MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE DIFERENTES FONTES NATURAIS QUE POSSIBILITEM SUA APLICABILIDADE BIOTECNOLÓGICA NEDNALDO DANTAS DOS SANTOS Natal/RN 2012 NEDNALDO DANTAS DOS SANTOS IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE DIFERENTES FONTES NATURAIS QUE POSSIBILITEM SUA APLICABILIDADE BIOTECNOLÓGICA Tese apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha. NATAL/RN 2012 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Profa. Dra. Ivonete Batista de Araujo NEDNALDO DANTAS DOS SANTOS IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE DIFERENTES FONTES NATURAIS QUE POSSIBILITEM SUA APLICABILIDADE BIOTECNOLÓGICA Aprovado em: 19 de Março de 2012 Banca Examinadora: Presidente da Banca: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha (UFRN) Membros da Banca: Prof. Dra Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza (UFRN) Prof. Dra Valeria Soraya de Farias Sales (UFRN) Prof. Dr Danilo José Ayres de Menezes (UFCG) Prof. Dr Eduardo Henrique Cunha de Farias (UNIFESP) AGRADECIMENTOS Primeiramente, a Deus, por ter me dado força para continuar seguindo em frente mesmo diante das dificuldades. Aos meus pais, Nilo (homenagem póstuma) e Sueli, por ficarem felizes com minhas vitórias, por sempre estarem ao meu lado, me apoiando e incentivando. Amo muito vocês! Ao meu professor e meu orientador Dr. Hugo Alexandre, pelos ensinamentos, confiança, credibilidade e paciência para o desenvolvimento desse trabalho e, principalmente, por sua amizade durante esses anos. À Universidade Federal do Rio Grande do Norte e Universidade do Minho por fornecerem as condições necessárias para realização deste trabalho. Ao CNPq, CAPES e FCT por financiarem este trabalho. A todos os professores e funcionários do Departamento de Bioquímica, em especial, as Professoras Edda Lisboa e Luciana da Matta e ao professor Elizeu Antunes pelo convívio e ensinamentos desde a minha graduação. A todos os professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, em especial, a Professora Ivonete e aos professores Arthur Carriço e Sócrates Egito pelo convívio e ensinamentos no decorrer do doutorado. À Professora Dra. Kátia Scostecci, por nossas conversas, pelo estágio no grupo de Plantas permitindo que trabalhasse com Biológia Molécular e por me permitir colaborar com seu grupo no transcorrer destes anos. Ao BIOPOL, minha segunda casa, e a todos que fazem parte deste grupo: Prof. Hugo (por ter me dado a oportunidade de fazer parte dessa caminhada de aprendizado), Ivan e Leandro (por terem me acolhido e por terem me ensinado muito do que hoje eu sei), Sara e Mariana (minhas grandes amigas e irmãs no laboratório e na minha vida), Jailma (pela amizade, caronas e por sempre me tirar do sufoco quando precisei), Dayanne (minha primeira IC que juntos acreditamos no potencial da Eichhornia), Popó (pelas coletas, brincadeiras, ajuda e trocas de idéias sobre cromatografia), Ruth e Rafael (pela alegria, pelas conversas, pelas coletas e pelas piadas que sempre me alegraram), Cinthia (uma menina de grande potencial), Edjane (pelo carinho que me tens), Leonardo (pelas palhaçadas e descontração), Gabriel e Arthur (por estarem sempre dispostos a ajudar), Rony (um jovem de espirito iluminado), Raniere, Fernando, Karol (pelo carinho), Ana Karina (primeira do grupo de fitoquimicos), Ingrid e Jessica (as nedetes), Letícia, Moacir, Daniel, Max, Vinicius. Enfim, obrigada a todos pelo auxílio nesses mais de dez anos, juntos crescemos como pesquisadores e como pessoas, sorrindo e chorando em alguns momentos. Obrigado por tudo! Nunca me esquecerei de vocês!!! À Jailma, Mariana, Dayanne e Mauricio por me ajudarem na finalização desta tese. À Ruth e Rafael meus queridos amigos pela ajuda nos experimentos e, além disso, pela sua amizade, carinho e apoio. Obrigado! À Mariana, minha amiga desde minha entrada no BIOPOL. Obrigado por sua amizade, por sempre me apoiar, pelo incentivo durante os obstáculos, pelas palavras de força nos momentos de tristezas, por se alegrar comigo e por estar comigo no hospital quando se fez preciso…rsrsrs... Adoro você minha amiga e irmã de coração!!! À Jailma por ser a pessoa critica mais que consegue ter um coração generoso, pela amizade, pelo carinho, pelo apoio, por estar sempre disposta a me ajudar, por compartilhar seus conhecimentos inúmeros sobre tantos assuntos e entre eles sobre nanopartículas. És muito especial para mim!!! Aos vários colegas de Departamento de Bioquímica pela convivência, pelos sorrisos e conversas nos corredores do DBQ, Cleysyvan, Marília, , Virgínia, Núbia, Claúdio, Sergio, Tati, Gloria e aos antigos amigos Adeliana, Edurdo Farias, Fernanda, Celina, Ana... em especial a minha amiga Luciana (a safada!). Aos meus amigos Ana Maria e Adriano (por estarem sempre perto), a Pe Thiago Theyse (pelos incentivo para continuar estudando), Luiz Teixeira, Adriana e Edesio (pela amizade e disposição em sempre ajudar), Pe Silvio (pela confiança nas tarefas paroquiais), Fabiano e Terinalda (meus compadres) e Manuel Souza, obrigado pela amizade de vocês. A todos os meus amigos obrigado pela oportunidade de compartilhar os momentos de minha vida e por me ajudarem a conhecer cada vez mais a Deus. Amo vocês! Ao meu amigo Mauricio Alcântara, que foi um ponto de apoio em momentos difíceis nessa caminhada me estimulando e incentivando a continuar sempre firme em meus objetivos e por me acolher em sua família. E a todos que, por um acaso, tenham ficado fora dessa lista, que se sintam agradecidos da mesma forma, pois não estaria aqui sem que vocês me apoiassem. “Ninguém é suficientemente perfeito, que não possa aprender com o outro e, ninguém é totalmente destituído de valores que não possa ensinar algo ao seu irmão.” São Francisco de Assis RESUMO Os polissacarídeos sulfatados (PS) são amplamente distribuídos em animais e tecidos de algas. Estes polímeros têm sido estudados em função da importância de suas atividades farmacológicas, tais como: anticoagulante, antioxidante, antitumoral, anti-inflamatória e as propriedades antivirais. Contudo, o potencial dos PS para sintetizar biomateriais, tais como nanopartículas, ainda é pouco explorado. Até então, os PS só foram encontrados em seis plantas e todas habitam ambientes salino. Não havendo relatos de PS em plantas de água doce. O que nos levou aos seguintes questionamentos: Os PS extraidos de vegetais marinhos não apresentam atividades farmacológicas? Os vegetais de água doce realmente sintetizam PS? É possível sintetizar nanopartículas utilizando PS a partir de algas marinhas? Para melhor entender as questões, esta tese foi dividida em três capítulos. No primeiro capítulo, um polissacarídeo sulfatado (SPSG) foi isolado a partir de um vegetal marinho Halodule wrightii. Os dados aqui apresentados mostram que o SPSG é uma heterogalactana sulfatada de 11 kDa constituida de glucose e xilose. Os ensaios realizados sugerem que o SPSG possue propriedades antioxidantes notáveis em diferentes ensaios in vitro e uma excelente actividade anticoagulante de 2,5 vezes mais elevadas do que a de heparina Clexane ® no teste APTT. No capítulo seguinte, utilizando ferramentas diferentes, tais como análises químicas e histológicas, análise de dispersão de raios-X (EDXA), eletroforese em gel e espectroscopia de infra-vermelho,confirmamos, em primeira mão, a presença de polissacarídeos sulfatados em vegetais de água doce. Além de demonstrarmos que o PS extraído a partir da raiz de E. crassipes tem potencial como um composto anticoagulante.No último capítulo uma fucana, um polissacárido sulfatado, extraído a partir de uma alga marrom, foi quimicamente modificada por adição de hexadecilamina à cadeia principal do polímero hidrofílico. O material resultante (SNFuc) forneceu partículas nanométricas. O grau de substituição para as cadeias hidrofóbicas de 1H RMN foi de aproximadamente 93%. SNFuc em meios aquosos tinha um diâmetro médio de 123 nm e potencial zeta de -38,3 ± 0,74 mV. Os ensaios com células tumorais (HepG2, 786, H-S5) demonstrou a ocorrência de uma inibição que variou de 2,0-43,7% em concentrações diferentes de SNFuc (0,05-0,5 mg / mL) resultado semelhante foi obtido com a RAEC monstrando uma inibição entre 8,0-22,0%. Por outro lado, o nanogel estimulou a proliferação de linhagens celulares não tumorais como CHO e RAW nas mesmas concentrações. Análise por citometria de fluxo revelou que este nanogel de fucana inibiu a proliferação celular de 786 por mecanismos dependentes e independentes de caspases. Além disso, bloqueou a passagens da célula 786 na fase S e G2-M do ciclo celular. Palavras chaves: Polissacarídeos sulfatados. Capim do mar; macrófitas aquáticas; atividade anticoagulante; nanopartículas de fucana. ABREVIATURAS ATCC American Type Culture Collection BIOPOL Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais da UFRN CS Condroitim sulfato Fuc A Fucana A Fuc B Fucana B Fuc C Fucana C GAGs Glicosaminoglicanos HS Heparam sulfato mg miligrama mL Mililitro MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide nm Nanômetro PBS Phosphate Buffer Saline PDA 1,3 diamino propano acetato PGs Proteoglicanos PS Polissacarídeos sulfatados µg Micrograma µL Microlitro LISTA DE FIGURAS Figura 1-Estrutura proposta por Aquino para a galactana sulfatada purificada de Ruppia marítima. Fonte: Aquino et al., 2005 …………………………………………………....... 18 Figura 2-Lâmina de eletroforese em gel de agarose das fucanas A, B e C da alga Spatoglossum schröederi. Foram aplicados 50 µg de cada fucana e apos a corrida elas foram coradas com azul de toluidina. Fuc A - fucana A; Fuc B - fucana B; Fuc C - fucana C. Fonte: Hugo A O Rocha (Rocha, 2002) ……………………………………… 19 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ………………………………………………………………. 13 2 REVISÃO DE LITERATURA ………………………………………………. 16 3 ANEXAÇÃO DOS ARTIGOS PUBLICADOS ……………………………. 22 4 ANEXAÇÃO DO ARTIGO SUBMETIDO …………………………………. 47 5 COMENTÁRIOS FINAIS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES ……………….. 65 6 REFERÊNCIAS ……………………………………………………………… 69 7 ABSTRACT ………………………………………………………………….. 79 13 1 INTRODUÇÃO A biotecnologia revela fundamental importância frente a uma exigência de ações multidisciplinares que venham melhorar a qualidade de vida de uma sociedade. Essa demanda vem a permitir o desenvolvimento de novos fármacos, alimentos e produtos de outros segmentos industriais. As ferramentas biotecnológicas são apropriadas às necessidades atuais por conseguirem associar ao desenvolvimento econômico, um menor impacto ao meio ambiente. Nesse contexto, a exploração de biomateriais vem despontando em resposta aos requisitos de mercado (HENRY, 2010; SCHRÖDER et al., 2008). Polissacarídeos sulfatados (PSs) são exemplos de biomateriais que podem ser inseridos neste contexto. Eles são biopolímeros naturais oriundos de fontes renováveis, apresentam uma viabilidade técnica e potencial de expansão considerável. Além disso, sua aplicabilidade em diferentes setores os torna alvo de interesse de muitas pesquisas (BARBOSA et al., 2004). O grupo em que está inserido este trabalho está entre os cinco grupos de pesquisa do país que vêm estudando sistematicamente propriedades estruturais e farmacológicas de PSs de diferentes espécies de algas marinhas (ALBUQUERQUE et al., 2004; ROCHA et al., 2005; MEDEIROS et al., 2008; COSTA et al., 2010; MAGALHÃES et al., 2011; CAMARA et al., 2011, COSTA et al., 2011a; COSTA et al., 2011b). Os estudos mais avançados se concentram em torno de PSs obtido da alga Spatoglossum schröederi, denominado de fucana A. Este polímero apresenta excelente atividade antitrombótica (BARROSO et al., 2008) e não apresenta potencial genotóxico ou mutagênico (ALMEIDA-LIMA et al., 2010), nem promoveu alterações 14 comportamentais, morfológicas, bioquímicas e hematológicas em ratos quando administrado por 70 dias contínuos (ALMEIDA-LIMA et al., 2011). Vale salientar que antes do desenvolvimento desta tese polissacarídeos sulfatados de vegetais ainda não tinham sido avaliados estruturalmente e biotecnologicamente por nenhum grupo de pesquisa. Tendo isto em consideração, o objetivo desta tese foi extrair e caracterizar química e farmacologicamente PSs de três diferentes organismos a fim de evidenciar possíveis aplicabilidades biotecnológicas desses polissacarídeos. Isto não só delineou a denominação do título desta tese, mas também todos os passos para o seu desenvolvimento. O leitor encontrará na tese três capítulos referentes aos dados obtidos: no primeiro descreve-se a caracterização química e as atividades anticoagulantes e antioxidantes de PSs obtidos do vegetal marinho conhecido como capim do mar (Halodule wrightii). Com isso, foi possível publicar o primeiro trabalho na literatura que mostra o potencial biotecnológico de PSs de vegetais ( ver artigo 1); No segundo capítulo, estão apresentados os dados estruturais e a atividade anticoagulante PSs do vegetal dulcícola Eicchornia crassipes que resultou no pioneiro trabalho na literatura que comprovou a presença de PSs em vegetais que crescem em água doce (ver artigo 2). Essa informação, além de abrir uma nova frente de pesquisas, pode fornecer um novo campo de trabalho com a exploração econômica do cultivo desse vegetal para extração e purificação desse polissacarídeo sulfatado; No terceiro capítulo, tem-se um artigo publicado que mostra o preparo, a caracterização e a atividade antiproliferativa frente a células tumorais de nanopartículas sintetizadas a partir da fucana A da alga S. schröederi. Finalmente, os dados obtidos nesse trabalho também foram apresentados na forma de painel em Congressos Nacionais e Internacionais no decorrer do seu curso. O desenvolvimento desse estudo proporcionou ao autor desta tese á oportunidade de 15 interagir com diversos ramos da pesquisa científica tais como Bioquímica, Morfologia, Botânica, Biologia Molecular, Física, Química, o que proporcionou ao trabalho um caráter interdisciplinar. Houve, ainda a oportunidade do autor criar laços científicos com o Depto. de Biologia Celular da Universidade Federal do Paraná (Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade), em função das análises de microscopia bem como a realização de um estágio no Depto. de Engenharia Biológica da Universidade do Minho, em Portugal (Prof. Dr. Francisco Miguel Portela Gama). 16 2 REVISÃO DE LITERATURA A biotecnologia pode ser definida como a aplicação de princípios científicos para o processamento de materiais, através de agentes biológicos, para prover bens e assegurar serviços (OECD, 1998). O Brasil, um dos maiores detentores da biodiversidade do planeta, possui um potencial biotecnológico natural e deve assumir um papel estratégico destinando recursos que permitam projetos de desenvolvimento nacional, com especial enfoque nas áreas da saúde e agricultura . Assim sendo, o desenvolvimento da Biotecnologia tem importância pariícular para o Brasil, pois esta tecnologia, na maioria das vezes, apresenta um baixo impacto ambiental, sendo possível conciliá-la com o desenvolvimento e com a preservação do meio ambiente (desenvolvimento sustentável) (KUMAR e tal., 2010). Este desenvolvimento já está avançando muito em algumas áreas estratégicas e vem destacando o país no cenário nacional e internacional, o que faz com que temas como plantas e animais trangênicos e mais recentemente, nanopartículas, nanomedicina, biocombustíveis e polímeros naturais sejam cada vez mais debatidos por diversos setores da sociedade (GUIMARÃES et al., 2008). Contudo, em algumas áreas os estudos ainda são escassos, como no desenvolvimento do uso biotecnológico de polissacarídoes sulfatados. Polissacarídeos sulfatados são polímeros naturais formados por unidades de monossacarídeos ligados covalentemente entre si e que se apresentam substituidos ou não por grupos sulfato. Estes grupos podem variar tanto em quantidade, como também, na posição de substituição (DIETRICH, 1984; BOISSON-VIDAL et al., 1995; SUGAHARA; KITAGAWA, 2000; HARON-BOUHEDJA et al., 2000; POMIN, 2010). 17 Estes polímeros apresentam diversas propriedades farmacológicas como pode ser observado em revisões publicadas recentemente (LI et al., 2008; ALE et al., 2011; FITTON et al.; 2011; JIAO et al., 2011). Os polissacarídeos sulfatados são encontrados em todas as espécies animais (MEDEIROS et al., 2000; BRITO et al., 2008) e de algas marinhas (JIAO et al., 2011; ROCHA et al., 2006). Além desses dois grupos de seres vivos existem relatos do polímero citado em apenas quatro espécies de vegetais, sendo três vegetais de origem marinha (AQUINO et al. 2005, Aquino et al., 2011) e um de origem terrestre (CHOOSAWAD et al., 2005). A essa lista adiciona-se três componentes com a publicação deste trabalho. Os principais polissacarídeos sulfatados encontrados em animais são denominados glicosaminoglicanos (GAGs) por apresentarem em sua estrutura resíduos de açúcares aminados (LIMA et al, 2011). No Reino Plantae, até pouco tempo não se tinha registro de polissacarídeos sulfatados. Em janeiro de 2005, foi publicado o primeiro trabalho demonstrando a presença de polissacarídeos em três espécies de angiospermas marinhas conhecidas popularmente como capim do mar: Ruppia maritima Linnaeus (Ruppiaceae), Halodule wrightii Ascherson (Cymodoceaceae) e Halophila decipiens Ostenfeld (Hydrocharitaceae). Os autores concentraram seus estudos num polissacarídeo sulfatado de Ruppla marítima. Esse se mostrou como uma galactana sulfatada composta por uma estrutura regular tetrassacarídica: [3-β-D-Gal-2(OSO3)-1→4-α-D-Gal- 1→4-α-D-Gal-1→3-β-D-Gal-4(OSO3)-1→]. (Figura 1). A galactana sulfatada dessa angiosperma marinha está localizada na parede celular, principalmente nos rizomas e raízes, indicando a relação entre a absorção de nutrientes e sua possível função fisiológica (AQUINO et al., 2005). 18 Figura 1- Estrutura proposta por Aquino para a galactana sulfatada purificada de Ruppia marítima.Fonte: AQUINO et al., 2005 Um fato interessante é que de todos os vegetais estudados até o presente momento, a galactose se mostrou como o principal constituinte, sugerindo-se a presença de galactanas sulfatadas como uma caracteristica de vegetais superiores de ambiente aquático. Contudo, existem trabalhos para se fazer afirmações mais objetivas sendo ainda necessário o surgimento de mais dados na literatura. Com relação à aplicabilidade biotecnológica destes polímeros de plantas, ainda não há dados publicados, com exceção dos já mencionados nesta tese(AQUINO et al. 2005, AQUINO et al., 2011, CHOOSAWAD et al., 2005). Outro grupo onde é possível identificar polissacarídeos sulfatados é o das algas marinhas (Chlorophycea, Rodhophyceae e Phaeophyceae). Estes seres são encontrados em abundância no litoral brasileiro, especialmente no litoral Nordestino. Os polissacarídeos de algas marinhas são substâncias naturalmente ativas, possuindo importantes aplicações na indústria alimentícia, farmacêutica e biotecnológica (ROCHA et al., 2011) Das algas pardas (Phaeophyta), um dos objetos de estudo desta tese, extraem- se polissacarídeos que apresentam α- L-fucose sulfatada na sua composição. Aqueles que possuem mais de 90% desse monossacarídeo na sua estrutura são chamados de fucanas e os demais são denominados de fucoidans (BERTEAU; MULLOY, 2003). 19 Contudo, vários autores empregam esses termos como sinônimos. Apesar disso a questão de nomenclatura das fucanas ainda não está totalmente definida. Segundo Rocha et al (2005) as algas pardas podem sintetizar mais de um tipo de fucana que podem ser classificadas de acordo com sua mobilidade eletroforética em gel de agarose em tampãp PDA: fucana A (menor mobilidade), fucana B (mobilidade intermediária) e fucana C (maior mobilidade) (ROCHA et al., 2005). Na figura 2 observam-se as três fucanas sintetizadas pela alga Spatoglossum schröederi. Figura 2 - Lâmina de eletroforese em gel de agarose em tampãp PDA das fucanas A, B e C da alga Spatoglossum schröederi. Foram aplicados 50 µg de cada fucana e após a corrida elas foram coradas com azul de toluidina. Fuc A – fucana A; Fuc B – fucana B; Fuc C - fucana C. Fonte: Hugo A O Rocha (ROCHA, 2002) As fucanas são os polissacarídeos sulfatados de origem não animal mais estudados (POMIN, 2010) devido ao seu grande potencial farmacológico. São atribuidas diversas atividades às fucanas, tais como: antiprolifativa (MAGALHÃES et al., 2011; COSTA et al., 2011), anticoagulante (CÂMARA, COSTA et al., 2011), antitrombótica (LEITE, MEDEIROS et al., 1998; BARROSO et al., 2008), antioxidante (OLALYE & ROCHA, 2007; PAIVA et al., 2011;CÂMARA et al., 2011; MAGALHÃES et al., 2011; COSTA et al., 2011) entre outras atividades. Um estudo recente mostrou que 20 é possível sintetizar nanopartículas a partir de fucanas (LIRA et al., 2011). Este foi o único trabalho publicado sobre este tema. Contudo, ele enfoca ou destaca o potencial biotecnológico das fucanas de algas. Nanopartículas podem ser utilizadas na nanomedicina, que é aplicação da nanotecnologia na área da saúde, o que promete revolucionar as práticas de diagnóstico e terapêuticas nos próximos anos. A aplicação de materiais nanoparticulados ou nanoestruturados tem permitir importantes desenvolvimentos nas áreas do diagnóstico médico, medicina regenerativa e na libertação controlada e dirigida de fármacos (LUTEN et al., 2008; ITALIA et al., 2009) O desenvolvimento de uma vasta classe de nanomateriais (lipossomas, dendrímeros, nanogeis, nanopartículas, etc), acopladas com sondas que lhes permitem reconhecer o alvo da sua ação, transportadores de moléculas bioativas (proteínas terapêuticas, material genético, siRNA, fármacos). Proporciona, o desenvolvimento de sistemas de administração de fármacos evitando a sua dispersão sistêmica e efeitos secundários associados. Ainda permite uma redução das dosagens administradas, proporciona uma libertação controlada de um fármaco (MAKHOF et al., 2009). Embora já existam numerosos sistemas disponíveis, diferentes aplicações requerem materiais com propriedades diversas (de biodistribuição, farmacodinâmica, aptidão para transportar moléculas com diferentes propriedades, reabsorção e excreção). Desta forma, é pertinente o desenvolvimento de novos nanomateriais. A utilização de biomateriais naturais, como fucanas, para esta finalidade, é naturalmente desejável, já que se trata de materiais biocompatíveis, cuja reatividade proporciona potencial para a acoplamento com moléculas dotadas de diversas funções (reconhecimento do alvo, aptidão para atravessar membranas biológicas, transporte de moléculas por afinidade ou por ligação covalente, etc) (LIRA et al., 2011). Outro fator importante para se desenvolver nanopartículas a partir de fucanas está no fato da 21 possibilidade de potencializar e/ou somar atividades que estes compostos já apresentem, às propriedades dos fármacos, por exemplo, que estão incorporados às nanopartículas de fucanas, potencializando assim tratamento. 22 3 ANEXAÇÃO DOS ARTIGOS PUBLICADOS 3.1 Artigo 1 Biological activities of the sulfated polysaccharide from the vascular plant Halodule wrightii. Períodico: Brazilian Journal of Pharmacognosy 2012, 22(1): 94-101. ISSN: 0102-695X (printed version) ISSN: 1981-528X (online version) Indexada: SCOPUS; SCIELO; ELSEVIER Fator Impacto (2011): 3.462 3.2 Artigo 2 Freshwater Plants Synthesize Sulfated Polysaccharides: Heterogalactans from Water Hyacinth (Eicchornia crassipes) Períodico: International Journal of Molecular Sciences 2012, 13: 961-976. ISSN: 1422-0067 Indexada: PUBMED / MEDLINE ; SCIENCE CITATION INDEX EXPANDED (SCIE) / WEB OF SCIENCE ; SCOPUS / SCIVERSE Fator Impacto (2011): 2.279 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 4 ANEXAÇÃO DO ARTIGO SUBMETIDO 4.1 Artigo 1 Antiproliferative activity of fucan nanogel Períodico: Marine Drugs 2012, 10, 1-x. ISSN: 1660-3397 Indexada: PUBMED / MEDLINE; SCOPUS / SCIVERSE; SCIENCE CITATION INDEX EXPANDED (SCIE) / WEB OF SCIENCE Fator Impacto (2011): 3.471 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 5 COMETÁRIOS FINAIS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES O Brasil apresenta em seu litoral uma gama variada de organismos vivos, sendo potencial fonte de biomateriais. No litoral do Rio Grande do Norte, em especial, essa afirmação é possivel ser confirmada pela biodiversidade presente em nossas praias. Este foi um dos fatores que permitiu ao grupo de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL) sob a coordenação do Professor Hugo Alexandre de Oliveira Rocha desenvolver diversos trabalhos com a extração de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas. Este trabalho foi iniciado em meados da década de 90, quando o grupo adaptou uma metodologia para extração e purificação de polissacarídeos de animais (DIETRICH et al., 1995) para algas. Utilizando essa metodologia foi possível extrair e purificar um polissacarídeo sulfatado da alga Spatoglossum schroederi que foi denominado de fucana A. Os polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Spatoglossum schroederi foram submetidos a ensaios para teste de diversas atividades. O processo de testes com atividades diversas exigiu que fossem feitas muitas extrações, o que comprovou a eficiência do método e permitiu que a metodologia fosse aplicada em trabalhos com outras algas marinhas pelo mesmo grupo de pesquisadores, e por outros. É importante salientar que as fucanas estão entre os polissacarídeos sulfatados de origem não animal mais estudados devido ao seu grande potencial farmacológico (POMIN, 2010). São atribuídas diversas atividades as fucanas extraídas de algas marinhas, tais como: Anti-adesiva (ROCHA, FRANCO et al., 2001); Anticoagulante (ALBUQUERQUE et al., 2004; CÂMARA et al., 2011; AZEVEDO et al., 2009) Anti-inflamatória (MEDEIROS et al., 2008), Antioxidante (OLALYE & ROCHA, 2007; CÂMARA, COSTA et al., 2011; 66 MAGALHÃES et al., 2011; COSTA et al., 2011), Antiproliferativa (MAGALHÃES et al., 2011; COSTA et al., 2011), Antitrombótica (LEITE et al., 2008; BARROSO et al., 2008). Os resultados iniciais desse trabalho surgem com o desejo do grupo em investigar outras fontes de polissacarídeos sulfatados. Esse desejo fez com que o grupo que, até então trabalhava com algas buscasse novas fontes desse polímero em outros grupos de seres vivos. Para tentar obter mais recursos que subsidiariam essa nova frente de pesquisa, em 2007 enviou-se um projeto ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) intitulado: “Caracterização estrutural e atividades anticoagulante e antioxidante de polissacarídeos sulfatados do vegetal Eichhornia crassipes.” Com aprovação do projeto foi possível realizar uma varredura entre vegetais de ambiente aquático presentes em nosso estado. Entre os vegetais inicialmente coletados e analisados podemos citar os seguintes espécies: Eichhornia crassipes (Mart.) Solms., Egeria densa Planchon, Egeria naja Planchon, Eleocharis interstincta (Vahl) Roemer & J.A. Shultes, Cabomba caroliniana Gray, Ceratophyllum aquaticum Lam., Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam., Nymphaea ampla (Salisb.) D.C. e Salvinia auriculata Aublet. Os dados preliminares desse levantamento permitiram publicar o artigo intitulado: Freshwater Plants Synthesize Sulfated Polysaccharides: Heterogalactans from Water Hyacinth (Eicchornia crassipes). Esse seria então o primeiro artigo que relata a presença de polissacarídeos sulfatados em macrófitas de ambiente dulcícola. Esse dado é de extrema importância, pois refutou a teoria de que a presença de polissacarídeos sulfatados (em organismos em algas e vegetais) estaria associada ao ambiente marinho e a que a presença de polissacarídeos sulfatados seria uma adaptação ao estresse salino (AQUINO et al., 2005; AQUINO et al., 2011). Este trabalho abriu uma nova linha de pesquisa para o grupo e dados obtidos neste trabalho, ainda não publicados, bem como, os dados que serão obtidos posteriormente 67 pelo grupo de pesquisadores do BIOPOL permitirão a publicação de novos trabalhos que ajudarão a compreender o papel e as aplicabilidades de polissacarídeos sulfatados encontrados nestas fontes que até então não eram conhecidas. Com os dados iniciais sobre os vegetais de ambiente dulcícola, a nossa pergunta foi se os vegetais de ambiente marinho sintetizariam também os polissacarídeos sulfatados. No decorrer de nossas analises um grupo do Rio de Janeiro publicou um trabalho que apresentava uma angiosperma marinha que possuía uma galactana sulfatada (AQUINO et al., 2005). Estes dados foram interessantes, pois nosso grupo tinha identificado um capim do mar (Halodule wrightii Asch.) que apresentou um hetero polissacarídeo sulfatado composto por galactose, glucose e xylose. Este polissacarídeo apresentou uma atividade antioxidante (teste de CAT), radical superóxido e DPPH e uma atividade anticoagulante. Com estes dados foi possível publicar o segundo trabalho do grupo que relata polissacarídeos sulfatados em vegetais. O trabalho foi publicado com o título: Biological activities of the sulfated polysaccharide from the vascular plant Halodule wrightii. Estes trabalhos associados aos obtidos com os compostos extraídos e purificados de macroalgas permitiram que o grupo crescesse e se estabelecesse frente a grandes grupos que trabalham com polissacarídeos sulfatados. Esse amaduremento do grupo permitiu que fossem firmados novos convênios com intuições estrangeiras. Em 2010, um convênio com a Universidade do Minho em Portugal nos permitiu desenvolver novas técnicas para síntese de nanogeis. O grupo já tinha iniciado a produção de nanopartículas com fucana A e a oportunidade da troca de experiências com outra instituição, que possui uma experiência maior, nos possibilitou desenvolver outras técnicas, evidenciando que metodologias diferentes aplicadas ao mesmo biomaterial permitem obter nanopartículas diferentes e com potenciais farmacológicos diferentes. Os dados preliminares oriundos desse convênio nos proporcionaram o envio 68 do artigo: Antiproliferative activity of fucan nanogel para a revista Marine Drugs. Nesse trabalho podemos observar que a metodologia desenvolvida é reprodutível, bem como nos fornece nanopartículas de tamanho e carga peculiares apresentrando atividades antiproliferativas frente a linhagens de células tumorais e atividade proliferativa frente a linhagens normais. Fato este, muito interessante ao considerarmos que as fucanas por si só já detêm algumas atividades farmacológicas que poderão ser potencializadas ao sintetizar nanogéis desse composto. Outra vantagem é termos uma nanopartícula que potencialmente poderá transportar fármacos e que possui um efeito celula- dependente. A produção de nanogéis de fucanas é algo desafiador, já que nenhum grupo no mundo tentou realizar esse procedimento, mas é compensador, pois os dados iniciais obtidos já nos permitem começar aos poucos a preencher a lacuna existente, apresentando a sociedade características estruturais e farmacológicas de vários nanogéis obtidos, o que, conseqüentemente, provocará o registro de patentes no futuro. O cronograma de atividades seguiu dentro dos padrões esperados, todas as dificuldades encontradas ao longo da realização deste trabalho foram superadas. A realização deste estudo envolveu intercâmbio entre universidades Brasileiras, tais como: UFRN, UNIFESP, UFPR e a Universidade do Minho de Portugal, desenvolvendo uma abordagem multidisciplinar e interdisciplinar preconizada pelo programa de Pós-Graduação do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 69 6 REFERÊNCIAS ALBUQUERQUE, I. R.; QUEIROZ, K. C.; ALVES, L. G.; SANTOS, E. A.; LEITE, E. L.; ROCHA, H. A. Heterofucans from Dictyota menstrualis have anticoagulant activity. Braz J Med Biol Res., v. 37, n. 2, p.167-171, 2004. ALE, M.T.; MIKKELSEN, J.D.; MEYER, A.S. Review: Important Determinants for Fucoidan Bioactivity: A Critical Review of Structure-Function Relations and Extraction Methods for Fucose-Containing Sulfated Polysaccharides from Brown Seaweeds .Mar. Drugs, v. 9(10), p. 2106-2130, 2011. ALMEIDA-LIMA, J.; COSTA, L.S.; SILVA, N.B.; MELO-SILVEIRA, R.F.; SILVA, F.V.; CANSANÇÃO FELIPE, M.B.; BATISTUZZO-MEDEIROS, S.R.; LEITE, E.L.; ROCHA, H.A. 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Is it possible to synthesize nanoparticles using SP from seaweed? In order to understand this question, this Thesis was divided into tree chapters. In the first chapter a sulfated polysaccharide (SPSG) was successfully isolated from marine plant Halodule wrightii. The data presented here showed that the SPSG is a 11 kDa sulfated heterogalactan contains glucose and xylose. Several assays suggested that the SPSG possessed remarkable antioxidant properties in different in vitro assays and an outstanding anticoagulant activity 2.5-fold higher than that of heparin Clexane® in the aPTT test; in the next chapter using different tools such as chemical and histological analyses, energy-dispersive X-ray analysis (EDXA), gel electrophoresis and infra-red spectroscopy we confirm the presence of sulfated polysaccharides in freshwater plants for the first time. Moreover, we also demonstrate that SP extracted from E. crassipes root has potential as an anticoagulant compound; and in last chapter a fucan, a sulfated polysaccharide, extracted from the brown seaweed was chemically modified by grafting hexadecylamine to the polymer hydrophilic backbone. The resulting modified material (SNFuc) formed nanosized particles. The degree of substitution for hydrophobic chains of 1H NMR was approximately 93%. SNFfuc-TBa125 in aqueous media had a mean diameter of 123 nm and zeta potential of -38.3 ± 0.74 mV, measured bydynamic light scattering. Tumor-cell (HepG2, 786, H-S5) proliferation was inhibited by 2.0 – 43.7% at SNFuc concentrations of 0.05– 0.5 mg/ mL and RAEC non-tumor cell line proliferation displayed inhibition of 8.0–22.0%. On the other hand, nanogel improved CHO and RAW non-tumor cell line proliferation in the same concentration range. Flow cytometric analysis revealed that this fucan nanogel inhibited 786 cell proliferation through caspase and caspase- independent mechanisms. In addition, SNFuc blocks 786 cell passages in the S and G2-M phases of the cell cycle. Keywords: Sulfated polysaccharides; seagrass; aquatic macrophyta, anticoagulant drugs; fucan nanoparticles.