Langassner, Silvana Maria ZucolottoTavares, Emanuella de Aragão2023-09-252023-07-03TAVARES, Emanuella de Aragão. Effects of Nopalea cochenillifera (L.) Salm-Dick extract on experimental models of intestinal inflammation and metabolic syndrome. Orientador: Silvana Maria Zucolotto Langassner. 2023. 174f. Tese (Doutorado em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2023.https://repositorio.ufrn.br/handle/123456789/54902INTRODUCCIÓN. Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) y el síndrome metabólico son dos trastornos de salud en aumento en todo el mundo, especialmente en los países desarrollados (1–3). Las EII, incluidas la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, son enfermedades crónicas que afectan al tracto gastrointestinal y pueden causar síntomas como rectorragia, diarrea con moco o sangre, dolor abdominal, fatiga y pérdida de peso (4). El síndrome metabólico, por su parte, es un conjunto de afecciones médicas que incluyen obesidad abdominal, hipertensión, aumento de los niveles de azúcar en sangre y dislipidemia (5). Ambas son enfermedades multifactoriales y complejas, en cuya etiopatogenia interviene una combinación de factores genéticos, ambientales y conductuales. En el caso de la EII, se cree que la interacción entre la microbiota intestinal, el sistema inmunitario y los factores ambientales puede desempeñar un papel importante en su desarrollo. Además, factores como el tabaquismo, el estrés y el uso prolongado de antiinflamatorios no esteroideos también pueden contribuir al desarrollo de la EII (6,7). Así como las EII, el síndrome metabólico también está asociado con una inflamación crónica implicada en su patogénesis. El conjunto de factores de riesgo, como la obesidad abdominal, resistencia a la insulina, hipertensión arterial y dislipidemia, aumentan el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, como un ataque cardíaco o un accidente cerebrovascular (8). La inflamación crónica ocurre cuando el sistema inmunológico del cuerpo se activa de forma persistente, lo que lleva a una producción continua de citocinas proinflamatorias y a un estado inflamatorio crónico. El tratamiento del síndrome metabólico a menudo implica la reducción de la inflamación crónica a través de cambios en el estilo de vida, como una dieta saludable, ejercicio regular y control del estrés, además de medicamentos para controlar la presión arterial, reducir los niveles de azúcar en sangre y disminuir los niveles de colesterol y triglicéridos. Aunque las EII y el síndrome metabólico son condiciones diferentes, pueden estar relacionadas en ciertos individuos, y una mejor comprensión de la inflamación crónica puede ayudar en el desarrollo de tratamientos más efectivos para ambas condiciones (9). Las evidencias clínicas han mostrado que el uso de fenoles aislados o de extractos ricos en fenoles administrados en combinación con medicamentos ya utilizados en la terapia de las EII y del síndrome metabólico ha contribuido a mejorar la calidad de vida de los pacientes y para mantener la enfermedad en remisión (10,11). Los polifenoles son metabolitos secundarios producidos por plantas que poseen propiedades antioxidante y antiinflamatoria, lo que los hace efectivos en la prevención y tratamiento de estas enfermedades. Su notable capacidad antiinflamatoria y antioxidante se debe a múltiples mecanismos de acción, como la inhibición de la producción o acción de mediadores proinflamatorios o incluso su fuerte influencia sobre la microbiota intestinal (12–14). En este escenario, la cactácea Nopalea cochenillifera (L.) Salm-Dyck, conocida popularmente como nopal, nopal cactus o “palma forrageira doce ou miúda” en portugués, es una buena fuente de compuestos bioactivos antiinflamatorios. Sus cladodios son ricos en polisacáridos y polifenoles (15), y se han utilizado ampliamente con fines agrícolas, alimentarios y medicinales (16). Tradicionalmente, se ha usado como antiinflamatorio y cicatrizante en el tratamiento de enfermedades como la hipercolesterolemia, la presión arterial, problemas renales y urinarios, y en el tratamiento de la diabetes (17,18). Estudios anteriores han informado sobre el potencial antibiótico y antifúngico del N. cochenillifera en ensayos in vitro (19,20). Además, se ha observado la reducción de los niveles de glucosa en estudios in vivo (21) y en un ensayo clínico piloto (22). En cuanto a su efecto antiinflamatorio, la administración oral del extracto hidroalcohólico de los cladodios de N. cochenillifera ha demostrado una significativa actividad antiinflamatoria en modelos de inducción de granuloma y úlcera gástrica en roedores (23,24). Los polifenoles presentes en el extracto de N. cochenillifera ya se consideran una fuente prometedora de agentes bioactivos. Sin embargo, cuando se trata de enfermedades inflamatorias intestinales, dirigir estos compuestos activos a la región del colon y reducir las concentraciones de extractos vegetales necesarias para lograr actividad farmacológica todavía son desafíos por superar. El desarrollo de sistemas de administración de medicamentos capaces de transportar las sustancias activas del extracto hasta el tejido del colon es una alternativa prometedora para mejorar la biodisponibilidad oral y prolongar su retención en el colon. Los sistemas nanoestructurados han mostrado propiedades interesantes y prometedoras en este sentido, como la mejora de la estabilidad, solubilidad y biodisponibilidad de compuestos naturales, así como la posibilidad de controlar la liberación de los compuestos bioactivos y reducir las dosis y frecuencias de administración (25–27). Estrategias que involucren la encapsulación del extracto de N. cochenillifera y la dirección de su liberación hacia la región del colon pueden potenciar su eficacia y reducir la dosis terapéutica necesaria. Teniendo en cuenta el potencial bioactivo de N. cochenillifera, es relevante destacar que esta especie es una excelente opción para el desarrollo de un insumo nacional, debido a su adaptación a la región nordeste de Brasil y a la presencia de cultivos establecidos. Esto permite el desarrollo de toda la cadena productiva en el país, desde el cultivo hasta el insumo y/o producto terminado, lo que puede tener impactos positivos en la economía local, como la generación de empleos y la promoción del desarrollo sostenible de la región. En este contexto, la presente propuesta tiene como objetivo realizar un estudio fitoquímico del extracto de N. cochenillifera y evaluar el efecto antiinflamatorio en modelos in vivo de inflamación intestinal y síndrome metabólico. OBJETIVO. El presente trabajo tuvo como objetivo realizar un estudio fitoquímico del extracto hidroalcohólico de cladodios de Nopalea cochenillifera, así como evaluar la toxicidad y eficacia en modelos in vivo de inflamación intestinal y síndrome metabólico. Además, este trabajo tuvo como objetivo desarrollar y caracterizar un sistema nanoparticulado cargado con el extracto de N. cochenillifera y evaluar el efecto farmacológico del extracto libre (NCE) y asociado a nanopartículas (NPE). De esta manera, se propusieron cinco objetivos específicos: 1. Caracterizar fisicoquímicamente el extracto hidroalcohólico de N. cochenillifera, determinar el contenido de compuestos fenólicos totales y flavonoides totales y el perfil cromatográfico mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (CLAE-EM). 2. Evaluar la toxicidad oral aguda del extracto hidroalcohólico de N. cochenillifera en ratas. 3. Evaluar el efecto antiinflamatorio intestinal de diferentes dosis del extracto hidroalcohólico de N. cochenillifera en un modelo de inflamación intestinal experimental inducido por ácido 2,4-dinitrobenceno sulfónico (DNBS) en ratas. 4. Desarrollar, caracterizar y evaluar los efectos de un sistema nanoparticulado cargado extracto hidroalcohólico de N. cochenillifera en un modelo de inflamación intestinal experimental inducido por sulfato de sodio de dextrano (DSS) en ratones. 5. Evaluar el efecto del extracto hidroalcohólico de N. cochenillifera en un modelo experimental de síndrome metabólico inducido por una dieta alta en grasas en ratones. METODOLOGÍA. 1. Preparación y caracterización fisicoquímica del extracto hidroalcohólico de N. cochenillifera (NCE) Los cladodios de N. cochenillifera fueron recolectados, luego fragmentados en pedazos más pequeños, secados en estufa de aire circulante, triturados y sometidos a extracción por el método de maceración con solvente hidroalcohólico en la proporción 1:10 (p/v). En el análisis fisicoquímico del NCE, se determinaron el pH, la acidez titulable, los contenidos de humedad, cenizas, extracto etéreo, fibra bruta, proteínas y carbohidratos totales. Estos análisis se realizaron de acuerdo con los métodos recomendados por AOAC (2020). El contenido total de fenoles del extracto de NCE se determinó mediante el método del reactivo Folin-Ciocalteu (28) y el contenido total de flavonoides se determinó mediante el método colorimétrico del cloruro de aluminio (29). El perfil cromatográfico se determinó mediante cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a espectrómetro de masas con fuente de ionización por electrospray (CLAEIES-EM). 2. Evaluación de la toxicidad oral aguda del NCE en ratas La toxicidad aguda por vía oral del extracto de N. cochenillifera se llevó a cabo siguiendo los criterios recomendados por la OECD, 2001 (Guidelines for Testing of Chemicals) (30). Se utilizaron ratas de la cepa Wistar (Rattus norvegicus). El grupo de prueba recibió una dosis única de 2000 mg/kg de NCE. En los días 1, 7 y 14 después de la administración de NCE, se sometió a los animales del grupo de prueba y de control a pruebas de comportamiento y motor (prueba de campo abierto y rota-rod). En el día 15, los animales fueron anestesiados y se realizó una extracción de sangre por punción cardíaca para realizar análisis hematológicos y bioquímicos. Los órganos (hígado, riñón y bazo) de los animales fueron examinados macroscópica y microscópicamente. 3. Estudio de la actividad antiinflamatoria intestinal “in vivo” La inducción de la inflamación intestinal se efectuó mediante el uso de DNBS en ratas (31) y DSS en ratones C57BL/6J (32). En el estudio con DNBS, se administraron 3 diferentes dosis de NCE (100, 200 y 300 mg/kg/día) a los animales. En el estudio con DSS, se investigó el efecto antiinflamatorio del extracto libre (200 mg/kg/día) y del extracto incorporado en nanopartículas poliméricas. En ambos casos, se evaluó el índice de actividad de la enfermedad (IAD) mediante la variación del peso corporal, la presencia de hemorragia rectal y la consistencia de las heces (32). Después de la eutanasia, se evaluó la expresión de marcadores inflamatorios y oxidativos, así como un análisis microscópico en muestras de colon. Además, se realizó una evaluación de la permeabilidad intestinal mediante el método de administración oral de FITC-dextrano en los animales sometidos a la inducción inflamatoria intestinal por DSS (33). 4. Obtención y caracterización de las nanopartículas poliméricas Las nanopartículas cargadas con extracto de N. cochenillifera (NPE) se prepararon mediante el método de nanoprecipitación (34,35). Las nanopartículas se caracterizaron según su tamaño, índice de polidispersión (PdI), potencial zeta, eficiencia de encapsulación (EE) y morfología. La estabilidad física de las nanopartículas se evaluó durante un período de 30 días. 5. Estudio del efecto del extracto de N. cochenillifera en un modelo de síndrome metabólico Se dividieron aleatoriamente ratones machos C57BL/6J en cuatro grupos experimentales: control (dieta estándar); control + NCE (dieta estándar, tratados con NCE (200 mg/kg)), control (dieta rica en grasas) y control + NCE (dieta rica en grasas, tratados con NCE (200 mg)) (36). Durante el período experimental de 10 semanas, se evaluó el peso corporal y la ingesta de agua y comida. Una semana antes de la eutanasia, los ratones fueron privados de alimentos durante 6 horas y se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa. Al final del experimento, los animales fueron anestesiados y se realizó una extracción de sangre por punción cardíaca para medir los niveles plasmáticos de glucosa. Se recolectaron y pesaron el hígado, bazo, riñones, colon, grasa abdominal, epididimal y marrón, y se analizaron macroscópicamente. Se procesaron muestras de hígado, colon y/o tejido adiposo para determinaciones bioquímicas y evaluar la expresión génica de diferentes marcadores mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). RESULTADOS. El contenido de fenoles y flavonoides totales por gramo de extracto seco fue de 67,85 y 46,16 mg/g, respectivamente. A través del análisis por CLAE-IES-EM, se caracterizaron un total de 25 compuestos como sacáridos, ácidos orgánicos, ácidos fenólicos y flavonoides. En el estudio de toxicidad, la dosis de 2000 mg/kg de extracto administrada por vía oral no mostró signos de toxicidad, mortalidad o alteraciones significativas en los parámetros conductuales, bioquímicos y hematológicos. En cuanto a los efectos antiinflamatorios intestinales en la inducción con DNBS, el análisis macroscópico del colon indicó que el NCE disminuyó el índice de actividad de la enfermedad (IAE). La concentración de interleucina (IL) 1 beta y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) disminuyeron, de la IL-10 aumentó y los niveles de malondialdehído (MDA) y mieloperoxidasa (MPO) disminuyeron en comparación con el grupo control. Además, se observó una disminución en la expresión génica de marcadores inflamatorios como proteína quinasa activada por mitógenos 1 (MAPK-1) y factor nuclear kappa B (NF-κB p65) en las muestras de colon. La integridad epitelial mejoró según los análisis histopatológicos e inmunohistoquímicos. Los grupos que recibieron dosis de 200 y 300 mg/kg presentaron mejores resultados. Los análisis fisicoquímicos mostraron que las nanopartículas cargadas con extracto (NPE) son esféricas, con carga superficial positiva, tamaño de 76,45 nm, potencial zeta positivo, alta eficiencia de encapsulación (EE = 100%) y estables por 30 días. En cuanto a los efectos antiinflamatorios intestinales en la inducción con DSS, se observó que el tratamiento con el NCE (200 mg/kg) y con NPE (4 mg/kg) también redujo el índice de actividad de la enfermedad (IAD), previno el acortamiento del colon y promovió la reducción en la expresión de marcadores inflamatorios como IL-1β, TNF-α, IL-6, receptor toll-like tipo 4 (TLR-4), proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1), proteína inflamatoria de macrófagos 2 (MIP-2), molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) y óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Además, se observó una mejora en la integridad de la mucosa intestinal de los animales tratados con NCE y NPE a través de un aumento en la expresión de marcadores de barrera como Zona de oclusión 1 (ZO-1), Ocludina (OCLN) y Mucina 3 (MUC-3), los hallazgos histopatológicos corroboraron estos resultados. Los efectos del NCE también fueron positivos en un modelo de síndrome metabólico inducido en ratones mediante una dieta alta en grasas. La administración de NCE en ratones obesos redujo significativamente el peso corporal en comparación con el grupo no tratado, aunque no se observaron diferencias significativas en el consumo de energía entre estos grupos. La administración de NCE también redujo la glucemia basal y la resistencia a la insulina, mostró una mejora en el perfil lipídico plasmático en comparación con los ratones obesos no tratados y resultó en un aumento significativo en la expresión del transportador de glucosa (GLUT-2) en el hígado, evidenciado por la reducción de los niveles de glucosa en sangre en los ratones obesos tratados. La expresión del receptor de leptina (Leptina-R) en el tejido hepático de los ratones obesos tratados se redujo, pero hubo una recuperación significativa con el tratamiento con NCE. Además, se observó un aumento en la expresión del receptor activado por proliferadores peroxisómicos tipo alfa (PPAR-α) en el grupo tratado. La expresión proteica de la proteína quinasa activada por monofosfato de adenosina (AMPK) y de la fosfatidilinositol 3- quinasa (PI3K) en el hígado de los ratones alimentados con HFD se redujo, pero hubo una recuperación significativa en los animales tratados. Los análisis de la expresión de los marcadores de barrera intestinal (ZO-1 y MUC-3) en muestras de colon de ratones obesos tratados indicaron que el extracto fue capaz de mejorar la integridad de la barrera intestinal, la cual se ve normalmente comprometida en ratones obesos. CONCLUSIÓN. La administración de NCE en el modelo DNBS de inflamación intestinal y de NCE y NPE en el modelo DSS, mostró un efecto preventivo y antiinflamatorio al reducir la puntuación del índice de actividad de la enfermedad y el daño macroscópico y microscópico del colon. A través de los análisis moleculares realizados, se pudo observar que NCE y NPE disminuyeron los niveles de mediadores inflamatorios y oxidativos, y promovieron la regulación negativa de la expresión de genes de importantes vías inflamatorias y oxidativas. Además, NCE y NPE contribuyeron a la mejora de la integridad epitelial según el análisis de marcadores de barrera y mediante técnicas histológicas. El extracto libre y el asociado a nanopartículas mostraron resultados similares, sin embargo, la dosis de NCE incorporada en NPE fue 50 veces inferior a la dosis de extracto libre evaluada en el ensayo de inducción inflamatoria intestinal por DSS. En los ensayos de síndrome metabólico inducido por dieta, el NCE mostró una mejora del perfil metabólico de los ratones obesos, así como una reducción significativa del aumento de peso corporal. Estos efectos se asociaron a una mejora del estado inflamatorio sistémico y parecen estar implicados diferentes mecanismos, destacamos los posibles efectos inmunomoduladores de los compuestos fenólicos, ya que éstos pueden tener efectos beneficiosos sobre la regulación de genes implicados en procesos metabólicos, inflamatorios y de estrés oxidativo. Sin embargo, se necesitan más estudios para comprender plenamente los mecanismos subyacentes. Los resultados preclínicos in vivo indican que el NCE libre o incorporado en nanopartículas es beneficioso para prevenir la colitis inducida y el síndrome metabólico, por lo tanto, los resultados de este estudio apoyan futuras investigaciones sobre el potencial terapéutico del extracto de N. cochenillifera en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias intestinales y del síndrome metabólico e indica su prometedor potencial como un ingrediente bioactivo prometedor para el desarrollo de fitoterapéuticos o suplementos funcionales innovadores en el tratamiento complementario de estas enfermedades.Acesso EmbargadoSuplemento funcional; Fitoterápicos; Cactaceae; Fenólicos; Nanopartículas;Toxicidade aguda; ácido 24-dinitrobenzeno sulfônico; Dextran sulfato de sódio; Doençasinflamatórias intestinais; Colite;doctoralThesisCNPQ::CIENCIAS DA SAUDE