UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR ESTUDOS IN SILICO DA PROTEÍNA AlkB E PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS ALCANOTRÓFICAS EM SOLOS DA BACIA PETROLÍFERA POTIGUAR MATHEUS SILVA PEREIRA NATAL-RN 2007 ii UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR ESTUDOS IN SILICO DA PROTEÍNA AlkB E PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS ALCANOTRÓFICAS EM SOLOS DA BACIA PETROLÍFERA POTIGUAR MATHEUS SILVA PEREIRA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular. Orientador: Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha NATAL-RN 2007 iii UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PROGRANA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR ESTUDOS IN SILICO DA PROTEINA AlkB E PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS ALCANOTRÓFICAS EM SOLOS DA BACIA PETROLÍFERA POTIGUAR MATHEUS SILVA PEREIRA Dissertação apresentada pelo aluno Matheus Silva Pereira ao Curso de Mestrado em Genética do programa de Pós-graduação e Genética e Biologia Molecular do Departamento de Biologia Molecular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, foi julgada pelos membros da banca examinadora, na sua redação final, para a conclusão do curso e à obtenção do título de Mestre em Genética. MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha DBG/UFRN Prof. Dra. Valéria Maia de Oliveira CPQAB/UNICAMP Profa. Dra. Magnólia F. Florêncio de Araújo DMP/UFRN NATAL-RN 2007 iv AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus por tudo que me tem dado e sou muito grato por isso. A Universidade Federal do Rio Grande do Norte pela oportunidade da realização deste trabalho. Ao Departamento de Biologia Celular e Genética desta Universidade. Ao Programa de Pós Graduação de Genética e Biologia Molecular. Aos laboratórios LBMG, LDIC/DMP por terem cooperado e assim tornar possível a realização dos experimentos. Ao programa Capes, por ter cedido a bolsa e ao CT-PETRO/CNPq pelo financiamento do projeto. Um agradecimento especial ao grupo CROB, principalmente a Igor, Carlos, Magda, Leonam, Cataline, Julliane, Carvalho, Moacyr, Bruno e Karol. A Rodrigo pela grande paciência e amizade, ajudou bastante. E a galera da Pós- graduação 2005. A Carlos por ter acreditado e depositado confiança em mim, obrigado pela paciência e pelo incentivo na minha formação acadêmica. E também como um amigo que considero. Aos meus amáveis pais, Antônio (Toinho, “bora chefe”) e Maria de Lourdes (Malu), que são exemplos da minha vida. obrigado por me terem como filho, tenho muito orgulho de vocês, pois amo vocês. Aos meus queridos irmãos Lucas (monstro) e Ariama. A minha linda e amada esposa Amanda que também é minha amiga, pelos conselhos, carinhos, beijos e abraços. Te amo! Ao meu cunhado André e aos meus maravilhosos sogrinhos Amâncio e Núbia e amável família (Edneide "Neguinha', Zélia, Edna “loooove” e filhos), obrigado pela compreensão, pois são muito importantes para mim. Também obrigado muito especial aos meus amigos, por estarem presentes na minha vida e que sabem da importância que tiveram sobre minha pessoa nos bons e maus momentos. A Tobby (cachorro) mesmo não sabendo ler me acompanhava nas eternas leituras dos artigos nas madrugadas, praticamente saiu mestre também. vLISTA DE FIGURAS vi Capítulo 2 vii LISTA DE TABELAS viii LISTA DE ABREVIATURAS AH – alcano hidroxilase ARDRA - Análise de restrição de rDNA amplificado Bdb – Banco de dados Blast - Ferramenta de procura e alinhamento local de seqüências. Boe - Barril óleo equivalente BPP-RN – Bacia Petrolífera Potiguar-RN ClustalW – Programa de alinhamento de seqüências hospedado em site ClustalX – Programa de alinhamento para windows CNTP - Condições normais de temperatura e pressão CROB - Grupo de pesquisa em Biotecnologia do Petróleo- Cluster for Research in Oil Biotechnonology FAME - Análise de ésteres metílicos de ácidos graxos HMMTP – Programa de hidrofobicidade M - marcador Ȝ digerido com PstI. mDNA - DNA metagenêmico Nro. – Número P450 – Citocromo P450 PAGE – Gel de poliacrilamida não desnaturante PCR-DGGE - Reação em cadeia da polimerase em eletroforese em gel com gradiente de desnaturação. PLFA - Análise de ácidos graxos e fosfolipídios pOCT - Plasmídeo OCT PREDATOR – Programa de Topologia de análise de estruturas secundárias ix rDNA – DNA ribossomal RISA - Análise de espaçadores intergênicos ribossomais SARST - Análise serial de etiquetas de seqüências ribossomais SSCP - Polimorfismo de conformação de fita simples TOPPRED2 – Programa de hidrofobicidade T-RFLP - Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminais xRESUMO Alguns microrganismos de ecossistemas virgens são capazes de utilizar petróleo como fonte de carbono e energia. O conhecimento dessa biodiversidade microbiana pode revelar vias metabólicas microbianas para utilizar alcanos que venham a ter importância biotecnológica. Os objetivos do presente trabalho são: i) realizar estudos in silico da proteína AlkB visando obter subsídios para a compreensão do mecanismo de seletividade na utilização de alcanos em bactérias Gram positivas e Gram negativas; ii) prospectar e avaliar a resposta de comunidades microbianas alcanotróficas de solos e mangue da BPP–RN e solo da Mata Atlântica na Reserva Horto Dois Irmãos-PE utilizando o gene alkB como biomarcador molecular, e as técnicas de PCR e PCR-DGGE. xi ABSTRACT Some microorganisms from virgin ecosystems are able to use petroleum it as source of carbon and energy. The knowledge of microbial biodiversity can help to reveal new metabolic systems for utilization alkanes with biotechnological importance. The aim of this study is: i) Accomplish an in silico study of the AlkB protein aimed to understand the probable mechanism involved on selectivity of alkanes in Gram positive and Gram negative bactéria. ii) prospect and analyze the response of the microbial alkanotrophics communities in soil and mangrove sediments of BPP–RN and soil of Atlantic forest in the Horto Dois Irmãos Reserve area/PE using the molecular biomarker, gene alkB; with the PCR and PCR-DGGE approach. xii xiii 1INTRODUÇÃO GERAL Atualmente os projetos genomas e diversas pesquisas geram dados biológicos que estão aumentando exponencialmente a cada ano. Proporcionalmente, as ferramentas da bioinformática tendem a solucionar problemas impossíveis de serem abordados nas décadas passadas. Com a disponibilidade dos Bancos de dados e as ferramentas computacionais é possível realizar estudos in silico que permitem realizar inferências sobre processos biológicos com relevância e confiabilidade independente de estudos laboratoriais. Com esta base, serão realizados estudos in silico visando identificar possíveis correlações entre propriedades estruturais da proteína AlkB e a capacidade de utilização de alcanos em bactérias alcanotróficas. Nosso conhecimento a respeito da diversidade microbiana, bactérias e fungos, são limitados em parte, principalmente devido à nossa inabilidade em reproduzir todas as variáveis ambientais dos microrganismos nos diferentes tipos de ecossistemas. Todos os organismos da biosfera dependem das atividades microbianas pela sua capacidade no processo de ciclagem de nutrientes e por, de certa forma, influenciar os ambientes abaixo e acima do solo. No entanto, diversas atividades antropogênicas como a indústria do petróleo, podem, potencialmente afetar a biodiversidade microbiana local, sendo desconhecidas como estas alterações nas comunidades microbianas podem influenciar os ecossistemas mais profundos e os mais superficiais. Devido à escassez de informações a respeito dos microrganismos nativos nos solos de ambientes que não tiveram nenhum tipo de exposição ao petróleo ou derivados, houve a necessidade da realização de estudos microbiológicos e moleculares destes microrganismos em diferentes ecossistemas localizados dentro da Bacia Petrolífera Potiguar - RN, como por exemplo, através de ensaios de microcosmos com solos de caatinga e de mangue, utilizando a técnica independente de cultivo PCR-DGGE. Este trabalho é o primeiro estudo de biodiversidade de bactérias alcanotróficas nativas sob impacto de contaminação com petróleo em solos continentais e costeiros da Bacia 2Petrolífera Potiguar (BPP-RN) e Mata Atlântica-PE utilizando o biomarcador molecular alkB. CAPÍTULO 1 Utilização de alcanos em bactérias alcanotróficas: Estudos in silico da proteína AlkB 1. INTRODUÇÃO Os alcanos são compostos químicos que consistem somente dos elementos carbono e hidrogênio (como por exemplo, os hidrocarbonetos) onde cada um desses átomos está ligado exclusivamente por ligações simples (por isso são chamados de compostos saturados). Os alcanos podem ser lineares (fórmula geral CnH2n+2), cíclicos (fórmula geral CnH2n, n>2) ou ramificados (fórmula geral CnH2n+2, n>3) (Morrison e Boyde, 1995). Alcanos lineares (também denominados de n-alcanos assim como parafinas) são hidrocarbonetos alifáticos saturados, de fórmula geral CnH2n+2. Estes se apresentam em cadeias lineares ou ramificadas. Os alcanos lineares são designados, na nomenclatura oficial, através de prefixos, geralmente gregos, seguidos do sufixo "ano". Eles são menos densos que a água e praticamente insolúveis na mesma, à medida que o tamanho da cadeia principal aumenta e seu peso molecular, os seus pontos de fusão e ebulição aumentam (Masterton et al., 1990). Em CNTP os alcanos de CH4 até C4H10, são gasosos; do C5H12 até C17H36, são líquidos; e depois de C18H38, se apresentam no estado sólido. Por conterem ligações simples, os alcanos são relativamente estáveis, difíceis de quebrar e são apolares (Morrison e Boyde, 1995). Os alcanos constituem entre 20 e 50% do petróleo, sendo estas variações dependentes da sua origem. O octano e hexadecano são os alcanos mais conhecidos. E tais compostos são muitas vezes utilizados como fontes de carbono pelos microrganismos, uma vez que estes desenvolveram rotas degradativas na utilização dos compostos alcanos. Os alcanos são quimicamente inertes, devendo ser ativados antes de serem metabolizados e na presença de oxigênio isto leva à oxidação dos grupamentos metil terminais, gerando álcool primário, que logo após são oxidados por desidrogenases até ácidos graxos que são metabolizados através de ȕ-oxidação (Van Hamme et 4al., 2003). As monooxigenases que contêm dois átomos de Fe++ e Cu são encontradas em bactérias metanotróficas como Methylococcus capsulatus (Murrel, 1994). As Bactérias das classes , ß, e -proteobactéria, como por exemplo, Acinetobacter, Alcanivorax, Burkholderia, Pseudomonas, e bactérias Gram- positivas com alto conteúdo de G+C, como por exemplo: Nocardia, Streptomyces, Bacillus, Rhodococcus possuem uma proteína de membrana que contém dois átomos de Fe++ (Smits et al., 1999; Van Beilen et al., 2001, Van Beilen et al., 2003). As leveduras e os fungos possuem citocromo P450 (CYP) de membrana (Ayala e Torres, 2004; Craft et al., 2003; van Beilen e Funhoff, 2005), que estão envolvidos em degradação de alcanos. A alcano hidroxilase de P. putida GPo1 e de outras eubactérias têm grande interesse biocatalítico (Witholt et al., 1990; Van Beilen e Funhoff, 2007) e para aplicações ambientais (Whyte et al., 2002), e é considerado o protótipo das proteínas non- heme Ferro oxigenases que incluem as desaturares (proteínas que removem dois átomos de hidrogênio de um composto orgânico criando uma dupla ligação entre dois átomos de carbono) e xileno monooxigenases (Shanklin e Cahoon, 1998). A enzima AH (alcano hidroxilase) de P. putida GPo1 catalisa a hidroxilação de compostos alifáticos lineares e ramificados, alicíclicos e aquil- aromáticos (McKenna e Coon. 1970; Van Beilen et al., 1994), oxidação terminal de álcoois a aldeídos correspondentes, demetilação de metil-ésteres ramificados, sulfoxidação de tio-ésteres e epoxidação terminal de olefinas (May e Abbott, 1972; Katopodis et al., 1984; May e Katopodis, 1986; Katopodis et al., 1988). Após a primeira descrição de que os genes envolvidos na degradação de alcanos estavam localizados num plasmídeo em Pseudomonas e a sua completa descrição dos operons por Eggink et al (1987), o modelo proposto por Van Beilen et al. (2001) (figura 1), baseado nos estudos de P. putida Gpo1, também conhecida como Pseudomonas oleovorans, é o melhor modelo alcanotrófico já proposto. 5Figura 1. Modelo do sistema alcano hidroxilase descrito por Van Beilen et al. (2001) em Pseudomonas putida Gpo1. São apresentadas as proteínas envolvidas na conversão dos n- alcanos a ácidos graxos. A P. putida possui um plasmídeo denominado OCT que abriga dois operons. O primeiro contém os genes alkBFGHJKL que codificam para uma alcano hidroxilase, duas rubredoxinas, um aldeído desidrogenase, um álcool desidrogenase, uma Acil-CoA sintetase e uma proteína de membrana externa de função ainda desconhecida, respectivamente. O segundo operon possui os genes alkST, codificando uma proteína regulatória da expressão do operon alkBFGHJKL e uma rubredoxina redutase (Grund et al., 1975). Entre os dois operons ainda encontra-se o gene alkN o qual codifica para um transdutor aceptor de grupamentos metil, que pode estar envolvido na quimiotaxia aos n- alcanos (Smits et al. 1999; Staijen et al., 1998; Van Beilen et al. 1994; 2001). Recentes pesquisas deram importantes contribuições ao descrever aminoácidos críticos na proteína AH (Van Beilen et al., 2005) e no citocromo P450 oxigenase (Funhoff et al., 2006) envolvidos na catálise de alcanos. Os Citocromos são proteínas, geralmente ligadas a uma membrana, que contêm grupos heme e que efetuam o transporte de elétrons. São encontradas sob a forma de proteínas monoméricas (por exemplo, citocromos c) ou como subunidades de complexos enzimáticos maiores catalisadores de reações redox. Podem ser encontrados na membrana interior das mitocôndrias e no retículo endoplasmático de eucariontes, nos cloroplastos de plantas, em microrganismos fotossintéticos e em bactérias. 6O citocromo P450 (cuja abreviação é CYP, P450 e menos frequente CYP450 faz parte da superfamília das hemoproteínas que são encontradas nas bactérias, Archaea e eucariotos. A reação mais comum catalisada pela CYP450 é a reação de monooxigenase, que é a inserção de um átomo de oxigênio em um substrato orgânico (RH) enquanto o outro átomo de oxigênio é reduzido a água. RH + O2 + 2H + + 2e–ĺ ROH + H2O O desconhecimento do mecanismo de discriminação de substrato pela proteína AlkB ainda persiste atualmente e ainda pode ser estendido para outros microrganismos que possuem uma AH com diferentes graus de identidade, porém utilizam substratos específicos ou até mesmo uma grande variedade de alcanos (C8 a C44). Diversos microrganismos degradadores de alcanos são detentores do gene alkB, mas o que não se sabe é como uma mesma proteína (AlkB) que é participante nas etapas iniciais do sistema alcano hidroxilase, pode se comportar de diversas maneiras em diferentes microrganismos frente a diferentes substratos. Utilizando as seqüências de proteínas alcano hidroxilase existentes em microrganismos degradadores nos bancos de dados e através de uma abordagem in silico, pretendemos explorar comparativamente utilizando-se das proteínas AlkB de P. putida GPo1 e a P450 oxigenase da Mycobacterium sp HXN 1500, as possíveis correlações entre propriedades estruturais da proteína AlkB e a capacidade de utilização de alcanos em bactérias alcanotróficas. 72. OBJETIVOS x Avaliar através de estudos in silico as possíveis correlações entre a estrutura primária, estrutura secundária, domínios funcionais e topologia das proteínas AlkB com a capacidade de discriminação de substratos alcanos em bactérias Gram positivas e Gram negativas. 83. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Construção da base de dados As seqüências de genes alkB e proteínas AlkB foram obtidas utilizando- se o pacote BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (NCBI-USA) que busca similaridades entre uma seqüência alvo (query) e as seqüências dos bancos de dados e calcula a sua significância estatística. A seqüência do gene alkB e proteína AlkB da bactéria Pseudomonas putida foram usadas como seqüências query nas buscas de informações sobre microrganismos degradadores de n-alcanos, devido ao grande número de informações disponíveis sobre esta bactéria. Dos grandes bancos de dados (como por exemplo, o Genbank, UM-BBD, SWISS-PROT) foi obtida uma grande quantidade de seqüências de genes alkB e de proteínas AlkB com grande similaridade, porém algumas seqüências foram descartadas, principalmente aquelas seqüências que se apresentaram incompletas e cujos valores de E- values maiores do que 1e-20. E com isso foi formada a nossa base de dados, denominada por Bdbalk. 3.2. Edição das seqüências Devido a grande quantidade de seqüências e sua dificuldade de identificação quando analisadas nos programas de bioinformática, como por exemplo o ClustalW, Predator, Toppred2 e outros. Essas seqüências passaram por um processo de edição realizada de forma manual. Nesta edição foram retiradas algumas letras presentes nas principais informações que identificavam as seqüências depositadas no formato fasta, mas que não comprometiam a identificação das mesmas. Isso propiciou o manuseio das seqüências de forma prática e rápida na utilização destas nas diversas ferramentas de bioinformática. 93.3. Análises de domínios conservados e assinaturas protéicas Foram utilizados diversos bancos de dados especializados em proteínas, entre eles: x PROSITE – Contém dados de domínios funcionais numa proteína utilizando consensos armazenados no banco de dados. x CDART - Conserved Domain Architecture Retrieval Tool - Detecção de domínios conservados. x CDD - Conserved Domain Database - Detecção de domínios conservados x INTERPRO – é um banco de dados de famílias de proteínas, domínios e sítios funcionais. x PIR - Protein Information Resource - Banco de dados de seqüências de proteínas anotadas funcionalmente. x SWISS-PROT - Banco de dados (Bd) de seqüências de proteínas possui integração com outros Bds. x UM-BBD – University Minnesota Biocatalysis/Biodegradation Database - banco de dados de diversos organismos envolvidos na biodegradação e biocatálise. 3.4. Alinhamentos múltiplos Para realização dos alinhamentos foram utilizados os programas: Clustal-W (Higgins e Sharp, 1988) ou Clustal-X, versão para Windows XP (Thompson, 1997) e depois para melhor visualização foi utilizado o BIOEDIT (Hall, 1999). 3.5. Análise topológica de proteínas Foram utilizados os softwares Toppred2 (Claros e Von Heijne,1994) e HMMTOP (Tusnady e Simon, 2001). Inicialmente foram empregados os dois softwares para comparação dos resultados gerados, e em virtude da equivalência dos dados, manuseio fácil e acessibilidade, o programa utilizado definitivamente foi o Toppred2. 10 3.6. Análise da relação da estrutura primária, secundária e domínios funcionais de proteínas AlkB Devido ao grande número de seqüências disponibilizadas nos bancos de dados para as análises in silico da proteína AlkB, foram utilizados os seguintes critérios: i) A proteína deveria ser completa, ii) não ser uma proteína hipotética iii) a sua literatura deveria estar disponível. As seqüências foram inicialmente analisadas pelo programa ClustalW e os dados visualizados em programa BioEdit (Hall, 1999). Os alinhamentos múltiplos também foram avaliados com o programa de topologia PREDATOR (Frishman e Argos, 1996), o qual prediz estruturas secundárias com base nas seqüências depositadas no programa. Para o alinhamento com o programa PREDATOR foi incluída uma seqüência de proteína modelo que é, a CYP153A6 da bactéria Mycobacterium sp HXN 1500. Esta seqüência serviu como modelo comparativo, pois fornecia informações sobre os aminoácidos críticos para a funcionalidade da proteína AlkB. Tabela 1. Proteína CYP153A6 de Mycobacterium sp HXN 1500 modelo conhecido para uso comparativo com as outras proteínas AlkB de Pseudomonas. 11 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO Dados protegidos para publicação 25 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W, Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. 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A microbiota dos solos é responsável por transformações fundamentais nos ciclos biogeoquímicos, reciclando a matéria orgânica, degradando resíduos industriais e xenobióticos, fixando N2 atmosférico e produzindo gases relacionados ao efeito estufa, entre outros processos conhecidos. A microbiota do solo também está associada à formação e manutenção da estabilidade de agregados, pela produção de proteínas e polissacarídeos extracelulares que contribuem à diversidade vegetal e de outros organismos que vivem acima do solo (Hughes et al., 2001; Dabert et al., 2002, Schmidt, 2006). Os microrganismos têm um papel fundamental na manutenção da qualidade dos solos. Organizando-se de forma às vezes pouco conhecidas em diferentes condições edáficas e/ou em resposta a diferentes distúrbios, por exemplo, contaminação com petróleo, as comunidades microbianas podem ser utilizadas como indicadoras da qualidade do solo. No entanto, como a maioria dos microrganismos dos solos não pode ser cultivada nos meios de cultura convencionais, o entendimento de um microbioma só será possível pela utilização de técnicas avançadas de biologia molecular, associadas às técnicas de bio e ecoinformática (Ovreas, 2000; Tyson e Banfield, 2005; Martiny et al., 2006). 31 1.2. Importância econômica e impactos causados pela indústria do petróleo O petróleo é um recurso não renovável resultante de processos físico- químicos e biológicos sofridos pela matéria orgânica. Esta é depositada juntamente com fragmentos de rochas durante a formação de rochas sedimentares há milhões de anos. Devido a efeitos mecânicos, ocorre a migração do petróleo no subsolo, acumulando-se em rochas porosas e permeáveis, denominadas rochas reservatório. O petróleo é utilizado principalmente para gerar combustível, contudo possui uma série de subprodutos que são gerados após o refino e amplamente utilizados pela sociedade, como por exemplo, lubrificantes, plásticos, fertilizantes, medicamentos, tintas e tecidos (Magot et al., 2000; Van Hamme et al., 2003; Head et al., 2003). O petróleo é explorado comercialmente há mais de 140 anos. Desde o início da produção comercial de óleo, engenheiros do petróleo têm enfrentado problemas causados por microrganismos (Magot et al., 2000; Van Hamme et al., 2003). O Brasil possui 30 bacias sedimentares, ocupando uma área de 4.650.000 km² na parte terrestre e 2.570.000 km² no mar até o limite do mar territorial, ou seja, 200 milhas da costa. Dentre estas 30 bacias, oito são produtoras de petróleo e gás natural. O Brasil produziu até hoje mais de cinco bilhões de boe (barril óleo equivalente) e possui uma reserva total de 15,5 bilhões de boe. O potencial petrolífero, ou seja, o volume remanescente a descobrir está entre 14 e 177 bilhões de boe. Geralmente, o fator de recuperação de hidrocarbonetos pode variar entre 10% e 60%, sendo freqüentemente extraído entre 20% e 30% (www.petrobras.com.br). As atividades na Bacia Petrolífera Potiguar, on-shore, só foram efetivamente implementadas quando um leigo descobriu óleo por acaso em um poço artesiano perfurado para abastecer uma piscina em 1978. Hoje esta bacia é a maior produtora em terra do país, produzindo 100 mil barris diários (figura 1). Está previsto para o período entre 2004 e 2008 o investimento de 840 milhões de reais na Bacia do Rio Grande do Norte e do Ceará. Desses 840 milhões, 22% serão investidos no mar, 8% na exploração, 13% em Mossoró- RN, 21% em gás e energia, 11% em suporte, 10% em Guamaré-RN e 15% no 32 município de Alto Rodrigues-RN. Os investimentos serão disponibilizados para as áreas de exploração, segurança e meio ambiente, comunicações, informática e suporte, processamento e novas instalações, produção, malha de gás e Termoaçu. Hoje, a Petrobrás possui no RN e CE 556 km de oleodutos, 542 km de gasodutos; 5.900 km de linhas de surgências, 9 estações de tratamento de óleo, 2 unidades de processamento de gás, 6.099 poços perfurados, 4.580 poços produtores, 50 campos de produção no RN e 6 no CE, 17 estações de injeção de vapor, 6 estações de compressão de gás, 67 estações coletoras de óleo e gás. Também possui unidade de produção de diesel e nafta, 8 equipamentos de perfuração, 17 sondas de intervenção em poços e 34 plataformas marítimas de exploração, demonstrando que além de ser uma excepcional produtora on-shore a BPP do RN e CE possui uma considerável estrutura para a captação de petróleo off-shore (figura 1) (www.anp.gov.br). Figura 1. Dados econômicos e setorias óleo e gás da Bacia petrolífera potiguar (ANP) Desde o primeiro grande acidente em 1969 no canal da Inglaterra e o desastre de Exxon Valdez no Alaska, ocorreram mais de 40 grandes derramamentos marinhos de petróleo. Os vazamentos durante o transporte são 33 responsáveis por 45,5% do petróleo lançado ao mar, enquanto que os vazamentos de atividades em terra vêm em segundo lugar, representando 29% (Scherrer e Mille, 1989). A contaminação principalmente de manguezais devido a derramamentos de petróleo é freqüente (Getter et al., 1981), ficando a flora e a fauna desse ecossistema vulneráveis ao poluente, devido principalmente à facilidade de sua acumulação no solo (Scherrer e Mille, 1989). As condições de inundação e as características da vegetação, com suas raízes abundantes formando uma malha superficial, dificultam o acesso às regiões contaminadas, impedindo a descontaminação imediata (Getter et al., 1984). Após a chegada ao ambiente, o petróleo sofre alterações de suas características originais, devido a fatores físicos (evaporação, dissolução, dispersão, oxidação fotoquímica, adsorção às partículas) e principalmente biológicos (biodegradação) (Getter et al., 1984). As transformações físicas e biológicas são reguladas pelas características específicas do derramamento e do ambiente atingido. Assim, o grau de impacto ambiental e a persistência do petróleo no ambiente dependem de fatores como: habitat atingido, tipo e quantidade do óleo, espécies de organismos atingidos, época do ano, condições hidrográficas e meteorológicas, clima, freqüência e duração da exposição ao petróleo e as práticas utilizadas na tentativa da descontaminação (Getter et al., 1981). O petróleo e seus derivados podem persistir por mais de vinte anos em manguezais, antes que a vegetação se recupere totalmente. Esta alta persistência é explicada pela lenta biodegradação dos hidrocarbonetos devido à limitação de oxigenação do meio e a lenta ciclagem dos nutrientes, essenciais para a atividade microbiana aeróbia (Scherrer e Mille, 1989). A persistência dos hidrocarbonetos depende também da exposição do sítio contaminado aos fluxos de águas marinhas, influenciados pelas marés. A maior freqüência de exposição a esses fluxos pode acelerar a remoção dos hidrocarbonetos, contribuindo para a recuperação da vegetação (Getter et al., 1984). Derramamentos de poluentes podem ocorrer com freqüência e são a principal e mais danosa causa de contaminação de solos e de águas, entretanto, processos como a bioremediação, onde são utilizados microrganismos capazes de biodegradar os mais diversos poluentes, podem 34 ser utilizados para minimizar os impactos ambientais causados por tais desastres (Head et al., 2003). Para um experimento de bioremediação eficiente, após um derramamento de petróleo, seriam elucidativas informações prévias sobre o comportamento das populações microbianas com potencial intrínseco para degradação de hidrocarbonetos no solo impactado. 1.3. Microbiologia do petróleo Até há poucas décadas, acreditava-se que as profundezas dos reservatórios de petróleo eram estéreis, e as bactérias isoladas de tais ambientes poderiam ser apenas de origem exógena. Nossa percepção disto mudou recentemente com descobertas inesperadas de populações diversas de microrganismos, realizando uma série de atividades metabólicas diferentes, expandindo os limites onde seria possível esperar atividade nesses ambientes extremos de subsuperfície (Pedersen, 2000, Röling et al., 2003; Van Hamme et al., 2003; Head et al., 2003). A presença de microrganismos nas reservas petrolíferas pode levar à biodegradação do petróleo em reservatórios, resultando em um decréscimo do seu conteúdo de hidrocarbonetos nobres e aumento no conteúdo de enxofre, na acidez e na viscosidade. Essas modificações têm conseqüências econômicas negativas para a produção de petróleo e as operações de refino. Este processo ocorre na maioria das reservas de petróleo do mundo, entre elas as brasileiras. A presença de bactérias em reservatórios de petróleo tem sido relatada na literatura e os trabalhos baseiam-se na sua identificação. Vários gêneros, abrangendo eubactérias e Archaea bactérias, têm sido identificados em diferentes campos de exploração de petróleo (Magot et al., 2000; Röling et al., 2003). Os doadores e aceptores de elétrons disponíveis nos reservatórios de petróleo determinam o tipo de atividade metabólica dentro desses ambientes. Os principais doadores de elétrons incluem o CO2, H2 de origem geoquímica ou bacteriana e inúmeras moléculas orgânicas. Uma vez que os campos de óleo são ambientes subterrâneos profundos e geralmente são isolados das águas de superfície, seu potencial redox é muito baixo e, dessa forma, aceptores de 35 elétrons estão freqüentemente ausentes, em particular o oxigênio, nitrato e íons férricos (Barth e Riis, 1992). Águas profundas geralmente contêm sulfato e carbonatos em várias concentrações, tais fatores sugerem que os principais processos metabólicos ocorrentes em tais ambientes são: a redução de sulfato, metanogênese, acetogênese e fermentação (Barth, 1991; Magot et al., 2000). As características fisiológicas de microrganismos nativos das reservas de petróleo podem esclarecer sob quais condições a degradação do petróleo pode ocorrer e quais os mecanismos envolvidos. Apesar de um grande número de microrganismos já terem sido isolados das reservas petrolíferas e caracterizados, o cultivo dessa população microbiológica nativa ainda é um desafio (Van Hamme et al., 2003). O termo nativo refere-se a microrganismos que estão presentes nos reservatórios, sem influência de contaminantes provenientes da perfuração (Grassia et al., 1996). Muitos dos parâmetros físico-químicos críticos para o estabelecimento de comunidades microbianas em subsuperfície também são válidos para comunidades microbianas localizadas em camadas superficiais. Exceto que não conferem, necessariamente, as condições extremófilas. Portanto elas terão papel importante sobre a diversidade microbiana nativa e seu papel na manutenção nos ecossistemas terrestres, de mangue e marinhos, quer sem impacto quer impactado por petróleo. As potencialidades de sobrevivência dessas comunidades microbianas sob impacto de diversos poluentes originários da indústria de petróleo são dependentes de genes que codificam proteínas envolvidas com a degradação de hidrocarbonetos, alguns deles utilizados como fonte de carbono. Genes amplamente distribuídos foram encontrados em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Lazar et al., 1999; Smits et al., 1999; Van Beilen et al., 2002; Van Hamme et al., 2003). Monooxigenases e dioxigenases são enzimas-chave na biodegradação de uma grande variedade de alcanos e os genes codificantes dessas enzimas têm sido caracterizados. Entre eles podemos citar: alkB, ndoB, todC1, xylE, cat23, bphA, etc (Van Hamme et al., 2003). Em Pseudomonas oleovorans, por exemplo, foram identificados genes que codificam para uma alcano-hidroxilase responsável pela conversão de alcanos (C5 - C44) em ácidos graxos (Chen et al., 1996; Whyte et al., 1997; Staijen et al., 1999; Margesin et al., 2003; Chaillan et al., 2004; Luz et al., 36 2004). Outros genes de biodegradação de hidrocarbonetos já têm sido descritos (Vomberg e Klinner, 2000; Belhaj et al., 2002; Kotik et al., 2005). Recentemente verificou-se que em P. aeruginosa um gene codificador da alcano hidroxilase é necessário para seu crescimento em óleo cru como única fonte de energia e de carbono (Belhaj et al., 2002; Siciliano et al., 2003). 1.4. Análises microbiológicas independentes de cultivo A existência de enorme e desconhecida diversidade de microrganismos não cultivados em amostras ambientais tem encorajado o desenvolvimento de novas metodologias para o seu estudo, sem a necessidade de cultivo prévio. Os métodos mais recentes exploram diferentes moléculas biológicas, incluindo rDNAs (tabela 1). Juntamente com a bioinformática, as análises estatísticas e filogenéticas são vistas como as mais promissoras ferramentas nos estudos visando a caracterização das comunidades microbianas e o papel delas em diferentes condições ambientais (Ovreas, 2000). Tabela 1. Técnicas para estudo da microbiota de amostras ambientais 37 O estudo de um grande número de comunidades de microrganismos de forma independente de cultura através do metagenoma pode brindar informações únicas ao acessar diretamente a informação genética dos microrganismos. Duas estratégias podem ser empregadas para melhorar o rendimento e a pureza do DNA metagenômico (mDNA) recuperado das amostras, representando de forma mais precisa a diversidade microbiológica: i) a primeira metodologia consiste na extração direta de ácidos nucléicos de partículas do solo através de lise celular in situ, seguida de purificação do DNA; (Ogram et al., 1987; Bruce et al, 1992; Orphan et al., 2000; Kirk et al., 2004). ii) metodologia baseada na separação bacteriana das partículas do solo, seguida de lise celular e purificação do mDNA (Yeates et al., 1998; Robe et al., 2003). O emprego de kits comerciais torna a extração do mDNA onerosa porém compensatório em termos de pureza e rendimento de mDNA propício para as reações de PCR (Nakatsu et al., 2000; Fredslund et al., 2001; Martin-Laurent et al., 2001; Evans et al., 2004a; Evans et al., 2004b; Kaplan e Kitts, 2004 e Mumy e Findlay, 2004). Seqüências de DNA genômico (DNAg) e mDNA provenientes de comunidades bacterianas nativas presentes no solo, sedimento e areia podem ser amplificadas pelo uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) e analisadas através de DGGE (Muyzer et al., 1993). A utilização de PCR-DGGE foi disseminada em estudos da diversidade genética microbiana em amostras ambientais mediante a utilização de primers para o gene 16S rDNA (Bruce et al., 1992; Amann et al., 1995; Orphan et al., 2000; Watanabe et al., 2001; Robe et al., 2003; Zhu et al., 2003; Evans et al.,2004a; Evans et al., 2004b; Kirk et al., 2004; Santos, 2006). A técnica de DGGE é uma poderosa ferramenta que é comumente usada na biologia molecular para a caracterização das estruturas e dinâmicas populacionais dos microrganismos. O fornecimento de dados são bastante rápidos e eficazes no que diz respeito ao conteúdo global das populações presentes na área de estudos. O emprego do DGGE consiste na análise da separação de fragmentos de bandas de DNA de dupla fita com tamanhos idênticos. Na prática, isso se refere à separação dos fragmentos de DNAs produzidos por reação de PCR. A façanha desta técnica (dentre outros fatores) baseia-se na estabilidade do 38 conteúdo GC (seu pareamento, possui três ligações de hidrogênio) em relação ao pareamento AT (o qual possui duas ligações de hidrogênio). A mistura de diferentes seqüências de DNAs são eletroforizados em gel de poliacrilamida contendo um gradiente que aumenta a desnaturação do DNA. Em geral os fragmentos de DNAs gerados que possuem um alto conteúdo GC apresentam uma tendência a serem mais estáveis, permanecendo dupla fita mesmo nos altos gradientes desnaturantes (Muyzer et al., 1993). Fragmentos dupla fita migram melhor no gel, enquanto moléculas de DNAs desnaturadas tornam-se efetivamente maiores e migram mais lentamente. Dessa maneira, fragmentos de DNAs de diferentes seqüências podem ser separados. 1.5. Diversidade microbiana relacionada a petróleo e derivados É importante destacar que a maioria dos estudos da diversidade microbiana biodegradadora de petróleo e/ou seus derivados e xenobióticos realiza as análises em ambientes associados a petróleo (Smits et al., 1999; Orphan et al., 2000; Milcic-Terzic et al., 2001; Tanaka et al., 2002; Margesin et al, 2003; Pepi et al., 2003; Chaillan et al 2004; Luz et al., 2004; Chang et al, 2005, Nievas et al, 2006; Sette et al, 2006). No entanto, praticamente se desconhece sobre a diversidade de comunidades microbianas nativas de locais não impactados, porém com elevado risco de impacto ambiental, como os realizados no Kuwait (Obuekwe et al, 2003) e na Alemanha (Kloos et al., 2006). Pesquisas sobre a diversidade microbiana nativa em diferentes ecossistemas em bacias petrolíferas no Brasil são limitadas (Sebastian, 1999; Evans et al., 2004ab,). Já em ambientes contaminados, vários trabalhos reportam experiências de isolamento e caracterização microbiológica: Praia do Recreio dos Bandeirantes RJ, (Del Arco, 1999); Bacia de Campos (Rosa, 2001); Baia de Guanabara - RJ (Santos de Oliveira, 2001); Petrobras, Lagoa de Baixo, Guamaré, RN (Costa Duarte, 2004); Região de Icapuí-CE (Marques, 2004); Petrobras, Guamaré-RN (Pinto da Silva, 2004), porém somente Bellicanta (2004) e Luz et al. (2004) realizaram estudos com abordagens moleculares no sistema estuarino de Santos e São Vicente, SP; Cubatão-SP, 39 respectivamente. Na Bacia Petrolífera Potiguar-RN (BPP-RN), a mais importante produtora de petróleo on shore, os estudos são pioneiros, como o de Santos (2006), que verificou através de PCR-DGGE que a população microbiana nativa de solos de Macau,RN (caatinga) e de Diogo Lopes-RN (Mangue) responde à contaminação por petróleo, revelando uma correlação na dinâmica de comunidades microbianas em função do tempo e tipo de solo impactado com petróleo, inclusive em amostras de solo da Mata Atlântica na Reserva Horto Dois Irmãos-PE. Ainda, Coutinho (2005) estudou in vitro a ocorrência de microrganismos nativos de Diogo Lopes-RN (Mangue) e da Mata Atlântica na Reserva Horto Dois Irmãos-PE com potencial de crescimento utilizando petróleo como única fonte de carbono. Silva (2005) observou a ocorrência de bactérias redutoras de Ferro (III), e prospectando os mesmos microcosmos experimentais isolou bactérias que também crescem utilizando petróleo como única fonte de carbono. Souza Junior (2006) avaliou a produção de biosurfactantes por bactérias biodegradadoras de petróleo isoladas de solos e de mangue da Bacia Petrolífera Potiguar-RN (BPP-RN), observando que estas apresentam uma produção aumentada de moléculas biosurfactantes quando crescem em petróleo como única fonte de carbono. Neste trabalho, através da aplicação de métodos moleculares como PCR-DGGE, espera-se contribuir para uma visão particular da diversidade de microrganismos alcanotróficos de microbiomas nativos da BPP-RN, baseado na ocorrência de genes catabólicos responsáveis pela biodegradação de alcanos e inferir suas potenciais aplicações em bioremediação em situações de impacto ambiental por petróleo e derivados na Bacia Petrolífera Potiguar-RN (BPP-RN). 40 2. OBJETIVOS x Prospectar bactérias alcanotróficas de solos e mangue da Bacia Petrolífera Potiguar – RN e solo da Mata Atlântica na Reserva Horto Dois Irmãos-PE utilizando o gene alkB como biomarcador molecular x Avaliar a resposta de comunidades microbianas alcanotróficas nativas de solos e mangue da Bacia Petrolífera Potiguar – RN ao impacto de contaminação por petróleo através de PCR-DGGE x Comparar respostas ao impacto de contaminação por petróleo de comunidades microbianas da Bacia Petrolífera Potiguar – RN e solo da Mata Atlântica na Reserva Horto Dois Irmãos-PE. 41 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Locais de amostragem de solos e sedimentos Foram utilizados como materiais de coleta: luvas, espátulas e contêineres com a capacidade para 20Kg que foram previamente esterilizados. Em uma área demarcada de 1m2 e a uma profundidade de 10cm da superfície foram coletados 20 Kg de amostras de solos de cada ambiente de estudo. Os locais de amostragens foram escolhidos de forma aleatória, observando-se apenas o distanciamento do local de possíveis ações antrópicas. A seguir segue a localização dos pontos com suas respectivas caracterizações: x Distrito de Macau-RN em Diogo Lopes-RN (05°05’39’’ de Latitude Sul e 36°21’33’’ de Longitude Oeste) na área de Proteção Ambiental (Mangue), pertencente à Bacia Petrolífera Potiguar, sem nenhum histórico registrado de contaminação por petróleo (figura 2). Os mangues são árvores ou arbustos que apresentam a característica idêntica de crescer em águas rasas e lodosas ou salobras, em especial em costas e estuários de águas tranqüilas. Produzem massas emaranhadas de raízes arqueadas, que ficam expostas durante a maré baixa. Os manguezais são alguns dos ecossistemas mais produtivos da natureza, proporcionando complexas relações ecológicas entre seus componentes e funcionando, por vezes, como um exportador de matéria orgânica para ecossistemas costeiros adjacentes. É um ecossistema de transição do ecossistema marinho e terrestre característico de regiões tropicais e subtropicais, este tipo de ambiente está sujeito ao regime de marés (recebendo diariamente ação de águas salgadas ou mesmo salobra) (Pereira e Soares-Gomes, 2002). x Distrito de Macau-RN na “Estrada do Óleo” (05°18’28’’ de Latitude Sul e 36°40’31’’ de Longitude Oeste) pertencente à Bacia Petrolífera Potiguar (Caatinga). Sem contaminação por petróleo conhecida, embora existam cavalos mecânicos para extração do petróleo no local (figura 2). 42 O bioma Caatinga é o principal ecossistema existente na Região Nordeste, estendendo-se pelo domínio de climas semi-áridos, numa área de 73.683.649 ha, 6,83% do território nacional; ocupa os estados da BA, CE, PI, PE, RN, PB, SE, AL, MA e MG. O termo Caatinga é originário do tupi-guarani e significa mata branca. É um bioma único, pois, apesar de estar localizado em área de clima semi-árido, apresenta grande variedade de paisagens, relativa riqueza biológica e endemismo. A ocorrência de secas estacionais e periódicas estabelece regimes intermitentes aos rios e deixa a vegetação sem folhas. A folhagem das plantas volta a brotar e fica verde nos curtos períodos de chuvas. (www.ibama.gov.br) x Dois Irmãos-PE (08°03’00’’ de Latitude Sul e 34°59’17’’ de Longitude Oeste) área de Reserva Florestal em remanescente de Mata Atlântica, localizada fora da Bacia Petrolífera Potiguar, em local selvagem não afetado por ação antrópica e sem histórico de contaminação por petróleo (figura 2). Em termos gerais, a Mata Atlântica pode ser vista como um mosaico diversificado de ecossistemas, apresentando estruturas e composições florísticas diferenciadas, em função de diferenças de solo, relevo e características climáticas existentes na ampla área de ocorrência desse bioma no Brasil. O ecossistema de Mata Atlântica compreende a região costeira do Brasil. O seu clima é equatorial ao norte e quente temperado sempre úmido ao sul, possui temperaturas médias elevadas durante o ano todo e não apenas no verão. A alta pluviosidade nessa região deve-se à barreira que a serra constitui para os ventos que sopram do mar. Seu solo é pobre e a topografia é bastante acidentada. No interior da mata, devido à densidade da vegetação, a luz é reduzida. As condições físicas na floresta atlântica variam muito, dependendo do local estudado, assim, apesar de a região estar submetida a um clima geral, há micro climas muito diversos e que variam de cima para baixo nos vários estratos. Os teores de oxigênio, luz, umidade e temperatura são bem diferentes, dependendo da camada considerada. Os solos da floresta são, via 43 de regra, pobres em minerais e sua natureza é granítica ou gnáissica. A maior parte dos minerais está contida nas plantas em vez de estar no solo (www.ibama.gov.br). Figura 2. Os pontos de amostragens no Rio Grande do Norte e Pernambuco. 3.2. Ensaio de microcosmo A construção do ensaio de microcosmo foi realizada por Santos (2006) na qual utilizou os três solos coletados (indicados no item 3.1 deste trabalho) em contêineres de 20Kg, o ensaio foi realizado em triplicata. Destes foram utilizados 15Kg, que foram divididos em dois contêineres menores de 7,5Kg, um mantido puro (nas condições encontradas no ambiente) e o outro foi contaminado com 3% de petróleo (não havendo reposição durante o experimento). Posteriormente, foram construídos 42 microcosmos para cada tipo de solo em estudo, 21 contendo solo puro e 21 contendo solo contaminado, gerando um total de 126 microcosmos com 250g de solo cada. Antes da acomodação dos solos nos recipientes, foi efetuada uma homogeneização tanto dos solos de microcosmos puros, quanto dos solos de microcosmos contaminados por petróleo, para assim serem mantidos durante 44 todo o experimento. As amostragens dos solos de microcosmos para análises foram realizadas a cada 2 meses (Tempos 0, 60, 120, 180, 240, 300 e 360 dias), durante um período total de 12 meses de experimento. A seguir segue o esquema do ensaio do microcosmo (figura 3): Figura 3. A esquerda uma Ilustração do ensaio de microcosmo e no lado direito desenho esquemático de sua montagem. 3.3. Cultivo de microrganismos em meio de cultura Luria Bertani (LB) O meio de cultura Luria Bertani (LB) foi preparado segundo Sambrook e Russell (2001). Para isolamento das colônias foi utilizado o método de esgotamento. As culturas foram feitas pela semeadura nos meios de cultura sólidos, distribuídos em placa de Petri e incubados a 37°C. Por se tratarem de microrganismos desconhecidos até o momento, o tempo de incubação variou para cada isolado. 3.4. Linhagens bacterianas utilizadas As cepas bacterianas controle utilizadas foram cedidas pelo pesquisador Bernard Witholt do Instituto Federal de Tecnologia da Suíça (ETHZ). São elas Escherichia coli W3110 (pGEc47) contendo o operon alk, Pseudomonas putida GPo1 (comumente conhecida como Pseudomonas oleovorans GPo1) (pOCT), 45 e P. putida GPo12 (curada do pOCT) (Van Beilen et al, 2001; Smits et al, 2002), utilizadas para verificar a especificidade dos primers construídos, os quais foram designados como mat. Também foram utilizadas linhagens que fazem parte da coleção do CROB (Cluster for Research in Oil Biotechnology), previamente selecionadas por Coutinho (2005) e Santos (2006) (Tabela 2). Os isolados microbianos 18R – 35 da tabela 2 são provenientes do microcosmo do solo de Diogo Lopes previamente isolados por Santos (2006). E os isolados 1.2 - 1.12 (Horto de Dois Irmãos), 2.6 - 2.11 (Diogo Lopes), são provenientes de microcosmos líquidos contendo petróleo a 3% realizados por Coutinho (2005). Tabela 2. Linhagens utilizadas para estudos do gene alkB. 3.5. Desenho de oligonucleotídeos para PCR Foi construída uma base de dados de genes alk de degradação de alcanos, através de mineração em bancos de dados: NCBI (The National Center for Biotechnology Information - USA), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes - JAPÃO) e UMBBD (University of Minnesota Biocatalysis/Biodegradation Database - USA). A escolha das seqüências nucleotídicas para desenho dos primers degenerados mat foi realizada a partir de alinhamentos múltiplos gerados pelo programa CLUSTALW (Higgins e Sharp, 1988). Para a construção dos primers específicos para o gene alkB em Pseudomonas foi utilizado o programa Fast PCR (by Ruslan Kalendar, versão 3.8.82 para windows) e adicionalmente foi sintetizado um grampo de GC com 40 nucleotídeos 5’ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G 3’ como descrito por Nakatsu et al. (2000), ligando a 46 extremidade 5` do primer forward específico, sendo denominado de matg. Também foram utilizados primers universais baseados no gene 16S rDNA desenvolvidos por Santos (2006). 3.6. Extração de DNA metagenômico de solos e extração de DNA genômico dos isolados microbianos O mDNA das amostras de solos puros e contaminados do microcosmo foram extraídos segundo o método descrito por Ausubel et al., (1995) e/ou utilizando o kit FastDNA SPIN (BIO101, Carlsbad, CA, USA). As extrações de DNA genômicos a partir de culturas bacterianas puras foram realizadas de acordo com o método “extração por fervura”. Foram fervidas as bactérias crescidas em meios líquidos enriquecidos, retirada uma alíquota de 500 µL das bactérias crescidas e colocou-se em microtubos de 2 mL, centrifugou-os durante 5 minutos a 13000 rpm, retirou-se o sobrenadante, ressuspendeu-se com água deionizada estéril, e furou-se as tampas dos microtubos com agulhas estéreis. Os microtubos foram colocados em banho-maria, (com a água previamente aquecida) dentro de um forno microondas em sua potência máxima por dois ciclos de 5 minutos. Em seguida, os microtubos foram centrifugados durante 10 minutos e o conteúdo foi recuperado e transferido para um outro microtubo estéril. A solução de DNA foi estocada no freezer (- 20°C). 3.7. PCR e DGGE Os produtos gerados nas reações de PCR foram analisados eletroforeticamente em agarose, como descrito por Sambrook et al. (1989). O programa de ciclagem (denominado DOWNTM) foi o mesmo para ambos os pares de primers ISBA (rDNA16S), mat (alkB primer degenerado) e matg (alkB primer específico), como descrito pela metodologia de Santos (2006). Para amostras de DNA metagenômicos e DNA genômico de consórcios bacterianos foi utilizado o seguinte protocolo de PCR: x 1 µL de DNA (~40 ng/ µL) , 1 µL de 2,5 mM MgCl2, 2 µL de 47 tampão de PCR10X (Biosystem), 2 µL de primer foward (20 pmol), 2 µL primer reverse (20 pmol), 1 µL DNTPs e 2,5 U de Taq polimerase (Biosystem). Para amostras de DNA genômico dos isolados bacterianos crescidos dos microcosmos que foram extraídas pelo método de “extração por fervura” foi utilizado o seguinte protocolo de PCR: x 5µL ácidos nucléicos dos consórcios, 1 µL de 2,5 mM MgCl2, 2 µL de tampão de PCR 10X (Biosystem), 2 µL de primer foward (20 pmol), 2 µL primer reverse (20 pmol), 1 µL DNTPs e 2,5 U de Taq (Biosystem) e/ou GoTaq® Flexi DNA Polymerase (PROMEGA). Após a reação de PCR com mDNA, as amostras foram analisadas em gel de agarose a 1,8%. Depois da avaliação com gel de agarose, os amplicons foram analisados pela técnica de PCR-DGGE, utilizando o aparelho DGGE-1001 (C.B.S., Scientific Company). As análises foram feitas em poliacrilamida a 8% durante 16 horas a 80 V e 22 mA, com gradiente de desnaturação uréia-formamida de 40% a 60%. Em cada canaleta do DGGE foram aplicados 10 ȝl das reações de PCR. Os géis foram corados com nitrato de prata a 0,2% e fotodocumentados. 48 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO Dados protegidos para publicação 59 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Akarsubasi, A. T., Ince, O., Kirdar, B., Oz, N. A., Orhon, D., Curtis, T. P., Head, I. M., Ince, B. K. (2005). Effect of wastewater composition on archaeal population diversity. Water Res. 39:1576 - 84. Amann, R. I., Ludwing, W. E., Schleifer, K. H. (1995). Phylogenetic identification and in situ detection of individual cells without cultivation. Microbiol. Reviews 59:143 - 69. Anderson, I. C., Cairney J W (2004). Diversity and ecology of soil fungal communities: increased understanding through the application of molecular techniques. Environ. Microbiol. 6:769 - 79. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. 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A grande maioria dos microrganismos possuem a proteína AlkB ou proteínas homológas, no entanto, os mecanismos e/ou processos envolvidos na preferência ou capacidade de utilizar alcanos específicos ainda são pouco conhecidos. As constantes atualizações e disponibilidade de novas ferramentas na área de bioinformática, bem como as inclusões de novas informações e seqüências nucleotídicas nos bancos de dados, e novas descrições microrganismos alcanotróficos, contribuirão para uma análise in silico mais abrangente e representativa das variações encontradas nas proteínas AlkB dos distintos gêneros bacterianos utilizadas neste estudo e possíveis correlações com a habilidade de utilização de substratos alcanos. Novas avaliações, incluindo modelagem 3D com outras oxigenases, permitirão obter subsídios para uma melhor compreensão sobre o possível papel da proteína AlkB na discriminação de alcanos. Acessar a biodiversidade microbiana de ambientes naturais e conhecer a resposta dessas comunidades microbianas perante o impacto por contaminação com petróleo tem grande relevância para a indústria de petróleo. Nossos resultados sugerem que o emprego de novas estratégias de enriquecimento devem ser incorporadas e contribuirão para aperfeiçoar a detecção molecular de bactérias alcanotróficas. A caracterização de hidrocarbonetos totais do petróleo utilizado contribuirá para estimar quais comunidades microbianas nativas possam ser bioestimuladas/selecionadas nos ensaios de microcosmos. A identificação molecular por sequenciamento de DNA de alguns amplicons de isolados e/ou OTUs originários de DGGE contribuirão para o conhecimento da biodiversidade de comunidades microbianas nativas nos ambientes estudados. na Bacia Petrolífera Potiguar – RN como também da Mata Atlântica na Reserva Horto Dois Irmãos-PE.