da amostra. 3.2.1.3. Determinação de Proteínas Os teores de proteínas das amostras foram determinados pelo método Semimicro Kjeldahl, através da dosagem do nitrogênio total. Amostras de 200 mg do fungo previamente delipidado com auxílio de solventes orgânicos foram dessecadas e colocadas em balão de Kjeldahl de 50 mL onde foram adicionados 0,5 g de sulfato de cobre, 1,0 g de sulfato de sódio e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado. Os balões foram levados ao digestor de Kjeldahl até completar mineralização durante aproximadamente 4 horas, fato este caracterizado pela formação de um líquido translúcido de cor verde-azulada. Após digestão e resfriamento foram adicionados 10 mL de água destilada ao balão de Kjeldahl, o qual foi acoplado ao aparelho de destilação. Na mangueira do destilador foi conectado um erlenmeyer contendo 10 mL de solução de ácido bórico saturado com três gotas do indicador misto. Através do funil do destilador, foram adicionados ao balão de Kjeldahl, 25 mL de hidróxido de sódio a 40%. Foi destilado aproximadamente um volume de 50 mL, o qual foi titulado com ácido sulfúrico 0,02 N, previamente padronizado. O teor de proteína foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: N = V x Normalidade x Fator do ácido x 14,01 g da amostra P = 6,25 x N 40 3.2.1.4. Determinação de Fibras O método utilizado foi o da digestão ácida e alcalina. Amostras de 2 g do fungo, previamente delipidada, foram pesadas e colocadas em béquer de 600 mL, contendo 200 mL de H2SO4 a 1,25% fervente e mantido em ebulição por 30 minutos; após esse período o material ainda quente foi filtrado a vácuo sobre papel de filtro comum; o béquer foi lavado com água destilada e a seguir, o material foi recolocado no mesmo béquer sendo adicionados 200 mL de hidróxido de sódio a 1,25% e mantido em ebulição por 30 minutos. Decorrido esse tempo, o material ainda quente foi filtrado a vácuo em cadinhos de Gooch com lã de vidro, previamente pesados, e o material lavado sucessivamente com água destilada para remover o excesso de base existente no filtrado, sendo este procedimento monitorado com um papel indicador, até completa neutralização. Em seguida, o resíduo foi lavado com álcool e éter etílico por duas vezes. Após a secagem à temperatura ambiente, o cadinho foi colocado em estufa a 105° C até peso constante. A variação do peso encontrado fornece a quantidade de fibras da amostra. 3.2.1.5. Determinação da umidade A umidade foi determinada pelo método gravimétrico, o qual quantifica o teor de água da amostra através da diferença de peso da amostra hidratada e seca. Para este procedimento foram pesadas amostras de 10 g em cápsulas de porcelana previamente taradas e levadas à estufa a 105º C para dessecar até peso constante. O teor de umidade foi determinado através da diferença do peso inicial e final. 41 3.2.1.6. Determinação de Carboidratos O teor de carboidratos presente no fungo T. ballouii foi obtido por estimativa, através da diferença dos componentes já determinados para um total de 100%, conforme mostra a fórmula abaixo: % Lipídeos + % Proteínas + % Fibras + % Cinzas = X% 100% - X% = % de Carboidratos 3.2.2. Obtenção dos polissacarídeos do fungo T. ballouii Antes do processo de extração para obtenção dos polissacarídeos, os corpos de frutificação do fungo foram lavados, dessecados a 40º C e posteriormente pulverizados. O método de extração dos polissacarídeos foi realizado a partir de modificações no método de Gonzaga et al., (2005). De um total de 70 g do fungo seco, 20 g foi destinado para análise da composição centesimal e 50 g à extração de polissacarídeos. O fungo foi suspenso em 5% de água destilada (w/w) permanecendo a mistura em banho-maria a 100º C por 4 h. O filtrado foi neutralizado para pH 7.0 por adição de solução de hidróxido de sódio e adicionado etanol/solução do extrato, 5:1, para obter as precipitações, as quais foram isoladas por centrifugação, lavadas com acetona e dessecadas. Peróxido de hidrogênio (30%) 1:1 etanol/peróxido foi adicionado por aproximadamente 15 h em temperatura ambiente para a clarificação do material extraído. Devido ao seu material parcialmente solubilizado foram submetidos à segunda extração usando etanol/volume de extrato (4:1). As precipitações foram isoladas por centrifugação, lavadas com etanol, depois com acetona e liofilizadas. Para purificar as amostras de possíveis substancias insolúveis, os materiais isolados foram suspensos em água destilada com agitação em 40°C por 12 h. Depois desse procedimento as suspensões foram centrifugadas e a fase solúvel foi removida, submetida à liofilização e acondicionados de forma adequada para manter suas características físico-químicas (FIGURA 7). 42 Corpos de frutificação de Tylopilus ballouii 70 g Precipitado 1Sobrenadante 5% em água destilada, 100°C/ 4h Precipitação com etanol (5:1 v/v) Centrifugação (8000g, 20min, 4°C) Precipitado 2Sobrenadante H2O2 a 30% (1:1 v/v) Precipitação com etanol (4:1 v/v) Centrifugação (8000g, 20min, 4°C) Sobrenadante Precipitado Ressuspenso em água/12h a 40°C Centrifugação (8000g, 20min, 4°C Liofilização FIGURA 7. Esquema de obtenção dos polissacarídeos do fungo T. ballouii. Fração solúvel 43 3.2.3. Caracterização química 3.2.3.1. Análises Colorimétricas 3.2.3.1.1. Açúcares totais Açúcares totais foram determinados pelo método do fenol/ácido sulfúrico de acordo com Dubois e colaboradores (1956), empregando-se como padrão L- galactose, sendo as leituras realizadas a 490 nm. 3.2.3.1.2. Proteínas O conteúdo de proteínas foi determinado segundo o método de Bradford (1976) utilizando o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 empregando-se como padrão albumina sérica bovina. 3.2.3.2. Cromatografia Descendente em Papel O composto polissacarídico foi hidrolisado (HCl 2N, 2 h, 100º C), neutralizado, seco, ressuspenso em água destilada e aplicado em papel Whatman N°1. O qual foi submetido a dois sistemas de solventes: butanol: ácido acético: Água (v/v/v, 2/ 3/ 1,5) e acetato de etila: piridina: água (v/v/v, 8/ 2/ 1). Os monossacarídeos foram revelados após redução do nitrato de prata (TREVELYAN, 1950). 3.2.3.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Os polímeros foram hidrolisados (HCl 2N, 2 h, 100° C) e a composição monossacarídica foi determinada utilizando-se um sistema de cromatografia liquida de alta eficiência acoplado a um detector de índice de refração, usou-se uma coluna LiChroCART ® 250-4. Como padrão para a análise foram utilizados os seguintes açúcares: glicose, galactose, arabinose, fucose, manose, ramnose e xilose. 44 3.2.3.4. Determinação da massa molecular As frações de polissacarídeos foram submetidas à cromatografia de gel filtração em Sephadex G-100 (140 × 1 cm) com 0,2 M de ácido acético e 0,15 M de cloreto de sódio como eluente. A eluição foi monitorada pela análise de açúcares totais (DUBOIS et al., 1956). Para estimar a massa molecular dos polissacarídeos, foram utilizadas dextranas de diferentes tamanhos como padrões (Pharmacia). 3.2.3.5. Análise de Infravermelho A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectômetro FT-IR ABB Bomen modelo MB 104, de 4000 a 400 cm-1. O polissacarídeo foi analisado após secagem sob a forma de pastilha de KBr. 3.2.3.6. Ressonância Magnética Nuclear (RMN) Os espectros de RMN foram obtidos a 60ºC utilizando amostras dissolvidas em D2O. As análises dos espectros de H1 foram realizadas em espectrômetro Varian Mercury 200 Magneto Oxford. 3.2.4. Atividade Antiinflamatória 3.2.4.1. Avaliação do efeito do composto de Tylopilus ballouii em um modelo de edema induzido por carragenana. Neste experimento foram utilizados ratos da linhagem Wistar para verificação do efeito do polissacarídeo de T. ballouii estimulado por um agente pró-inflamatório denominado carragenana, na face plantar da pata direita. Os animais foram previamente anestesiados utilizando-se cloridrato de xilazina e cloridrato de ketamina por via intraperitoneal (i.p), antes da aplicação do agente inflamatório no intuito de aliviar sua sensação dolorosa. Todos os animais foram pesados e um cronômetro digital foi utilizado para verificação do tempo decorrido desde a administração. 45 Sete grupos foram formados com n = 5 • Grupo 1: Controle negativo: solução salina • Grupo 2: Controle positivo: 1% de carragenana (sem tratamento) • Grupo 3: Animais tratados com polissacarídeos de T.ballouii a 30 mg/kg i.p e 1% de carragenana r.p. • Grupo 4: Animais tratados com polissacarídeos de T. ballouii a 50mg/kg i.p e 1% de carragenana r.p. • Grupo 5: Animais tratados com polissacarídeos de T. ballouii a 70mg/kg i.p e 1% de carragenana r.p • Grupo 6: Animais tratados com Indometacina a 50 mg/kg i.p e 1% de carragenana r.p • Grupo 7: Animais tratados com Diclofenaco de Sódio a 50mg/kg i.p e 1% carragenana r.p Nos grupos 3, 4 e 5 foram administrados o composto polissacarídico de T. ballouii nas concentrações de 30, 50 e 70 mg/kg de animal por i.p 30 minutos antes da injeção da carragenana. Nos grupos 1 e 2 foram administrados i.p solução fisiológica. Nos grupos 6 e 7 aplicou-se indometacina e diclofenaco de sódio i.p, respectivamente. Após o intervalo de 30 minutos, realizou-se a medida da espessura da pata direita com o uso de um paquímetro, em seguida a inflamação foi induzida através da aplicação da injeção plantar de carragenana 1% (0,1 mL) na pata direita de todos os ratos. Os grupos controles foram submetidos ao mesmo procedimento sendo que os animais receberam solução salina estéri i.p. Este procedimento foi repetido após o intervalo de 1ª, 2ª, 3ª e 4ª h. Os resultados da medição foram expressos como a diferença entre o volume final da pata a cada tempo (Vf) e o volume inicial (Vi), representados pela fórmula: Vp = Vf-Vi. Para a realização das análises histológicas, após 4ª h das injeções i.p, r.p e aferição da espessura da pata por paquímetro, os animais foram eutanisiados e amostras da pele e tecido celular subcutâneo da região plantar foram colhidas para análise histológica. 46 3.2.4.2. Análises histológicas Para os exames histológicos, foram retiradas amostras da pele com tecido celular subcutâneo da pata dos animais. O tecido foi fixado em formaldeído 10% por 48hs, embebido em parafina, cortados em micrótomo rotativo na espessura de 5 mm. Seqüencialmente, os cortes foram submetidos à técnica de coloração pela hematoxilina-eosina (H.E.) e analisados em microscópio de luz e fotografados em fotomicroscópio (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1995). 3.2.5. Atividade Citotóxica 3.2.5.1. Determinação da Viabilidade Celular ex vivo A viabilidade celular foi determinada utilizando-se o método de exclusão por azul de tripan descrito por Phillips (1973). Doze camundongos Swiss foram reunidos em 4 grupos, anestesiados e o polissacarídeo foi administrado i.p em diferentes doses (50 e 100 mg/kg). Os animais foram eutanasiados após 4 h e outros após 24 h. O grupo controle recebeu apenas PBS (pH 7,4) no lugar da amostra. O lavado peritoneal foi coletado e uma alíquota de 20 µL da suspensão de células foi retirada e diluída em 20 µL de azul de tripan. A porcentagem de células viáveis foi determinada após contagem diferencial em Câmara de Neubauer. A taxa de viabilidade foi calculada conforme a equação: Células Viáveis (%) = 100 x células não coradas/ células totais (não coradas+ coradas). A viabilidade dos controles foi normatizada para 100%. 47 3.2.6. Atividade Antioxidante 3.2.6.1. Radicais Superóxidos Os radicais superóxidos foram gerados em 3 mL de tris-HCl (16mM, pH 8,0), que continham 78 µM de NADH (forma reduzida), 50 µM de nitroazul de tetrazolio, 10 µM de fenazina metossulfato e concentrações variadas de polissacarídeos. A reação foi detectada por monitoramento da absorbância a 560 nm. Foram realizados controles para cada amostra. O branco não continha NADH, sendo este substituído pelo tris-HCl (ZHANG et al., 2003). 3.2.6.2. Radicais Hidroxilas Os radicais hidroxilas foram gerados por um método modificado de Smirnoff e Cumners (1989) em 3 mL de fosfato de sódio (150 mM, pH 7,4), que continha 10 mM de sulfato ferroso heptahidratado (FeSO4.7H2O), 10 mM de etilenodiaminotetraacético (EDTA), 2m M de salicilato de sódio, 200 µL de peróxido de hidrogênio a 30 % e concentrações variadas de polissacarídeos. A solução foi incubada a 37°C por 1 h, e a atividade do radical hidroxila sobre o salicilato foi detectada a absorbância de 510 nm. No branco o peróxido foi substituído pelo tampão fosfato (ZHANG et al., 2003). 3.2.6.3. Capacidade Antioxidante Total A capacidade antioxidante total foi determinada pelo método do fosfomolibdênio, que se baseia na determinação espectrofotométrica da redução do Mo+5 a Mo+4 com formação subseqüente de fosfato de Mo+5, que apresenta absorção máxima a 695 nm. Alíquotas de 0,1 mL da solução da amostra (concentração variada de polissacarídeos) foi misturada em um tubo Eppendorf com 1 mL da solução reagente (0,6 M de ácido sulfúrico, 28 mM fosfato de sódio e molibdato de amônio 4 mM).Os tubos foram fechados e incubados a 95 °C por 90 48 min. Após resfriamento, à temperatura ambiente, foi determinada a absorbância a 695 nm. Foi utilizado ácido ascórbico como padrão e a capacidade antioxidante total foram expressos em equivalentes de ácido ascórbico (PRIETO et al. 1999). 3.2.6.4. Peroxidação Lipídica A inibição da peroxidação lipídica foi determinada pela quantificação do produto de decomposição de peróxido lipídico MDA baseada na reação ao ácido tiobarbitúrico com gema de ovo como substrato oxidável. Resumidamente, 0,5 mL de homogeneizado de ovo (10% em 0,2 MPBS (pH 7,4), v / v) e 0,5 mL de amostra em diferentes concentrações foram misturadas, em seguida, 0,05 mL de sulfato de ferro (0,07 M) foi adicionado ao para iniciar a peroxidação lipídica. Após a incubação a 37 ° por 30 min, 1,5 mL de tricloroacético ácido (20%) (w / v) e 1,5 mL de ácido tiobarbitúrico 0,8% (w / v) foram adicionados para saciar a reação, a mistura resultante foi agitada e aquecida a 100 ° C por 15 min, e em seguida, centrifugado a 3000 rpm por 10 min. A absorbância da camada superior foi medido em 532 nm (ZHANG ;YU, 1997). A inibição da peroxidação lipídica foi calculada da seguinte forma: taxa de inibição (%) = [1 - (A Amostra - Branco Amostra) / AControle] x 100, O α-tocoferol foi utilizado com padrão. 3.2.7. Cálculo do IC50 O IC50, ou seja, a quantidade em mg/mL da amostra necessária para inibir em 50% os radicais antioxidantes foi determinado para seqüestro dos radicais superóxido e hidroxila, bem como para inibição da peroxidação lipídica. O cálculo do IC50 de cada atividade foi realizado por regressões não lineares. 49 3.2.8. Análises Estatísticas Para análises estatísticas dos modelos experimentais de inflamação e citotoxicidade foi utilizado o teste de análise de variância ANOVA com nível de significância de p<0,001 e p>0,5 para determinar que grupos diferem entre os valores obtido para os grupos controle e experimental. 50 4. RESULTADOS 4.1. Extração A extração foi desenvolvida conforme descrito anteriormente em materiais e métodos, apresentando um rendimento de 0, 997 g de polissacarídeos o qual foi caracterizado quimicamente e analisadas suas propriedades farmacológicas. 4.2. Composição centesimal O conhecimento da composição centesimal é realizado através da análise química determinando-se o teor de umidade, cinzas, lipídeos, proteínas, fibras e carboidratos (MORETTO et al., 2002). Pelo fato desta pesquisa estar direcionada no estudo das propriedades antioxidantes e antiinflamatória do fungo T. ballouii, outros parâmetros nutricionais como minerais e vitaminas não foram quantificados individualmente neste trabalho. Os resultados obtidos na análise da composição centesimal do fungo T. ballouii podem ser observados na TABELA 3. Estas análises demonstraram que os carboidratos (32,5%) representam o principal constituinte do corpo de frutificação do fungo T. ballouii. Outros constituintes, proteínas (27,0%) e fibras (18,2%) também se destacaram com altos percentuais na composição desse fungo. 51 TABELA 3: Análise da composição centesimal do fungo T. ballouii. Componentes Teor (%) Umidade Proteína Lipídeos Fibras Cinzas Carboidrato 11,3 27,0 5,2 18,2 5,8 32,5 4.3. Análises químicas Após extração e fracionamento dos componentes dos corpos de frutificação do fungo T. ballouii por procedimentos já referidos em materiais e métodos as analises químicas foram realizadas no sentido de verificar os constituintes resultantes do processo de fracionamento. Neste trabalho, realizou-se a extração com água quente seguida de posteriores precipitações com etanol (precipitado 1) e (precipitado 2). Essa metodologia é largamente utilizada por ser uma forma eficiente de precipitação de polissacarídeos e por isto, bastante relatada pela literatura (PEREYRA et al., 2003; ALQUINI, et al., 2004). Os resultados das análises do precipitado 2 demonstraram conter altos teores de carboidratos (80,5%) e razoável teor de proteínas (19.5 %) (FIGURA 8). 52 FIGURA 8. Percentual dos constituintes açúcares totais e proteínas após extração de T. ballouii. 4.4. Composição monossacarídica do precipitado 2 Para analise estrutural de um polissacarídeo faz-se necessário primeiro, determinar os tipos de monossacarídeos que o constituem (NELSON et al., 2000). Para isso foram realizados dois métodos cromatográficos, cromatografia descendente em papel (CDP) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). 4.4.1. Cromatografia descendente em papel A CDP realizada no sistema de solvente acetato de etila: piridina: água (v/v/v, 8: 2: 1) demonstra, de forma qualitativa, a presença dos monossacarídeos: xilose e/ ou fucose, manose, e galactose (FIGURA 9A). A CDP realizada no sistema de solvente butanol: ácido acético: água (v/v/v, 2: 3: 1,5) apresentou como esperado, diferenças na migração entre os monossacarídeos xilose e fucose caracterizando a presença destes dois açúcares (FIGURA 9B). 53 Acetato de etila Butanol FIGURA 9. Cromatografia descendente em papel do hidrolisado dos polissacarídeos de T. ballouii, utilizando como padrão monossacarídeos. A: Sistema solvente Acetato de etila: Piridina: água. B: Sistema solvente Butanol: Ácido acético: água. Legenda das siglas na figura: FUC: fucose; XIL: xilose; GAL: galactose; GLI: glicose; MAN: manose; ARA: arabinose; P: polissacarídeo de T. ballouii. 4.4.2. Análise da fração de polissacarídeos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) Os dados obtidos por HPLC mostraram de forma quantitativa a presença de xilose, fucose, arabinose (traços) manose e galactose, demonstrando predominância dos dois últimos, galactose (26,88%) e manose (54,20%) comprovando a presença de galactomananas neste composto (TABELA 4). Os perfis cromatográficos foram inicialmente obtidos com gradiente exploratório de água e acetonitrila (5 a 90% do modificador orgânico em 60 min), em coluna de LiChroCART 250-4 usando-se como referencial diversos padrões monossacarídicos. Os perfis cromatográficos obtidos por HPLC resultaram na presença de quatro unidades monossacarídicas (FIGURA 10). 54 TABELA 4. Composição monossacarídica dos polissacarídeos do fungo T. ballouii. Galactose Manose Fucose Arabinose Xilose Relação molar 0,50 1 0,13 0,04 0,30 Composição (%) 26,88 54,20 6,57 1,91 12,40 . FIGURA 10. Cromatografia em HPLC da fração polissacarídica do fungo T. ballouii e eluição em gradiente de água e acetonitrila. 55 4.5. Determinação da massa molecular A determinação da massa molecular do composto polissacarídico foi analisada por cromatografia em gel filtração em Sephadex G-100. Esta, mostrou uma simetria no pico de eluição indicando homogeneidade no polímero e massa molecular de aproximadamente 147 kDa quando comparado com os padrões da curva de calibração da coluna (FIGURA 11). FIGURA 11. Perfil dos polissacarídeos do fungo T. ballouii em cromatografia gel filtração. 4.6. Espectroscopia de Infravermelho O espectro de infravermelho dos polissacarídeos do fungo T. ballouii apresentou similaridade para os padrões de carboidratos e proteínas. As atribuições das principais absorções são características das estruturas glucosídicas e são relacionadas com o estiramento de OH (3000- 3500cm-1), e carbono anomérico (1070 cm-1). O sinal existente na faixa entre as bandas (1630 e 1400 cm-1) estão relacionados com as vibrações de grupo amida o que confirma a presença de 56 proteínas nesse composto, sugerindo uma associação entre carboidrato e proteínas (FIGURA 12). Figura 12. Espectro de Infravermelho dos polissacarídeos do fungo T. ballouii. 4.7. Ressonância magnética nuclear do hidrogênio A ressonância magnética nuclear (RMN) é uma das mais poderosas técnicas espectroscópicas no estudo de aspectos estruturais e dinâmicos de moléculas orgânicas em solução (KAISER, 2000). Para a química de carboidratos se tornou uma ferramenta largamente utilizada, portanto torna-se imprescindível sua utilização, principalmente na elucidação estrutural de polissacarídeos com estruturas complexas. Pelas análises de RMN várias informações podem ser obtidas a respeito da estrutura do polissacarídeo. O espectro de RMN do H1 do composto polissacarídico contém sinais característicos de uma galactomanano. Apresenta sinais nos prótons anoméricos (δ 5.4 e 5.1) para D-galactose e D-manose, 57 respectivamente. Também, foi possível evidenciar a presença de outros monossacarídeos como fucose e xilose conforme demontrado na FIGURA 13. Na fucose observou-se forte ressonância do H6 (δ 1.25) e sinais referentes à presença de xilose (TABELA 5). TABELA 5. Sinais de hidrogênio (H) observados nos espectros de RMN de 1H encontrados na literatura e na fração de polissacarídeos de T. ballouii H1 H2 H3 H4 H5 H6 D- galctopiranosil 5,4 A, D 3,6 B 3,92 E 3,99 E 3,87 E 4,07 B D - manopiranosil 5.1 D 4.18 C 3,78 C 3,85 E 3,54 E 3,94 C L-fucopyranosil - - - - - 1.25 G D-xylopyranosil 4.52 F 3.38 F 3.26 F - - - A- Manjoosha; Kapoor, 2001. B- Alexander et al., 2003. C- Ramesh et al., 2001. D- Harsha; Virendra, 2003. E- Pablyana et al., 2009. F- Cunha et al.;2009 G- Yutaka et al., 2004 58 FIGURA 13. Espectros de RMN de 1 H obtidos das frações de polissacarídeos de T. ballouii. 59 4.8. Avaliação do efeito do polissacarídeo de Tylopilus ballouii em um modelo de edema induzido por carragenana Para se conhecer melhor o processo inflamatório, alguns modelos foram desenvolvidos na tentativa de reproduzi-lo experimentalmente. O presente trabalho utilizou como modelo de inflamação o edema de pata induzido por carragenana. A ação do polissacarídeo rico em galactomanana foi testada nas doses de 30, 50 e 70 mg/kg de peso corporal em diferentes grupos de animais, conforme já descrito. A FIGURA 14 representa os resultados obtidos deste pré-tratamento em relação aos controles positivos (carragenana 1%) e controle negativo (solução salina). Esta demonstra uma discreta redução do edema na 1ª hora para as doses de 30 e 50 mg/kg. Após a 2ª, 3ª e 4ª horas observa-se uma redução de 33% e 55% do volume da pata, respectivamente. O polissacarídeo rico em galactomanana reduziu 56% do edema quando aplicado na concentração de 70 mg/kg do peso do animal, logo após há 1ª hora e na 3ª e 4ª hora, pico da caragenana, houve uma redução de 83% do edema. Com relação à dose de 70 mg/kg, pode-se inferir que apresentou melhor efeito antiinflamatório quando comparadas com as demais concentrações mesmo nas primeiras horas e quando comparada ao grupo controle observa-se uma redução significativa (p >0,05) na evolução do edema. 60 FIGURA 14. Efeito antiinflamatório do polissacarídeo de T. ballouii no modelo de edema plantar induzido por carragenana. Os dados foram expressos em média ± DP onde *** corresponde a p< 0.001. Para fins comparativos do efeito antiinflamatório do polissacarídeo em estudo, o mecanismo de ação deste biopolímero foi analisado com substâncias padrões cujo mecanismo de ação fosse conhecido e amplamente comprovado. Para tal, foi administrada a concentração que apresentou melhor efeito inibitório (70 mg/kg) e os antiinflamatórios não esteroidas (AINES) diclofenaco de sódio e indometacina. Os resultados observados na FIGURA 15 demonstraram que na 1ª h após aplicação do polissacarídeo rico em galactomanana já foi possível verificar a redução do edema de pata. O composto a partir da 2ª h apresentou uma ação similar à indometacina e o diclofenaco. Na 4ª h a redução do volume do edema foi significante para as substâncias analisadas. Os resultados obtidos da avaliação antiinflamatória indicaram que o polissacarídeo rico em galactomanana apresentou redução no edema induzido por carragenana. Segundo os testes ANOVA todas as doses testadas com os polissacarídeos e os grupos tratados com os fármacos indometacina e diclofenaco de sódio, quando comparados ao controle positivo apresentaram resultados significativos estatisticamente, principalmente a partir da segunda hora (p< 0.001). 61 FIGURA 15. Efeito antiinflamatório dos polissacarídeos de T. ballouii (70 mg/kg) e antiinflamatórios como diclofenaco de sódio e indometacina no modelo de edema plantar induzido por carragenana. Os dados foram expressos em média ± DP onde * corresponde a p< 0.05; ** p<0.01; ***p<0.001. 4.9. Análises Histológica do edema de pata em ratos induzidos por carragenana Através de observações microscópicas e da utilização de técnicas de biologia molecular é possível caracterizar melhor a participação das células sanguíneas e substâncias químicas envolvidas no processo inflamatório (SOUZA et al., 2003). Nas análises histológicas do edema de pata em ratos induzidos por carragenana usou-se controles positivo e negativo (salina) assim como diferentes concentrações do composto polissacarídico de T. ballouii. No grupo destes animais observou-se um intenso infiltrado de células polimorfonucleares (Figura 16 A). Por outro lado, foi observado que as análises das patas dos animais tratados com galactomanas do citado fungo apresentaram uma diminuição do infiltrado (Figura 16 C, D e E). *** *** ** *** * 62 FIGURA 16. Análises histológicas (HEX100) da pata de animais com edema plantar induzido por carragenana. A- Controle positivo; seta indica infiltrado celular; B – Tylopilus ballouii (30 mg/kg); C – Tylopilus ballouii (50 mg/kg); D – Tylopilus ballouii (70 mg/kg); E- Diclofenaco de sódio; F- Indometacina; G- Controle negativo. 63 4.10. Determinação da Viabilidade Celular ex vivo Uma das dificuldades de se estabelecer a ação imunomoduladora de um fungo é a presença de citotoxicidade em algumas espécies de fungos. Observamos que os polissacarídeos desse fungo têm ação antiinflamatória e que não apresentam, neste experimento, citotoxicidade frente a macrófagos peritoneais no modelo de Viabilidade celular ex vivo (FIGURA 17). FIGURA 17. Efeito dos polissacarídeos de T. ballouii sobre a viabilidade celular no lavado peritoneal de camundongos Swiss. 4.11. Atividade Antioxidante 4.12. Seqüestro de Radicais Superóxidos Foi testada a atividade seqüestrante de radicais superóxido do composto polissacarídico de T. ballouii utilizando o modelo de sistema in vitro, onde o radical superóxido é gerado - fenazina metassulfato / NADH - com redução do NBT. A 64 FIGURA 18 mostra o percentual de sequestro dos radicais superóxido em várias concentrações dos polissacarídeos de T. ballouii. Observamos um efeito dose dependente com um percentual máximo (±30%) de sequestro destes radicais atingindo um platô a partir de 1,25 mg/mL, havendo uma remoção significativa em todas as concentrações testadas (p<0.001). FIGURA 18. Efeito inibitório dos radicais superóxido pelos polissacarídeos do fungo T. ballouii. 4.13. Radicais Hidroxilas Radical hidroxila é considerado um antioxidante muito potente que pode reagir com a maioria das biomacromoleculas e provocar graves danos às biomoléculas adjacentes. Assim, a remoção do radical hidroxila é importante para a defesa antioxidante da célula (ARUOMA, 1998). O sequestro dos radicais hidroxilas pelo polissacarídeo isolado do fungo T.ballouii encontra-se demonstrado na FIGURA 65 19. Observamos que este polissacarídeo apresentou no inicio uma atividade mais discreta e depois mais potencializada na concentração 0, 625 mg/mL, atingindo inibição máxima em torno de 60% (p<0.001). A capacidade dos polissacarídeos no seqüestro de radicais hidroxilas foi em concentração dose-dependente. FIGURA 19. Efeito inibitório dos radicais hidroxilas pelos polissacarídeos do fungo T. ballouii. 66 4.14. Atividade Antioxidante Total Os polissacarídeos do fungo T. ballouii apresentaram uma atividade antioxidante total frente à molibidato de amônia com aumento rápido da inibição na concentração de 0, 039 mg/mL (3,8%) para 0, 078 mg/mL (19,3%). O máximo de atividade atingida pelos polissacarídeos deste fungo pode ser comparado ao sequestro realizado por 1,22 mg de ácido ascórbico. Observou-se que em concentrações a partir de 0, 250 mg/mL de polissacarídeos ocorria uma saturação do seqüestro dos radicais livres (FIGURA 20). FIGURA 20. Capacidade antioxidante total dos polissacarídeos do fungo T. ballouii. 67 4.15. Peroxidação lipídica A peroxidação lipídica é um processo que pode ser a principal razão de dano celular quando induzida por radicais livres (WEI et al., 2003). Esse complexo processo envolve a formação e propagação de peróxidos lipídicos, e a eventual destruição das membranas lipídicas, produzindo produtos secundários como o malonildialdeído em microssomos (ZHANG et al., 2003). Neste ensaio foi observado que a atividade inibidora do ânion hidroxila pelos polissacarídeos de T. ballouii é da ordem de 35% aproximadamente (FIGURA 21). FIGURA 21. Inibição da peroxidação lipídica da membrana da gema de ovos pelos polissacarídeos do fungo T. ballouii. 68 4.16. IC50 O IC50 representa a concentração da amostra necessária para proporcionar 50% da atividade inibitória (seqüestro) de radicais livres. Este parâmetro foi calculado a partir das concentrações dos compostos analisados e da taxa de inibição da cada amostra. A formação de radicais livres nestes sistemas foi inibida pelos polissacarídeos do fungo T. ballouii o qual mostrou valores de IC50 de 1,25 mg/ml, 1,64 e 1,70 mg/mL, para os testes de radicais hidroxila, superóxido e peroxidação lipídica, respectivamente (TABELA 6). TABELA 6. Valores de IC50 de polissacarídeos de T. ballouii Tylopilus ballouii IC50 (mg /ml) Radicais hidroxilas 1,25 Radicais Superoxido 1,64 Peroxidação Lipídica 1,65 69 5. DISCUSSÃO Os fungos têm sido utilizados durante milênios devido às suas propriedades medicinais e nutricionais (FORTES; NOVAES, 2006; TAVEIRA et al, 2007, FIRENZUOLI et al., 2008). Trabalhos científicos apontando essas propriedades têm levado a um maior interesse no consumo destes no Brasil (COLAUTO et al., 1998). O corpo de frutificação do fungo T. ballouii foi utilizado para obtenção dos polissacarídeos e análise de composição centesimal. A avaliação da composição centesimal do fungo T. ballouii foi realizada, tendo em vista que o cogumelo em estudo pertence ao gênero onde são encontradas algumas espécies comestíveis. Esta avaliação demonstrou que esse fungo é composto principalmente por carboidratos (32,5%) e proteínas (27,0%). Teores semelhantes foram publicados por Chang e Milles (1989) para os fungos Agaricus bisporus (champignon de Paris), Lentinus edodis (shiitake) e Pleurotus ostreatus (shimeji), os quais contêm como principais constituintes: carboidratos com teor médio para as espécies analisadas da ordem de 63,17% e proteínas 28%, 19% e 22%, respectivamente. A extração deste fungo resultou em um composto cujo teor de carboidratos foi de 80,5%, valores semelhantes foram encontrados por Dore et al (2007) que citou valores da ordem de 84% para o fungo Geastrum saccatum. O composto extraído do fungo T. ballouii apresentou também razoável teor de proteínas (19,5%) em sua composição. Este resultado difere de outros analisados por Queiroz et al (2009) para o fungo Caripia montagnei que apresentou baixos teores de proteinas (1,3%) e Dore et al (2007) para os fungos G. saccatum e Polyporos dermoporus que apresentaram teores de proteínas de 7,7% e 1%, respectivamente. Relatos da literatura descrevem vários polissacarídeos e complexo polissacarídeo-proteína isolados de fungos sendo usados como fonte de agentes terapêuticos (CHAKRABORTY et al, 2004). É de fundamental importância nos estudos de polissacarídeos bioativos a determinação de sua composição monossacarídica para uma interpretação bem sucedida das suas atividades biológicas. Dois métodos cromatográficos, portanto, foram utilizados neste estudo. O primeiro, mais tradicional que avalia de forma qualitativa a 70 cromatografia descendente em papel (CDP), e um segundo, um método de quantificação, sendo este mais sensível e rápido (HPLC). Os dois métodos mostraram que os polissacarídeos do fungo estudado são formados principalmente de manose e galactose, bem como xilose e fucose, com vestígios de arabinose. No entanto, as análises de HPLC demonstram teores maiores de galactose (26,88%) e manose (54,2%), sugerindo se tratar de um composto rico em galactomanana. Polissacarídeos contendo galactose, manose e fucose também foram caracterizados para Ganoderma applanatum (USUI et al., 1981), Fomitella fraxinea (CHO et al., 1998), Laetiporus sulphureus (ALQUINI et al., 2004) e Flammulina velutipes (SMIDERLE et al., 2008). Polissacarídeos são polímeros de média a alta massa molecular, constituídos por monossacarídeos conectados por ligações glucosídicas. Esses polímeros diferenciam-se, principalmente, pelos monômeros constituintes, tipo de ligação, comprimento da cadeia e número de ramificações (FREIMUND et al., 2003). Análises feitas por cromatografia em gel filtração utilizando coluna Sephadex G-100 mostraram que o polímero em estudo apresentou um alto peso molecular (147 KDa). A espectroscopia de infravermelho (IV) tem sido largamente usada na caracterização de diversos compostos. Torna-se de fundamental importância não só na caracterização de alguns grupos funcionais, como nas modificações químicas induzidas em alguns polímeros. As atribuições das principais absorções do espectro do IV (4000– 400 cm-1) são característicos de estruturas glucosídicas e estão relacionados ao estiramento OH (3000-3500 cm-1); vibração do grupo anomérico C1H (1070 cm-1) (GONZAGA et al., 2005), sendo esta mesma banda relacionada a polissacarídeos com ligações α-(16) e α-(14), (SHINGEL, 2002). Da mesma forma os padrões de proteínas também foram evidenciados com absorções característica 1630 e 1400 cm-1 (CAREY, 1992). As bandas relacionadas a proteínas confirmam mais uma vez a sua presença, o que e possível uma associação entre carboidrato e proteínas. Outro método espectroscópico que pode ser utilizado na caracterização química de moléculas é a ressonância magnética nuclear. Para a química de carboidratos se tornou uma ferramenta largamente utilizada, portanto torna-se imprescindível sua utilização, principalmente na elucidação estrutural de polissacarídeos com estruturas 71 complexas. Diversos trabalhos na literatura relatam aspectos de galactomananas de diferentes fontes em relação aos resultados obtidos por RMN, indicando similaridade nos deslocamentos químicos desses polissacarídeos. Dessa forma, as ressonâncias do hidrogênio (1H) e do carbono (13C) podem ser atribuídas baseadas em dados reportados na literatura (JOSHI e KAPOOR, 2003; VIEIRA et al., 2007; CUNHA et al., 2009). O espectro do hidrogênio para as amostras dissolvidas em água deuterada confirmou mais uma vez a presença dos monossacarídeos galactose, manose, xilose e fucose. Em relação aos heteropolissacarídeos foi descrita uma galactomanana encontrada em Collybia maculata (LIM et al., 2005) e Lasallia pustulata (PEREYRA et al., 2003). Polissacarídeos fúngicos vêm sendo muito estudados e relatados na literatura por possuírem diferentes aplicações medicinais. Dentre esses diversos estudos muitos estão sendo realizados para verificar o potencial dessas macromoléculas como antioxidantes, antimutagênicos, anticoagulantes, antiinflamatórios, antitrombóticos e imunomoduladores (FREIMUND et al., 2003; CORRADI et al., 2006; ZHANG et al., 2005). Dessa forma, o alvo deste estudo foi caracterizar os polissacarídeos obtidos do corpo de frutificação do fungo T. ballouii e verificar seu potencial antioxidante e antiinflamatório. Para avaliar a possível atividade antiinflamatória do composto polissacarídico do fungo T. ballouii foi utilizado o modelo de edema plantar induzido por carragenana em ratos Wistar. Segundo Lapa et al (2003) este modelo induz aumento agudo e progressivo do volume da pata injetada que é proporcional à intensidade da resposta inflamatória, constituindo um parâmetro útil na avaliação da atividade antiinflamatória de novos compostos. Este modelo de inflamação envolve a liberação de vários mediadores que induzem a reação inflamatória em duas fases distintas (SULEYMAN; BUYUKOKUROGLU, 2001). A fase inicial (0-1h) onde ocorre principalmente à liberação de histaminas e a fase posterior (1-4h) onde há uma elevada e destacada produção de prostaglandinas, produtos da cicloxigenase (PEPIANAYAGAM et al., 2006; SILVA et al., 2005). Na segunda fase a ação das prostaglandinas é caracterizada principalmente por migração de leucócitos e edema pronuciado, com pico entre a terceira e quarta hora (RANGEL, 2005). 72 Polissacarídeos obtidos a partir do fungo T. ballouii reduziram o edema provocado pela injeção s.p de carragenana de forma dose dependente e com perfil de redução semelhante ao diclofenaco de sódio e indometacina, fármacos comerciais que atuam sobre a COX (cicloooxigenase). Polissacarídeos obtidos de Ganoderma tsugae, Ganoderma lucidum e Grifola frondosa apresentaram efeito antiinflamatório semelhantes reduzindo a migração de leucócitos e a liberação de mediadores pró- inflamatórios (LIN et al., 2006 HONG et al., 2004; ZHANG et al, 2002, 2003). Para confirmar os resultados obtidos no modelo de edema plantar induzido por carragenana bem como verificar o efeito dos polissacarídeos do fungo T. ballouii sobre o infiltrado celular foram realizadas análises histológicas das patas de ratos que foram submetidos à indução por carragenana. As análises histológicas também exibiram um perfil de dose-dependência na ação dos polissacarídeos em questão sobre o recrutamento de leucócitos. A melhor concentração utilizada para inibição da inflamação foi a de 70 mg/kg por peso corporal. Polissacarídeos de T. felleus testados pelo modelo de edema de pata induzido por carragenana apresentam uma inibição semelhante da inflamação em doses superiores a 50 mg / kg (KOHLMUNZER et al., 1977). É possível que a ação antiinflamatória desse polímero seja atribuída à ação de sequestro sobre os radicais livres e sobre a COX (ciclooxigenase) ou à inibição de fatores como citocinas que pode mediar à lesão tecidual relacionada à resposta inflamatória (GORDON, 2001; HERMANN et al., 2001). Técnicas de coloração são usualmente utilizadas para avaliar a citotoxicidade de substâncias. Neste trabalho foi utilizado o teste de exclusão com o azul de tripan, que é um corante que só penetra nas células mortas, cujas membranas não podem mais excluí-lo. Este fenômeno de permeabilidade da membrana celular permite estimar indiretamente o grau de integridade da mesma (WALUM et al., 1990). Através desta técnica foi observado que o composto polissacarídico do fungo T. ballouii não apresentou ação citotóxica no período de 4 h e 24 h. Os efeitos adversos dos fungos com propriedades medicinais não são descritos detalhadamente na literatura, mas estudos in vivo comprovam inexistência de toxicidade quando utilizados em diferentes concentrações (KUROIWA et al, 2005; NOVAES et al, 2005). 73 Vários compostos fúngicos já foram descritos na literatura por possuírem atividade antioxidante (BARROS et al., 2008; JAYAKUMAR et al., 2006; CHEUNG; CHEUNG, 2005). Entretanto, a maioria dos antioxidantes utilizados ainda são os sintéticos, os quais têm sido suspeitos de ser responsável por danos no fígado e carcinogênese (GRICE, 1988; QI et al., 2005). Assim, pesquisas direcionadas para a utilização de eficazes antioxidantes naturais são essenciais para que possam proteger o corpo humano dos radicais livres e retardar o progresso de muitas doenças crônicas (LUO, 2008; NANDITA; RAJINI, 2004). O composto polissacarídico extraído de T. ballouii demonstrou capacidade de sequestrar radicais livres nas metodologias testadas, principalmente no seqüestro do radical hidroxila onde atingiu o IC50 com 1,25 mg/ mL. Compostos polissacarídicos derivados de diferentes espécies de fungos já foram descritas na literatura por apresentarem potencial atividade “sequestradora” de radicais superóxido e hidroxila (LIU; OOI; CHANG, 1997). A metodologia realizada para peroxidação lipídica envolveu a observação de produtos secundários a partir da gema do ovo no qual a reação com o tiobarbitúrico produz um composto de coloração rosa, que tem forte absorção a 532 nm (WEI et al., 2003). Comparado com outros sistemas geradores de radicais realizados neste trabalho, o seqüestro de peróxidos lipídico pelo composto polissacarídico do fungo T. ballouii foi o que apresentou menor efeito antioxidante. Polissacarídeos derivados de cogumelos podem ser efetivos na inibição de radicais superóxidos e hidroxilas, entretanto, não exibir efeito no processo de peroxidação lipídica (LIU et al., 1997). Por outro lado, Sun et al (2009) conseguiram inibir em cerca de 64% a peroxidação lipídica em gema de ovo. 74 6. CONCLUSÕES  A composição centesimal do tecido do fungo Tylopilus ballouii mostrou um teor de 32,5% de carboidratos, seguido de 27,0% de proteínas;  As análises químicas, a espectrofotometria de infravermelho e a composição monossacarídica demonstraram que os polissacarídeos obtidos do fungo são compostos, principalmente, por galactomananas associado a porções protéicas, comuns em fungos;  No modelo de inflamação testado, o edema plantar induzido por carragenana, os polissacarídeos de Tylopilus ballouii mostrou um efeito antiinflamatório significativo na concentração de 70 mg/Kg;  O perfil de redução do edema dos polissacarídeos de Tylopilus ballouii é semelhante à indometacina e ao diclofenaco sódico, dois fármacos antiinflamatórios, indicando que esses polissacarídeos em estudo podem possuir atividade antiinflamatória por inibir a COX;  As combinações das análises realizadas sugerem que este fungo apresenta um potencial efeito antiinflamatório e antioxidante podendo assim contribuir para a prevenção ou redução do desenvolvimento de patologias;  Os ensaios de viabilidade celular mostraram que os polissacarídeos do fungo Tylopilus ballouii não promovem citotoxicidade significativa no período de 4 e 24h após administração. Estas características são bastante relevantes, portanto mais estudos precisam ser realizados para que este fungo possa ser validado cientificamente, podendo assim apresentar uma maior utilidade pela população tanto na área de nutricêuticos com farmacológica. ADAMS, D. Fungal cell wall chitinases and glucanases.Microbiology, Reading, 150(7): 2029-2035, 2004. ADEREM, A.; ULEVITCH, R. J. Toll-like receptors in the induction of the innate immune response. Nature, v. 406, p. 782-787, 2000. ALEXANDER, S.; SHASHKOV, A., GALINA, M.; STRESHINSKAYA, B.; LARISA, N.; KOSMACHEVSKAYA, B.; SOF’YA, N.; SENCHENKOVA, A.; LYUDMILA, I.; EVTUSHENKO, C.; IRINA, B.; NAUMOVA, B. NMR-based identification of cell wall galactomannan of Streptomyces sp. VKM Ac-2125. Carbohydrate Research, 338 2021-/2024 ALEXOPOULOS, C.J.; MIMS, C. W.; BLACKWELL, M. Introductory mycology, 4ed. John Wiley & Sons, New York, 1996. ALLER, M. A.; ARIAS, J.L; ARIAS, J.I.; SÁNCHEZ-PATÁN, F.; ARIAS, J. 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