UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA RAYSSA KARLA DE MEDEIROS OLIVEIRA AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INIBIÇÃO DO REPARO DE SÍTIOS ABÁSICOS NA RESPOSTA INFLAMATÓRIA CELULAR Natal 2014 ii RAYSSA KARLA DE MEDEIROS OLIVEIRA AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INIBIÇÃO DO REPARO DE SÍTIOS ABÁSICOS NA RESPOSTA INFLAMATÓRIA CELULAR Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientador Lucymara Fassarella Agnez- Lima NATAL 2014 iii iv Dedico esta obra à Deus, aos meus pais, familiares, noivo e amigos pelo amor, apoio e paciência sem os quais nada seria possível. v AGRADECIMENTOS À professora Lucymara Fassarella pela paciência e conhecimento dispensados durante a elaboração desse trabalho. Aos professores do DBQ por todos os conhecimentos transmitidos durante o curso. Aos amigos do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica pelo apoio. Ao grupo da meningite, formado por Fabrícia Fontes, Daniele Pinheiro, Leonam Coutinho e Ana Helena Sales pelos conhecimentos e auxílio durante o desenvolvimento deste trabalho. Ao Laboratório Nacional de Ciências Computacionais e o Instituto do Cérebro pelo apoio na análise dos dados. À CAPES e ao CNPq pelo suporte financeiro. vi “Crê em ti mesmo, age e verá os resultados. Quando te esforças, a vida também se esforça para te ajudar. Chico Xavier vii RESUMO Proteínas do reparo por excisão de bases (BER) têm sido associadas a funções além do reparo e DNA. A apurínica/apirimidinica endonuclease 1 (APE1) é uma proteína multifuncional envolvida em diversas atividades celulares como ativação redox de fatores de transcrição, processamento de RNA e reparo de DNA. Alguns trabalhos têm descrito a ação da proteína 8-oxoguanina (OGG1) na correção de lesões oxidadas no promotor como passo para a transcrição de citocinas pro-inflamatórias. Apesar de ser notadamente importante na ativação redox de fatores de transcrição, como o fator nuclear κB (NF- κB) e AP-1, a atividade de reparo de APE1 ainda não foi associada à resposta inflamatória. Neste trabalho, foram utilizadas análises bioinformáticas e abordagens experimentais para investigar a relação entre a inibição do reparo de sítios abásicos no DNA pela MX, molécula sintética inibidora indireta da atividade de reparo de APE1, e a modulação de resposta inflamatória. Os resultados demonstraram que o tratamento de monócitos com lipopolissacarídeo (LPS) e MX reduziu a expressão de citocinas, quimiocinas e receptores toll-like, e regulou negativamente processos biológicos da imunidade, como ativação de macrófagos, e as vias ativadas pelo (NF-κB), fator de necrose tumoral (TNF-α) e interferon, sem induzir morte celular. A análise transcriptômica sugere que o tratamento LPS/MX induz disfunções mitocondriais, estresse de retículo endoplasmático e ativação de vias de autofagia, provavelmente ativadas pelo comprometimento da energética celular e/ou pelo acúmulo de danos ao DNA, nuclear e mitocondrial. Adicionalmente, propõe-se que a atividade de reparo de APE1 é requerida para a transcrição de genes inflamatórios pela interação com sítios abásicos no promotores específicos e recrutamento de complexos transcricionais durante a sinalização inflamatória. Este trabalho apresenta uma nova perspectiva acerca das interações entre a atividade do BER e a modulação de resposta inflamatória, e sugere uma nova atividade para a proteína APE1 como modular da resposta imune de maneira redox-independente. PALAVRAS-CHAVE: APE1, transcriptoma, metoxiamina, inflamação. viii ABSTRACT Base excision repair (BER) proteins has been associated with functions beyond DNA repair. Apurynic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) is a multifunctional protein involved in a plethora of cellular activities, such as redox activation of transcription factors, RNA processing and DNA repair. Some studies have described the action of the protein 8-oxoguanine (OGG1) in correcting oxidized lesions in promoters as a step in the transcription of pro-inflammatory cytokines. Despite being especially important in redox activation of transcription factors such as nuclear factor κB (NF-κB) and AP- 1, the repair activity of APE1 has not yet been associated with the inflammatory response. In this study, experimental and bioinformatic analysis approaches have been used to investigate the relationship between inhibition of the repair of abasic sites in DNA by MX, a synthetic molecule designed to inhibt the repair activity of APE1, and the modulation of the inflammatory response. The results showed that treatment of monocytes with lipopolysaccharide (LPS) and MX reduced the expression of cytokines, chemokines and toll-like receptors, and negatively regulated biological immune processes, as macrophages activation, and NF-κB and tumor necrosis factor (TNF-α) and interferon pathways, without inducing cell death. The transcriptomic analysis suggests that LPS/MX treatment induces mitochondrial dysfunction, endoplasmic reticulum stress and activation of autophagy pathways, probably activated by impairment of cellular energy and/or the accumulation of nuclear and mitochondria DNA damage. Additionally, it is proposed that the repair activity of APE1 is required for transcription of inflammatory genes by interaction with abasic sites at specific promoters and recruitment of transcriptional complexes during inflammatory signaling. This work presents a new perspective on the interactions between the BER activity and the modulation of inflammatory response, and suggests a new activity for APE1 protein as modulator of the immune response in a redox-independent manner. Key words: Methoxyamine, transcriptome, cytokines, autophagy. ix LISTA DE FIGURAS Figura 1.Via canônica de ativação de NF-κB. Dímeros de p50/RelA mantem-se no citoplasma pela interação com uma proteína inibitória IκB. A ligação de moléculas específicas a receptores de membrana (como TNFR ou TLR) recruta adaptadores ao domínio citoplasmático do receptor. Por sua vez, esses adaptadores recrutam e ativam o complexo IKK (formado por unidades catalíticas e duas moléculas regulatórias NEMO), que fosforila resíduos da IκB marcando-a para degradação proteassomal. O NF-κB então entra no núcleo e ativa a transcrição de genes contendo sequência concenso específica. Adaptado GILMORE (2006) .................................. 17 Figura 2. Formação de ERO. As ERO podem ser formadas a partir do metabolismo basal da célula pela atividade da fosforilação oxidativa mitocondrial. A redução de um elétron do oxigênio (O2) produz o ânion superóxido (O2•−), altamente reativo. O O2•− pode reagir com o oxido nítrico (NO) e formar o peroxinitrito (ONOO−). A atividade da superóxido dismutase (SOD) converte o O2•− em peróxido de hidrogênio (H2O2), menos reativo, o qual pode ser convertido em hidroxila (•OH) pela reação de fenton ou em água e O2 pela ação da catalase. Adaptado AITKEN e ROMAN, 2008........ 18 Figura 3. Complexos da cadeia transportadora de elétrons (CTE) e fosforilação oxidativa. Localizado na membrana mitocondrial interna, a cadeia transportadora de elétrons é formada por diversas subunidades organizadas em cinco complexos, especializados em converter a energia potencial da transferência de elétrons em bombeamento de prótons da matriz para o espaço intermembranas. O complexo I e II oxidam o NADH e succinato provenientes do ciclo do ácido cítrico e transferem o elétron para os complexos seguintes. Os complexos III e IV, com a passagem dos elétrons, bombeiam prótons para o espaço intermembranas, que voltarão à matriz através do complexo V. A ATP sintase usa o fluxo de prótons como energia para a conversão de ADP e fosfato inorgânico (Pi) em ATP. Adaptado KEGG 2014. ......... 19 Figura 4. Formação do autofagolisossomo durante a autofagia. A indução ocorre em resposta a estímulos como privação de nutrientes, e iniciam a formação do atofagolisossomo. Na elongação, proteínas citoplasmáticas e organelas são sequestradas para uma vesícula formada por bicamada lipídica. Em seguida, o lisossomo se funde ao autofagossomo, formando o autofagolisossomo, onde os corpos vesiculares serão degradados. Adaptado (Cury, 2010) ................................. 23 Figura 5. Reparo de DNA por excisão de bases. O BER pode ocorrer pela via curta ou pela via longa, formadas por proteínas específicas. O reparo ocorre em cinco passos: (1) excisão da base lesada; (2) incisão, (3) processamento de extremidades, e (4) síntese. Na via curta apenas um nucleotídeo é adicionado pela polimerase na fase de síntese. Na via longa, a polimerase adiciona dois ou mais nucleotídeos, enquanto a fita de DNA que é substituída forma uma extensão livre que posteriormente será clivada pela ação da FEN1. Adaptado KROKAN e BJORAS, 2013. ................. 26 Figura 6. Atividades desempenhadas pela APE1. APE1 possui multiplas atividades bioquímicas e desempenha diversas atividades celulares. A atividade de reparo de x DNA é responsável pelo reparo majoritário dos sítios AP gerados no DNA. Além da ativação redox de fatores de transcrição, a APE1 possui atividade sobre o controle de qualidade dos RNA sintetizado. APE1 também desempenha papel importante na mitocôndria onde repara danos oxidados e contribui para a manutenção da organela. Diante da complexidade das funções desempenhada, a atividade da proteína APE1 está envolvida na sobrevivência celular, resposta inflamatória e suscetibilidade a doenças, por afetar vários processos celulares como proliferação e apoptose. Adaptado Luo et al., 2010. ........................................................................................ 29 Figura 7. Representação esquemática da proteína APE1. A porção carboxi-terminal (C-terminal) concentra o domínio responsável pela atividade endonuclease da proteína. Na porção amino-terminal (N-terminal) o domínio responsável pela ativação redox de fatores de transcrição, em especial a cisteína 65. Os domínios opostos da proteína são funcionalmente independentes. SLN= Sinal de localização nuclear. Adaptado EVANS, LIMP-FOSTER e KELLEY, 2000. ............................................... 30 Figura 8 Modelo esquemático das atividades de regulação da transcrição mediadas pela APE1. APE1 interage com diferentes proteínas na formação de complexos de trans-ativação. APE1 interage com hnRNP-I e HDAC1 para ligação à região nCARE- B (elemento B de resposta negativa ao cálcio), agindo como repressor da expressão do PTH. No complexo de ligação a HRE (elementos de resposta a hipóxia), APE1 interage com HIF-1α, STAT3, e p300 e ativa a expressão de VEGF induzido por hipóxia. APE1 interage com Erg-1 para ativação da expressão de PTEN, e com o complexo YB-1 e p300 para a transcrição de MDR-1. Adaptado BHAKAT, MANTHA e MITRA (2009). ........................................................................................................... 32 Figura 9. Esquema representativo da reação de formação de adutos no DNA pela MX. A MX reage com a forma tautomerica de anel aberto da desoxiribose, gerado quando uma base alterada é removida. A estrutura química do aduto sítio AP-MX pode bloquear o reparo pela alteração química do sítio ou tornando refratária a ligação fosfodiester à ação catalítica da APE1. (Adaptado ZHU et al., 2012). ...................... 33 Figura 10. Representação dos componentes de um grafo. Nó (esquerda) pode ser a representação de proteínas, DNA, RNA e através de um conector (centro) pode formar interação (direita) com outro nó. Uma rede de interação pode possuir centenas de nós e ser organizada de analisada por cálculos matemáticos. ........................................ 36 Figura 11.Ensaio de viabilidade celular por exclusão de azul de tripano. As diferenças na viabilidade celular entre os tratamentos não foram consideradas significativas pelo teste estatístico one-way-ANOVA, *p<0,05. .............................................................. 47 Figura 12. Cinética da produção de TNF-α e IL-6 em resposta ao tratamento com LPS. Os resultados foram analisados pelo teste estatístico t-student (Two-tailed) e valores de p<0.05 foram considerados estatísticos. *p<0,05. ................................................ 48 Figura 13.Redução da expressão de citocinas e quimiocinas pelo tratamento LPS/MX. (A) Os níveis proteicos de citocinas e quimiocinas; (B) Níveis transcricionais foram medidos por PCR em tempo real. Teste estatístico t-student (Two-tailed); *p<0,05 . 50 xi Figura 14. Genes up-regulados mais diferencialmente expressos. Os cinquenta genes com maiores valores de fold change são listados. .................................................... 51 Figura 15. Genes down-regulados mais diferencialmente expressos. Os cinquenta genes com maiores valores de fold change são listados. ......................................... 53 Figura 16.Processos biológicos enriquecidos com os genes up-regulados. Os processos apresentados foram selecionados de acordo com sua relevância e critérios de amenização de redundâncias dentre todos os listados na tabela Sx. .................. 56 Figura 17. Processos biológicos enriquecidos com os genes down-regulados. Os processos apresentados foram selecionados de acordo com sua relevância e critérios de amenização de redundâncias dentre todos os listados na tabela Sx.. ................. 58 Figura 18. Vias celulares canônicas significativas anotadas pelo KEGG. (A) via do metabolismo de propanoato; (B) via da leucemia mielóide aguda e (C) via do metabolismo de valina, leucina e isoleucina. Quadros vermelhos genes down- regulados; azul, up-regulados. .................................................................................. 62 Figura 19.Rede base de interação biológica formada com transcritos up-regulados. Nós ressaltados em amarelo representam as proteínas-hubs da rede calculadas pela ferramenta de centralidades CentiScaPe (PLCG2, DNMT3B, TBP, AIMP3 e ECT2). .................................................................................................................................. 63 Figura 20. Rede expandida de interação biológica formada com transcritos up- regulados. Nós destacados representam as proteínas-hub da rede calculadas pelo CentiScaPe e descritas na tabela A4 (Apêndice). ..................................................... 65 Figura 21. Delimitação das sub-redes contidas na rede expandida up-regulada. (A) delimitação de todas as sub-redes contidas na rede expandida; (B) Em destaque a sub-rede “i” com maior valor de score (11,34) obtido pela análise de clusterização da rede up-regulada. A descrição dos processos biológicos de cada sub-rede está listada na tabela 7. Quadros i-vi representam as sub-redes 1-6 respectivamente. .............. 66 Figura 22.Rede base de interação biológica formada com transcritos down-regulados. Nós apresentados em amarelo representam as proteínas-hubs da rede calculadas pela ferramenta de centralidades CentiScaPe (HSPA8, YES1, KRR1, MYC, SKP1). .................................................................................................................................. 70 Figura 23. Rede de interação PPI expandida down-regulada. Nós destacados em amarelo representam as proteínas-hub da rede, calculadas pela ferramenta CentiScaP. A descrição detalhada das proteínas-hubs são descritas na tabela A4 (Apêndice). ................................................................................................................ 72 Figura 24. Delimitação das sub-redes contidas na rede expandida down-regulada. (A) delimitação de todas as sub-redes contidas na rede expandida; (B) Em destaque a sub-rede “I” com maior valor de score (11,74) obtido pela análise de clusterização da rede down-regulada. A descrição dos processos biológicos de cada sub-rede está listada na tabela 8. Nós em amarelo representam as proteínas-hub da rede. .......... 73 xii Figura 25.validação de resultados por PCR em tempo real. Os genes selecionados foram quantificados por PCR em tempo real e apresentaram aumento ou diminuição de expressão semelhante ao padrão observados com o sequenciamento. .............. 76 Figura 26. Ensaio de mensuração de ciclo celular por citometria de fluxo. Os valores foram analisados pelo teste t estatístico, *p<0,05. .................................................... 77 Figura 27.Detecção da localização celular de p65 e APE1 por imunofluorescência. (A) marcação da subunidade p65 de NF-κB; (B) marcação da proteína APE1. A fluorescência verde representa a proteína analisada; em azul a marcação do compartimento nuclear pelo DAPI. ............................................................................ 81 Figura 28. Cinética de produção de citocinas. Os níveis proteicos de citocinas e quimiocinas foram mensurados após 2 h, 4 h e 6 h de tratamento pela plataforma BioPlex. O teste estatístico t-student pareado two-tailed foi utilizado. *p<0,05. ........ 83 Figura 29. Medição de ERO por DCFH-DA.. Os resultados foram analisados pelo teste estatístico t-student (Two-tailed) e valores de p<0.05 foram considerados estatísticos. *p<0,05. ..................................................................................................................... 84 Figura 30. Quantificação de APE1. Após tratamento, as proteínas totais e o mRNA foram extraídos e os níveis de APE1 foram medidos. Em (A) western BLOT; (B) representação gráfica da densitometria das bandas e (C) quantificação de mRNA de APE1. *p<0,05 t-student ............................................................................................ 85 xiii LISTA DE TABELAS Tabela 1 Descrição dos primer selecionados para validação por PCR em tempo real .................................................................................................................................. 46 Tabela 2 Descrição dos dez genes up-regulados com maiores valores de fold change. ..................................................................................................................... 51 Tabela 3 Descrição dos dez genes down-regulados com maiores valores de fold change. ..................................................................................................................... 53 Tabela 4 Descrição dos genes up- e down-regulados relacionados ao reparo de DNA. .......................................................................................................................... 55 Tabela 5 Vias canônicas anotadas através da análise do KEGG. ............................ 59 Tabela 6 Descrição das proteínas-hub da rede base up-regulada. .......................... 64 Tabela 7 Processos biológicos significativos listados para cada sub-rede da rede expandida up-regulada anotadas pelo BiNGO. ......................................................... 67 Tabela 8 Descrição das proteínas-hubs da rede base down-regulada ..................... 71 Tabela 9 Processos biológicos significativos anotados pela análise da rede down- regulada atrevés da ferramenta BiNGO. ................................................................... 74 Tabela 10 Descrição dos genes relacionados a vias autofágicas e de estresse de retículo. ..................................................................................................................... 79 xiv LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS .OH Radical hidroxila 1O2 Oxigênio singlete 5’dRP 5’ desoxiribose fosfato acetil-CoA Acetil- coenzima A ADP Difosfato de adenosina AP Apurínico/apirimidínico AP-1 Proteína ativadora 1 APE1 Endonuclease apurínica/apirimidínica/fator efetor redox- 1 ATP Trifosfato de adenosina BER Reparo por excisão de bases cDNA DNA complementar CTE Cadeia transportadora de elétrons dRP Desoxiribose-fosfato Egr-1 Proteína da resposta ao crescimento inicial 1 ERN Espécies reativas de nitrogênio ERO Espécies reativas de oxigênio FADH2 Dinucleotídeo de flavina e adenina GO Ontologia gênica H2O2 Peróxido de hidrogênio HIF1-a Fator indusível por hipóxia 1 IL-12 Interleucina 12 IL-1β Interleucina 1 beta IL-6 Interleucina 6 KO Knockout LPS Lipopolissacarídeo LSD1 desmetilase lisina específica 1 MIP1-b Proteína inflamatória de macrófagos b mRNA RNA mensageiro mtDNA DNA mitocondrial MX Metoxiamina NAD* Dinucleotideo de nicotinamida e adenina NF-kB Fator nuclear κB O2.- Radical ânion superóxido OGG1 8-oxoguanina 1 PBS Tampão salino PBST Tampão salino com tween-20 0,01% PCNA Antígeno nuclear de proliferação celular PCR Reação de polimerase em cadeia PVDF Fluoreto de polivilideno RE Retículo endoplasmático RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute; rRNAs RNA ribossomal xv SOD Superóxido dismutase TLRs Receptores toll-like TMZ Temolozomida TNF-α Fator de necrose tumoral α tRNAS RNA transportador UPR Unfolded protein response XRCC1 Proteína do grupo de complementação de reparo de raio X xvi SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 18 1.1. Resposta inflamatória à infecção .......................................................................... 18 1.2. A Mitocôndria e o estresse oxidativo .................................................................... 17 1.3. Danos celulares: Sobrevivência ou morte............................................................ 22 1.4. Reparo de lesões oxidadas no DNA ...................................................................... 24 1.5. APE1: um link entre reparo de DNA e reposta inflamatória ............................... 27 1.6. Metoxiamina ............................................................................................................. 32 1.7. Análises bioinformáticas e biologia de sistemas ................................................ 34 2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 38 2.1. Objetivo Geral .......................................................................................................... 38 3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 39 3.1. Linhagem e cultivo celular ..................................................................................... 39 3.2. Indução de resposta imune em modelo celular ................................................... 39 3.3. Viabilidade celular ................................................................................................... 40 3.4. Ciclo celular .............................................................................................................. 40 3.5. Quantificação de Citocinas e quimiocinas por Luminex ................................... 40 3.6. Análise da expressão proteica por Western-Blot ................................................ 41 3.6.1. Extração de proteínas totais ................................................................................ 41 3.6.2. Western Blot..................................................................................................... 41 3.7. Ensaio para quantificação de ERO ....................................................................... 42 3.8. Imunofluorecência .................................................................................................. 42 3.9. Sequenciamento e análise transcriptômica ......................................................... 43 3.9.1. Extração de RNA .............................................................................................. 43 3.9.2. Pirosequenciamento pela plataforma 454 Roche ......................................... 43 3.9.3. Redes de interações proteína-proteína ......................................................... 44 3.9.4. Ontologia Gênica .............................................................................................. 45 3.10. Validação de transcriptôma por PCR em tempo real ...................................... 45 4. RESULTADOS .................................................................................................... 47 4.1. MX não induz alterações na viabilidade de células U937 ................................... 47 4.2. Estabelecimento de modelo inflamatório celular ................................................ 47 xvii 4.3. O tratamento com MX e a resposta inflamatória ................................................. 49 4.4. Análises Bioinformáticas ........................................................................................ 50 4.4.1 Visão global dos genes diferencialmente expressos. ................................. 50 4.4.2 Análise ontológica ............................................................................................ 56 4.4.3 Interações proteína-proteína (PPI) e análise de redes. ............................... 62 4.4.4- Perfil trancriptômico de genes DOWN regulados ........................................ 70 4.4.5 Validação por PCR em tempo real ................................................................. 76 4.4.6 MX induz parada de ciclo celular em G1. ...................................................... 77 4.4.7 MX pode induzir disfunção mitocondrial, estresse de retículo e autofagia 77 4.4.8 Modulação da resposta inflamatória .............................................................. 80 4.4.9 A inibição do reparo pela MX reduz a produção cinética de citocinas e quimiocinas. .................................................................................................................... 82 4.4.10 Espécies reativas de oxigênio ........................................................................ 83 4.4.11 Expressão de APE1 .......................................................................................... 84 5. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 86 6. CONCLUSÕES ................................................................................................... 97 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 98 18 1. INTRODUÇÃO 1.1. Resposta inflamatória à infecção Os organismos vivos são suscetíveis a infecção por microrganismos do ambiente. A infecção por bactérias, por exemplo, pode desencadear a ativação da resposta inflamatória a partir do reconhecimento de moléculas específicas da superfície bacteriana, como o lipopolisacarídeo (LPS) das bactérias Gram-negativas. Diversas bactérias ativam a resposta inflamatória do hospedeiro através da ruptura da barreira epitelial e invasão de tecidos, e são responsáveis por doenças graves, como a meningite bacteriana (MB) (HORNEF et al., 2002; KIM, 2010; KOEDEL et al., 2002; KIM, 2003; BROUWER e VAN DE BEEK, 2012). Uma série complexa e intricada de eventos envolvendo citocinas, quimiocinas, enzimas proteolíticas e oxidantes podem ser relacionados ao quadro inflamatório da MB. Inicialmente, o LPS é reconhecido pelo receptor Toll-like 4 (TLR4) de células de defesa, desencadeando a ativação de fatores de transcrição e expressão de citocinas de resposta rápida, como o fator de necrose tumoral –α (TNF-α), interleucina-1β (IL- 1β), e IL-6 (Yang et al., 1998). As citocinas iniciam, sinergicamente, a cascata de mediadores inflamatórios, dentre eles outras citocinas, metabólitos de ácido aracdônico, quimiocinas e intermediários reativos de nitrogênio e oxigênio, cuja função é combater localmente o patógeno e recrutar outras células ao sítio da infecção (DINARELLO, 1996). TNF-α é uma citocina encontrada em elevadas concentrações em pacientes acometidos com MB e é responsável por mediar diversas funções durante a resposta ao patógeno, incluindo a geração de inflamação neutrofílica, aumento do metabolismo cerebral, consumo de oxigênio e aumento do fluxo sanguíneo (LEIB et al., 2001). Quando liberado no meio extracelular, o TNF-α é reconhecido por receptores específicos de membrana (TNFR) e estimula a cascata inflamatória pela ativação do fator de transcrição fator nuclear κB (NF-κB) que, por sua vez, transloca-se para o núcleo e promove a transcrição de diversos outros moduladores inflamatórios, entre eles IL-8, proteína inflamatória de macrófago 1 alpha (MIP-1a) e beta (MIP-1b), e o próprio TNF-α (SPANAUS et al., 1997). 16 NF-κB é uma família de fatores de transcrição diméricos indutíveis, formada por cinco principais membros Rel (c-Rel), RelA (p65), RelB, NF-κB1 (p50/p105) e NF-κB2 (p52/p100). É responsável pelo reconhecimento de regiões consenso no DNA e regula grande número de genes alvo, principalmente aqueles envolvidos no sistema imune e defesa contra patógenos, além de genes envolvidos na inflamação, injúria, estresse e respostas de fase aguda (CARBONE e MELICI 2012). Em células não estimuladas, homodímeros ou heterodímeros de membros da família NF-κB encontram-se no citoplasma associados a proteínas inibitórias, como IκBα, IκBβ e IκBε, pela ligação a regiões ricas em anquirina. A ligação retém os dímeros no citoplasma, e impede o inicío da transcrição gênica associada ao fator (ZANDI et al., 1997). Na via clássica de ativação de NF-κB, a estimulação de diversos receptores celulares de membrana, como os TNFRs, o receptor de células B (BCR) e TLRs induzem a fosforilação, ubiquitinação e degradação proteassomal das IκBs, levando a desestabilização dos complexos inibitórios e consequente ativação de NF-κB (KARIN e HUNTER, 1995; WATERFIELD et al., 2004). A fosforilação das IκBs ocorre em serinas da região aminoterminal das proteínas e é catalizada por proteínas IκB quinases (IKKs) α e β, organizadas em complexo com a subunidade regulatória NEMO (modulador essencial de NF-κB, IKKy) (MAY et al., 2000) (Figura 1). Com a fosforilação, ocorre a reorganização espacial da proteína e são expostos sítios proteicos que direcionam o complexo NF-κB ligado ao IκB à degradação proteolítica pelo proteassoma 26S. Dímeros de NF-κB, comumente heterodímeros de p50/p65, translocam-se para o núcleo onde se associam a co-ativadores e a sítios específicos no DNA, e ativam a transcrição gênica (GILMORE, 2006; MILLS et al., 2007). Frente a isso, moléculas capazes de ativar ou inibir a atividade de fatores de transcrição são alvos de interesse para o desenvolvimento de tratamentos anti-inflamatórios. 17 Figura 1.Via canônica de ativação de NF-κB. Dímeros de p50/RelA mantem-se no citoplasma pela interação com uma proteína inibitória IκB. A ligação de moléculas específicas a receptores de membrana (como TNFR ou TLR) recruta adaptadores ao domínio citoplasmático do receptor. Por sua vez, esses adaptadores recrutam e ativam o complexo IKK (formado por unidades catalíticas e duas moléculas regulatórias NEMO), que fosforila resíduos da IκB marcando-a para degradação proteassomal. O NF-κB então entra no núcleo e ativa a transcrição de genes contendo sequência concenso específica. Adaptado GILMORE (2006) 1.2. A Mitocôndria e o estresse oxidativo Além das citocinas e quimiocinas, a resposta inflamatória induz a geração de de espécies reativas de nitrogênio (ERN) e oxigênio (ERO), as quais desempenham papel importante na patofisiologia de diversas doenças (LEIB et al., 1999, GUZIK et al., 2003). O termo ERO inclui todas as moléculas quimicamente reativas derivadas de oxigênio, abrangendo radicais livres como radicais hidroxila (HO•) e o ânion superóxido (O2•−), assim como não radicais, como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o oxigênio singlet (1O2). (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1996). Nos organismos, as ERO podem ser produzidas como subprodutos normais do metabolismo, como consequência de diversas reações de transferências de elétrons, ou em resposta a 18 agentes exógenos (Figura 2) (VALKO et al., 2005; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1986; FREINBICHLER et al., 2011). Apesar de as ERO serem tradicionalmente associadas a situações patológicas, são extremamente importantes nos processos fisiológicos, como manutenção do tônus vascular, sensores de oxigênio e fisiologia da musculatura esquelética, além dos mecanismos de proteção já mencionados. O balanço entre a produção de espécies reativas e a atividade de enzimas anti-oxidantes, como superóxido dismutase (SOD) e catalase, é indispensável para manutenção do estado redox da célula (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007). Figura 2. Formação de ERO. As ERO podem ser formadas a partir do metabolismo basal da célula pela atividade da fosforilação oxidativa mitocondrial. A redução de um elétron do oxigênio (O2) produz o ânion superóxido (O2•−), altamente reativo. O O2•− pode reagir com o oxido nítrico (NO) e formar o peroxinitrito (ONOO−). A atividade da superóxido dismutase (SOD) converte o O2•− em peróxido de hidrogênio (H2O2), menos reativo, o qual pode ser convertido em hidroxila (•OH) pela reação de fenton ou em água e O2 pela ação da catalase. Adaptado AITKEN e ROMAN, 2008. A principal fonte de espécies reativas na célula é a mitocôndria, organela essencial que, além de outras funções, codifica proteínas específicas, tampona os gradientes de cálcio intracelular e supre a célula com ATP, proveniente da degradação de metabólitos energéticos e da fosforilação oxidativa. Apesar dos passos iniciais do metabolismo da glicose ocorrerem no citoplasma, com a formação do piruvato, é na 19 mitocôndria onde ocorre a sua oxidação completa até CO2, no processo chamado ciclo do ácido cítrico. Além disso, o acetil-CoA gerado no metabolismo de ácidos graxos também é consumido no ciclo do ácido cítrico mitocondrial. As enzimas do ciclo, localizadas na matriz mitocondrial desempenham papel essencial na degradação de metabólitos energéticos e, consequentemente na bioenergética celular. O processo de degradação de acetil-CoA a CO2 é associado à redução de moléculas transportadoras de energia NAD+ e FAD a NADH e FADH, cujos elétrons de alta energia serão transportados através de complexos na membrana mitocondrial interna até uma molécula do oxigênio molecular, seu aceptor final. Esse processo de carreamento de elétrons é realizado por séries de complexos proteicos que em conjunto formam a Cadeia Transportadora de Elétrons (CTE) (COOPER, 2000). A CTE é um sistema composto por cinco complexos proteicos formados por subunidades estruturais e catalíticas localizadas na membrana mitocondrial interna. Resumidamente, os complexos recebem os elétrons das moléculas de NADH e FADH2 e os transferem para o próximo complexo, convertendo a energia potencial da reação de transferência em um gradiente de prótons através da membrana. Os prótons bombeados da matriz para o espaço intermembranas retornam à matriz, gerando energia para a conversão de ADP e fosfato inorgânico (Pi) em ATP, através do complexo V, chamado ATP sintase. O processo de geração de ATP pela fosforilação oxidativa supre a demanda celular energética e gera radicais livres durante seu funcionamento (COOPER, 2000). Figura 3. Complexos da cadeia transportadora de elétrons (CTE) e fosforilação oxidativa. Localizado na membrana mitocondrial interna, a cadeia transportadora de elétrons é formada por diversas subunidades organizadas em cinco complexos, especializados em converter a energia potencial da transferência de elétrons em bombeamento de prótons da matriz para o espaço intermembranas. O 20 complexo I e II oxidam o NADH e succinato provenientes do ciclo do ácido cítrico e transferem o elétron para os complexos seguintes. Os complexos III e IV, com a passagem dos elétrons, bombeiam prótons para o espaço intermembranas, que voltarão à matriz através do complexo V. A ATP sintase usa o fluxo de prótons como energia para a conversão de ADP e fosfato inorgânico (Pi) em ATP. Adaptado KEGG 2014. Alterações na estrutura, localização e formação dos complexos da CTE estão relacionadas com alterações no potencial de membrana mitocondrial, comprometimento da atividade da cadeia, déficit energético e distúrbios na produção de espécies reativas. Neste sentido, sendo as ERO o principal mecanismo contra infecções e agentes danosos (CHEN et al., 2010), as mitocôndrias tornam-se essenciais durante o processo inflamatório (TSCHOPP, 2011; LOPEZ-ARMADA et al., 2013). Entre processos de fusão e fissão, as mitocôndrias controlam suas atividades em resposta aos estímulos gerados pela inflamação. A fusão de mitocôndrias em situação de estresse permite o aumento da capacidade bioenergética da célula a longo prazo, ao passo que a fissão, em mesma situação, sinaliza danos irreversíveis e a marca para degradação por autofagia (CHAN, 2006; WESTERMANN, 2010). A mitocôndria contém seu próprio sistema genético, separado e distinto do genoma nuclear, formado por DNA circular de aproximadamente 16 kb, composto por genes codificadores de proteínas do sistema de fosforilação oxidativa e RNAs não- codantes (rRNAs e tRNAs). Como o DNA nuclear, o DNA mitocondrial (mtDNA) também pode ser alterado por danos oxidados. O mtDNA parece ser mais suscetível a mutações devido a sua proximidade do sítio de produção das ERO e por não ser protegido por histonas. Disfunções mitocondriais podem induzir mutagênese no mtDNA, afetar a codificação de genes dos complexos da CTE e comprometer a eficiência da fosforilação oxidativa (KUJOTH et al., 2005; ESCAMES et al., 2011). Alterações da função mitocondrial são também associadas a doenças inflamatórias (NAIK e DIXIT, 2011). Um grande número de mediadores inflamatórios, incluindo as citocinas TNF-α e IL-1β, e os intermediários reativos de nitrogênio, podem induzir danos mitocondriais. Alterações na atividade dos complexos da CTE, o aumento excessivo de ERO e o comprometimento do DNA mitocondrial (mtDNA) podem induzir alterações no transporte de elétrons e culminar na exacerbação do estresse oxidativo (GUIDARELLI et al., 2007; GUZY et al., 2005). O Ca+ mitocondrial, as espécies reativas e as citocinas são os mediadores iniciais da resposta inflamatória e induzem modificações funcionais e reversíveis nas mitocôndrias em situações 21 fisiológicas. Contudo, a combinação de ambos os efeitos (alterações funcionais e permanentes dos complexos mitocondriais) pode causar modificações mais substanciais na organela, estabelecendo danos contínuos e sub-letais à mitocôndria, criando um ciclo vicioso de aumento da inflamação-estresse oxidativo (DADA e SZNADER, 2011). Na resposta inflamatória, ERO são importantes na sinalização e comunicação celular. No entanto, quando seus níveis superam a disponibilidade de agentes antioxidantes celulares, o balanço redox da célula fica comprometido, gerando o quadro conhecido como estresse oxidativo (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007). O excesso de ERO pode culminar em reações químicas e sequestro de elétrons de biomoléculas importantes como proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA (FRIDOVICH, 1998; VALKO et al., 2006; CADET et al., 2010). Os danos a biomoléculas e organelas podem ser irreversíveis e culminar na perda de função e direcionamento para degradação. Uma situação comum em processos inflamatórios é a resposta de proteínas não-dobradas (UPR – do inglês unfolded protein response), desencadeada pelo retículo endoplasmático (RE) sob situações de estresse oxidativo. A UPR é ativada quando o excesso de espécies reativas compromete a montagem correta das proteínas recém-sintetizadas no RE. Quando as proteínas mal-formadas se acumulam, ocorre uma cascata de reações que sinalizam para a célula o comprometimento do RE e induzem alterações como ativação da transcrição de genes relacionados ao RE e a repressão da transcrição geral da célula, situação denominada de estresse do RE (SCHRODER e KAUFMAN, 2005; SHEN, ZHANG e KAUFMAN, 2004). O estresse do RE está relacionado com o mau funcionamento das mitocôndrias. Quando ocorre o aumento da produção de espécies reativas pela mitocôndria, e estabelece-se o ciclo inflamação-estresse oxidativo, os danos acumulados ao retículo não só comprometem a atividade de dobramento de proteínas, mas também a sua capacidade de estocagem de Ca+, ocorrendo um desbalanço no fluxo de cálcio no interior da célula. Sendo o Ca+ outro ativador da atividade mitocondrial, as respostas mitocondriais, estresse de retículo e UPR acabam sendo retroalimentadas, até que os sinalizadores sejam neutralizados (revisado em XU, BAILLY-MAITRE e REED, 2014). 22 1.3. Danos celulares: Sobrevivência ou morte. Em situações de estresse, o acúmulo de danos às organelas e biomoléculas pode sinalizar para a degradação ou, dependendo do grau de comprometimento, para a morte celular. Inicialmente, a célula dispõe de dois principais mecanismos de reciclagem citoprotetiva, o sistema de degradação proteassomal ou o lisossomal, ambas unidades de degradação intracelular de eucariotos. A macroautofagia, ou autofagia, é definida como um processo catabólico de manutenção da homeostase celular dependente de lisossomos (YANG e KLIONSKY, 2010). O processo de autofagia inclui o sequestro de proteínas não-funcionais e componentes celulares danificados em compartimentos vesiculares de bicamada lipídica, seguido da fusão com lisossomos para degradação (Figura 4) (MIZUSHIMA et al., 2008). Sob situações normais, a autofagia basal trabalha na ciclagem de biomoléculas com meia-vida avançada. Além de moléculas, os processos autofágicos também degradam organelas defeituosas, reduzindo-as a metabólitos reutilizáveis para suprir a energia, e monômeros para a síntese de novas moléculas. A autofagia é ativada em resposta a vários estressores celulares como privação de nutrientes, excesso ou danos à organelas, acumulo de proteínas mal-dobradas, estresse de retículo, estresse oxidativo, toxinas, radiação e hipóxia (BOYA, REGGIORI e CODOGNO, 2013). Recentemente foi relatado o envolvimento da autofagia na imunidade inata e adaptativa, contra protozoários, bactérias e vírus (DERETIC, 2012; DERETIC, SAITO e AKIRA, 2013). Basicamente, o processo da autofagia envolve a indução de sinal, reconhecimento e seleção da carga, formação da vesícula, fusão do autofagossomo- lisossomo, digestão da carga e finalmente liberação dos produtos da digestão no citosol (LAMB, YOSHIMORI e TOOZE, 2013) 23 Figura 4. Formação do autofagolisossomo durante a autofagia. A indução ocorre em resposta a estímulos como privação de nutrientes, e iniciam a formação do atofagolisossomo. Na elongação, proteínas citoplasmáticas e organelas são sequestradas para uma vesícula formada por bicamada lipídica. Em seguida, o lisossomo se funde ao autofagossomo, formando o autofagolisossomo, onde os corpos vesiculares serão degradados. Adaptado (Cury, 2010) Caso falhem todas as tentativas de reestabelecimento da homeostase, a célula via de regra, programa-se para a morte. Existe uma extensa comunicação entre autofagia e formas de morte celular, como apoptose e necrose. A autofagia pode preceder, inibir ou aumentar a morte celular programada no mesmo tipo celular, sob diferentes contextos (LEVINE e YUAN, 2005). Conhecida como morte celular programada, a apoptose é um mecanismo complexo formado por séries de eventos finamente orquestrados que resultam no controle da sobrevivência celular. É caracterizada pela ativação de proteases que resultam na destruição de componentes celulares e na redução do corpo celular, facilitando a fagocitose (ELMORE, 2007). Uma extensa variedade de sinais podem induzir a apoptose, inclusive a sinalização pela mitocôndria (XIONG et al., 2014) A apoptose pode envolver a ativação de uma cascata distinta de proteases ácido aspartico-cisteínas, chamadas de caspases, presentes em forma de zimogênios inativos, causando a degradação seletiva de componentes celulares e a ativação de outras caspases, como a caspase 3 (CREAGH e MARTIN, 2001). A mitocôndria tem papel importante, talvez central, no processo apoptótico (DESAGHER e MARTINOU, 1997; GREEN e REED, 1998). A organela controla a apoptose por dois meios principais: manutenção (1) da produção de ATP; e (2) do potencial de membrana e permeabilidade da membrana mitocondrial para liberação de fatores apoptogênicos, como citocromo c (VAYSSIÈRE et al., 1994; ZORATTI e SZABÓ, 1995; KROEMER e REED, 2000; XIONG et al., 2014). 24 1.4. Reparo de lesões oxidadas no DNA O estresse oxidativo pode gerar também diferentes lesões no DNA, como danos às bases nitrogenadas, criação de sítios apurínicos/apirimidínicos (sítios AP), ou induzir quebras simples e duplas na cadeia (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007; CADET, DOUKI e RAVANAT, 2010). Tais danos oxidados no DNA podem provocar bloqueio na replicação, mutações, anormalidades cromossômicas e consequentemente citotoxicidade (BOITEUX et al., 2002; ENSMINGER et al., 2014; WEEKS et al., 2014; CADET et al., 2010). Sítios abásicos ou apurínicos/apirimidínicos (sítios AP) são um tipo comum de lesão no DNA, com estimativa de 10.000 bases depurinadas por célula a cada dia (LINDAHL e LJUNGQUIST, 1975). Essas lesões podem decorrer de hidrólises espontâneas da ligação N-glicosídica entre a desoxiribose e a base nitrogenada, da ação de agentes exógenos, de danos oxidados, ou serem geradas enzimaticamente pela remoção de bases por DNA glicosilases. O acúmulo de sítios AP não reparados está relacionado com redução da viabilidade celular e instabilidade genômica, uma vez que a lesão bloqueia a replicação do DNA, além de ser citotóxica e mutagênica (KROKAN et al., 1997; CADET et al., 2010; BROXSON et al., 2014). Frente a isso, as células desenvolveram mecanismos elaborados para preservar a fidelidade do material genético e remover as lesões oxidadas. As vias de reparo de DNA são indispensáveis para a manutenção da estabilidade genômica e sobrevivência celular (MCKINNON, 2013; SHILOH e LEHMANN, 2004; LUKAS et al., 2011; LOMBARD et al., 2005; CICCIA e ELLEDGE, 2010). A via de reparo de DNA por excisão de bases (BER do inglês base excision repair) é a principal via de reparo acionada para restauração da integridade química do DNA após lesões não-volumosas, sítios abásicos e quebras de fita simples tipicamente geradas pela desaminação, oxidação ou metilação de bases (MITRA et al., 2002; MITRA et al., 1997; KROKAN et al., 2000; BREEN et al., 2004; TAPAS et al., 2007). O início da via BER ocorre com o reconhecimento da lesão por enzimas DNA glicosilases, as quais iniciam o reparo pela hidrolise da ligação N-glicosídica entre o açúcar e a base danificada, gerando um sítio AP. Importante ressaltar que algumas glicosilases além de removerem a base danificada, também apresentam atividade AP liase (ou β liase) e clivam os sítios AP. Quando possuem capacidade de clivar sítios AP, a glicosilase é denominada bifuncional, quando apenas cliva a base 25 danificada, a enzima é dita monofuncional e requer a participação de uma proteína AP endonuclease para hidrolisar a ligação fosfodiéster na porção 5’ ao sítio AP. A enzima 8-Oxoguanina glicosilase 1 (OGG1) é um exemplo de glicosilase bifuncional, responsável por identificar e clivar as guaninas oxidadas no DNA, em especial a 8- hidroxiguanina (8-oxo-G) (KROKAN e BJORAS, 2013) Se o reparo for iniciado por uma glicosilase monofuncional, o sítio AP gerado é reconhecido pela proteína Apurinica/apirimidinica endonuclease 1/fator efetor redox - 1 (APE1), uma endonuclease que catalisa a clivagem da ligação fosfodiéster, expondo um grupo hidroxil 3’ e o fosfato da desoxiribose (dRP) em 5’ via mecanismos estimulados pelo magnésio (DOETSH e CUNNINGHAN, 1990). Se o dano for removido por uma glicosilase bifuncional, a β-eliminação pela atividade de β-liase da proteína gera um hidroxialdeído insaturado ligado à extremidade 3’ terminal (3’dRP) e um fosfato na porção 5’. A 3’ dRP é eficientemente removida pela APE1 que gera uma extremidade 3’OH reconhecida pela polimerase. Após a ação da APE1, a via BER pode seguir por duas sub-vias, a via curta ou a via longa, dependendo da natureza da lesão, do tipo da DNA glicosilase que remova a base danificada, da cinética de competição entre as enzimas, bem como do nível de expressão das diferentes proteínas do BER (Figura 5). Na via curta do BER, o sítio gerado após a excisão da base é processado pela DNA polimerase β, que insere um novo nucleotídeo e, com sua atividade fosfodiesterase, remove a extremidade dRP 5’ gerando uma extremidade fosfato 5’ requerida para a atividade da ligase (MATSUMOTO e KIM, 1995; SVILAR et al. 2011). O reparo é finalizado com a ação da DNA ligase I ou III selando a ligação fosfodiéster. A via longa tem a participação de proteínas replicativas e é ativada para o processamento de sítios gerados pela atividade da glicosilase e da APE1. Tais proteínas incluem as DNA polimerases δ/ε, proteína antígeno de proliferação celular nuclear (PCNA), endonuclease de estrutura específica flap 1 (FEN1) e ligase 1 (LIG1) (SVILAR et al., 2011). A via longa do BER diferencia-se da via curta pela atividade da polimerase, que adiciona dois ou mais nucleotídeos ao sítio da lesão. A atividade da polimerase na via longa gera um fragmento novo de DNA pareado, o que induz o deslocamento do fragmento de DNA antigo, formando uma extensão na extremidade 3’ do gap. A extensão livre é retirada pela ação da FEN1 gerando uma extremidade 3’ fosfato, e o reparo é concluído com a ação da proteína ligase 1. O BER também repara 26 quebras de fita simples, através do reconhecimento do dano pela XRCC1 e PARP-1 (HEGDE et al., 2008). Figura 5. Reparo de DNA por excisão de bases. O BER pode ocorrer pela via curta ou pela via longa, formadas por proteínas específicas. O reparo ocorre em cinco passos: (1) excisão da base lesada; (2) incisão, (3) processamento de extremidades, e (4) síntese. Na via curta apenas um nucleotídeo é adicionado pela polimerase na fase de síntese. Na via longa, a polimerase adiciona dois ou mais nucleotídeos, enquanto a fita de DNA que é substituída forma uma extensão livre que posteriormente será clivada pela ação da FEN1. Adaptado KROKAN e BJORAS, 2013. O tipo da DNA glicosilase que remove a base danificada também define qual será a via será processada. Sítios abásicos, timina glicol e 8-oxoG são removidos pela 27 via curta, enquanto que uracila e hipoxantina são removidas tanto pela via curta como pela via longa (BENNETT et al., 2001; FORTINI e DOGLIOTTI, 2007). A cinética de competição entre as enzimas envolvidas no processo é outro fator importante. Por exemplo, a escolha entre via curta e via longa depende da concentração de ATP após o passo de excisão da 5’ dRP, altos níveis de ATP favorecem a atividade da ligase III e a via curta, níveis baixos de ATP promovem a estabilização da via longa. (SUNG e MOSBAUGH, 2003). A via BER também participa da manutenção da integridade do mtDNA. Como comentado, a proximidade da CTE favorece as reações químicas entre as espécies reativas e o mtDNA, acarretando em danos oxidados. As enzimas UDG, OGG1 e APE1 já foram descritas no BER mitocondrial e são codificadas pelos mesmo genes expressos para o reparo nuclear. Contudo, as proteínas mitocondriais não possuem o sinal de localização nuclear (NLS) e podem conter uma sequência de direcionamento para a mitocôndria (SDM) na região N-terminal (CROTEAU et al., 1997; PFANNER 2000). Chattopadhyay e colaboradores (2006) observaram que a APE1 mitocondrial não possui os 33 resíduos de aminoácidos da porção N-terminal, incluindo o SLN requerido para a importação nuclear, e sugeriram que a perda do SLN é um pré- requisito para a importação mitocondrial da proteína (CHATOPADHYAY et al., 2006). A inibição do processamento de sítios abásicos pela APE1 estimula a degradação do mtDNA em situação de estresse oxidativo, sugerindo que a impossibilidade de reparar danos no mtDNA pode ser um sinal para sua degradação (SHOKOLENKO et al., 2009) 1.5. APE1: um link entre reparo de DNA e reposta inflamatória Proteínas da via BER, como OGG1 e APE1 tem sido associadas a funções outras além da localização e correção de danos no DNA. Estudos mostraram que camundongos knockout (KO) para OGG1, ou seja, que não possuíam a proteína, apresentaram redução do estresse oxidativo e da ativação inflamatória em resposta ao LPS, infecção por H. pilory, invasão por P. aeruginosa e em modelos de inflamação de vias aéreas, comparados aos camundongos proficientes em OGG1 (MABLEY et al., 2005; TOUATI et al., 2006; WU et al., 2011; GUOPING et al., 2012). Recentemente constatou-se que o recrutamento de proteínas de reparo para lesões nos promotores é requerido para a ligação de fatores de transcrição, como NF-κB, a sequências específicas no DNA e para a estabilização dos complexos transcricionais (AMENTE 28 et al., 2010; BA et al., 2014; ROSADO et al., 2013). Essas pesquisas demonstraram que proteínas de reparo de DNA podem ser diretamente associadas a transcrição de proteínas inflamatórias. A APE1 é uma proteína multifuncional envolvida em uma grande variedade de funções celulares importantes. Além de ser a AP endonuclease mais importante em mamíferos, APE1 também participa do processamento de RNA e da regulação redox celular, reduzindo resíduos conservados em fatores de transcrição, tais como AP-1, p53, NF-κB, HIF1-α, Erg-1, Myc e membros da família ATF/CREB, aumentando assim a afinidade ao DNA (Figura 6). (AKAMATSU et al., 1997; EMA et al., 1999; LANDO et al., 2000). As atividades de APE1 podem ser reguladas a nível transcricional e pós- traducional. A regulação transcricional da enzima está associada a estímulos, incluindo estresse oxidativo, hormônios e citocinas. Agentes oxidantes como H2O2 e injúrias que geram ERO promovem uma indução transiente de APE1, a qual se relaciona diretamente com o aumento de suas atividades redox e de endonuclease (TELL et al., 2005). A regulação de APE1 a nível pós-traducional envolve dois principais mecanismos não mutuamente exclusivos: (1) localização subcelular, e (2) o grau de modificações pós-traducionais. A localização de APE1 nas células humanas é extremamente variada. Vários estudos mostraram que a localização de APE1 predomina no núcleo, enquanto outros mostraram que em células com alta atividade metabólica ou proliferativa, como hepatócitos e espermatócitos, APE1 tem localização citoplasmática (TELL et al., 2005). Há ainda células em que a proteína localiza-se em ambos os compartimentos celulares. Em geral, os estímulos capazes de induzir a expressão de APE1 e determinadas condições celulares também promovem sua translocação intracelular. A proteína APE1 é alvo de modificações pós-traducionais como fosforilação e acetilação, capazes de influenciar na sua atividade. Bhakat e colaboradores (2003) mostraram que a ocorrência de acetilação nas lisinas 6 e 7 da proteína APE1 promoveu um aumento na repressão do paratormonio (PTH), produzido pela glândula paratireóide, sob regulação de APE1 (BHAKAT et al., 2003). No contexto da resposta inflamatória, a APE1 facilita a transcrição de mediadores inflamatórios através da ativação redox de NF-κB, HIF-1 e AP-1. A inibição de APE1, pelo bloqueio de sua atividade redox, diminui significativamente a expressão de citocinas como TNF-α, IL-6 e IL-12, e mediadores inflamatórios, 29 principalmente por reduzir a ativação de fatores de transcrição (JEDINAK et al., 2011). Contudo, o estudo do envolvimento da atividade de reparo de APE1 na resposta inflamatória ainda não foi elucidado. Figura 6. Atividades desempenhadas pela APE1. APE1 possui multiplas atividades bioquímicas e desempenha diversas atividades celulares. A atividade de reparo de DNA é responsável pelo reparo majoritário dos sítios AP gerados no DNA. Além da ativação redox de fatores de transcrição, a APE1 possui atividade sobre o controle de qualidade dos RNA sintetizado. APE1 também desempenha papel importante na mitocôndria onde repara danos oxidados e contribui para a manutenção da organela. Diante da complexidade das funções desempenhada, a atividade da proteína APE1 está envolvida na sobrevivência celular, resposta inflamatória e suscetibilidade a doenças, por afetar vários processos celulares como proliferação e apoptose. Adaptado Luo et al., 2010. Estudos anteriores do nosso grupo mostram a associação entre APE1 e a meningite. Silva e colaboradores (2011) avaliaram a relação entre polimorfismos nos genes da via BER, APE1 Asn148Glu, OGG1 Ser326Cys, e PARP-1 Val762Ala, com o desenvolvimento da resposta inflamatória na MB. A partir de diferenças observadas nas frequências genotípicas e alélicas entre os pacientes analisados, foi observada uma frequência elevada do alelo polimórfico para APE1 em pacientes acometidos com MB e meningite asséptica (MA), quando comparados ao grupo controle (SILVA et al., 2012). Esse resultado sugere uma relação entre alterações na proteína APE1 com a propensão para desenvolvimento da doença MB. Sabendo que o polimorfismo no 30 gene da APE1 está localizado em uma região intermediária entre ambos os domínios da proteína (Figura 7), propõe-se que a mesma esteja relacionada à resposta inflamatória de uma maneira redox-independente. Figura 7. Representação esquemática da proteína APE1. A porção carboxi-terminal (C-terminal) concentra o domínio responsável pela atividade endonuclease da proteína. Na porção amino-terminal (N-terminal) o domínio responsável pela ativação redox de fatores de transcrição, em especial a cisteína 65. Os domínios opostos da proteína são funcionalmente independentes. SLN= Sinal de localização nuclear. Adaptado EVANS, LIMP-FOSTER e KELLEY, 2000. Atualmente tem sido relatada a associação direta da APE1 com fatores de transcrição e moléculas co-ativadoras (p300, por exemplo), como componente indispensável para a formação de complexos de pré-iniciação da transcrição, regulando a transcrição de uma maneira redox independente (AMENTE et al., 2010; SENGUPTA et al., 2011; ANTONIALIA et al., 2013). Inicialmente, a APE1 foi identificada em associação com complexos localizados no promotor do gene do paratormonio (PTH) humano, denominados elementos de resposta ao calcio (nCARE). A expressão do PTH é regulada pela presença de cálcio intracelular e tem a APE1, em associação com outras moléculas trans-ativadoras, como um modulador transcricional. O aumento dos níveis de Ca+ aumentam os níveis de APE1 acetilada, em decorrência da fosforilação da proteína p300, catalizada pela proteina quinase C ou da calmodulina quinase IV dependente de cálcio (CAM), e indução da sua atividade de acetilação de histonas. Foi demonstrado que a acetilação de APE1 em resposta ao Ca+ induziu o recrutamento de complexos APE1-HDACs ao promotor do PTH, agindo como repressor da transcrição. Paralelamente, foi observado que APE1 interage estavelmente com Egr-1, supressor tumoral que regula a expressão de genes como p53 e PTEN, e aumenta a sua ligação ao DNA em células osteoblásticas. Os pesquisadores demonstraram também que a expressão de PTEN mediado por Egr-1 é dependente da acetilação de APE1 (PINES et al., 2005; FANTINI et al., 2008) Amente e colaboradores (2010) demonstrou que a transcrição mediada pela família Myc (proto-oncogene) de fatores de transcrição é dependente da desmetilação 31 de histonas e da atividade de reparo do BER. A LSD1 é uma enzima desmetilase contendo FAD que, ao ser recrutada para o promotor dos genes responsivos à Myc e remover o grupamento metil da histona H3, gera H2O2. O peróxido produzido reage com o DNA na região promotora e oxida as bases, produzindo 8-oxodesoxiguanina (8-oxodG), a qual recruta OGG1 para região promotora. A atividade de excisão da base pela OGG1 gera um sítio AP que é rapidamente reconhecido e clivado pela APE1. Os autores observaram que a base oxidada, a OGG1 e a APE1 foram localizadas nas mesmas regiões da cromatina ocupadas pela RNA pol II e Myc, e propuseram que o mecanismo de ativação transcricional mediado por Myc depende diretamente da desmetilação da histona H3 pela LSD1, da oxidação de bases no promotor e do recrutamento de proteínas de reparo de DNA (AMENTE et al., 2010). Sengupta e colaboradores (2011) estudaram o envolvimento de APE1 no mecanismo de ativação do fator de transcrição proteína de ligação a Y-box (YB-1) no promotor do gene de resistência a multidrogas (MDR-1). Os pesquisadores descobriram que a proteína APE1 interage estavelmente com YB-1 e, quando acetilada, tem a ligação potencializada, levando a ativação do promotor. A acetilação de APE1 aumenta a interação entre p300 e YB-1 e, a formação do complexo no promotor do gene, o que induz a montagem da RNA polimerase II e consequente transcrição de MDR-1 (SENGUPTA et al., 2011) Apesar de alguns estudos evidenciarem a importância da atividade de reparo de APE1 na transcrição de genes, as pesquisas de desenvolvimento de adjuvantes para o tratamento de doenças inflamatórias, com enfoque no controle da expressão de citocinas e quimiocinas, comumente desconsidera a potencial aplicação de inibidores de reparo na modulação da inflamação. 32 Figura 8 Modelo esquemático das atividades de regulação da transcrição mediadas pela APE1. APE1 interage com diferentes proteínas na formação de complexos de trans-ativação. APE1 interage com hnRNP-I e HDAC1 para ligação à região nCARE-B (elemento B de resposta negativa ao cálcio), agindo como repressor da expressão do PTH. No complexo de ligação a HRE (elementos de resposta a hipóxia), APE1 interage com HIF-1α, STAT3, e p300 e ativa a expressão de VEGF induzido por hipóxia. APE1 interage com Erg-1 para ativação da expressão de PTEN, e com o complexo YB-1 e p300 para a transcrição de MDR-1. Adaptado BHAKAT, MANTHA e MITRA (2009). 1.6. Metoxiamina Metoxiamina (CH3ONH2) (MX) é uma pequena molécula sintética, desenvolvida para inibir a atividade de reparo da via BER. A ação específica a partir da qual a MX impede o reparo pela via BER pode ser visto na figura 8. A MX se liga covalentemente ao grupo aldeído de sítios abásicos do DNA com velocidade e especificidade muito elevados, associando-se ao sítio tão imediatamente ele seja formado (ROSA et al., 1991). A ligação da MX ao sítio abásico forma adutos estáveis que impedem o reparo: (1) diretamente, pela ligação covalente com a metade aldeído do sítio tornando-o quimicamente diferente e impassível de reconhecimento pela APE1; ou (2) indiretamente, tornando a ligação fosfodiéster adjacente ao sítio AP refratária à ação catalítica de APE1 (ZHU et al., 2012). Os sítios AP não reparados 33 (pela ligação da MX) podem bloquear a replicação e transcrição do DNA (HORTON et al., 2000). Figura 9. Esquema representativo da reação de formação de adutos no DNA pela MX. A MX reage com a forma tautomerica de anel aberto da desoxiribose, gerado quando uma base alterada é removida. A estrutura química do aduto sítio AP-MX pode bloquear o reparo pela alteração química do sítio ou tornando refratária a ligação fosfodiester à ação catalítica da APE1. (Adaptado ZHU et al., 2012). A MX também tem ação inibitória sobre a via BER mitocondrial. Shokolenko e colaboradores (2009) mostraram que a inibição do reparo de danos oxidados no mtDNA aumentam a sua degradação. Nesse estudo, os autores observaram que células HeLa submetidas a estresse oxidativo com H2O2 apresentaram maiores danos oxidados no DNA nuclear e mitocondrial quando tratadas com MX, e que a exposição ao inibidor aumentou a degradação do mtDNA (SHOKOLENKO et al., 2009). Devido a sua eficiência em bloquear atividade de reparo de DNA pela via BER, MX tem sido aplicada em pesquisas para desenvolvimento de abordagens anti- tumorais. Estudos têm demonstrado a capacidade da MX em aumentar a resposta citotóxica de drogas quimioterápicas, como temozolomida (TMZ) (SAVVIDES et al., 2012), permetrex (BULGAR et al., 2012) e carmustina (BCNU) (LIU et al., 2003), além de potencializar a radiosensibilização mediada por 5-iodo-2-desoxiuridina (IdUrd) (TAVERNA et al., 2003; YAN et al., 2006). Gurkan-Cavusoglu e colaboradores (2013) demonstraram a partir de modelos computacionais que a eficácia da inibição do reparo do BER pela MX tem associação direta com o grau de eficiência da maquinaria de reparo do paciente, sendo a inibição mais efetiva quando mais eficiente for o reparo por excisão, e menos efetiva quando menor a eficiência do reparo. Os resultados obtidos in vitro e in silico permitiram que a capacidade da MX de aumentar a citotoxicidade da TMZ em uma variedade de tumores sólidos fosse testada na fase clínica I. Os resultados preliminares 34 corroboraram os dados in silico, demonstrando que a inibição da via curta do BER reduz o reparo dos danos induzidos pela TMZ e que a eficiência do BER é variável tanto em tecidos humanos normais, quanto em tumores. As evidencias sobre a citotoxicidade da TMZ e a inibição do BER pela MX foi quantificada usando as células do sangue circulante de pacientes, e observou-se a redução de 10-40% na formação de sítios AP (refletindo a ligação da MX ao sítio AP) e o aumento de 2-3 vezes na quantidade de quebras de simples fita em resposta ao tratamento com TMZ/MX comparado apenas a TMZ. Os dados das primeiras doses do tratamento TMZ/MX mostraram que não houve aumento na citotoxicidade em tecidos normais, e 3 de 23 tumores demonstraram resposta estável. (GURKAN-CAVUSOGLU et al., 2013; SAVVIDES et al., 2012; SAVVIDES et al., 2012). 1.7. Análises bioinformáticas e biologia de sistemas A complexidade das rotas metabólicas e a enorme diversidade de respostas celulares aos sinais intracelulares e extracelulares, levaram ao desenvolvimento de novas técnicas para varredura e estimativa do comportamento global da célula em resposta a estímulos de interesse. Uma das técnicas desenvolvidas foi o sequenciamento de nova geração (NGS, do inglês Next-Generation Sequencing). O NGS é uma nova ferramenta desenvolvida na área de genética, genômica e epigenômica, que elevou a qualidade da análise e reduziu os custos da pesquisa (HAYDEN et al., 2009). Com a ferramenta, pesquisadores tem acesso ao genoma celular e são capazes de investigar uma série de fenômenos, incluindo polimorfismos de nucleotídeo único (CRAIG et al., 2008), eventos epigenéticos (PARK, 2009), expressão diferencial (BLOOM et al., 2009), ou mesmo splicing alternativo (SULTAN et al., 2008). O sequenciamento de RNA (RNAseq) é uma aplicação de notada efetividade, cuja metodologia foi melhorada a partir de tecnologias prévias como ensaios de microarrajos de DNA e analise seriada da expressão gênica (SAGE, do inglês sequencing analysis of gene expression) (CLOONAN et al., 2009). O RNAseq utiliza a tecnologia do NGS para sequenciar, mapear e quantificar populações de transcritos celulares (MORTAZAVI et al., 2008; MOROZOVA et al., 2009). Apesar de recente, a estratégia fornece informações sem precedentes sobre a complexidade transcricional de diversos organismos, dentre eles, humanos (SULTAN et al., 2008). 35 O NGS pode ser obtido a partir de diferentes plataformas, dentre elas a plataforma 454 Genome Sequencer FLX, Illumina’s Genome Analyzer, SOLiD Applied Biosystems e Ion Torrent (CLOONAN et al., 2008; EVELAND et al., 2008; MARIONI et al., 2008). As plataformas, apesar de distintas, usam métodos de sequenciamento de RNA semelhantes. Inicialmente, o RNA é isolado da célula, fragmentado em posições aleatórias e copiados em uma fita da DNA complementar (cDNA). Para os próximos passos, os fragmentos são selecionados de acordo com o tamanho específico (200-300 bases, por exemplo) e submetidos à amplificação por PCR. Uma vez amplificadas, as moléculas de cDNA são sequenciadas usando NGS, e as reads resultantes são alinhadas com um genoma de referência. A quantidade de reads alinhadas com cada gene do genoma de referência é tabulado e, sua contagem, ou medidas de expressão gênica digital (MED) pode ser usada para testes de expressão diferencial (MORTAZAVI et al., 2008). O processamento e análise das listas de transcritos geradas pelo sequenciamento é realizado com auxílio de análise computacional e da Biologia de Sistemas. As interações complexas por traz do sistema da imunidade inata, o qual resulta em uma resposta efetiva do hospedeiro em condições normais, e doenças inflamatórias quando perturbado, pode ser dissecada de uma maneira compreensiva através de ferramentas de biologia de sistemas. A Biologia de Sistemas é uma ferramenta de estudo e organização de dados que tem como base as interações entre componentes de um sistema e a relevância dessas interações para funções e processos desse sistema. Proteínas, metabólitos ou RNAs envolvidos em uma via metabólica são exemplos de componentes de um sistema. Com o auxílio da Biologia de Sistemas é possível transformar dados computacionais em vias e processos celulares e, a partir disso, formular hipóteses e mensurar possíveis experimentos para comprovação de comportamentos celulares. (ALBERT, 2005). Dos dados brutos gerados pelas plataformas de sequenciamento até a representação gráfica de processos celulares, são realizados testes e cálculos matemáticos. Uma das formas de representação de resultados é pela Teoria dos Grafos. Grafos são representações gráficas de componentes de um sistema que, de alguma maneira, interagem entre si, podendo formar redes de interações (BARABASI e OLTVAI, 2004) (Figura 9). Em um grafo, um nó representa uma unidade, ou seja, um componente do sistema que, caso interaja com outro nó, compartilhará com este um conector. Desta maneira, entende- 36 se que só haverá conector havendo no mínimo dois nós interagindo entre si, seja por associação física, ativação, inibição, co-regulação ou outra relação qualquer (BROWN et al., 2004; HUBER et al., 2007). Na Biologia de Sistemas, os grafos podem conter centenas de nós e, assim gerar grandes redes de componentes interagindo entre si. Apesar de o termo “grafo” estar associado com a representação matemática de dados, e o termo “redes” estar associado com a representação gráfica, ambos podem ser entendidos sinônimos (HUBER et al., 2007). Figura 10. Representação dos componentes de um grafo. Nó (esquerda) pode ser a representação de proteínas, DNA, RNA e através de um conector (centro) pode formar interação (direita) com outro nó. Uma rede de interação pode possuir centenas de nós e ser organizada de analisada por cálculos matemáticos. Outras abordagens matemáticas podem ser aplicadas após a formação das redes biológicas. Essas verificações fornecem dados sobre a disposição de cada nó dentro da rede, a relação entre os nós, além da identificação de sub-redes de interações contidas da rede geral (VALENTE et al., 2008). Um teste matemático bastante relevante na compreensão da rede é a análise de centralidade. Centralidades são caracteres matematicamente calculados para cada nó da rede que fornecem dados acerca da importância de cada componente individual dentro do sistema (KONIG e TESSONE, 2011). Uma das medidas importantes de centralidade, o degree (conectividade) representa o quanto um nó interage com outros nós dentro da rede. Nós com alto valor de degree são consideradas hubs e tendem a ser componentes importantes da arquitetura do sistema analisado (JIN et al., 2007; LIN et al., 2008). Outros parâmetros de centralidade bastante utilizados na Biologia de Sistemas são o closeness (proximidade) que indica o quanto um nó está próximo a outro, e o Betweenneess (intermedialidade) que representa o quanto um nó específico está entre todos os outros nós da rede (SCARDONI et al., 2009). Nós com altos valores de betweenneess são chamados de bottleneck (gargalos), pois interagem com diversos outros nós, tornando-se por vezes elos entre sub-redes diferentes, e cuja remoção fragmentaria a rede total (YU et al., 2007). 37 Dentro das redes, comumente formam-se estruturas onde os nós, mais relacionados entre si, formam maior número de interações. Essas estruturas são chamadas de sub-redes (ou clusters) e interagem com outras sub-redes para formar a rede total. Cada sub-rede pode ser formada por proteínas, genes, subunidades ou produtos metabólicos que compartilham atividade em processos biológicos específicos (ESTRADA e BODIN, 2008). Os processos biológicos contidos em cada rede podem ser avaliados independentemente em ferramentas denominadas Ontologias Gênicas (GO, do inglês Gene Ontology), e ordenados de maneira hierárquica em relação a rede total analisada. Os dados da GO fornecem informações importantes acerca do perfil celular obtido após determinadas condições-teste, e auxilia na elaboração de hipóteses e formulação de mecanismos celulares de ação (MAERE et al., 2005; RIVALS et al., 2007). A complexidade das doenças inflamatórias, bem como o seu envolvimento na etiologia de doenças graves e de difícil tratamento como o câncer, apresentam-se como desafios para a pesquisa médica. O estudo de alternativas para a modulação da resposta inflamatória exige o conhecimento acerca das relações entre as proteínas e vias celulares, a fim de desenvolver métodos mais eficazes para a melhoria da qualidade de vida dos pacientes. Diante das novas atividades celulares atribuídas às proteínas de reparo de DNA e, frente à carência de estudos acerca do envolvimento da atividade de reparo da proteína APE1 na ativação da resposta inflamatória, este estudo visa analisar, pela primeira vez, o envolvimento da inibição da atividade de reparo de sítios AP pela MX na resposta inflamatória celular induzida por LPS. 38 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Geral Avaliar o envolvimento da atividade de reparo de sítios abásicos da proteína APE1 na regulação da resposta inflamatória induzida por LPS em modelo celular. 2.2. Objetivos específicos  Avaliar a citotoxicidade do tratamento com MX em células monocíticas U937;  Determinar os tempos de estimulação com LPS para estabelecimento do modelo celular de inflamação;  Determinar o perfil de expressão de citocinas e quimiocinas em resposta à exposição ao LPS durante 24 h e posterior co-incubação com MX por mais 4 h;  Avaliar o perfil transcriptômico das células U937 após os tratamentos com LPS e LPS/MX a partir de ferramentas de biologia de sistemas;  Realizar a análise comparativa das redes interatômicas formadas com os transcritos up-regulados e down-regulados após tratamentos;  Avaliar a progressão do ciclo celular após os tratamentos;  Validar os resultados do RNAseq através da quantificação por PCR em tempo real;  Observar a localização celular de APE1 e da subunidade p65 do fator de transcrição NF-κB após os tratamentos;  Analisar a atuação da MX na cinética de produção de citocinas inflamatórias após 2 h, 4 h e 6 h de tratamento;  Determinar o perfil de produção de ERO em resposta aos tratamentos;  Quantificar a expressão de APE1 em resposta aos tratamentos; 39 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Linhagem e cultivo celular Células monocíticas U937 provenientes de linfoma histiocítico (BCRJ-0242) foram subcultivadas em suspensão de meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com bicarbonato de sódio (NaHCO3) 44 mM (Sigma), 10% de soro bovino fetal (Gibco) e 1% de solução antimicótica e antibiótica (Sigma), e mantidas em estufa com atmosfera a 5% de CO2 e 37ºC. As células foram cultivadas em frascos para cultura celular de 25, 75 e 150 cm2 e os experimentos foram realizados em placas de 6, 24 e 96 poços (Sarstedt). A manutenção da cultura se deu por centrifugação (1500 rpm; 5 min), remoção do meio de cultura, suspensão das células em meio novo, alíquota das células em novos frascos contendo meio RPMI- 1640 pré-aquecido (37 °C) e incubação como previamente descrito. 3.2. Indução de resposta imune em modelo celular Para os experimentos de indução de resposta inflamatório foram criados quatro grupos experimentais, a saber: células não-tratadas como parâmetro de não indução e controle negativo (CTRL); células estimuladas com LPS para indução de resposta inflamatória como controle positivo de inflamação (LPS); células estimuladas com LPS e co-incubadas com metoxiamina (MX) (LPS/MX); e células não estimuladas tratadas com MX (MX). Para a avaliação da viabilidade celular as células foram expostas ao LPS na concentração de 1 µg/ml (Song et al., 2008) por 1 h e co-incubadas com MX até completar tempos finais de incubação de 2 h, 4 h, 6 h, 24 h e 48 h. Para o estabelecimento de modelo de resposta inflamatória, 3 x 105 células foram expostas ao tratamento com LPS durante 2 h, 4 h, 6 h, e 24 h. Após determinação do modelo, cerca de 3 x 105 células por poço foram distribuídas em placas de 24 poços e, ao meio de cultura dos grupos estimulados, foi adicionado LPS e incubado por 28 h em ambiente à 37ºC e atmosfera a 5% CO2. Para o tratamento do grupo LPS/MX, as células foram estimuladas com LPS durante 24 h e, em seguida, co-incubadas com metoxiamina (MX), na concentração de 30mM por mais 4h, totalizando 28 h de tratamento. Para os experimentos de cinética, as células do grupo 40 LPS/MX foram incubadas com LPS durante 1 h e co-incubadas com MX até os tempos finais de 2 h, 4 h e 6 h de incubação. 3.3. Viabilidade celular Após os tratamentos, os grupos experimentais foram expostos ao azul de tripano 1:1 (v:v) e foram quantificadas as células totais (vivas e mortas) em Câmara de Neubauer. Como padronização, células com membrana celular intacta e citoplasma não-corado foram consideradas vivas, células com citoplasma corado foram consideradas mortas. A razão de viabilidade foi calculada em função do número de células mortas em relação ao número de células total. 3.4. Ciclo celular Para observação do ciclo celular, 2 x106 células de cada grupo experimental foram centrifugadas (2.500 rpm por 5 min) e o sedimentado celular re-suspenso e fixado em paraformaldeído 70% (diluído em PBS) por 30 min a temperatura ambiente. Após o período de fixação, as células foram centrifugadas (2.500 rpm por 5 min) e re- suspensas em solução permeabilizante contendo saponina 0,1% (diluída em PBS) e RNAse livre de DNAse 1ug/ml durante 60 min a 37ºC. Decorrido o tempo, foi adicionado iodeto de propídio (2 µg/mL) por 10 min e as amostras foram analisadas em citômetro de fluxo (BD, Becton Dickinson) usando comprimento de onda de 488 nm. A fluorescência do DNA foi coletada a partir de 30.000 células por amostras. Os experimentos foram realizados em triplicata e os dados foram analisados usando o programa Flow Jo7.6.5. 3.5. Quantificação de Citocinas e quimiocinas por Luminex A imunoanálise baseada em ensaios múltiplos e na tecnologia de microesferas denominada Bio-Plex 200 suspension array system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante para mensurar as concentrações de citocinas e quimiocinas no meio de cultura das células estudadas. Human cytokine Lincoplex Kit (HCYTO-60k, Lincoplex®, Linco Research Inc., St Charles, MA, USA) foi usado para esta análise. Resumidamente, uma mistura do padrão foi reconstituída em 250 μl de água deionizada, gerando uma concentração estoque de 10.000 pg/ml para cada citocina analisada. O estoque padrão foi serialmente diluído no tampão de ensaio 41 disponibilizado pelo kit, fornecendo 6 concentrações enquadradas na curva padrão de 3.2–10,000 pg/ml. Após os tratamentos, 25 μl do meio de cultura celular foram incubados com esferas anticorpo-específicas durante 16 h a 4ºC sob agitação contínua. Cada esfera é acoplada a um anticorpo monoclonal específico para uma única citocina ou quimiocina. Posteriormente, as esferas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem para remoção de proteínas não-ligadas, e então incubadas com anticorpo biotinilado de detecção citocina-específico por 1 h sob agitação contínua. No passo subsequente, estreptoavidina–ficoeritrina foi adicionada às amostras que foram incubadas durante 30 min. Após incubação, as esferas foram lavadas e re-suspensas em fluido próprio do sistema. Os constituintes de cada poço foram expostos ao Bio-Plex Suspension Array System, responsável por identificar cada esfera como uma população de proteínas e quantificar cada proteína alvo baseado na cor e fluorescência do anticorpo secundário. Por fim, as concentrações de citocinas foram automaticamente calculadas pelo programa Bio-Plex manager usando a curva padrão derivada das citocinas recombinantes humanas. 3.6. Análise da expressão proteica por Western-Blot 3.6.1. Extração de proteínas totais A extração de proteínas totais foi realizada com o kit illustra tripleprep (GE Healthjcare, Sweden), de acordo com as instruções do fabricante. Após a extração, as amostras proteicas foram quantificadas pelo método de Bradford (Bradford, 1976), e a absorbância das amostras foi medida no espectrofotometro de microplacas μQuant (Biotek). 3.6.2. Western Blot Cerca de 10 μg de proteínas totais foram separadas eletroforeticamente por SDS-PAGE (12%), e transferidas para uma membrana de PVDF ativada em metanol 100%, água e tampão de transferência 1x, através do sistema de transferência semi- seco, Semi-Dry 10 (Biosystems). Após a transferência, a membrana foi bloqueada com solução bloqueadora (TBS + Tween-20 0,1% + leite desnatado 5%) e incubada com anticorpo primário monoclonal anti-APE1 (1:5000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) diluído em TBS + Tween-20 0,1% + leite desnatado 2%, durante 18h, a 4 ºC. Posteriormente, a membrana foi lavada com a solução de lavagem (TBS + Tween-20 0,1%) por 3 vezes e incubada com o anticorpo secundário correspondente 42 (1:1000, RD systems, Minneapolis, MN, USA) associado à uma peroxidase por 1h. Decorrido o tempo, a membrana foi lavada por 3 vezes e revelada pelo método de quimioluminescência aumentada. Para a revelação, a membrana foi exposta ao H2O2 + luminol (milipore) por 2 min e posicionada junto a filmes de revelação (GE Healthcare). As bandas foram visualizadas após tratamento do filme com solução reveladora (KODAK RP X-OMAT developer Replenisher) e fixadora (KODAK RP X-OMAT LO Fixer and Replenisher). As bandas foram fotodocumentadas através do scanner EPSON L355. A densitometria de bandas foi realizada pelo programa ImageJ, e os cálculos foram normalizados pela densitometria das bandas de β-actina. Os resultados dos tratamentos foram comparados aos obtidos no grupo não-tratado (CTRL), o qual corresponde a 100%. 3.7. Ensaio para quantificação de ERO Para quantificar a produção e acúmulo de espécies reativas de oxigênio, foi utilizado o teste de fluorescência usando diclorofluoroceína-diacetato (DCFH-DA). As células foram distribuídas em placas de 96 poços, previamente tratada com poli-L- lisina. Na concentração de 104 células por poço em 100 μl de meio de cultura, as células foram expostas ao LPS por 24 h e a metoxiamina por mais 4 h, em estufa a 37ºC e 5% de CO2. Decorrido o tempo dos tratamentos, o meio de cultura foi aspirado e 200 μl de DCFH-DA (100 μM) foram adicionados aos poços por 30 min. Em seguida, os poços foram lavados com PBS e, posteriormente, adicionados 200 μl de meio RPMI sem fenol red, e realizada a leitura em leitor de microplacas Sigma D-6883, sob excitação de 485-10 nm. 3.8. Imunofluorecência A localização celular de APE1 foi realizada a partir de ensaios de imunofluorescência. Para tanto, 3 x 105 células foram tratadas como descrito e fixadas durante 60 min em lamínulas previamente expostas a poli-L-lisina, por 30 min. Após o tratamento, as células foram lavadas com PBSA gelado e fixadas com paraformaldeído 3% (PFA 3%) durante 30 min, à temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram lavadas com PBST (PBS + Tween-20 0,1%), durante 5 min por três vezes, sob agitação leve. As células foram incubadas com anticorpo primário anti- APE1 ou anti-p65 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), por uma hora, e foram 43 lavadas três vezes com PBST por 10 min, sob agitação leve. Em seguida, as células foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), no escuro durante 1 h. Decorrido o tempo, foram realizadas três lavagens com PBST por 10 min. Terminado o processo de lavagem, as lâminas foram montadas utilizando-se a solução de montagem (Dako) + DAPI 1,5 µg/ml, e analisadas em microscópio de fluorescência CKX41 (Olympus), utilizando-se a câmera para fluorescência DP-70 (Olympus). Todos os anticorpos foram diluídos em PBS + tween- 20 0,1% + BSA 2%. 3.9. Sequenciamento e análise transcriptômica 3.9.1. Extração de RNA Após os tratamentos, o RNA total das células foi extraído usando o kit illustra tripleprep (GE Healthcare, Sweden). A avaliação da integridade do RNA e sua quantificação foram realizados usando o Bioanalyzer da plataforma Agilent 2100 (RNA 6000 Nano, Agilent technologies, Waldbronn, Germany) e nanovue (GE healthcare, Sweden), respectivamente. A biblioteca de RNAm foi obtida a partir da técnica de isolamento pela cauda poly-A 3.9.2. Pirosequenciamento pela plataforma 454 Roche O RNA extraído após os tratamentos celulares, como descrito anteriormente, foi direcionado ao Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC), localizado no estado do Rio de Janeiro, Brasil, onde foi submetido ao sequenciamento de nova geração. A plataforma de pirosequenciamento 454 Roche foi utilizada para sequenciar todo RNA mensageiro (mRNA) extraído das células após os tratamentos descritos. As sequencias geradas foram alinhadas contra o banco de dados RefSeq human, provido pela Universidade da Califórnia Santa Cruz (UCSC), disponível no site http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/refMrna. fa.gz, 30 Jan 2014. Os alinhamentos foram feitos usando o BLAT (KENT, 2002) e os resultados filtrados usando a ferramenta psICDnaFilter (UCSSC- disponível em http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/), com a menor identidade de 98%, mínimo de 90% de cobertura e apenas um alinhamento por sequência. Todas as sequências alinhadas a genes ribossomais (rRNA) foram excluídas. Finalmente, o fold 44 change foi calculado usando a quantidade normalizada de reads. O fold change é o valor que representa a razão entre a quantidade de transcritos identificados no tratamento LPS em relação ao obtido em LPS/MX, determinando a diferença quantitativa da expressão transcricional entre os tratamentos. 3.9.3. Redes de interações proteína-proteína Após as análises de expressão diferencial, os transcritos do tratamento com LPS/MX foram separados de acordo com o perfil de expressão aumentada (up- regulados) ou diminuída (down-regulados), em relação aos transcritos obtidos no tratamento apenas com LPS. Foram considerados para análise de Biologia de Sistemas apenas os transcritos codificadores de produtos proteicos. Cada tabela de genes foi submetida à análise de interação proteica pelo software STRING 9.05 (http://string-db.org/) separadamente. Os parâmetros do programa para estabelecimento de interações entre os genes foram todos aceitos, exceto text mining. A lista de genes foi fragmentada, e o máximo de 200 genes foi usado por análise. Aos 200 genes de cada análise foram inseridos de maneira aleatória 10 novos genes por expansão, não ocorrendo mais de 15 expansões para cada grupo, obedecendo os parâmetros de escore de confidência médio (0.400) e network depht igual a 2. Os resultados das interações proteicas de cada grupo foram então analisados com o programa Cytoscape 2.8.2. Todas as redes geradas por grupo foram somadas para montagem das redes interatômicas totais. As sub-redes de maior relevância contidas na rede total foram identificadas através da ferramenta AllegroMCODE (Molecular Complex detection), pluggin gratuitamente disponível para download. Foram parâmetros de seleção das sub-redes: degree cutoff igual a 2; loops inclusos; nós com interação única foram deletados da sub-rede (opção haircut ativada); expansão da sub-rede com uma sub-rede próxima permitida (fluff node density cutoff no valor de 0,1); Node score cutoff de 0,2; k-core de 2; e maximum depth da rede igual a 100. Todos os nós da rede foram submetidos à leitura com AllegroMCODE e foram consideradas válidas as sub-redes cujo valor de score foram maiores ou iguais à 2.5 após seleção de todos os parâmetros. 45 A rede total e cada sub-rede foram submetidas à análise de centralidade pelo plugin Centiscape e os valores de closeneess, betweenneess e node degree foram computados para seleção de nós-chave das redes. 3.9.4. Ontologia Gênica O processamento das ontologias gênicas de cada sub-rede foi realizado através do software Biological Network Gene Ontology (BiNGO), plugin gratuito para o Cytoscape. O valor e a categoria atribuídos à cada sub-rede foi obtido por distribuição hipergeométrica (p-Value) e, após correção, foram considerados significativos aqueles maiores ou iguais a 10-6. Uma segunda análise ontológica foi realizada com todos os transcritos, através do software gratuito DAVID Bioinformatic Resources 6.7, disponível em (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Nesta ferramenta, foram avaliados apenas os transcritos originais diferencialmente expressos em cada tratamento. As sequências foram introduzidas no software pelo ensebl gene - ID, os resultados foram plotados por anotação funcional de Processos Biológicos, Componente Celular e Função Biológica. Foi também avaliada a participação dos transcritos em vias celulares organizadas pela ferramenta KEGG pathway, também disponível no DAVID, sendo consideradas significativas as vias com p-Values maiores ou iguais a 10-6. 3.10. Validação de transcriptôma por PCR em tempo real Para validação dos resultados obtidos pelo sequenciamento, foram realizadas reações em cadeia de polimerase PCR em tempo real. Para garantir a fidelidade dos resultados, foram utilizadas amostras de RNA extraídas com mesmo protocolo daquelas submetidas ao sequenciamento, como anteriormente descrito. A síntese de cDNA foi realizada com High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, Foster, CA). A detecção da amplificação dos cDNA dos alvos foi realizada com SYBR-green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster, CA). A especificidade do sinal do SYBR-green foi validada pela presença de um único pico bem definido observado na curva de melting para cada corrida de PCR. A quantidade de primers e cDNA utilizada foi normalizada usando o gene gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (GAPDH), cuja expressão constitutiva apresentou níveis mais estáveis no tipo celular 46 usado.Os oligonucleotídeos dos genes-alvo foram desenhados pelo site Integrated DNA technologies IDT, disponível em https://www.idtdna.com, pelas ferramentas, PrimerQuest. Tabela 1 Descrição dos primer selecionados para validação por PCR em tempo real Gene Forward Reverse TM DDIT3 CACTCTCCAGATTCCAGTC GGGAATGACCACTCTGTT 59º RPS6KC1 GCAGGAACAGAAAGACCA GCTGCAGCACAAGAAATAC 59º CYB5R4 GTCAGCCCTTATATGGAGTA AGTTCAGTACCATCTGATCC 59º ENDOG CCAGAATGCCTGGAACAA CTGTGCAGACATAGACGTT 59º MYC CCAGAATGCCTGGAACCTG CTGTGCAGACATAGACGAC 59º CCL2 CCAGAATGCCTGGAACAA CTGTGCAGACATAGACGTC 59º NMI GACAGGAATGGAAGGCAT CATTCTTTGCCCGTTGAAA 59º MINA GGTGTGTCAATGGGAAGA TCTCTGAGGTTGGTGAAAC 59º 3.11. Análises estatísticas Os dados foram analisados usando o programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA, USA. As variáveis que não seguiram distribuição normal foram analisadas com métodos não-paramétricos e diferenças entre grupos foram analisadas usando o teste não parametrico Kruskal-Wallis. Para análises de ensaios de viabilidade, análises de expressão foi utilizado o teste ANOVA e pós-teste de Tukey e Bonferoni. Diferenças entre dois grupos foram analisados com o two-tailed t test quando a distribuição era normal e Mann Whitney quando a distribuição não era normal. Para todos os testes estatísticos, valores obtidos com o p<0.05 foram considerados significativos. 47 4. RESULTADOS 4.1. MX não induz alterações na viabilidade de células U937 Sendo a MX um composto sintético inibidor de reparo de DNA, fez-se necessária a avaliação da capacidade citotóxica da molécula nas condições-teste e linhagem celular utilizados. Os resultados dos testes de viabilidade celular por exclusão de tripano mostraram que a estimulação com LPS, LPS/MX ou MX durante 2 h, 4 h, 6 h, 24 h ou 48 h não induziu alterações na permeabilidade da membrana celular, permitindo às células excluir com eficácia o tripano do citoplasma. As células incapazes de expulsar o corante foram consideradas mortas e somaram aproximadamente 10% do total de células, quantidade não estatística (Figura 10). Estes resultados indicam que os tratamentos LPS, LPS/MX e MX não induziram alterações celulares características de morte, mantendo as células viáveis em relação ao controle não tratado Figura 11.Ensaio de viabilidade celular por exclusão de azul de tripano. As diferenças na viabilidade celular entre os tratamentos não foram consideradas significativas pelo teste estatístico one-way- ANOVA, *p<0,05. 4.2. Estabelecimento de modelo inflamatório celular A resposta inflamatória está intimamente relacionada à síntese e liberação de moduladores inflamatórios como citocinas e quimiocinas. A fim de escolher o melhor modelo celular de inflamação, os monócitos foram expostos ao LPS (1 μg/mL) por diferentes tempos, e a cinética de produção das citocinas TNF-α e IL-6 foi avaliada. Os resultados mostraram que o tratamento com LPS aumentou significativamente os níveis proteicos de TNF-α após 2 h de incubação, e os manteve elevados sob 48 exposição contínua, sendo 24 h o período de incubação com maiores níveis da citocina no meio de cultura (Figura 11 A). A produção de IL-6 também foi responsiva ao LPS, com níveis proteicos significativos após 6 h de incubação, comparado aos níveis observados em células não estimuladas (Figura 11 B). Figura 12. Cinética da produção de TNF-α e IL-6 em resposta ao tratamento com LPS. Os resultados foram analisados pelo teste estatístico t-student (Two-tailed) e valores de p<0.05 foram considerados estatísticos. *p<0,05. Semelhante ao observado para TNF-α, os níveis proteicos de IL-6 foram mais elevados após 24 h de exposição ao LPS. Esses resultados demonstram que o LPS é capaz de estimular a resposta inflamatória em células monocíticas através da B A 49 produção de TNF-α e IL-6, apresentando elevados níveis após 24 h de tratamento. Frente à maior detecção de citocinas inflamatórias, padronizou-se o período de 24 h de incubação com LPS como o modelo celular de inflamação para este estudo. 4.3. O tratamento com MX e a resposta inflamatória Em seguida, foi avaliado o envolvimento da atividade de reparo com a produção de citocinas e quimiocinas. Para tanto, as células foram expostas ao tratamento com LPS durante 24 h e co-incubadas com MX por mais 4 h, como previamente descrito. O efeito sobre a inflamação foi avaliado através da diferença de produção de citocinas e quimiocinas, a saber: TNF-α, IL-8, IL-6, IL-10, MCP-1, MIP-1alpha e MIP-1beta, de reconhecida importância para o estabelecimento e manutenção da resposta inflamatória. Os resultados mostraram que o tratamento com LPS por 24 h mimetizou a resposta inflamatória responsiva à infecção bacteriana e induziu a expressão de todas as proteínas analisadas (Figura 12 A). A exposição das células estimuladas à MX por mais 4h reduziu os níveis de todas as citocinas testadas, sendo significativas as reduções nos níveis proteicos de TNF-α, IL-6, IL-8 e MCP-1 quando comparada ao tratamento apenas com LPS. O perfil de regulação observado através da quantificação proteica das citocinas e quimiocinas pode ser comparado à produção a nível transcricional. A MX reduziu a expressão do mRNA de IL-8 em relação ao tratamento com LPS, embora a redução não tenha sido significativa. Para os níveis de TNF-α e MCP-1 observou-se uma redução significativa após o tratamento com MX, quando comparado aos valores obtidos no modelo inflamatório (Figura 12 B) A 50 Figura 13.Redução da expressão de citocinas e quimiocinas pelo tratamento LPS/MX. (A) Os níveis proteicos de citocinas e quimiocinas; (B) Níveis transcricionais foram medidos por PCR em tempo real. Teste estatístico t-student (Two-tailed); *p<0,05 4.4. Análises Bioinformáticas A redução da expressão de reguladores inflamatórios em resposta ao tratamento com MX sugere uma relação entre o reparo de sítios abásicos no DNA e a sinalização para a transcrição de genes relacionados à resposta imune. Diante disto, técnicas de sequenciamento, análises transcriptômicas e ferramentas de bioinformática foram aplicadas para investigar o perfil de alterações celulares em resposta à inibição do reparo e seu envolvimento com a modulação da resposta inflamatória. Neste trabalho, foi realizado o sequenciamento de todo o mRNA das células após tratamento e os genes expressos nas células tratadas com LPS/MX foram comparadas aos expressos naquelas estimuladas apenas com LPS. Os dados contendo os genes diferencialmente expressos foram organizados em up-regulados e down-regulados como descrito em Material e Métodos e estão listados nas tabelas A6 e A7 (Apêndice). 4.4.1 Visão global dos genes diferencialmente expressos. 4.4.1.1 Genes up-regulados O resultado do sequenciamento e as análises comparativas identificaram um total de 683 genes cujos transcritos foram mais expressos (up-regulados) em resposta B 51 ao tratamento LPS/MX quando comparados àqueles obtidos após tratamento apenas com LPS. Os genes up-regulados foram então organizados e avaliados em relação ao produto gerado e o valor de fold change, como descrito. Os 50 genes com maior divergência de expressão após os tratamentos estão listados na figura 14. Uma análise inicial indica que o tratamento LPS/MX altera processos celulares e funções biológicas específicas, regulando positivamente genes envolvidos com componentes organelares e transporte intracelular (TRAPPC5, CLSTN3, ARL13B, HGSNAT, NAGPA, RP9, PEX26, ATG2A), e com a organização do citoesqueleto (SHROOM2, PARVB, MAP2K5). Uma análise detalhada dos 10 genes com maiores valores de fold change pode ser observada na tabela 2. O gene com maior expressão após tratamento com LPS/MX foi uma GTPase (GIMAP1) que, apesar de ser apenas superficialmente conhecida, é descrita por seu envolvimento na diferenciação de linfócitos T e células B na resposta imune. Figura 14. Genes up-regulados mais diferencialmente expressos. Os cinquenta genes com maiores valores de fold change são listados. Tabela 2 Descrição dos dez genes up-regulados com maiores valores de fold change. up-regulados Fold change Gene Proteína Funçãoa 29.3 GIMAP1 Membro da família GTPase IMAP 1 Pode regular a sobrevivência de linfócitos. Requerida para níveis normais de linfócitos T e células-B maduros 24.9 ARL13B Proteína tipo fator ribosilação-ADP Proteínas cílio-específica requerida para o controle da estrutura ciliada do axonema baseado em microtúbulos. Pode regular o tráfego endocítico de reciclagem. 52 24.1 ARHGAP 12 Proteína ativadora Rho GTPase 12 GTPase ativadora de GTPases tipo Rho pela conversão das mesmas ao estado de ligação GDPase inativo 18.9 SHROOM 2 Proteína Shroom 2 Pode estar envolvido em mudanças na morfologia de células endoteliais durante a movimentação celular. 15.5 EXO1 Exonuclease 1 Exonuclease de dupla fita de DNA no sentido 5'-3' que pode possuir uma atividade críptica de exonuclease 3'-5'. 15.5 PANK4 Pantotenato quinase 4 Desempenha papel na regulação fisiológica da concentração intracelular de CoA. 15.5 SIK3 Proteína serina/treonina quinase SIK3 isoforma 1 Catalisa a reação de fosforilação de proteínas a partir do ATP 13.8 EFCAB7 Proteína contendo domínio de ligação ao cálcio mão-EF Possui domínio de ligação à cálcio e metais 13.8 HGSNAT Precursor heparan-alfa- glicosaminida N- acetiltransferase Acetiltransferase lisossomal que acetila o terminal não- reduzido dos resíduos alfa-glicosamina da heparina intralisossomal ou do heparan sulfato, convertendo-o em um substrato para a alfa-N-acetil glicosaminidase luminal. a A descrição parcial das funções de cada gene foi obtida por consulta ao banco de dados UniProt. Expandindo a análise para toda a lista de transcritos observa-se que o tratamento LPS/MX induz a regulação da expressão de genes cujos produtos proteicos estão envolvidos em todos os compartimentos celulares, sendo a maioria deles relacionados ao lúmen de organelas. Os genes associados à mitocôndrias totalizaram aproximadamente 7% de todos os genes organelares up-regulados. Além da mitocôndria, organelas como o aparato Golgiense (PSEN2, CLSTN3, NCOA3, SCAMP5), membranas lisossomais (CLN5, CTN5, VTL1B), vacúolos (ATP6VOD2, MAP1LC3B) e microtúbulos do citoesqueleto (MAP2K5, ATG4C, TNK5, E4F1) também apresentaram genes associados. Observou-se também a participação dos genes em funções moleculares da célula, como atividade de ligação a íons metálicos (RGS1, GPS2, ARAP3, SOS2), exonuclease (EXOC3, EXOC9, ERI1, XRN1) e ligação ao DNA (ENDOG, DDIT3, E4F1, TBP, ESRRA, NFIL3). 53 4.4.1.2 Genes down-regulados As análises comparativas entre os tratamentos geraram uma lista com 503 genes down-regulados em resposta ao tratamento com LPS/MX. A figura 15 lista os 50 genes com maiores valores de fold change, alguns deles envolvidos no reparo de DNA (TDG, EYA3) e na progressão do ciclo celular (CCNA1, URGCP). Genes importantes na sinalização da resposta inflamatória celular, como o gene codificador do receptor Tool-like 2 (TLR2) e CD101, tiveram sua expressão reduzida após o tratamento com LPS/MX em relação às células apenas estimuladas com LPS. Além disso, o gene codificador da caspase 3 (CASP3), proteína importante na sinalização da morte celular programada, também teve sua expressão reduzida após exposição à MX. A descrição das funções de cada produto proteico codificado pelos 10 genes mais diferencialmente expressos está listada na tabela 3. Figura 15. Genes down-regulados mais diferencialmente expressos. Os cinquenta genes com maiores valores de fold change são listados. Tabela 3 Descrição dos dez genes down-regulados com maiores valores de fold change. down-regulados Fold change Gene Proteína Funçãoa -13.3 AHDC1 Proteína contendo motivo de ligação ao DNA at-hook Possui domínio de ligação ao DNA. -12.8 KIAA0232 Proteína não- caracterizada KIAA0232 Não-caracterizada 54 -12.2 CUL3 Culina-3 Componente do complexo BTB-CUL3-RBX1 de ubiquitina-proteína ligase o qual medeia a ubiquitinação e subsequente degradação proteassomal de proteínas-alvo. -12.2 PANK2 Pantotenato quinase 2 Pode ser o maior regulador da biossíntese de CoA. Cataliza a primeira reação irreversível para formação de Acetil-coA. -11.6 EYA3 Homólogo eyes absent 3 Promove o reparo de DNA pela desfosforilação de H2AX, promovendo o recrutamento de complexos de reparo de DNA contendo MDC1 -11.0 AKAP1 Precursor mitocondrial proteína âncora quinase- A 1 Liga-se à subunidades regulatórias da proteína quinase A do tipo I e II e as ancora na face citoplasmática da membrana externa da mitocondria. -110 GTSF1 Fator gametócito específico 1 Ligação ao DNA -10.5 ANKRD22 Proteína contendo domínio repetitivo de anquirina 22 Não-descrito -10.5 POLR1B Polipeptídeo B da RNA polimerase, 128kDa RNA polimerase dependente de DNA que catalisa a transcrição do DNA em RNA usando quatro ribonucleosídeos trifosfatos como substrato -9.9 ARPC5L Proteína relacionada à actina complexo 2/3 subunidade 5 Pode funcionar como um componente do complexo arp2/3, envolvido na regulação da polimerização da actina e juntamente com uma ativação do fator promotor de nucleação (NPF) mediar a formação de redes de actina a A descrição parcial das funções de cada gene foi obtida por consulta ao banco de dados UniProt. Semelhante ao observado para os genes up-regulados, a análise dos conjuntos de genes down-regulados também demonstrou a regulação da transcrição de genes relacionados a organelas celulares, em especial à mitocôndria (aproximadamente 11% dos genes), ao retículo endoplasmático (RE) (EHD4, IKBIP, NAPG, SEC11, TMX3), e à estruturas, como complexos de ribonucleoproteínas (HSPA1A, TEP1, MRPL10). A análise dos processos celulares revelou a regulação negativa de atividades como a ativação da transcrição (CITED4, FOXO4, YAF2), RNA polimerase (POLR1B, POLR1D, POLR1F), e ligação à ribonucleotídeos (ATP5D, DDX1, AKT3, RIPK1, PANK3, RPS6KB1). A análise das listas de genes up- e down-regulados permite a anotação de diversos genes relacionados ao reparo de DNA, descritos na tabela 4, e à mitocôndria (Tabela A3 do apêndice). 55 Tabela 4 Descrição dos genes up- e down-regulados relacionados ao reparo de DNA. Genes up-regulados Genes Fold change Descrição Sinônimos POLL 8.60 DNA polimerase lambda BETAN|POLKAPPA POLR2M 8.6 subunidade GRINL1A da RNA polimerase II DNA-directed GCOM1|GRINL1A|Gdown|Gdown1 ALKBH3 5.16 alkB, homólogo 3 de reparo de alquilação ABH3|DEPC-1|DEPC1|PCA1 ERCC8 3.44 proteína de reparo por excisão de DNA ERCC-8 CKN1|CSA|UVSS2 XRCC2 3.44 proteína de reparo de DNA XRCC2-like Genes down-regulados EYA3 -11,61 homologo 3 “eyes absent” TDG -8,70 DNA glicosilase timina-específica de mismatch G/T hTDG SHPRH -8,13 E3 proteína ubiquitina ligase SHPRH isoforma a bA545I5.2 XRCC3 -5,81 proteína de reparo de DNA XRCC3 CMM6 RRM2B -5,51 ribonucleosidio-difosfato redutase subunidade M2 B MTDPS8A|MTDPS8B|P53R2 BRCC3 -4,21 Deubiquitinase lisina-63-especifica BRCC36 BRCC36|C6.1A|CXorf53 DCLRE1A -4,07 reparo de DNA cross-link 1A PSO2 homologo PSO2|SNM1|SNM1A NSMCE2 -4,07 E3 SUMO-proteína ligase NSE2 C8orf36|MMS21|NSE2|ZMIZ7 PAPD5 -4,07 Proteína ligase 5 contendo domínio associada a PAP isoforma b TRF4-2 NEIL3 -3,77 endonuclease VIII-like 3 FGP2|FPG2|NEI3|hFPG2|hNEI3 C11orf30 -3,48 proteína EMSY EMSY RAD9A -3,48 homologo A da RAD9 RAD9 XPC -3,48 xeroderma pigmentosum, grupo de complementação C RAD4|XP3|XPCC NCK1 -3,48 Proteína adaptadora da região não-catalítica da proteína tirosina quinase NCK|NCKalpha|nck-1 DDX11 -3,19 Provavel RNA helicase ATP-dependente DDX11 CHL1|CHLR1|KRG2|WABS RAD51AP1 -3,19 Proteína 1 associada à RAD51 PIR51 56 4.4.2 Análise ontológica Para investigar mais detalhadamente as mudanças globais nas funções biológicas celulares após a exposição à MX, as tabelas de genes up- e down- regulados foram submetidas à análise de enriquecimento de ontologias gênicas pelo software DAVID (detalhes em Materiais e Métodos). 4.4.2.1 Análise de dados up-regulados A análise de GO dos genes up-regulados gerou a anotação de 74 processos biológicos descritos na Tabela A1 (Apêndice). Os processos de maior representatividade são mostrados na figura 16, dentre os quais: “regulação da transcrição” (29%), “transporte de proteínas” (10%), “processo catabólico de macromoléculas” (10%) e “metabolismo de RNA não-codante” (6%) agruparam maior número de genes. Figura 16.Processos biológicos enriquecidos com os genes up-regulados. Os processos apresentados foram selecionados de acordo com sua relevância e critérios de amenização de redundâncias dentre todos os listados na tabela A1 (Apêndice). Alguns dos genes up-regulados envolvidos na transcrição são relacionados à regulação negativa de p53 (RUNDC1, LETMD1, E4F1), fatores responsivos ao cálcio (EDF1) e inibição da atividade do complexo CREB/p300 (DDIT3, KLHDC2). Dentre os 57 genes listados no processo biológico transcrição, nota-se o envolvimento em atividades de modificação de histonas, regulação da transcrição e metilação de biopolímeros. A análise das funções moleculares desses genes demonstra a presença de domínios zinc finger_C2H2, caracterizado pela ligação ao DNA, KRAB (krueppel- associated box), relacionado à repressão transcricional da atividade de RNA polimerase I, II e III pela ligação à sequência de DNA, e o domínio SET conhecido por sua associação com metilação de histonas. Uma análise detalhada dos genes organizados no processo biológico “transporte de proteínas” permite observar a participação de genes na importação celular de proteínas (6 genes), secreção (6), exocitose (4) e transporte mediado por vesículas (9). O domínio SNARE coiled-coil, importante no reconhecimento e ligação de membranas, foi anotado na análise estrutural dos produtos listados, e é reconhecido por intermediar o processo de fusão de vesículas com a membranas- alvo. 4.4.2.2 Análise de dados down-regulados O total de 96 processos biológicos foram enriquecidos na análise dos dados down-regulados está listado na tabela A2 (Apêndice). Os processos biológicos de maior representatividade anotados foram “transcrição” (19%), “ciclo celular” (10%), “transporte intracelular” (9%), “processo metabólico de DNA” (7%) e “transporte mediado por vesículas” (7%) (Figura 17). 58 Figura 17. Processos biológicos enriquecidos com os genes down-regulados. Os processos apresentados foram selecionados de acordo com sua relevância e critérios de amenização de redundâncias dentre todos os listados na tabela A2 (Apêndice). O processo “transcrição” engloba genes relacionados à transcrição celular global (CITED, PPARA, PARG), remodelamento da cromatina (ACTR5, SMARCD2, RSF1, CBX2) e genes associados ao complexo CREBBP/CBP/p300 (CITED2, CITED4, NMI, MYC). Além disso, estão envolvidos na regulação positiva do processo metabólico de nucleobases, nucleotídeos, nucleosídeos e ácidos nucleicos (18 genes), regulação positiva da resposta ao estímulo (5) e do processo biossintético (17). Em relação ao processo “transporte mediado por vesículas” observa-se a presença de genes relacionados ao transporte de vesículas do Golgi (11), transporte do RE ao Golgi mediado por vesículas (5), e transporte mitocondrial (5). No geral, os produtos dos genes citados possuem domínios envolvidos com o tráfego, transporte e reconhecimento de vesículas/membranas-alvo, tais como o domínio SH3, VHS e α- adaptina. Além da análise de ontologia gênica, o software DAVID disponibiliza o acesso à organização dos dados analisados de acordo com seus envolvimentos em vias celulares canônicas, através do banco de dados KEGG. O resultado da análise de dados pelo KEGG está descrito na tabela 5. Os genes up-regulados enriqueceram 59 vias relacionadas à biossíntese de tRNA, o que corrobora os resultados observados na análise ontológica, com a anotação de processos relacionados a processamento de RNA não-codante. Os genes down-regulados foram organizados em seis vias celulares significativas, dentre elas “metabolismo de aminoácidos e ácidos graxos”. Os genes down-regulados envolvidos nas vias de degradação de aminoácidos, do metabolismo do propanoato e de ácidos graxos estão localizados em posições muito peculiares das vias, em sua maioria nos pontos de regulação da formação de malonil- CoA e outros intermediários relacionados a coenzimas, sugerindo uma possível alteração no balanço energético da célula (Figuras 18 A e C). A via da leucemia mieloide aguda foi enriquecida com genes down-regulados associados aos passos finais da via, especificamente relacionados à sinalização para a proliferação celular e transcrição de genes anti-apoptóticos. (Figuras 18 B). Apesar de não apresentar valores significativos, a via de receptores toll-like (down-regulada) e da doença de Hutington foram enriquecidas (Figura A3, Apêndice). Tabela 5 Vias canônicas anotadas através da análise do KEGG. up-reguladas Anotações do KEGG Genes p-Value hsa00970:Biossíntese de Aminoacyl- tRNA NARS2 SARS EARS2 TARSL2 LARS2 2,50E-02 down-reguladas hsa00280:Degradação de valina, leucina e isoleucina PCCA ACAA1 PCCB ACAA2 HIBCH HIBADH HMGCS1 1,10E-03 hsa00640: Metabolismo do Propanoato PCCA PCCB HIBCH ACACA ACSS2 1,00E-02 hsa05221:Leucemia mieloide aguda AKT3 CHUK MYC PIK3R3 CCNA1 RPS6KB1 2,00E-02 hsa00071:Metabolismo de ácidos graxos ACAA1 ACAA2 CPT2 CHKB ADH5 2,20E-02 hsa04350:Via de sinalização de TGF-β AMH MYC SKP1 ZFYVE16 SMAD5 PPP2CB RPS6KB1 3,00E-02 hsa00240:Metabolismo de pirimidina POLR3F RRM2B POLR1B UPP1 NME2 DTYMK POLR3D 4,30E-02 60 A 61 B 62 Figura 18. Vias celulares canônicas significativas anotadas pelo KEGG. (A) via do metabolismo de propanoato; (B) via da leucemia mielóide aguda e (C) via do metabolismo de valina, leucina e isoleucina. Quadros vermelhos genes down-regulados; azul, up-regulados. 4.4.3 Interações proteína-proteína (PPI) e análise de redes. Considerando a importância das interações proteicas na resposta celular global, uma análise de PPI foi. Os genes foram analisados no STRING e as redes foram organizadas com os produtos proteicos dos genes listados como up- ou down- C 63 regulados, e expandidas para a adição de proteínas relacionadas, como descrito em Material e Métodos. 4.4.3.1 Rede up-regulada 4.4.3.1.1 Rede base O levantamento transcriptômico comparativo revelou aumento na expressão de 683 genes descritos após o tratamento com LPS/MX. A lista dos transcritos foi submetida à análise de interações proteicas pelo programa STRING e avaliada através do programa Cytoscape. O resultado gerou uma rede de 120 produtos gênicos com 147 interações (Figura 19). Os nós em amarelo representam as proteínas-hubs, ou seja, aquelas que possuem maiores valores de centralidade da rede, e têm seus valores descritos na tabela 6. A rede base dos genes up-regulados foi submetida à análise pela ferramenta AlegroMCODE, contudo, nenhuma das sub-redes formadas apresentaram valores de score significativos. Figura 19.Rede base de interação biológica formada com transcritos up-regulados. Nós ressaltados em amarelo representam as proteínas-hubs da rede calculadas pela ferramenta de centralidades CentiScaPe (PLCG2, DNMT3B, TBP, AIMP3 e ECT2). 64 Tabela 6 Descrição das proteínas-hub da rede base up-regulada. Genes Fold change Node degree Descrição TBP 3.87 8.0 Fator de transcrição geral que funciona no core para ligação ao DNA do fator multiproteico TFIID ECT2 4.30 7.0 Fator de troca de nucleotídeo guanina (GEF) o qual cataliza a troca de GDP para GTP. AIMP3 5.16 7.0 Interage com ATM e ATR. A interação com ATM, independente de TP53, é induzida por danos ao DNA ocorridos durante estresse genotóxico ou crescimento celular. A interação com ATR é aumentada por radiação UV. PLCG2 3.19 7.0 Enzima crucial para a sinalização transmenbrana. DNMT3B 3.44 6.0 Requerida para a metilação de novo do genoma e é essencial para o estabelecimento do padrão de metilação durante o desenvolvimento. 4.4.3.1.2 Rede expandida Para uma visualização mais ampla da dinâmica celular alterada após o tratamento, a rede transcriptômica inicial foi expandida através do STRING, adicionando cerca de 100 novas proteínas à rede base. A rede final expandida englobou 427 produtos gênicos formando 2.759 interações (Figura 20). A análise da rede pelo CentiScape calculou as dez proteínas-hub com maiores valores de centralidade, ressaltadas na rede e descritas na tabela A4 (Apêndice). As proteínas listadas com maiores valores de centralidade da rede up-regulada estão enquadradas em duas principais atividades: (1) funções mitocondriais (NDUFS4, NDUFA2), e (2) transcrição. TAF1, TAF11 e TAF4 são ambas componentes do core de montagem do complexo transcricional TFIID, essencial nas respostas mediados ppor ativação e repressão transcricional de promotores. A proteína SHC1 está envolvida na sinalização e acoplament de fatores de transcrição, além de ter sido associda a sobrevivência celular em resposta ao estresse. KAT5 e CARM1 promovem alterações na estrutura da cromatina para processos transcricionais, e a NCOA3 se liga a receptores nucleares e estimula a transcrição de maneira semelhante aquela hormônio-dependente. 65 Figura 20. Rede expandida de interação biológica formada com transcritos up-regulados. Nós destacados representam as proteínas-hub da rede calculadas pelo CentiScaPe e descritas na tabela A4 (Apêndice). A rede expandida foi então submetida à análise de clusterização através da ferramenta AllegroMCODE. A rede foi fragmentada em seis sub-redes significativas organizadas na figura 21 A (ampliação dos clusters na Figura A1, apêndice). A sub- rede com maior score foi formado por 50 nós realizando 567 interações relacionados a funções mitocondriais, como a cadeia transportadora de elétrons (CTE) (NDUFS2, NDUFS4) (Figura 21 B). Os processos biológicos listados para cada sub-rede 66 formada, bem como os genes listados na tabela de dados envolvidos em cada processo são descritos na tabela 7. Figura 21. Delimitação das sub-redes contidas na rede expandida up-regulada. (A) delimitação de todas as sub-redes contidas na rede expandida; (B) Em destaque a sub-rede “I”, envolvida na cadeia transportadora de elétrons, com maior valor de score (11,34) obtido pela análise de clusterização da rede up-regulada. Em (A): I= Cluster 1- envolvido na cadeia transportadora de elétrons; II= cluster 2- organização de componentes celulares e regulação da expressão gênica; III= cluster 3- processamento de RNA não codante, processo catabólico de RNA; IV= Cluster 4- regulação do processo biossintético, regulação da morte celular programada; V= cluster 5- interação interespecífica entre organismos, transdução de sinal; VI= cluster 6 organização do centrossomo e formação de organelas. A descrição detalhada dos processos biológicos anotados para de cada sub-rede está listada na tabela 7. 67 Tabela 7 Processos biológicos significativos listados para cada sub-rede da rede expandida up-regulada anotadas pelo BiNGO. GO-ID Categoria de Processo Biológico (GO) p-Value corr p- Value ka fb Genesc S U B -R E D E 1 22900 Cadeia transportadora de elétrons 3,56E-59 8,92E-57 34 47 NDUFB3|NDUFB5|NDUFB7|NDUFB8|NDUFB9|NDUFS7|NDUFS6|NDUFS5 |NDUFS4|NDUFS8|NDUFS3|NDUFS2|NDUFS1|NDUFA4|NDUFA5|NDUFA 2|NDUFB11|NDUFB10|NDUFA8|NDUFA9|NDUFA6|NDUFA7|NDUFC2|NDU FA13|NDUFA10|NDUFA12|NDUFA11|NDUFV3|MT- ND4|SDHB|SDHC|NDUFV1|NDUFV2|MT-ND1 45333 Respiração celular 1,03E-51 8,64E-50 30 47 NDUFB3|NDUFB5|NDUFB7|NDUFB8|NDUFB9|NDUFS7|NDUFS6|NDUFS5 |NDUFS4|NDUFS8|NDUFS3|NDUFS2|NDUFS1|NDUFA4|NDUFA5|NDUFA 2|NDUFB10|NDUFA8|NDUFA9|NDUFA6|NDUFA7|NDUFC2|NDUFA10|NDU FV3|MT-ND4|SDHB|SDHC|NDUFV1|NDUFV2|MT-ND1 S U B -R E D E 2 16043 Organização de compartimentos celulares 4,96E-23 1,27E-20 79 132 BMI1|TBP|CDC16|PTTG1|CBX1|CBX8|CTNNB1|CUL3|MAX|KDM1A|GTF2 A1|GTF2A2|ANAPC1|ANAPC2|RBBP4|ANAPC5|MTA2|RXRA|TAF4B|RCO R1|ANAPC4|DYNLT3|HMG20B|RB1|MBD3|MBD2|RBBP7|GTF2B|C20ORF 20|TAF11|TAF10|TAF13|TAF12|HIF1A|EP300|JUN|ANAPC7|ANAPC16|HA US6|ANAPC13|ANAPC10|TRRAP|ANAPC11|CCNG2|FBXW7|CDYL|HIST1 H4A|BCL2|BCL3|HSPA4|FBXO4|DNMT3B|CHD4|CHD3|KAT2A|TAF2|TAF1 |TAF4|KAT2B|VHL|TAF5|CREB1|TAF7|CREBBP|SMAD4|SMAD3|CDC23|S MAD2|CDC26|CDC27|CCNB1|HDAC2|HDAC1|HIST1H3A|HIST1H3B|PHF2 1A|DNMT1|CHAF1A|RERE 70647 Modificação proteica por conjugação ou remoção de pequenas proteínas 5,43E-21 8,13E-19 30 132 ANAPC16|COPS5|ANAPC13|ANAPC10|CDC16|TRRAP|ANAPC11|CBX8|R BX1|CUL3|FBXW7|BCL2|FBXO4|FBXW11|CUL1|KAT2A|ANAPC1|ANAPC2 |ANAPC5|VHL|DDB1|ANAPC4|CDC23|UBE2H|SKP1|CDC26|CDC27|TAF10 |TRIM33|ANAPC7 10468 Regulação da expressão gênica 1,06E-20 1,47E-18 81 132 BMI1|TBP|NFKB1|CBX8|CITED2|CTNNB1|KDM1A|ZGPAT|MAX|SAP30|FO S|SIN3B|SIN3A|GTF2A1|HIF1AN|GTF2A2|SAP30L|MYC|RBBP4|YY1|MTA2 |RELA|RCOR1|TAF4B|RXRA|MTA1|HMG20B|RB1|MBD3|MBD2|RBBP7|GT F2B|C20ORF20|TAF11|TAF10|TAF13|UHRF1|TAF12|HIF1A|EP300|NCOA3 |TRIM33|JUN|HCFC1|NFKBIA|EGLN1|TRRAP|CDYL|NR1D2|BCL2|BCL3|T CEA2|DNMT3B|CHD4|CHD3|KAT2A|TAF2|TAF1|TAF4|KAT2B|TAF3|VHL|C REB1|TAF8|TAF7|CREBBP|SMAD4|SMAD3|SMAD2|STAT3|CCNB1|HDAC 2|SP1|HDAC1|IKBKG|PHF21A|DNMT1|TCEB1|IKBKB|CHAF1A|RERE S U B - R E D E 3 34470 Processamento de ncRNA 6,30E-11 2,77E-09 10 18 EXOSC8|EXOSC9|EXOSC6|EXOSC7|EXOSC4|EXOSC5|EXOSC2|EXOSC 3|EXOSC1|CDK5RAP1 68 90304 Processamento metabólico de ácidos nucleicos 1,61E-10 4,73E-09 16 18 ZFP36|UPF2|EXOSC8|EXOSC9|EXOSC6|EXOSC7|EXOSC4|EXOSC5|EX OSC2|EXOSC3|EXOSC1|DCP1B|DCP2|LSM4|CDK5RAP1|XRN1 6401 Processo catabólico de RNA 1,85E-08 3,25E-07 7 18 ZFP36|UPF2|DCP1B|DCP2|EXOSC7|EXOSC4|XRN1 S U B -R E D E 4 9889 Regulação de processos biossintéticos 6,31E-19 2,06E-16 81 134 BMI1|MYOD1|TAF1A|SNIP1|MITF|PAX5|NFKB1|CBFA2T2|BUD31|CITED2| CTNNB1|MAX|FOS|SIN3B|NOD2|SIN3A|PRMT7|HIF1AN|E4F1|SAP30L|MY C|BRD8|HSP90AA1|RCOR1|RXRA|CDK8|TP53|CCNC|HMG20B|RB1|IL6R| ESR2|DDIT3|SUV420H2|UHRF1|HIF1A|EP300|EDF1|PIAS2|CARM1|ZNF2 74|TNF|HCFC1|EGLN1|TCF7L2|ARNT|ATF2|PLAGL1|LIF|CDYL|NR1D2|BC L2|BCL3|KDM3A|DNMT3B|TERF1|KAT2A|IL6|ESRRA|KAT2B|CREB3|KLF9 |VHL|CREB1|STAT1|KAT5|GPS2|EIF4E|ATF3|SP1|HDAC1|DBP|NTRK1|IK BKG|PCNA|DNMT1|MTOR|IKBKB|CHAF1A|C15ORF42|RERE 43067 Regulação da morte celular programada 8,51E-15 8,83E-13 41 134 TNF|MITF|NFKB1|BCL2L2|BCL2L1|TCF7L2|CTNNB1|CTNNBL1|CITED2|B TK|ATF2|CUL3|PLAGL1|CUL2|NOD2|CUL5|SIN3A|BCL2|BCL3|CUL1|TER F1|KAT2A|IL6|VHL|CREB1|RXRA|TP53|IL6R|ESR2|STAT1|RPS6|DDIT3|C UL4A|HDAC1|BBC3|GSK3B|NTRK1|IKBKG|MAPK9|MAPK8|IKBKB S U B -R E D E 5 51171 Regulação do processo metabólico de componentes nitrogenados 2,51E-24 4,38E-22 97 157 MYOD1|SNIP1|ASCC1|CTNNB1|CITED2|KDM1A|SIN3B|SIN3A|WWP1|INS R|EGFR|RCOR1|TAF4B|RXRA|RELA|YY1|RELB|MTA1|HMG20B|DDIT3|JU P|EP300|HIF1A|TRIM33|JUN|EDF1|PIAS2|ERBB2|NFKBIA|TRRAP|ATF1|A TF2|ARNT|PLAGL1|LIF|FBXW7|DNMT3B|ESRRA|CREBBP|SMAD4|SMAD 3|SMAD2|TEAD3|KAT5|FOXP1|ATF3|HDAC1|NTRK1|IKBKG|PCNA|DNMT 1|HIVEP1|MTOR|IKBKB|TAF1A|PAX5|NFKB1|NFKB2|MAX|SAP30|FOS|PB XIP1|HSF2|SHC1|MYC|BRD8|ZFP36|HSP90AA1|CDK8|ESR1|CCNC|ESR2| RB1|MBD2|C20ORF20|ACVR2B|NCOA3|CARM1|TNF|TRIB3|HCFC1|TCF7 L2|IGF1R|PRDM15|NR1D2|BCL3|TERF1|KAT2A|IL6|KAT2B|CREB3|CREB 1|STAT1|STAT3|SP1|SP2|PHF21A 44419 Interações interespecíficas entre organismos 5,82E-21 6,47E-19 35 157 GRB2|COPS6|BTRC|HCFC1|NFKBIA|ITGB1|SRC|CUL2|WWP1|INSR|PIK3 R1|CUL1|KAT2A|KAT2B|CREB3|CREB1|RELA|RXRA|RCOR1|DDB1|CREB BP|SMAD3|TNFRSF14|RB1|STAT1|KAT5|STAT3|EP300|EIF4E|CUL4A|SP 1|HDAC1|JUN|IKBKG|CARM1 69 23060 Transmissão de sinal 6,47E-13 3,44E-11 67 157 IL6ST|BTRC|SNIP1|NFKB1|NFKB2|BTK|CTNNB1|FOS|EIF4EBP1|WWP1|C SF2RB|SHC1|MICAL1|INSR|CHUK|BRD8|EGFR|ZFP36|HSP90AA1|RELA| ESR1|MTA1|RB1|IL6R|SOCS5|ESR2|ACVR2B|HIF1A|EP300|JUN|MAPK9| MAPK8|NKIRAS2|TNF|GRB2|CCR1|ERBB2|NFKBIB|NFKBIA|TRRAP|SRC| ATF1|ATF2|IGF1R|HIST1H4A|SOS1|SOS2|BCL3|APBA2|INPP5D|TRIP10| PIK3R1|TERF1|IL6|CREB1|CREBBP|SMAD4|SMAD2|TEAD3|STAT1|STAT 3|NTRK1|PLCG2|IKBKG|PCNA|MTOR|IKBKB S U B -R E D E 6 51297 70925 Organização do centrossomo Formação de organelas 8,08E-18 8,27E-13 9,22E-16 2,75E-11 9 8 14 14 HAUS4|HAUS3|HAUS6|HAUS5|CEP135|HAUS2|HAUS1|HAUS7|HAUS8 HAUS4|HAUS3|HAUS6|HAUS5|HAUS2|HAUS1|HAUS7|HAUS8 48285 Fissão de organelas 1,59E-07 1,76E-06 8 14 HAUS4|HAUS3|HAUS6|HAUS5|HAUS2|HAUS1|HAUS7|HAUS8 a- Número total de proteínas encontradas na rede de transcritos que fazem parte da ontologia gênica específica b- Número total de proteínas pertencentes à sub-rede c-genes representados em negrito são encontrados nas tabelas iniciais de dados, não sendo adicionadas pela expansão da rede. 70 Foi possível observar o aumento de proteínas envolvidas com regulação, iniciação, manutenção e parada de ciclo celular. A organização de proteínas e do citoesqueleto é observada em diferentes sub-redes. A regulação da expressão gênica é representada por diferentes processos, distribuídos em mais de uma sub-rede, e sob rotas distintas, como degradação de RNA e inativação de fatores de transcrição. As alterações também ocorrem a nível de biogênese e montagem de complexos macromoleculares e proteicos, e em vias de sinalização celular por proteínas quinases. O metabolismo proteico e suas modificações pós-traducionais são processos celulares regulados positivamente após tratamento com MX. 4.4.4- Perfil trancriptômico de genes DOWN regulados 4.4.4.1 Rede base As interações entre as proteínas down-reguladas geraram uma rede de 171 nós e 180 interações (Figura 22). A análise da ferramenta AllegroMCODE não demonstrou a formação de sub-redes significativas para a rede base down-regulada. Os nós com maiores valores de node degree são destacados em amarelo e descritos na tabela 8. É possível observar que as proteínas-hub da rede base estão relacionadas ao crescimento celular, adesão, ciclo e diferenciação celular, o que sugere um comprometimento da progressão de ciclo e do status celular. Figura 22.Rede base de interação biológica formada com transcritos down-regulados. Nós apresentados em amarelo representam as proteínas-hubs da rede calculadas pela ferramenta de centralidades CentiScaPe (HSPA8, YES1, KRR1, MYC, SKP1). 71 Tabela 8 Descrição das proteínas-hubs da rede base down-regulada 4.4.4.2. Rede expandida A rede expandida final englobou 417 nós e 2.756 interações (Figura 23). As proteínas-hubs são mostradas em amarelo e descritas na tabela A4 (Apêndice). Interessante notar que a proteína Myc foi calculada como o nó com maior número de interações em ambas as as redes down-reguladas geradas (base e expandida), indicando a sua relevância para a resposta celular observada. Dentre as proteínas- hub listadas, seis são componentes da mitocondria e desempenham papel nas atividades energéticas da organela, como CTE e fosforilação oxidativa. As proteínas ATP5D e ATP5H são subunidades do complexo V da CTE, responsável pela sítese de ATP. As proteínas PPP2CB e CHUK estão envolvidas na via de sinalização de NF- Kb, e participam da ativação do fator transcricional e, consequentemente da reposta inflamatória. A proteína SKP1 é componente essencial do complexo responsável pela ubiquitinação de proteínas envolvidas na progressão do ciclo celular, transdução de sinal e transcrição, processos biológicos enriquecidos com a análise de GO. Genes Fold change Node degree Descrição MYC -3,83 9 Ativa a transcrição de genes relacionados ao crescimento KRR1 -3,67 8 Requerido para a biogênese da porção 40S do ribossomo SKP1 -3,67 7 Componente essencial do complexo ubiquitina ligase SCF, responsável pela ubiquitinação de proteínas envolvidas na progressão do ciclo celular, transdução de sinal e transcrição. HSPA8 -9,22 7 Age como repressor transcricional. Se liga ao lipopolisacarídeo bacteriano (LPS) e medeia a indução da resposta inflamatória induzida por LPS, incluindo a transcrição de TNF por monócitos. YES1 -6,38 6 Proteína tirosina quinase não-receptora envolvida na regulação do crescimento celular, sobrevivencia, adesão célula-célula, remodelamento do cioesqueleto e diferenciação. 72 Figura 23. Rede de interação PPI expandida down-regulada. Nós destacados em amarelo representam as proteínas-hub da rede, calculadas pela ferramenta CentiScaP. A descrição detalhada das proteínas- hubs são descritas na tabela A4 (Apêndice). A fragmentação da rede através da ferramenta AllegroMCODE resultou na delimitação de cinco sub-redes com valores de score significativos, submetidas à análise ontológica pelo BiNGO (Figura 24 A). A sub-rede com maior score foi formada por 70 proteínas agrupadas pelo envolvimento em funções mitocondriais, como fosforilação oxidativa (NDUFB7), geração de precursores metabólicos e energia (NDUFA13, NDUFA9) e a síntese de ATP acoplada ao transporte de elétrons (ATP5D, ATP5H) (Figura 24 B). As sub-redes 2 e 5 não foram enquadradas em processos 73 biológicos significativos. Processos relacionados à progressão de ciclo celular, metabolismo e biossíntese de ácidos nucleicos, reparo de danos ao DNA, bem como regulação da expressão gênica foram significativamente down-regulados em diferentes sub-redes analisadas. Igualmente representativos, processos relacionados ao controle e sinalização para morte celular, e processamento de ribonucleosídeo trifosfatado foram verificados após tratamento, corroborando os resultados obtidos com o enriquecimento de processos biológicos pelo DAVID. O detalhamento dos processos listados para cada sub-rede formada na rede down-regulada está descrito na tabela 9. Figura 24. Delimitação das sub-redes contidas na rede expandida down-regulada. (A) delimitação de todas as sub-redes contidas na rede expandida; (B) Em destaque a sub-rede “I” com maior valor de score (11,74) obtido pela análise de clusterização da rede down-regulada. A descrição dos processos biológicos de cada sub-rede está listada na tabela 8. I= cluster 1- fosforilação oxidativa, geração de metabólitos energéticos e energia; II=Cluster 2- anotação não significativa; III= cluster 3- replicação do DNA e resposta ao estresse; IV= Cluster 4- regulação da expressõ gênica; V= cluster 5- anotação não significativa; VI= cluster 6 – processo metabólico de ribonucleosídeo trifosfatado. Nós em amarelo representam as proteínas-hub da rede. Curiosamente, ambas as redes up- e down-reguladas apresentaram sub-redes e proteínas-hubs relacionadas a funções mitocondriais, o que será discutido posteriormente. 74 Tabela 9 Processos biológicos significativos anotados pela análise da rede down-regulada atrevés da ferramenta BiNGO. GO-ID Categoria de Processo Biológico (GO) p-Value corr p- Value ka fb Genesc S U B -R E D E 1 6119 Fosforilação oxidativa 1,27E-63 1,03E- 60 38 65 ATP5D|NDUFB3|NDUFB5|NDUFB7|NDUFB8|NDUFB9|ATP5 B|NDUFS7|NDUFS6|NDUFS5|NDUFS4|NDUFS8|ATP5L|NDU FS3|ATP5I|NDUFS2|ATP5H|NDUFS1|ATP5J|NDUFA4|NDUF A5|ATP5J2|NDUFA2|NDUFB10|NDUFA8|NDUFA9|NDUFA6|N DUFA7|ATP5F1|NDUFC2|NDUFA10|NDUFV3|MT- ND4|NDUFV1|NDUFV2|ATP5C1|ATP5A1|MT-ND1 6091 Geração de precursores metabólicos e energia 1,46E-54 5,94E- 52 44 65 NDUFB3|ATP5D|NDUFB5|NDUFB7|NDUFB8|NDUFB9|ATP5 B|NDUFS7|NDUFS6|NDUFS5|NDUFS4|IDH3G|NDUFS8|ATP 5L|NDUFS3|ATP5I|ATP5H|NDUFS2|NDUFS1|ATP5J|NDUFA4 |NDUFA5|ATP5J2|NDUFA2|NDUFB11|NDUFB10|NDUFA8|ND UFA9|NDUFA6|NDUFA7|ATP5F1|NDUFC2|IDH3B|NDUFA13| NDUFA10|NDUFA12|NDUFA11|NDUFV3|MT- ND4|NDUFV1|NDUFV2|ATP5C1|ATP5A1|MT-ND1 42776 Síntese mitocondrial de ATP acoplada ao transporte de elétrons 1,80E-17 9,72E- 16 10 65 ATP5D|ATP5J2|ATP5B|ATP5F1|ATP5C1|ATP5L|ATP5A1|ATP 5I|ATP5H|ATP5J S U B -R E D E 3 7049 Ciclo celular 1,71E-10 8,12E- 09 37 154 DBF4|BTRC|DTYMK|RPS6KB1|CDC34|FOXO4|RPA1|CUL3|N CAPH|FBXW7|SIN3A|MCM7|HBP1|TUBG1|CCNA1|FBXW11| CDC7|TAF2|CDC6|YEATS4|TAF1|SGOL2|ANXA1|SKP2|SMA D3|MCM2|RB1|MCM3|CDK2|WEE1|UHRF1|EP300|PSME1|TI MELESS|CKS2|FBXO31|CHAF1A 6260 Replicação de DNA 3,47E-14 5,18E- 12 23 154 CDC7|CDC6|DBF4|HUS1|RAD9A|MCM2|RRM2B|CDC34|MC M3|CDK2|MCM5|ORC1L|RPA3|RPA1|RPA2|ORC2L|ORC3L|S IN3A|MCM7|ORC4L|ORC6L|ORC5L|CHAF1A 6950 Resposta ao estresse 8,51E-14 9,86E- 12 61 154 PPARA|TLR2|RPS6KB1|TLR4|NFKB1|FOXO4|CITED2|S1PR 3|MAX|FOS|CASP3|MYD88|MCM7|SLC2A1|TICAM1|CSF3R| CHUK|HSP90AA1|BRCC3|NEIL3|RELA|RAD9A|MCM2|UHRF 1|EP300|HIF1A|XPC|TIMELESS|EIF2S1|MAPK9|MAPK8|TF|C CL2|TNF|NMI|HUS1|EGLN1|HSPA1A|RRM2B|RPA3|ARNT|R PA1|RPA2|BCL3|APEX1|HSPA8|TAF1|RAD51AP1|VHL|NFRK B|CREBBP|ANXA1|SMAD3|STAT3|TFRC|IKBKG|TDG|FBXO3 1|DNAJB1|CHAF1A|HDAC7 75 S U B -R E D E 4 10468 Regulação da expressão gênica 5,53E-21 1,20E- 18 98 176 MYOD1|IMPACT|CBX4|RPS6KB1|CBX2|FOXO4|KDM1A|SIN 3B|SIN3A|SMARCD2|MED26|SATB2|RARG|MTA2|RCOR1|ST RN3|YY1|RELA|RELB|MTA1|PPARGC1B|UHRF1|HIF1A|PIAS 3|JUN|EIF2S1|MED18|MAPK9|RNF20|SIVA1|TRAF2|PAM|NF KBIA|TADA1|TRRAP|ARNT|TAF2|TAF1|YEATS4|TAF4|CREB BP|TAF7|SMAD3|UIMC1|HDAC2|ATF3|HDAC1|RNF4|IKBKG| DNMT1|MTOR|IKBKB|CHAF1A|ZNF385A|HDAC7|PPARA|RS F1|NFKB1|NFKB2|SAP30|MAX|FOS|HIF1AN|TICAM1|MKL2| MYC|ZFP36|CTBP1|RBBP4|ESR1|TP53|RB1|MCM2|MBD3|M CM3|RBBP7|MBD2|MCM5|CDK2|TAF10|TAF12|NCOA3|RIPK 1|CARM1|TNF|EGLN1|TNFRSF1A|PPP2CA|BCL3|CHD4|CHD 3|VHL|CREB1|STAT3|MED30|SP1|SETD7|TEP1 43067 Regulação da morte celular programada 3,51E-08 1,06E- 06 38 176 SIVA1|TRAF2|TNF|CCL2|PPP2R5C|CBX4|NFKBIA|NFKB1|R PS6KB1|HSPA1A|RRM2B|CUL3|CASP3|SIN3A|PPP2CA|CAS P8|TICAM1|BCL3|PIK3CA|RASA1|CUL1|RARG|VHL|CREB1| RELA|TP53|ESR1|SMAD3|FADD|HDAC1|RIPK1|JUN|IKBKG| RIPK3|TEP1|MAPK9|MAPK8|IKBKB S U B -R E D E 6 9142 Processo biossintético de ribonucleotídeo 2,43E-12 1,14E- 10 8 10 ATP5J2|NME1|ATP5B|ATP5C1|ATP5L|ATP5A1|ATP5I|ATP5J 9199 Processamento metabólico de ribonucleosídeo trifosfatado 5,23E-12 1,90E- 10 8 10 ATP5J2|NME1|ATP5B|ATP5C1|ATP5L|ATP5A1|ATP5I|ATP5J a- Número total de proteínas encontradas na rede de transcritos que fazem parte da ontologia gênica específica b- Número total de proteínas pertencentes à sub-rede c-genes representados em negrito são encontrados nas tabelas iniciais de dados, não sendo adicionadas pela expansão da rede. 76 4.4.5 Validação por PCR em tempo real Os resultados obtidos pelo pirosequenciamento de RNA foram validados através da técnica de PCR quatitativa em tempo real. Para validação foram selecionados genes de acordo com suas funções celulares e relevância na resposta celular observada. O gene CCL2 codifica a citocina MCP-1 cujos níveis proteicos foram regulados negativamente após o tratamento; o gene CYB5R4 está relacionado à sinalização de estresse de retículo endoplasmático; MYC codifica a proteína Myc envolvida na regulação do crescimento e apoptose celular; NMI e MINA são genes responsivos à ativação transcricional por Myc; ESRRA por seu envolvimento no metabolismo energético celular; DDIT3 codifica a proteína CHOP, indispensável para a sinalização do estresse de retículo; e RPS6KC1 por seu envolvimento na sinalização celular. Os resultados são mostrados na figura 25 e demonstram que todos os genes avaliados apresentaram o mesmo padrão de expressão após os tratamentos em ambas as metodologias, confirmando a acurácia dos resultados obtidos com o sequenciamento. Figura 25.validação de resultados por PCR em tempo real. Os genes selecionados foram quantificados por PCR em tempo real e apresentaram aumento ou diminuição de expressão semelhante ao padrão observados com o sequenciamento. 77 4.4.6 MX induz parada de ciclo celular em G1. A formação de adutos no DNA pode comprometer a leitura das fitas por polimerases e afetar transcrição e duplicação do DNA, processos de extrema importância para progressão de ciclo e manutenção celular. Uma vez que a ligação da MX ao sítio abásico forma um aduto, e uma vez elevada a representatividade do processo biológico do ciclo celular, down-regulado, foi avaliada a progressão do ciclo celular após exposição à MX. Os resultados revelaram que o tratamento apenas com LPS não induz alterações significativas na progressão do ciclo celular das células U937. Contudo, o tratamento com LPS/MX induz aumento da população de células na fase G1, e redução sutil da população na fase G2/M, quando comparado às células tratadas apenas com LPS (Figura 26). Esses resultados sugerem que o tratamento com MX sinaliza para parada de ciclo entre as fases G1/S sem, contudo, comprometer a viabilidade celular. Figura 26. Ensaio de mensuração de ciclo celular por citometria de fluxo. Os valores foram analisados pelo teste t estatístico, *p<0,05. 4.4.7 MX pode induzir disfunção mitocondrial, estresse de retículo e autofagia Os resultados da análise das PPI demonstraram que ambas as redes gênicas up- e down-reguladas foram formadas com proteínas relacionadas a funções mitocondriais, organizadas nas sub-rede de maiores scores. A maioria dos nós foram envolvidos em complexos da CTE, atividades de fosforilação oxidativa, e organização 78 mitocondrial. Adicionalmente, algumas proteínas e processos biológicos envolvidos na função do RE e ativação de autofagia foram listados (Tabela 10). O gene DDIT3, que codifica a proteína CHOP (DNA damage-inducible transcript 3 protein/C/EBP- homologous protein), principal marcador do estresse de retículo, está up-regulado após o tratamento com LPS/MX comparado ao tratamento com LPS, o que sugere a ativação da cascata de sinalização do estresse no RE. Os resultados de anotações de GO também propõem evidências que suportam essas hipóteses. A regulação positiva de genes relacionados ao citoesqueleto e localização de macromoléculas, transdução de sinal mediado por GTPases, regulação do transporte de calcio e modificações de proteinas são processos biológicos relacionados à comunicação mitocondria-RE e sinalização de autofagia. A regulação negativa de processos biológicos como transporte de vesículas do retículo ao Golgi, transporte de vesículas do Golgi e transporte intracelular são negativamente modulados em situações de estresse do RE. Os resultados do transcriptoma também demonstram a regulação positiva de transritos importantes relacionados às vias autofágicas, como Autophagy-related protein 2 homolog A (ATG2), Cysteine protease ATG4C (ATG4C) and Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B (MAP1LC3B). Além disso, genes que codificam proteínas dos compartimentos lisossomais e processos catabólicos de macromoléclas foram mais expressos no tratamento LPS/MX, o que sugere a ativação da formação de lisossomos e degradação de macromoléculas, características de autofagia. 79 Tabela 10. Descrição dos genes relacionados a vias autofágicas e de estresse de retículo. Genes Função Fold change up-regulados A u to fa g ia ATG2A Requerida para a formação do autofagossomo e regulação da morfologia de lipídeos. 10,32 MAP1LC3B Proteína ubiquitina-like modificada envolvida na formação de vacúolos autofagossomais (autofagossomos). Desempenham papel na mitofagia contribuindo para a regulação da quantificação e qualidade mitocondriais através daeliminação da mitocôndria ao nível basal para reestabelecer as necessidades energéticas celulares sob situações de estresse como jejum prolongado. 3,78 ATG4C Cisteína protease requerida para o transporte de vacúolos no citoplasma. Requerida para a resposta autofágica apropriada sob situações de estresse como jejum prolongado. 3,44 E s tr e s s e d e R E DDIT3 Fator transcricional multifuncional na resposta ao estresse do retículo. Desempenha papel essencial na resposta a uma variedade de estresses celulares, induz parada no ciclo celular e apoptose em resposta ao estresse do retículo. 4,3 CYB5R4 Citocromo b5-NADH redutase envolvida na via de resposta ao estresse de retículo endoplasmático. Tem papel crítico na proteção de células beta pancreáticas contra estresse oxidativo, possivelmente por proteger a celula contra o excesso dae produção de ERRO. 4,01 SCAMP5 Age provavelmente em cooperação com a maquinaria SNARE. Pode estar envolvida no acúmulo da proteína poliglutamina (polyQ) huntingtina (HTT) em casos de estresse no retículo pela inibição da via de endocitose. 3,01 80 4.4.8 Modulação da resposta inflamatória A análise ontológica das listas de genes up- e down-regulados, obtidas através do DAVID organizou um grande número de genes em funções biológicas relacionadas à imunidade (Tabela A5 do apêndice). As vias celulares envolvidas na reposta imunológica enriquecidas com genes up-regulados não obtiveram valores significativos. Os resultados anotados com genes down-regulados foram, em sua maioria, correlacionados a fatores inflamatórios importantes, como NF- κB, TNF-α e interferon, cujas vias celulares foram consideradas down-reguladas após o tratamento com MX. Curiosamente, a MX também modulou a resposta inflamatória pela via de apresentação de patógenos, down-regulando as respostas celulares a moléculas bacterianas e a via de sinalização mediada por receptores toll-like (TLR2, TLR4, TICAM1). Para observar o impacto da MX na cascata de sinalização de NF-κB, foi observada a localização celular da subunidade p65, através de imunofluorescência, após os tratamentos. Os resultados podem ser observados da figura 27 A e demonstram que o tratamento com LPS induz a translocação da subunidade do citoplasma para o núcleo da célula. O tratamento das células com LPS/MX demonstrou uma redução sutil na intensidade da fluorescência no núcleo da célula, o que sugere uma redução da concentração da subunidade no compartimento nuclear. Para observar se a alteração na localização celular tem relação com a prote´ína APE1, sua localização celular também foi analisada. Os resultados são mostrados na figura 27 B. Em situações endógenas, a proteína APE1 localiza- se predominantemente no núcleo das células U937, como observado na figura. Após estimulação com LPS durante 24 h, APE1 transloca-se para o citoplasma, mantendo-se em ambos os compartimentos celulares. Contudo, após exposição das células estimuladas à MX por 4 h a fluorescência da APE1 no citoplasma foi diminuída quando comparada à intensidade da marcação observada nas células apenas estimuladas com LPS. Esses resultados sugerem que o tratamento com MX induz alterações na sinalização celular por alterar a translocação de ambas as proteínas analisadas, e sugere uma possível co-relação entre a localização celular de p65 e APE1, e a redução da resposta inflamatória. 81 Figura 27.Detecção da localização celular de p65 e APE1 por imunofluorescência. (A) marcação da subunidade p65 de NF-κB; (B) marcação da proteína APE1. A fluorescência verde representa a proteína analisada; em azul a marcação do compartimento nuclear pelo DAPI. A B 82 4.4.9 A inibição do reparo pela MX reduz a produção cinética de citocinas e quimiocinas. Uma vez observado que o tratamento com LPS/MX regula negativamente a ativação de NF-κB e as vias responsivas ao TLR após 24 h de estimulação com LPS, foi investigado se tal modulação é uma consequencia de mudanças celulares globais ou se acompanha a sinalização da resposta inflamatória. Para isso, foi mensurada a produção cinética de citocinas e quimiocinas em ambos os tratamentos em tempos diferentes. Os resultados mostraram que, como esperado, o tratamento com LPS induziu a produção de citocinas e quimiocinas quando comparada àquela obtida em células não- estimuladas, e que a co-incubação com LPS/MX reduz significativamente os níveis de IL-8 após 4 h de tratamento, e de IL-6, IL-8, MCP-1 e TNF-α após 6 h de tratamento (teste t pareado Two-tailed) (figura 28). A redução de citocinas e quimiocinas após 4 h de estimulação com LPS sugere que o tratamento com MX afeta a sinalização inflamatória de produção de citocinas e quimiocinas também em etapas iniciais da cascata inflamatória, sugerindo um envolvimento na regulação de mecanismos transcricionais. 83 Figura 28. Cinética de produção de citocinas. Os níveis proteicos de citocinas e quimiocinas foram mensurados após 2 h, 4 h e 6 h de tratamento pela plataforma BioPlex. O teste estatístico t-student pareado two-tailed foi utilizado. *p<0,05. 4.4.10 Espécies reativas de oxigênio O estresse oxidativo tem papel importante na instalação e manutenção da resposta inflamatória no organismo. Dentre as espécies reativas, as ERO tem função de moduladores da inflamação e, em decorrência disso, foram monitoradas após os tratamentos celulares. Em contraponto ao esperado, a 84 exposição celular ao LPS não induziu aumento da intensidade de fluorescência do DCFH-DA, assemelhando os valores de ERO aos observados nas células sem indução. O grupo tratado com LPS/MX demonstrou redução quantitativa de ERO nas células, totalizando valores abaixo dos observados no grupo estimulado com LPS (Figura 29). Esses resultados indicam que a inibição do reparo de DNA e/ou a redução da expressão de citocinas pela MX reduz a produção de espécies reativas na célula. Figura 29. Medição de ERO por DCFH-DA.. Os resultados foram analisados pelo teste estatístico t-student (Two-tailed) e valores de p<0.05 foram considerados estatísticos. *p<0,05. 4.4.11 Expressão de APE1 Alterações na quantidade da proteína APE1 poderiam ser suficientes para alterar os níveis de moduladores inflamatórios. Diante disso, tornou-se necessária a mensuração da disponibilidade da proteína APE1 após exposição à MX. Os resultados mostraram que o tratamento com LPS e, paralelamente com MX não alterou a disponibilidade da proteína APE1 (37kDa) nas células, mantendo os seus níveis semelhantes ao controle (Figura 29 A). Nas amostras controle não-tratadas e LPS, o imunoblot para APE1 revelou duas bandas, uma de 37 kDa referente a proteína APE1 completa, e outra de aproximadamente 33 kDa provavelmente indicativa de clivagem. Com o tratamento LPS/MX a banda de APE1 clivada não foi detectada. A nível transcricional, a exposição ao LPS induziu a expressão de mRNA de APE1 nas células de maneira significativa quando comparado ao controle não-tratado. O tratamento das células com MX por 4 h foi capaz de reverter os níveis de RNA mensageiro de APE1 aos valores celulares basais (Figura 29 C). 85 A B C Figura 30. Quantificação de APE1. Após tratamento, as proteínas totais e o mRNA foram extraídos e os níveis de APE1 foram medidos. Em (A) western BLOT; (B) representação gráfica da densitometria das bandas com a média de três experimentos e (C) quantificação de mRNA de APE1. *p<0,05 t-student 86 5. DISCUSSÃO Estudos têm demonstrado o envolvimento de proteínas do reparo por excisão de bases (BER) em respostas imunes (SILVA et al. 2011; MABLEY et al. 2005; TOUATI et al., 2006; GUOPING et al., 2012), e relatado sua capacidade de participar e coordenar passos da via inflamatória por envolvimento direto com a sinalização global e ativação transcricional de promotores (AMENTE et al., 2010; ROSADO et al., 2013; BA et al., 2014). A APE1 é uma proteína multifuncional que desempenha papel essencial na via BER, reparando sítios abásicos gerados espontaneamente ou em decorrência da excisão de bases oxidadas ou alquiladas por DNA glicosilases, como a OGG1 (DEMPLE e HARRISON, 1994; IZUMI et al., 2003; MITRA et al., 2002). Apesar de sua notável participação na ativação redox de fatores de transcrição envolvidos na cascata inflamatória, e da sua recente associação a complexos transcricionais de maneira redox-independente, o envolvimento da atividade de reparo da APE1 na modulação da reposta inflamatória ainda não foi investigado. Diante disso, este trabalho estudou o envolvimento da atividade de reparo da APE1 na resposta inflamatória monocítica induzida por LPS. Os resultados iniciais mostraram que a co-incubação de monócitos U937 com LPS/MX nas concentrações utilizadas não induziu mudanças significativas na viabilidade celular. Adicionalmente, a expressão de marcadores canônicos da resposta inflamatória TNF-α, IL-6, IL-8 e MCP-1, obtidos após 24 h de incubação com LPS, foi reduzida significativamente com a exposição à MX. A redução da expressão de citocinas e quimiocinas pela inibição do BER foi associada à atividade de DNA glicosilase da OGG1. Ratos KO para OGG1 demonstraram redução do estresse oxidativo global, da expressão de citocinas/quimiocinas, e a modulação de uma variedade de condições patofisiológicas, incluindo alergias e autoimunidade. O mecanismo envolvido na modulação imune pela OGG1 foi associado com a regulação da ativação de fatores de transcrição, expressão de citocinas/quimiocinas, estresse oxidativo, e recrutamento de células imunes (MABLEY, et al., 2005; TOUATI et al., 2006; WU et al., 2011; BA et al., 2012). Estudo recente do nosso grupo demonstrou que polimorfismos nos genes que codificam proteínas de reparo de DNA OGG1, 87 APE1 e PARP-1 estão relacionados com a modulação da resposta imune em pacientes com MB (SILVA et al, 2011). Neste trabalho, os autores observaram que pacientes com MB apresentaram maior frequência de polimorfismo de nucleotídeo único no gene da APE1, e que essa alteração estava associada ao desenvolvimento da doença. Os autores mostraram que, apesar do polimorfismo no gene da APE1 estar localizado em região entre os domínios redox e AP endonuclease, a troca do nucleotídeo foi associada a redução na expressão das citocinas IL-6, IL-8, IL-1Ra e MCP-1 em pacientes com MB (SILVA et al, 2011). Esses resultados sugerem que a proteína APE1 pode regular a expressão de citocinas de uma maneira independente da sua atividade redox. Curiosamente, os dados obtidos com a inibição indireta da atividade de reparo de APE1 pela MX em modelo celular, revelou a redução da expressão de IL-6, IL-8 e MCP-1, mesmas citocinas reguladas nos pacientes acometidos com MB e portadores do alelo polimórfico para APE1, indicando um possível envolvimento da atividade AP endonuclease de APE1 na regulação da resposta inflamatória. A APE1 já foi associada a expressão gênica de uma maneira redox- independente. Gray e colaboradores (2005) demonstraram que APE1 interage estavelmente com STAT3 e HIF-1, e que STAT3, CBP/p300, e APE1 são componentes de um complexo transcricional que regula a expressão de VEGF em carcinomas pancreáticos e prostáticos induzidos por Src dependente de hipóxia (GRAY et al, 2005). A atividade trans-ativa de APE1 foi também relacionada à formação do complexo transcricional e expressão de genes responsivos a p53 (HANSON et al., 2005) e ao mecanismo de ativação do fator de transcrição YB-1 no promotor do gene MDR-1 (SENGUPTA et al., 2011). Atividade similar foi associada a transcrição dos promotores ativados por c-Myc, onde o reparo de lesões oxidadas geradas pela atividade demetilase de LSD-1 pela APE1 recruta e auxilia a formação da RNA-pol II para expressão dos promotores-alvo. O modelo foi comprovado pela regulação negativa da transcrição de genes alvos de c-Myc após silenciamento de LSD1, OGG1 ou APE1 (AMENTE et al., 2010). Os resultados das análises bioinformáticas revelam a down-regulação do transcrito do gene MYC e o comprometimento de diversas vias celulares por ele reguladas, como o crescimento celular, biogênese ribossomal e apoptose em 88 resposta ao tratamento com LPS/MX. Além disso, Myc possuiu altos valores de centralidade na rede PPI down-regulada, o que caracteriza a sua importância dentre os transcritos da rede. Curiosamente, a via apoptótica mediada por p53 também foi regulada após o tratamento, sugerindo que o bloqueio de sítios abásicos pela MX pode estar envolvido no processo transcricional desses genes. A proteína de ligação ao CREB (CREBBP/CBP) e p300 são homólogos e funcionam como co-ativadores para muitos fatores de transcrição sequência- específicos, como AP-1, p53 e receptores nucleares (CHRIVIA et al., 1993; YUAN e GIORDANO, 20002). CBP/p300 por si mesmos não se ligam ao DNA. Contudo, quando associados a fatores de transcrição, ativam a transcrição via remodelamento da cromatina, através da acetilação de histonas do nucleossomo (por sua atividade de histona acetil transferase (HAT)) e interação com a maquinaria basal (BANNISTER e KOUZARIDES, 1996). A p300 é responsável pela acetilação de outras proteínas não-histonas como a APE1 in vivo e in vitro (BHAKAT et al. 2009). A acetilação de APE1 aumenta a sua afinidade pelo nCARE-B, levando a uma regulação negativa do gene PTH da paratireóide (OKAZAKI et al., 1994) e é indispensável para o recrutamento, formação e estabilização de complexos transcricionais como comentado. Os resultados do transcriptoma revelaram que o tratamento com MX induziu alterações globais nas atividades transcricionais de diversos genes, o que sugere que o acúmulo de sítios abásicos não reparados e/ou de adutos sítios abásicos/MX no DNA sinalizam para reorganização da cromatina, e modulam a transcrição gênica. A regulação negativa da transcrição de genes, cuja ativação transcricional dependem do complexo CREB/p300 (NMI, CITED2 e MYC), e que estão envolvidos na ativação da transcrição global da célula (PPARA, CITED, PARG), somada ao aumento da expressão de genes relacionados à regulação negativa de p53 (RUNDC1, LETMD1, E4F1), e à inibição da atividade de CREB/p300 (DDIT3, KLHDC2), sugerem que a proteína APE1, em especial a sua atividade de reparo de DNA, pode ser requerida para a estabilização, recrutamento e atividade transcricional dos complexos formados por CBP/p300 nos promotores. É razoável propor que APE1, além de funcionar como “scafold” para formação dos complexos transcricionais, pode também ter sua relevância 89 conferida pela atividade de reparo de lesões em promotores, tanto mais expostos aos danos quanto mais acionados forem. A inibição do reparo de sítios AP pela MX reduziu a expressão de diversos genes relacionados com o reparo de DNA. A transcrição de genes de reparo de DNA é modulada por diversos fatores, dentre eles ERO produzidas durante a inflamação. O aumento do estresse oxidativo provavelmente exerce efeitos pleiotrópicos no BER; por um lado estimula a transcrição e tradução de diversas enzimas do reparo, por outro pode inativar os componentes da via pela oxidação ou nitrozilação direta das enzimas. A transcrição da proteína APE1, que estimula a atividade de excisão das glicosilases OGG1 e TDG é aumentada em resposta a ERO (PINES et al., 2005). É possível propor que a diminuição da expressão dos genes de reparo de DNA após o tratamento LPS/MX pode resultar de duas vias principais: (1) da redução dos níveis de ERO, e/ou (2) do bloqueio da transcrição pelos adutos de MX. Propõe-se ainda, que o mecanismo de ativação transcricional dos genes de reparo seja semelhante ao observado para a citocinas pro-inflamatórias, requerendo a atividade de reparo eficiente para a transcrição correta dos promotores. Os resultados do transcriptoma mostraram que diversos genes e processos biológicos mitocondriais foram modulados após o tratamento com LPS/MX. O comprometimento de subunidades da cadeia transportadora de elétrons (CTE) está associado à problemas no transporte de elétrons, potencial de membrana mitocondrial e atividade de ATP sintase (WALLACE, 2005; HUANG et al., 2007). A redução da síntese de ATP após tratamento com LPS/MX, inferida pela down- regulação de subunidades da ATP sintase, e o perfil alterado da transcrição de subunidades da cadeia respiratória podem sugerir um comprometimento na CTE e possível acúmulo de NADH na mitocôndria (não oxidado pelo complexo I). Sabendo que a degradação de carboidratos e ácidos graxos culminam no abastecimento do ciclo do ácido cítrico, o excesso de NADH reduzido (e consequente diminuição do NAD+ disponível) pode sinalizar para o ciclo do ácido cítrico um acúmulo de energia, e funcionar como um feedback negativo para geração de outros precursores energéticos (processo biológico down-regulado anotado pelo BiNGO), como a via do metabolismo do propanoato e da degradação de aminoácidos. Outros genes relacionados a vias metabólicas 90 foram down-regulados, como o isocitrato desidrogenase 3 (NAD+) gamma (IDH3G) e 3-hidroxisobutril-coA hidrolase (HIBCH), envolvidos no ciclo do ácido cítrico e no processo de biossíntese de ácidos graxos, respectivamente. Esses resultados sugerem que o tratamento LPS/MX pode modular a função mitocondrial e bioenergética celular. Células de mamíferos respondem à perda de funções mitocondriais com mudanças na expressão gênica. Foi mostrado que a sinalização de estresse entre mitocôndria-núcleo é provavelmente devida à perda do potencial de membrana mitocondrial, que resulta no aumento do Ca2+ livre no citoplasma (BISWAS et al., 1999). O aumento do Ca2+, também proveniente da resposta ao estresse do RE, pode ativar proteínas fosfatases, quinases e a calmodulina- calcio quinase IV (CaMKIV) sensíveis ao cálcio, as quais ativam fatores de transcrição, resultando em alterações na expressão gênica nuclear (BUTOW e AVADHANI, 2004; BROOKES et al., 2004; MICELI e JAZWINSKI, 2005). As diferenças de expressão dos genes das subunidades dos complexos mitocondriais, dos genes responsivos ao cálcio e a modulação da transcrição de genes mitocondriais gerais podem ser resultado do comprometimento da função mitocondrial. O mtDNA é fisicamente próximo à membrana mitocondrial internar e, por isso é alvo constantemente de ERO. Lesões oxidadas no mtDNA são extremamente tóxicas e são processadas por duas vias principais, detecção e correção do dano por enzimas de reparo como OGG1 e APE1, ou rapidamente marcadas para degradação. Tem sido mostrado que o bloqueio do reparo do mtDNA pela MX induz a degradação do mtDNA, levando a uma redução do potencial de membrana e da produção de ERO. Diante disso, propõe-se que o tratamento LPS/MX induz o acúmulo de danos oxidados no mtDNA e bloqueia o reparo pela APE1 mitocondrial, o que pode marcar o mtDNA para degradação, reduzir a atividade da CTE e, consequentemente, a produção de ERO. Em concordância com tal proposição, observou-se que o tratamento LPS/MX reduziu experimentalmente os níveis de ERO nas células, quando comparado aos demais tratamentos. Após 24 h de indução inflamatória com LPS, as células U937 não totalizaram níveis de ERO aumentados em relação às células sem tratamento. Esse parece um resultado contraditório uma vez que é de 91 conhecimento que a exposição celular à parede bacteriana induz ativação de cascatas que culminam na produção de ERO e liberação de citocinas (CHEN et al., 2010). A observação dos níveis inalterados de ERO após exposição ao LPS pode ser resultado do tempo de exposição elevado, uma vez que as espécies reativas têm seu pico de formação nos estágios iniciais da resposta inflamatória e as proteínas antioxidantes tendem a reestabelecer o estado redox da célula. A regulação mediada por APE1 pode sofrer modulação em resposta às variações na expressão da proteína, decorrentes de alterações no perfil redox celular, como por exemplo, acúmulo de ERO (GROSCH et al., 1998). Os resultados obtidos indicam que a MX reduziu significativamente a quantidade de transcritos de APE1, embora a nível traducional a variação não tenha sido significativa. Como a extração dos transcritos e proteínas foram pontuais, é possível que a diferença entre transcrito e proteínas sejam decorrentes de um momento celular onde a expressão de APE1 tenha sido diminuída, contudo o turnover da proteína ainda não tenha ocorrido, mantendo normais seus níveis proteicos. A redução dos transcritos de APE1 após o tratamento LPS/MX pode ser uma consequência da redução das ERO e do estado redox da célula, ou ainda decorrer de um controle à nível de complexos transcricionais, como proposto para os demais genes de reparo down-regulados. O western Blot com marcação para APE1 revelou duas bandas para o controle não-tratado e para o tratamento com LPS, mas não para o tratamento com MX. Chattopadhyay e colaboradores (2006) caracterizaram a AP- endonuclease mitocondrial e constataram que a mtAPE1 é uma forma truncada da APE1 nuclear, cujo sinal de localização nuclear foi perdido. A perda dos 33 aminoácidos da região N-terminal é um determinante para a translocação da APE1 para a mitocôndria. Dependendo de quantos aminoácidos sejam perdidos, a mtAPE1 pode apresentar tamanhos diferentes, expondo padrões de bandas diferenciados em western Blot (CHATTOPADHYAY et al., 2006). É possível que a banda de 33kDa observada após os tratamentos represente uma forma truncada de mtAPE1 e que a exposição à MX esteja, de alguma forma, impedindo a clivagem da proteína ou a sinalização de direcionamento da APE1 para mitocôndria. Esse resultado pode ainda estar associado à localização predominantemente nuclear da APE1 observada nas células tratadas com 92 LPS/MX. É possível que a presença da MX nos sítios abásicos sinalize para a retenção da APE1 nuclear, ou mesmo para o retorno da APE1 citoplasmática (translocada ao citoplasma pela estimulação prévia com LPS) ao compartimento nuclear como alternativa para solucionar os danos oxidados acumulados no DNA nuclear. Nesse sentido, a APE1 não estaria “disponível” para sofrer clivagens e ser direcionada para a mitocôndria, razão pela qual não é detectada a banda da APE1 truncada no extrato proteico do tratamento com LPS/MX. Esse contexto, por sua vez, poderia estar relacionado aos danos e comprometimentos mitocondriais, sugeridos pelos resultados da bioinformática. A análise do transcriptoma revelou também a regulação positiva de genes relacionados ao estresse do RE. Estresse de RE é caracterizado pela disfunção da organela em resposta a diversas situações como expressão de TNF- α, danos ao DNA, déficit energético (starvation) e alterações mitocondriais (UBEDA et al., 1996; OYADOMARI e MORI, 2004; SCHRODER e KAUFMAN, 2005). Quando há o acúmulo de proteínas mal-dobradas, o retículo inicia a UPR, resposta bastante eficiente que visa a incrementação da capacidade de dobramento correto das proteínas ou sinaliza-las para degradação. Não sendo suficiente para reestabelecimento da função, a UPR pode sinalizar para a autofagia ou apoptose (Schroder, 2008). A ativação da UPR é diretamente relacionada à transcrição do gene DDIT3 ou GADD153, para produção da proteína CHOP. A CHOP é um fator de transcrição que ativa a transcrição de genes para o retículo, e inibe a transcrição global da célula através da inibição do co-ativador CBP/p300. A ligação ao CBP/p300 forma dímeros que impedem a ligação do co-ativador com fatores de transcrição como NF-κB e o receptor ativado pela proliferação de peroxissomo (PPAR-gama), reduzindo suas atividades (UBEDA et al., 1996; OYADOMARI e MORI, 2004). Foi observada a regulação positiva da transcrição de DDIT3, e a regulação negativa de transcritos relacionados a PPAR-gama e NF-κB após tratamento LPS/MX. Além disso, foi verificada a regulação positiva do metabolismo de RNAs não-codantes, o que pode estar relacionado ao controle pós-transcricional da síntese de proteínas gerais. Esses resultados sugerem que a MX, em paralelo à persistência da inflamação, pode induzir estresse de RE e 93 estimular a transcrição de DDIT3 o que, consequentemente, modula a atividade transcricional de NF-κB, resultando em uma redução da resposta imune. O estresse de RE pode sinalizar para autofagia, uma via de degradação dependente de lisossomo que promove a homeostase celular em resposta a estresses, como privação de nutrientes, estresse oxidativo e/ou danos ao DNA (VESSONI et al., 2013; GREEN et al., 2011; KROEMER et al., 2010; SINGH e CUERVO, 2011). Quando ativada em resposta a poucos danos no DNA, a autofagia induz a remoção de mitocôndrias com membranas permeabilizadas (RAVIKUMAR et al., 2010); a geração de dNTPs e/ou ATP para a atividade de reparo de DNA (KATAYAMA et al., 2007; DYAVAIAH et al., 2011); e a degradação de proteínas pro-apoptóticas (HOU et al., 2010). Os resultados das análises transcriptômicas indicam que o bloqueio do reparo dos danos ao DNA nuclear e mitocondrial pelos adutos de MX induz a ineficácia do reparo, as disfunções mitocondriais e estresse de RE, o que pode culminar na parada da progressão do ciclo celular e ativação de vias autofágicas citoprotetivas. Os resultados do transcriptoma revelaram genes e processos biológicos característicos de condições autofágicas, como transporte de vesículas, processos catabólicos de macromoléculas, regulação da morte celular programada e lisossomos. Em resposta ao tratamento, além dos danos ao DNA, a autofagia pode também ser ativada em resposta ao comprometimento mitocondrial como alternativa de reciclagem da organela e abastecimento energético da célula. A autofagia, somada a regulação da morte celular programada (processo up-regulado anotado pelo BiNGO) pode explicar a resistência das células U937 ao tratamento LPS/MX, observado pela viabilidade celular inalterada. O fato de a exposição à MX induzir parada de ciclo celular em G1, mas não induzir morte celular pode sugerir que a razão pela qual o mecanismo de controle do ciclo induziu a parada pode ser passível de correção, ou está sobre verificação. Algumas situações celulares, como visto, podem induzir a parada o ciclo celular e encaminhar, ou não, a célula para apoptose (HAHN et al., 1999;). Danos ao DNA são pontos fortes de verificação constante ao longo das fases da mitose e podem ser gerados por inúmeros fatores, desde acoplamento de nucleotídeos errados por polimerases até lesões oxidadas (SANCAR et al., 94 2004). Além disso, a sinalização de parada tardia do ciclo em G1 é dada por cascatas de ativação que tem como principais proteínas Ras/Raf, MEK, MAPK, PIK3, AKT, TGF-β, Ciclina E, IGF1, mTOR e Myc. A conexão entre a Ciclina E e mTOR ocorre via sinalização por TGF-β e culmina na sensibilização do ciclo à quantidade de energia disponível, sendo mTOR ativado pela presença de aminoácidos e suprimido pela redução dos níveis de ATP celular (GADIR et al., 2008). Curiosamente, nas redes geradas a partir dos transcritos down-regulados, observa-se processos relacionados à bioenergética em geral, como CTE, síntese de ATP acoplada à cadeia, respiração celular e geração de precursores e energia, sugerindo comprometimento da energia celular. Interessante também notar que expressão de alguns genes responsivos ao mTOR foi alterada após tratamento com LPS/MX, sendo up-regulados genes inibidos pela via (EIF4EBP1) e down-regulados aqueles por ela ativados (P70S6K), o que reforça a hipótese. A proteína Myc induz a progressão do ciclo celular e a sinalização para apoptose logo, a regulação negativa ou inativação da proteína resulta em comprometimento da progressão do ciclo celular (SCHMIDT, 1999). A parada em G1 observada após o tratamento com LPS/MX pode resultar do reparo incorreto ou inexistente dos danos ao DNA, comprometimento da atividade mitocondrial e bioenergética celular, e/ou estar diretamente associado com a regulação negativa da expressão do gene MYC. Tal situação pode também estar relacionada a modulação da sinalização pró-apoptótica, o que explicaria a redução da expressão de genes relacionados à morte celular programada (caspase 3, por exemplo). Em relação à transcrição de genes da resposta imune após o tratamento LPS 24 h e MX 4 h, algumas hipóteses podem ser geradas. Inicialmente, sugere- se que a inibição do reparo do mtDNA pela MX pode levar a diminuição da atividade da CTE, modular a produção de ATP e ERO, e reduzir a ativação do ciclo estresse oxidativo-inflamação, o que acarreta o comprometimento da ativação redox de fatores de transcrição e, consequentemente, a transcrição de genes pró-inflamatórios. Outra possível explicação para a redução na expressão de citocinas pode estar relacionada com a regulação negativa de vias de sinalização de NF-κB. Sabe-se que a cascata inflamatória induzida por infecção 95 é ativada pelo reconhecimento de antígenos por receptores imunes (AKIRA e SATO, 2003; KOPP e MEDZHITOV, 2003), e que a redução da expressão de TLR2 e TLR4 pode por si só, diminui a ativação de NF-κB levando à redução da inflamação (TAKEDA, 2005). Diante disso, a redução da expressão de TLRs e da localização nuclear de p65 após o tratamento LPS/MX podem explicar a regulação negativa de genes da via inflamatória, como TNF-α, IFN-b, NF-κB e TGF-beta. Além disso, a expressão de CHOP, e consequente inibição da atividade co-ativadora de CBP/p300 também pode regular a atividade transcricional de NF-κB e de toda a via a ele responsiva. Os dados obtidos indicam que a modulação da expressão de citocinas decorre, mesmo que não unicamente, da redução da atividade de NF-κB. Citocinas e quimiocinas são importantes sinalizadores envolvidos em modificações autócrinas e recrutamento de células aos pontos de inflamação (AKIRA e SATO, 2003). A redução dos níveis proteicos de citocinas/quimiocinas na fase inicial da inflamação sugere que a MX pode influenciar na expressão de genes pro-inflamatórios. Recentemente, a atividade de OGG1 foi relatada na modulação da inflamação. Nesse trabalho, os autores demonstraram que o aumento de ERO induzido por TNF-α eleva os níveis de 8-oxo-G no genoma, incluindo regiões promotoras, além de estimular a ligação de OGG1 ao promotor da proteína inflamatória de macrófagos 2-alpha (MIP2-alpha) em camundongos e humanos. A ligação de OGG1 ao promotor aumenta a expressão de MIP2- alpha via facilitação do recrutamento do fator iniciador da transcrição II-D (TFIID), NF-κB /RelA, Sp1 e p-RNA pol II ao promotor (BA et al., 2014). Uma vez que o estresse oxidativo também gera sítios abásicos no DNA, é plausível considerar que a atividade de reparo de DNA da APE1, semelhante ao que ocorre com OGG1, pode ser requerida para a transcrição de genes pro-inflamatórios. Considerando essa hipótese, a APE1, ao reconhecer e clivar os sítios abásicos gerados nas regiões promotoras, recrutaria e estabilizaria o complexo de pré- iniciação da transcrição, formado por fatores de transcrição e coativadores, como NF-κB e CBP/p300, e a RNA Pol II, facilitando a transcrição de genes pró- inflamatórios. Neste contexto, a ligação da MX ao sítio abásico pode bloquear o reconhecimento da lesão pela APE1, a correção dos danos e a formação do complexo para transcrição, culminando na redução observada da expressão de 96 citocinas, quimiocinas, TLRs e demais moduladores da resposta inflamatória. O modelo proposto encontra subsídios nas interações já descritas entre APE1, CBP/p300 e fatores de transcrição como YB-1, p53 e Myc, e propõe um novo mecanismo para transcrição de genes pró-inflamatórios. Por fim, propõe-se que a atividade de reparo de APE1 é necessária para a transcrição de genes inflamatórios, interagindo com sítios abásicos em promotores específicos e recrutando complexos de pré-iniciação e RNA pol II para a transcrição em modelo celular de inflamação. Este trabalho fornece uma nova perspectiva acerca da interação entre o reparo de DNA e a modulação da resposta inflamatória, e sugere uma nova atividade da proteína APE1 como modulador da resposta imune de maneira redox-independente. 97 6. CONCLUSÕES Este trabalho permite concluir que:  O tratamento com LPS e MX não induz alterações na viabilidade celular de células monocíticas U937;  O tempo de 24 h de estimulação com LPS induziu o acúmulo de maiores concentrações de citocinas inflamatórias e foi estabelecido como modelo de inflamação celular;  O tratamento com LPS por 24 h e co-incubação com MX por mais 4 h reduziu a expressão das citocinas e quimiocinas analisadas, quando comparado ao tratamento apenas com LPS;  O bloqueio do reparo pela MX induz disfunções mitocondriais e uma cascata de respostas que podem culminar na redução da bioenergética celular e atividade da CTE mitocondrial.  As células tratadas com LPS/MX apresentam parada de ciclo celular em G1;  A APE1 é retida no núcleo, enquanto a subunidade p65 tem sua localização nuclear reduzida em células tratadas com LPS/MX, quando comparadas às células apenas estimuladas com LPS.  Sob situação inflamatória, MX pode induzir estresse do RE, privação de nutrientes e/ou acúmulo de danos ao DNA.  O tratamento LPS/MX reduz os níveis de ERO nas células, quando comparado ao tratamento com LPS;  Os níveis transcricionais de APE1 são reduzidos após o tratamento LPS/MX, contudo, não foi observada alteração nos níveis proteicos; 98 REFERÊNCIAS AITKEN, J.R.; ROMAN, S.D. 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Lista de processos biológicos representativos anotados com os genes up-regulados. up-regulados Processo Biológico Contagema p-Value GO:0006399~tRNA metabolic process 16 4,98E+09 GO:0008033~tRNA processing 12 2,68E+11 GO:0009451~RNA modification 9 1,23E+12 GO:0034660~ncRNA metabolic process 20 1,45E+12 GO:0043414~biopolymer methylation 9 0.001517107164213627 GO:0034470~ncRNA processing 15 0.0026745446517751122 GO:0032259~methylation 9 0.0028209777201535103 GO:0016567~protein ubiquitination 11 0.004696924346187406 GO:0016571~histone methylation 5 0.004711280866539542 GO:0051056~regulation of small GTPase mediated signal transduction 17 0.0069356685055132605 GO:0016569~covalent chromatin modification 11 0.006995306531164267 GO:0006350~transcription 87 0.007220695807470787 GO:0046578~regulation of Ras protein signal transduction 15 0.007345206697264494 GO:0045449~regulation of transcription 104 0.008604294359202357 GO:0000209~protein polyubiquitination 5 0.008711021686933803 GO:0001522~pseudouridine synthesis 4 0.008996496596712839 GO:0006730~one-carbon metabolic process 10 0.009491202028215712 GO:0034969~histone arginine methylation 3 0.009500380633588074 GO:0032446~protein modification by small protein conjugation 11 0.009586954963329423 GO:0015031~protein transport 37 0.011602658577742024 GO:0045184~establishment of protein localization 37 0.01331990483813533 GO:0070647~protein modification by small protein conjugation or removal 12 0.01347321960460368 GO:0033044~regulation of chromosome organization 5 0.014453356948364804 GO:0008104~protein localization 41 0.015036404909569041 GO:0051129~negative regulation of cellular component organization 11 0.01545811223859028 GO:0016570~histone modification 10 0.01599827105406982 GO:0032483~regulation of Rab protein signal transduction 6 0.01639614702998562 GO:0032313~regulation of Rab GTPase activity 6 0.01639614702998562 GO:0006325~chromatin organization 21 0.018530075579610606 GO:0051276~chromosome organization 25 0.022370805774955142 GO:0030163~protein catabolic process 30 0.025749661800852995 GO:0006396~RNA processing 27 0.027683338094014697 111 GO:0051603~proteolysis involved in cellular protein catabolic process 29 0.02837437444769268 GO:0044257~cellular protein catabolic process 29 0.029949972219771005 GO:0007613~memory 5 0.034726781172526054 GO:0008213~protein amino acid alkylation 5 0.034726781172526054 GO:0006479~protein amino acid methylation 5 0.034726781172526054 GO:0048567~ectodermal gut morphogenesis 3 0.038474501374401164 GO:0007439~ectodermal gut development 3 0.038474501374401164 GO:0044265~cellular macromolecule catabolic process 33 0.03951781970666636 GO:0019941~modification-dependent protein catabolic process 27 0.045684597439292096 GO:0043632~modification-dependent macromolecule catabolic process 27 0.045684597439292096 GO:0032318~regulation of Ras GTPase activity 8 0.04828353576034658 GO:0006333~chromatin assembly or disassembly 9 0.05016016188642354 a Contagem de genes listados para cada processo biológico de um total de 432 genes iniciais. Tabela A2. Lista de processos biológicos representativos anotados com os genes down- regulados. down-regulados Processo biológico Contagem p-Value GO:0051276~chromosome organization 26 0.0011633657115714833 GO:0048193~Golgi vesicle transport 11 0.0025170682655476827 GO:0046907~intracellular transport 31 0.0026036384576673278 GO:0016568~chromatin modification 17 0.0026378638292782128 GO:0007049~cell cycle 35 0.0026458804864933883 GO:0006695~cholesterol biosynthetic process 5 0.004547489577486807 GO:0051301~cell division 17 0.005384964920591348 GO:0006325~chromatin organization 20 0.00578646698847534 GO:0022403~cell cycle phase 21 0.007180256231649549 GO:0006259~DNA metabolic process 24 0.008338740139608483 GO:0009132~nucleoside diphosphate metabolic process 4 0.009485401297055367 GO:0000278~mitotic cell cycle 19 0.009756462079767237 GO:0006974~response to DNA damage stimulus 19 0.010530639815607996 GO:0016192~vesicle-mediated transport 26 0.01061837094734286 GO:0016126~sterol biosynthetic process 5 0.01322320447285994 GO:0015937~coenzyme A biosynthetic process 3 0.01342966292344774 GO:0000280~nuclear division 13 0.014295438895705654 GO:0007067~mitosis 13 0.014295438895705654 GO:0022402~cell cycle process 25 0.015425123947491834 GO:0000087~M phase of mitotic cell cycle 13 0.016251729955956175 GO:0051099~positive regulation of binding 7 0.017137397046215846 112 GO:0002281~macrophage activation during immune response 3 0.017595473584119593 GO:0044265~cellular macromolecule catabolic process 30 0.01781410591089332 GO:0048285~organelle fission 13 0.019006945214853858 GO:0006281~DNA repair 15 0.019191397521579775 GO:0006732~coenzyme metabolic process 10 0.020559697312069178 GO:0015936~coenzyme A metabolic process 3 0.022231038380275986 GO:0051092~positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity 5 0.02261292704586659 GO:0006351~transcription, DNA-dependent 15 0.02370208322162501 GO:0006888~ER to Golgi vesicle-mediated transport 5 0.024487491587483968 GO:0008610~lipid biosynthetic process 16 0.025279041298383577 GO:0032774~RNA biosynthetic process 15 0.026236678532466688 GO:0009116~nucleoside metabolic process 6 0.026946947404905365 GO:0032481~positive regulation of type I interferon production 3 0.027308720296727915 GO:0006720~isoprenoid metabolic process 5 0.02851099072584301 GO:0000279~M phase 16 0.029166322378046224 GO:0033865~nucleoside bisphosphate metabolic process 3 0.032802009029836446 GO:0009119~ribonucleoside metabolic process 5 0.032904733290218174 GO:0045089~positive regulation of innate immune response 5 0.032904733290218174 GO:0009108~coenzyme biosynthetic process 6 0.035745396077191016 GO:0032312~regulation of ARF GTPase activity 4 0.03692733859310361 GO:0015908~fatty acid transport 4 0.03692733859310361 GO:0000077~DNA damage checkpoint 5 0.03767237043002214 GO:0043388~positive regulation of DNA binding 6 0.03769381552791706 GO:0009057~macromolecule catabolic process 30 0.04130583375017316 GO:0051101~regulation of DNA binding 8 0.04172634159654319 GO:0015718~monocarboxylic acid transport 5 0.042815733477665735 GO:0042254~ribosome biogenesis 8 0.04330760144440149 GO:0045638~negative regulation of myeloid cell differentiation 4 0.044041717979433716 GO:0032648~regulation of interferon-beta production 3 0.04493476055321988 GO:0006457~protein folding 10 0.04592267891236782 GO:0033554~cellular response to stress 23 0.04640531622807749 GO:0006733~oxidoreduction coenzyme metabolic process 5 0.048334914766026055 GO:0006473~protein amino acid acetylation 5 0.048334914766026055 GO:0031570~DNA integrity checkpoint 5 0.048334914766026055 GO:0022613~ribonucleoprotein complex biogenesis 10 0.050123472324945566 GO:0051098~regulation of binding 9 0.05065012926884142 GO:0002224~toll-like receptor signaling pathway 3 0.051526482769443535 113 GO:0031365~N-terminal protein amino acid modification 3 0.051526482769443535 GO:0045088~regulation of innate immune response 5 0.054228356278643655 GO:0006350~transcription 68 0.05604069631549942 GO:0019748~secondary metabolic process 6 0.058132184792385556 GO:0032760~positive regulation of tumor necrosis factor production 3 0.058438257071221356 GO:0032479~regulation of type I interferon production 3 0.058438257071221356 GO:0042116~macrophage activation 3 0.058438257071221356 GO:0006220~pyrimidine nucleotide metabolic process 4 0.06907842898681543 GO:0055072~iron ion homeostasis 4 0.06907842898681543 GO:0051056~regulation of small GTPase mediated signal transduction 12 0.07116365302496105 GO:0002221~pattern recognition receptor signaling pathway 3 0.07313706316627468 GO:0051091~positive regulation of transcription factor activity 5 0.07411592021165234 GO:0006308~DNA catabolic process 5 0.07411592021165234 GO:0043543~protein amino acid acylation 5 0.07411592021165234 GO:0006694~steroid biosynthetic process 6 0.07467619130614614 GO:0051186~cofactor metabolic process 10 0.07490866419011974 GO:0051409~response to nitrosative stress 2 0.07731401758918421 GO:0006853~carnitine shuttle 2 0.07731401758918421 GO:0002237~response to molecule of bacterial origin 6 0.07765810796912906 GO:0008643~carbohydrate transport 5 0.07774487259515642 GO:0002275~myeloid cell activation during immune response 3 0.08088387698420202 GO:0019941~modification-dependent protein catabolic process 22 0.08178539661942166 GO:0043632~modification-dependent macromolecule catabolic process 22 0.08178539661942166 GO:0016044~membrane organization 16 0.0821043419854783 GO:0007249~I-kappaB kinase/NF-kappaB cascade 5 0.08526383514192606 GO:0006769~nicotinamide metabolic process 4 0.08861949351424132 GO:0046496~nicotinamide nucleotide metabolic process 4 0.08861949351424132 GO:0002758~innate immune response-activating signal transduction 3 0.08887024264223672 GO:0002218~activation of innate immune response 3 0.08887024264223672 GO:0032755~positive regulation of interleukin-6 production 3 0.08887024264223672 GO:0006366~transcription from RNA polymerase II promoter 11 0.09306695397245812 114 GO:0009820~alkaloid metabolic process 4 0.09383053823579911 GO:0006364~rRNA processing 6 0.0968641035285435 GO:0008203~cholesterol metabolic process 6 0.0968641035285435 GO:0033261~regulation of S phase 3 0.09707813977687797 GO:0008299~isoprenoid biosynthetic process 3 0.09707813977687797 GO:0033273~response to vitamin 5 0.09717781969997105 GO:0019362~pyridine nucleotide metabolic process 4 0.09916461874569574 115 Tabela A3. Descrição dos genes up- e down-regulados relacionados à mitocôndria após o tratamento com LPS/MX. up-regulados Gene Fold change Descrição Sinônimos COQ9 8,60689655 ubiquinone biosynthesis protein COQ9, mitochondrial C16orf49|COQ10D5 GRPEL2 6,03019845 GrpE-like 2, mitochondrial Mt-GrpE#2 NARS2 5,16824849 probable asparaginyl-tRNA synthetase, mitochondrial SLM5|asnRS TTC19 5,1673568 tetratricopeptide repeat protein 19, mitochondrial isoform 2 2010204O13Rik|MC3DN2 LARS2 5,16705003 probable leucyl-tRNA synthetase, mitochondrial LEURS|PRLTS4 NDUFS4 5,1637931 NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 4, mitochondrial AQDQ|CI-18 LETM2 4,30716135 LETM1 domain-containing protein LETM2, mitochondrial precursor 0 EARS2 4,30716135 probable glutamate--tRNA ligase, mitochondrial precursor COXPD12|MSE1 SLC25A25 4,30716135 calcium-binding mitochondrial carrier protein SCaMC-2 MCSC|PCSCL|RP11-395P17.4|SCAMC- 2 RHOT2 3,87618637 mitochondrial Rho GTPase 2 ARHT2|C16orf39|MIRO-2|MIRO2|RASL GTPBP3 3,44521139 tRNA modification GTPase GTPBP3, mitochondrial precursor GTPBG3|MSS1|MTGP1|THDF1 MRPL23 3,44521139 39S ribosomal protein L23, mitochondrial L23MRP|RPL23|RPL23L SMDT1 3,44450834 single-pass membrane protein with aspartate-rich tail 1, mitochondrial precursor C22orf32|DDDD|dJ186O1.1 ALDH6A1 3,44450834 methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase [acylating], mitochondrial MMSADHA|MMSDH ENDOG 3,44310345 endonuclease G, mitochondrial 0 TK2 3,44310345 thymidine kinase 2, mitochondrial MTDPS2|MTTK OMA1 3,44310345 metalloendopeptidase OMA1, mitochondrial precursor 2010001O09Rik|DAB1|MPRP- 1|YKR087C|ZMPOMA1|peptidas TIMM44 3,15756182 mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM44 TIM44 ACAD8 3,10041408 isobutyryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial ACAD-8|ARC42 MRPL28 3,01509922 39S ribosomal protein L28, mitochondrial MAAT1|p15 116 NDUFA2 3,44310345 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 2 B8|CD14|CIB8 SDHA 3,52305521 succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp) CMD1GG|FP|PGL5|SDH1|SDH2|SDHF down-regulados AKAP1 -11,03507014 A-kinase anchor protein 1, mitochondrial precursor AKAP|AKAP121|AKAP149|AKAP84|D- AKAP1|PPP1R43|PRKA1| COQ2 -8,13126253 para-hydroxybenzoate--polyprenyltransferase, mitochondrial CL640|COQ10D1|MSA1 TARS2 -7,5501002 threonine--tRNA ligase, mitochondrial isoform a TARSL1|thrRS GLS -6,26983173 glutaminase kidney isoform, mitochondrial precursor AAD20|GAC|GAM|GLS1|KGA SLC25A22 -5,80761523 solute carrier family 25 (mitochondrial carrier: glutamate), member 22 EIEE3|GC1|NET44 MRPS5 -5,80761523 28S ribosomal protein S5, mitochondrial precursor MRP-S5|S5mt HIBADH -5,22745491 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase NS5ATP1 NDUFA13 -5,2243365 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 13 B16.6|CDA016|GRIM-19|GRIM19 MRPL10 -4,64629259 39S ribosomal protein L10, mitochondrial precursor L10MT|MRP-L10|MRP- L8|MRPL8|RPML8 SUPV3L1 -4,64629259 ATP-dependent RNA helicase SUPV3L1, mitochondrial precursor SUV3 NDUFA9 -4,45108514 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 9, 39kDa CC6|CI-39k|CI39k|NDUFS2L|SDR22E1 ABCB8 -4,3535303 ATP-binding cassette sub-family B member 8, mitochondrial EST328128|M-ABC1|MABC1 MRM1 -4,06513026 rRNA methyltransferase 1, mitochondrial precursor 0 MRPL45 -4,06513026 39S ribosomal protein L45, mitochondrial L45mt|MRP-L45 METAP1D -4,06513026 methionine aminopeptidase 1D, mitochondrial precursor MAP 1D|MAP1D|MetAP 1D|Metap1l ATP5D -4,06513026 ATP synthase subunit delta, mitochondrial 0 YRDC -4,06513026 yrdC domain-containing protein, mitochondrial DRIP3|IRIP|RP11-109P14.4|SUA5 GRPEL1 -4,06359539 grpE protein homolog 1, mitochondrial HMGE BCKDHA -4,06359539 2-oxoisovalerate dehydrogenase subunit alpha, mitochondrial BCKDE1A|MSU|MSUD1|OVD1A IDH3G -3,77410468 isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) gamma H-IDHG ACAA2 -3,67712855 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial DSAEC MRPL16 -3,48496994 39S ribosomal protein L16, mitochondrial L16mt|MRP-L16 117 ATP5H -3,48496994 ATP synthase subunit d, mitochondrial ATPQ CPT2 -3,48496994 carnitine O-palmitoyltransferase 2, mitochondrial CPT1|CPTASE|IIAE4 MTRF1L -3,48496994 peptide chain release factor 1-like, mitochondrial isoform a HMRF1L|MRF1L|mtRF1a NDUFB7 -3,48496994 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 7 B18|CI-B18 PCCA -3,19278918 propionyl-CoA carboxylase alpha chain, mitochondrial 0 HIBCH -3,19278918 3-hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase, mitochondrial HIBYLCOAH PCCB -3,19278918 propionyl-CoA carboxylase beta chain, mitochondrial 0 PTCD3 -3,09649416 pentatricopeptide repeat domain-containing protein 3, mitochondrial precursor MRP-S39 118 Tabela A4. Descrição dos genes de maior centralidade dentre as redes up- e down-reguladas. Centralidades dos hubs up-regulados Genesa Fold change Node degree Betweenees Closeness Função do produto NDUFS4 5,16 33.0 170 7,44E-04 Subunidade acessória da NADH desidrogenase (complexo I da cadeia respiratória) na membrana mitocondrial. NDUFA2 3,44 33.0 105 7,35E-04 Subunidade acessória da NADH desidrogenase (complexo I da cadeia respiratória) na membrana mitocondrial. TAF1 3,44 29.0 3.965 1,01E-04 Maior componente e corpo de montagem do complexo de transcrição basal TFIID, essencial para a progressão da fase G1 do ciclo celular. NCOA3 3,33 28.0 419 9,97E-04 Receptor coativador nuclear que se liga diretamente a receptores nucleares e estimula a atividade transcricional de maneira semelhante aquela hormonio- dependente. TAF4 5,16 22.0 177 8,16E-04 Parte do complexo TFIID, complexo multiproteico que desempenha papel central nas respostas mediadas por promotores a vários ativadores e repressores. PTTG1 6,03 21.0 401 9,42E-04 Pituitary tumor-transforming 1 SHC1 3,22 21.0 386 9,57E-04 Adaptador de sinalização que acopla receptores de fatores de transcrição à vias de sinalização. KAT5 3,44 20.0 157 9,91E-04 Subunidade catalítica do complexo NuA4 acetiltransferase, envolvido na ativação transcricional de genes específicos principalmente por acetilação de histonas nucleossomais H4 e H2A. CARM1 6,2 18.0 166 8,96E-04 Metila resíduos de arginil em diversas proteínas envolvidas no empacotamento do DNA, regulação da transcrição, splicing de pré-mRNA e estabilidade de mRNA. TAF11 3,1 18.0 104 7,96E-04 Fator TATA-biding 11. Presente no core de TFIID. Centralidades dos hubs down-regulados MYC -3,83 55.0 6.151 1,14E-03 Activa a transcrição de genes relacionados ao crescimento celular 119 NDUFB7 -3,48 40.0 26 7,93E-04 Subunidade acessória do complexo I da cadeia respirtatória mitocondrial NADH dehydrogenase. ATP5H -3,48 38.0 2.061 1,01E-03 Subunidade da ATP sintase (complexo V) da membrana mitocondrial, produz ATP a partir do ADP em presença de um gradiente de prótons. PPP2CB -3,19 36.0 2.080 1,02E-03 Desempenha papel importante na ativação de NF-kappaB mediada por TNF-α , pela desfosforilação e inativação de IKBKB/IKKB. NDUFA9 -4,45 36.0 18 7,91E-04 Subunidade acessória do complexo I da cadeia respirtatória mitocondrial NADH dehydrogenase. NDUFA13 -5,22 36.0 4.014 1,03E-03 Subunidade acessória do complexo I da cadeia respirtatória mitocondrial NADH dehidrogenase. Previne a transativação de genes –alvo de STAT3. ATP5D -4,06 36.0 78 7,86E-04 Subunidade da ATP sintase (complexo V) da membrana mitocondrial, produz ATP a partir do ADP em presença de um gradiente de prótons. CHUK -3,09 35.0 1.091 1,06E-03 Serina quinase essencial para a via de sinalização de NF-kB; ativada por multiplos estímulos como citocinas inflamatórias, produtos virais e bacterianos, danos ao DNA ou outros estresses celulares. COX7B -4,06 21.0 2 7,57E-04 Cadeia peptídica da citocromo c oxidase mitocondrial codificada no núcleo. SKP1 -3,67 20.0 1.071 1,01E-03 Componente essencial do complexo ubiquitina ligase SCF, responsável pela ubiquitinação de proteínas envolvidas na progressão do ciclo celular, transdução de sinal e transcrição. 120 CLUSTER 4 CLUSTER 1 CLUSTER 6 CLUSTER 3 CLUSTER 2 CLUSTER 5 121 122 Figura A1. Representação das sub-redes geradas com a análise de clusterização. Em (A) fragmentação da rede up-regulada e (B) down-regulada. Em (A): Cluster 1- envolvido na cadeia transportadora de elétrons; cluster 2- organização de componentes celulares e regulação da expressão gênica; cluster 3- processamento de RNA não codante, processo catabólico de RNA; Cluster 4- regulação do processo biossintético, regulação da morte celular programada; cluster 5- interação interespecífica entre organismos, transdução de sinal; cluster 6 organização do centrossomo e formação de organelas. Em (B): cluster 1- fosforilação oxidativa, geração de metabólitos energéticos e energia; Cluster 2- anotação não significativa; cluster 3- replicação do DNA e resposta ao estresse; cluster 4- regulação da expressõ gênica; cluster 5- anotação não significativa; cluster 6 – processo metabólico de ribonucleosídeo trifosfatado. Tabela A5. Ontologias gênicas significativas relacionados à resposta imune. GO down-regulados anotados Genes p-Value GO:0002281~ativação de macrófago durante a resposta imune TLR2 TICAM1 TLR4 1,80E-02 GO:0051092~regulação positiva da atividade do fator de transcrição NF-kappaB AMH TLR2 TICAM1 TLR4 RIPK1 2,30E-02 GO:0032481~regulação positiva da produção de interferon do tipo I POLR3F TICAM1 POLR3D 2,70E-02 GO:0045089~regulação positiva da resposta imune inata POLR3F TLR2 TICAM1 TLR4 POLR3D 3,30E-02 GO:0032648~regulação da produção de interferon beta POLR3F TICAM1 POLR3D 4,50E-02 123 124 Figura A2. Via celular canônica da doença de Huntington. A via foi enriquecida com genes up- e down-regulados contudo não apresentou valores estatísticos. Quadros em azul representam proteínas codificadas por genes up-regulados e em vermelho down-regulados. 125 Tabela A6. Lista completa dos genes cujos transcritos foram down-regulados após o tratamento LPS/MX Gene LPS/MX LPS Fold change Descrição GIMAP1 16.972 0.0580 29.262.068.970 GTPase IMAP family member 1 ARL13B 28.953 0.1159 24.981.018.120 ADP-ribosylation factor-like protein 13B ARHGAP1 2 13.977 0.0580 24.098.275.860 Rho GTPase activating protein 12 SHROOM2 10.982 0.0580 18.934.482.760 protein Shroom2 EXO1 0.8985 0.0580 15.491.379.310 exonuclease 1 PANK4 0.8985 0.0580 15.491.379.310 pantothenate kinase 4 SIK3 0.8985 0.0580 15.491.379.310 serine/threonine-protein kinase SIK3 isoform 1 EFCAB7 0.7987 0.0580 13.770.689.660 EF-hand calcium-binding domain-containing protein 7 HGSNAT 0.7987 0.0580 13.770.689.660 heparan-alpha-glucosaminide N-acetyltransferase precursor KCTD1 0.7987 0.0580 13.770.689.660 BTB/POZ domain-containing protein KCTD1 isoform b COPRS 13.977 0.1159 12.059.534.080 coordinator of PRMT5 and differentiation stimulator DENND4C 13.977 0.1159 12.059.534.080 DENN domain-containing protein 4C PARVB 0.6989 0.0580 12.050.000.000 parvin, beta RP9 0.6989 0.0580 12.050.000.000 retinitis pigmentosa 9 (autosomal dominant) TNKS1BP 1 0.6989 0.0580 12.050.000.000 182 kDa tankyrase-1-binding protein CDYL 12.979 0.1159 11.198.446.940 ATG2A 0.5990 0.0580 10.327.586.210 autophagy-related protein 2 homolog A CCNG2 0.5990 0.0580 10.327.586.210 cyclin-G2 CTH 0.5990 0.0580 10.327.586.210 cystathionase (cystathionine gamma-lyase) EIF3CL 0.5990 0.0580 10.327.586.210 eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C-like protein KIAA1430 0.5990 0.0580 10.327.586.210 UPF0501 protein KIAA1430 homolog MAP2K5 0.5990 0.0580 10.327.586.210 dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 5 NAGPA 0.5990 0.0580 10.327.586.210 N-acetylglucosamine-1-phosphodiester alpha-N- acetylglucosaminidase precursor PPAPDC1 B 0.5990 0.0580 10.327.586.210 phosphatidate phosphatase PPAPDC1B PUSL1 0.5990 0.0580 10.327.586.210 tRNA pseudouridine synthase-like 1 TREM1 0.5990 0.0580 10.327.586.210 triggering receptor expressed on myeloid cells 1 precursor TRAPPC5 10.982 0.1159 9.475.409.840 trafficking protein particle complex subunit 5 MBNL2 0.9984 0.1159 8.614.322.690 muscleblind-like 2 isoform A P2RX7 0.9984 0.1159 8.614.322.690 P2X purinoceptor 7 PEX26 0.9984 0.1159 8.614.322.690 peroxisome assembly protein 26 RN7SL2 0.9984 0.1159 8.614.322.690 ANGEL1 0.4992 0.0580 8.606.896.550 angel homolog 1 ARAP3 0.4992 0.0580 8.606.896.550 arf-GAP with Rho-GAP domain, ANK repeat and PH domain-containing protein 3 ARHGEF9 0.4992 0.0580 8.606.896.550 Cdc42 guanine nucleotide exchange factor (GEF) 9 C16orf13 0.4992 0.0580 8.606.896.550 UPF0585 protein C16orf13 homolog C1orf52 0.4992 0.0580 8.606.896.550 UPF0690 protein C1orf52 homolog CD84 0.4992 0.0580 8.606.896.550 SLAM family member 5 isoform 1 precursor CLSTN3 0.4992 0.0580 8.606.896.550 calsyntenin 3 precursor COQ9 0.4992 0.0580 8.606.896.550 ubiquinone biosynthesis protein COQ9, mitochondrial DHRS11 0.4992 0.0580 8.606.896.550 dehydrogenase/reductase (SDR family) member 11 126 FOXD2- AS1 0.4992 0.0580 8.606.896.550 LRRC25 0.4992 0.0580 8.606.896.550 leucine-rich repeat-containing protein 25 precursor PGBD5 0.4992 0.0580 8.606.896.550 piggyBac transposable element-derived protein 5 POLL 0.4992 0.0580 8.606.896.550 DNA polymerase lambda POLR2M 0.4992 0.0580 8.606.896.550 DNA-directed RNA polymerase II subunit GRINL1A RPS6KC1 0.4992 0.0580 8.606.896.550 ribosomal protein S6 kinase, 52kDa, polypeptide 1 TARSL2 0.4992 0.0580 8.606.896.550 probable threonine--tRNA ligase 2, cytoplasmic THAP9- AS1 0.4992 0.0580 8.606.896.550 TMEM128 0.4992 0.0580 8.606.896.550 transmembrane protein 128 TRIM9 0.4992 0.0580 8.606.896.550 tripartite motif-containing protein 9 VWA5A 0.4992 0.0580 8.606.896.550 von Willebrand factor A domain containing 5A XPNPEP3 0.4992 0.0580 8.606.896.550 probable Xaa-Pro aminopeptidase 3 ZNF35 0.4992 0.0580 8.606.896.550 zinc finger protein 35 ZNF45 0.4992 0.0580 8.606.896.550 zinc finger protein 45 ZNF791 0.4992 0.0580 8.606.896.550 zinc finger protein 791 CEP135 13.977 0.1739 8.037.377.800 centrosomal protein of 135 kDa FRRS1 0.8985 0.1159 7.752.372.740 ferric-chelate reductase 1 precursor HIVEP1 0.8985 0.1159 7.752.372.740 human immunodeficiency virus type I enhancer binding protein 1 ORAI3 0.8985 0.1159 7.752.372.740 protein orai-3 PPIH 0.8985 0.1159 7.752.372.740 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase H isoform 2 RHBDD2 0.8985 0.1159 7.752.372.740 rhomboid domain containing 2 TBC1D25 0.8985 0.1159 7.752.372.740 TBC1 domain family member 25 TFPT 0.8985 0.1159 7.752.372.740 TCF3 fusion partner homolog UNC50 0.8985 0.1159 7.752.372.740 protein unc-50 homolog SESN2 26.956 0.3478 7.750.431.280 sestrin 2 ZRANB1 12.979 0.1739 7.463.484.760 ubiquitin thioesterase zranb1 BRD8 0.7987 0.1159 6.891.285.590 bromodomain containing 8 C21orf33 0.7987 0.1159 6.891.285.590 uncharacterized protein LOC100381155 CR1 0.7987 0.1159 6.891.285.590 complement receptor type 1 precursor CYB5D1 0.7987 0.1159 6.891.285.590 cytochrome b5 domain-containing protein 1 FAM3A 0.7987 0.1159 6.891.285.590 protein FAM3A precursor LETMD1 0.7987 0.1159 6.891.285.590 LETM1 domain-containing protein 1 PDIK1L 0.7987 0.1159 6.891.285.590 serine/threonine-protein kinase pdik1l SEZ6L2 0.7987 0.1159 6.891.285.590 seizure protein 6 homolog precursor SLC37A4 0.7987 0.1159 6.891.285.590 solute carrier family 37 (glucose-6-phosphate transporter), member 4 RBMXL1 19.967 0.2898 6.889.924.090 RNA binding motif protein, X-linked-like-1 ACVR2B 11.980 0.1739 6.889.016.680 activin receptor type-2B precursor UBLCP1 11.980 0.1739 6.889.016.680 ubiquitin-like domain-containing CTD phosphatase 1 ago/03 0.3993 0.0580 6.884.482.760 protein argonaute-3 AMACR 0.3993 0.0580 6.884.482.760 alpha-methylacyl-CoA racemase ARAP2 0.3993 0.0580 6.884.482.760 arf-GAP with Rho-GAP domain, ANK repeat and PH domain-containing protein 2 C12orf76 0.3993 0.0580 6.884.482.760 uncharacterized protein C12orf76 CAMK1D 0.3993 0.0580 6.884.482.760 calcium/calmodulin-dependent protein kinase ID CBX8 0.3993 0.0580 6.884.482.760 chromobox homolog 8 CCDC115 0.3993 0.0580 6.884.482.760 coiled-coil domain-containing protein 115 127 CCDC9 0.3993 0.0580 6.884.482.760 coiled-coil domain-containing protein 9 E4F1 0.3993 0.0580 6.884.482.760 transcription factor E4F1 EVI5L 0.3993 0.0580 6.884.482.760 ecotropic viral integration site 5-like FAM127B 0.3993 0.0580 6.884.482.760 protein FAM127B isoform 2 FAM161B 0.3993 0.0580 6.884.482.760 protein FAM161B FBXL14 0.3993 0.0580 6.884.482.760 F-box and leucine-rich repeat protein 14 FBXO4 0.3993 0.0580 6.884.482.760 F-box protein 4 FRMD3 0.3993 0.0580 6.884.482.760 FERM domain-containing protein 3 GBP5 0.3993 0.0580 6.884.482.760 guanylate binding protein 5 GMDS 0.3993 0.0580 6.884.482.760 GDP-mannose 4,6 dehydratase isoform 1 HAUS4 0.3993 0.0580 6.884.482.760 HAUS augmin-like complex subunit 4 HIST2H4B 0.3993 0.0580 6.884.482.760 histone H4 ITGA7 0.3993 0.0580 6.884.482.760 integrin alpha-7 isoform 2 precursor KLHL35 0.3993 0.0580 6.884.482.760 kelch-like protein 35 LUC7L 0.3993 0.0580 6.884.482.760 LUC7-like MACROD1 0.3993 0.0580 6.884.482.760 MACRO domain-containing protein 1 MROH6 0.3993 0.0580 6.884.482.760 maestro heat-like repeat-containing protein family member 6 MXRA7 0.3993 0.0580 6.884.482.760 matrix-remodelling associated 7 NOSIP 0.3993 0.0580 6.884.482.760 nitric oxide synthase-interacting protein NT5C3A 0.3993 0.0580 6.884.482.760 cytosolic 5'-nucleotidase 3 PDSS1 0.3993 0.0580 6.884.482.760 decaprenyl-diphosphate synthase subunit 1 PLAGL1 0.3993 0.0580 6.884.482.760 zinc finger protein PLAGL1 isoform 1 RANBP6 0.3993 0.0580 6.884.482.760 ran-binding protein 6 isoform 3 RIMS3 0.3993 0.0580 6.884.482.760 regulating synaptic membrane exocytosis protein 3 SDHAP1 0.3993 0.0580 6.884.482.760 SNHG6 0.3993 0.0580 6.884.482.760 TBCK 0.3993 0.0580 6.884.482.760 TBC domain-containing protein kinase-like protein TCF7L2 0.3993 0.0580 6.884.482.760 transcription factor 7-like 2 TGFBR3 0.3993 0.0580 6.884.482.760 transforming growth factor beta receptor type 3 precursor TMEM53 0.3993 0.0580 6.884.482.760 transmembrane protein 53 XYLT2 0.3993 0.0580 6.884.482.760 xylosyltransferase II ZFYVE19 0.3993 0.0580 6.884.482.760 zinc finger FYVE domain-containing protein 19 ZNF324B 0.3993 0.0580 6.884.482.760 zinc finger protein 324B QTRT1 10.982 0.1739 6.315.123.630 queuine tRNA-ribosyltransferase TNKS 21.964 0.3478 6.315.123.630 tankyrase-1 CARM1 17.971 0.2898 6.201.173.220 histone-arginine methyltransferase CARM1 AP3M2 0.6989 0.1159 6.030.198.450 AP-3 complex subunit mu-2 EML3 0.6989 0.1159 6.030.198.450 echinoderm microtubule-associated protein-like 3 GRPEL2 0.6989 0.1159 6.030.198.450 GrpE-like 2, mitochondrial KIF24 0.6989 0.1159 6.030.198.450 kinesin-like protein KIF24 PPP1R12 B 0.6989 0.1159 6.030.198.450 protein phosphatase 1, regulatory subunit 12B PTTG1 0.6989 0.1159 6.030.198.450 pituitary tumor-transforming 1 SAMM50 0.6989 0.1159 6.030.198.450 sorting and assembly machinery component 50 homolog A SLC35A5 0.6989 0.1159 6.030.198.450 probable UDP-sugar transporter protein SLC35A5 TMEM18 0.6989 0.1159 6.030.198.450 transmembrane protein 18 128 TRUB1 0.6989 0.1159 6.030.198.450 probable tRNA pseudouridine synthase 1 ZNF277 0.6989 0.1159 6.030.198.450 zinc finger protein 277 NFIL3 13.977 0.2318 6.029.767.040 nuclear factor interleukin-3-regulated protein RNF34 13.977 0.2318 6.029.767.040 E3 ubiquitin-protein ligase RNF34 COPS4 0.9984 0.1739 5.741.230.590 COP9 signalosome subunit 4 FKTN 0.9984 0.1739 5.741.230.590 fukutin ST6GAL1 0.9984 0.1739 5.741.230.590 beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 TSC22D1 0.9984 0.1739 5.741.230.590 TSC22 domain family protein 1 ZNF865 0.9984 0.1739 5.741.230.590 zinc finger protein 865 KLC4 12.979 0.2318 5.599.223.470 kinesin light chain 4 isoform b TMEM14B 12.979 0.2318 5.599.223.470 transmembrane protein 14B isoform b VLDLR 12.979 0.2318 5.599.223.470 very low-density lipoprotein receptor precursor ALKBH3 0.5990 0.1159 5.168.248.490 alkB, alkylation repair homolog 3 BUD31 0.5990 0.1159 5.168.248.490 protein BUD31 homolog C19orf47 0.5990 0.1159 5.168.248.490 chromosome 19 open reading frame 47 CLN5 0.5990 0.1159 5.168.248.490 ceroid-lipofuscinosis, neuronal 5 precursor CSRP2BP 0.5990 0.1159 5.168.248.490 cysteine-rich protein 2-binding protein FAM160B 1 0.5990 0.1159 5.168.248.490 uncharacterized protein LOC100038786 FAM86DP 0.5990 0.1159 5.168.248.490 GPT2 0.5990 0.1159 5.168.248.490 glucose-6-phosphate/phosphate translocator 2 MTMR10 0.5990 0.1159 5.168.248.490 myotubularin-related protein 10 NARS2 0.5990 0.1159 5.168.248.490 probable asparaginyl-tRNA synthetase, mitochondrial PRDM15 0.5990 0.1159 5.168.248.490 PR domain zinc finger protein 15 isoform 1 TLK2 11.980 0.2318 5.168.248.490 serine/threonine-protein kinase tousled-like 2 TOR2A 0.5990 0.1159 5.168.248.490 torsin family 2, member A precursor VPS52 0.5990 0.1159 5.168.248.490 vacuolar protein sorting-associated protein 52 homolog ZFAT 0.5990 0.1159 5.168.248.490 zinc finger and AT hook domain containing GPN3 14.975 0.2898 5.167.356.800 GPN-loop GTPase 3 TTC19 14.975 0.2898 5.167.356.800 tetratricopeptide repeat protein 19, mitochondrial isoform 2 LARS2 17.971 0.3478 5.167.050.030 probable leucyl-tRNA synthetase, mitochondrial SHARPIN 17.971 0.3478 5.167.050.030 sharpin TSEN15 17.971 0.3478 5.167.050.030 tRNA-splicing endonuclease subunit Sen15 YLPM1 17.971 0.3478 5.167.050.030 YLP motif-containing protein 1 MMGT1 0.8985 0.1739 5.166.762.510 membrane magnesium transporter 1 precursor RPL37 0.8985 0.1739 5.166.762.510 ribosomal protein L37 SUV39H2 0.8985 0.1739 5.166.762.510 suppressor of variegation 3-9 homolog 2 VTI1B 0.8985 0.1739 5.166.762.510 vesicle transport through interaction with t-SNAREs homolog 1B ADAL 0.2995 0.0580 5.163.793.100 adenosine deaminase-like protein ADCK5 0.2995 0.0580 5.163.793.100 aarF domain containing kinase 5 ASCC1 0.2995 0.0580 5.163.793.100 activating signal cointegrator 1 complex subunit 1 ATP6V0D2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 ATPase, H+ transporting, lysosomal 38kDa, V0 subunit d2 B4GALT2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4- galactosyltransferase, polypeptide 2 BBC3 0.2995 0.0580 5.163.793.100 BCL2 binding component 3 C11orf45 0.2995 0.0580 5.163.793.100 putative uncharacterized protein C11orf45 129 C1orf233 0.2995 0.0580 5.163.793.100 fibronectin type-III domain-containing transmembrane protein C1orf233 precursor C1RL-AS1 0.2995 0.0580 5.163.793.100 CARHSP1 0.2995 0.0580 5.163.793.100 calcium-regulated heat stable protein 1 CCDC138 0.2995 0.0580 5.163.793.100 coiled-coil domain containing 138 CCDC150 0.2995 0.0580 5.163.793.100 coiled-coil domain-containing protein 150 CD300E 0.2995 0.0580 5.163.793.100 CMRF35-like molecule 2 precursor CEP19 0.2995 0.0580 5.163.793.100 centrosomal protein of 19 kDa CHRNA7 0.2995 0.0580 5.163.793.100 neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-7 CHRNB2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 cholinergic receptor, nicotinic, beta 2 (neuronal) precursor CLEC2D 0.2995 0.0580 5.163.793.100 C-type lectin domain family 2 member D isoform 1 CSPP1 0.2995 0.0580 5.163.793.100 centrosome and spindle pole-associated protein 1 CUTC 0.2995 0.0580 5.163.793.100 copper homeostasis protein cutC homolog CYB5A 0.2995 0.0580 5.163.793.100 cytochrome b5 EEF1E1 0.2995 0.0580 5.163.793.100 eukaryotic translation elongation factor 1 epsilon 1 ERI2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 ERI1 exoribonuclease 2 F2RL3 0.2995 0.0580 5.163.793.100 proteinase-activated receptor 4 precursor FAM171A 2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 uncharacterized protein LOC100158440 precursor FAM195A 0.2995 0.0580 5.163.793.100 uncharacterized protein LOC379127 FBXW9 0.2995 0.0580 5.163.793.100 F-box and WD repeat domain containing 9 FOXF1 0.2995 0.0580 5.163.793.100 forkhead box protein F1 GPHN 0.2995 0.0580 5.163.793.100 gephyrin HIST1H3B 0.2995 0.0580 5.163.793.100 histone H3.2 HSPBAP1 0.2995 0.0580 5.163.793.100 HSPB1-associated protein 1 homolog LIMD2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 LIM domain containing 2 LINC0026 5 0.2995 0.0580 5.163.793.100 LOC10028 8069 0.2995 0.0580 5.163.793.100 LRSAM1 0.2995 0.0580 5.163.793.100 E3 ubiquitin-protein ligase LRSAM1 LRTOMT 0.2995 0.0580 5.163.793.100 leucine-rich repeat-containing protein 51 LTBP2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 latent-transforming growth factor beta-binding protein 2 precursor METTL14 0.2995 0.0580 5.163.793.100 methyltransferase-like protein 14 MFSD3 0.2995 0.0580 5.163.793.100 major facilitator superfamily domain containing 3 MIPEP 0.2995 0.0580 5.163.793.100 MVB12A 0.2995 0.0580 5.163.793.100 multivesicular body subunit 12A MVD 0.2995 0.0580 5.163.793.100 diphosphomevalonate decarboxylase NDUFS4 0.2995 0.0580 5.163.793.100 NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 4, mitochondrial NEURL1B 0.2995 0.0580 5.163.793.100 uncharacterized protein LOC553620 PTBP2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 polypyrimidine tract-binding protein 2 RNF121 0.2995 0.0580 5.163.793.100 ring finger protein 121 RRAS 0.2995 0.0580 5.163.793.100 ras-related protein R-Ras SCN8A 0.2995 0.0580 5.163.793.100 sodium channel, voltage gated, type VIII, alpha subunit SIPA1L3 0.2995 0.0580 5.163.793.100 signal-induced proliferation-associated 1-like protein 3 SLC39A13 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc transporter ZIP13 SLFN5 0.2995 0.0580 5.163.793.100 schlafen family member 5 SNHG5 0.2995 0.0580 5.163.793.100 130 SNIP1 0.2995 0.0580 5.163.793.100 Smad nuclear interacting protein SOS2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 son of sevenless homolog 2 ST20 0.2995 0.0580 5.163.793.100 suppressor of tumorigenicity 20 protein TAF4B 0.2995 0.0580 5.163.793.100 transcription initiation factor TFIID subunit 4B TCEA2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 transcription elongation factor A protein 2 TMEM208 0.2995 0.0580 5.163.793.100 transmembrane protein 208 TMEM41B 0.2995 0.0580 5.163.793.100 transmembrane protein 41B TRUB2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 probable tRNA pseudouridine synthase 2 TSSC4 0.2995 0.0580 5.163.793.100 protein TSSC4 TUBGCP5 0.2995 0.0580 5.163.793.100 gamma-tubulin complex component 5 UBXN8 0.2995 0.0580 5.163.793.100 UBX domain-containing protein 8 isoform 1 UQCC2 0.2995 0.0580 5.163.793.100 ubiquinol-cytochrome c reductase complex assembly factor 2 WWP1 0.2995 0.0580 5.163.793.100 WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1 ZBTB22 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger and BTB domain-containing protein 22 ZFP62 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 62 homolog isoform 2 ZNF131 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 131 ZNF16 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 16 ZNF180 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 180 ZNF319 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 319 ZNF436 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 436 ZNF500 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 500 ZNF519 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 519 ZNF618 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 618 ZNF628 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 628 ZNF649 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 649 ZNF708 0.2995 0.0580 5.163.793.100 zinc finger protein 708 FXR1 22.962 0.4637 4.951.908.560 fragile X mental retardation syndrome-related protein 1 TRIB3 42.930 0.8694 4.937.888.200 tribbles homolog 3 NOC3L 19.967 0.4057 4.921.616.960 nucleolar complex protein 3 homolog FUBP3 10.982 0.2318 4.737.704.920 Far upstream element-binding protein 3 TRAPPC1 10.982 0.2318 4.737.704.920 trafficking protein particle complex subunit 1 ARL6IP4 0.7987 0.1739 4.592.869.470 ADP-ribosylation factor-like protein 6-interacting protein 4 CHMP2B 0.7987 0.1739 4.592.869.470 charged multivesicular body protein 2b EXOC1 0.7987 0.1739 4.592.869.470 exocyst complex component 1 FAR1 15.974 0.3478 4.592.869.470 fatty acyl-CoA reductase 1 FOXRED1 0.7987 0.1739 4.592.869.470 FAD-dependent oxidoreductase domain-containing protein 1 IQCB1 0.7987 0.1739 4.592.869.470 IQ motif containing B1 PCMTD2 0.7987 0.1739 4.592.869.470 protein-L-isoaspartate (D-aspartate) O- methyltransferase domain containing 2 PI4KAP2 0.7987 0.1739 4.592.869.470 STX11 15.974 0.3478 4.592.869.470 syntaxin-11 SUV420H2 0.7987 0.1739 4.592.869.470 suppressor of variegation 4-20 protein-like 2 CYTH4 12.979 0.2898 4.478.605.940 cytohesin-4 SMOX 17.971 0.4057 4.429.627.800 spermine oxidase B3GNTL1 0.4992 0.1159 4.307.161.350 UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N- acetylglucosaminyltransferase-like protein 1 CEP120 0.4992 0.1159 4.307.161.350 centrosomal protein 120kDa 131 CHMP4A 0.4992 0.1159 4.307.161.350 charged multivesicular body protein 4a CNOT3 0.9984 0.2318 4.307.161.350 CCR4-NOT transcription complex subunit 3 CYP2R1 0.4992 0.1159 4.307.161.350 cytochrome P450, family 2, subfamily R, polypeptide 1 DDIT3 0.4992 0.1159 4.307.161.350 DNA-damage-inducible transcript 3 EARS2 0.9984 0.2318 4.307.161.350 probable glutamate--tRNA ligase, mitochondrial precursor ECT2 0.9984 0.2318 4.307.161.350 CIPK1 interacting protein ECT2 EIF4EBP1 0.9984 0.2318 4.307.161.350 eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 FDX1 0.4992 0.1159 4.307.161.350 ferredoxin 1 GPS2 0.4992 0.1159 4.307.161.350 G protein pathway suppressor 2 HCST 0.4992 0.1159 4.307.161.350 hematopoietic cell signal transducer precursor IFFO1 0.4992 0.1159 4.307.161.350 IL31RA 0.4992 0.1159 4.307.161.350 interleukin-31 receptor subunit alpha isoform 1 INTS12 0.4992 0.1159 4.307.161.350 integrator complex subunit 12 ITFG2 0.4992 0.1159 4.307.161.350 integrin alpha FG-GAP repeat containing 2 LETM2 0.4992 0.1159 4.307.161.350 LETM1 domain-containing protein LETM2, mitochondrial precursor MFGE8 0.4992 0.1159 4.307.161.350 milk fat globule-EGF factor 8 protein precursor NOD2 0.4992 0.1159 4.307.161.350 nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 NPDC1 0.4992 0.1159 4.307.161.350 neural proliferation, differentiation and control, 1 precursor OVCA2 0.4992 0.1159 4.307.161.350 candidate tumor suppressor in ovarian cancer 2 PLEKHM1 P 0.4992 0.1159 4.307.161.350 PPM1D 0.4992 0.1159 4.307.161.350 protein phosphatase 1D magnesium-dependent, delta isoform RFK 0.4992 0.1159 4.307.161.350 riboflavin kinase RNF167 0.4992 0.1159 4.307.161.350 ring finger protein 167 precursor RPL23AP5 3 0.4992 0.1159 4.307.161.350 RRAGA 0.4992 0.1159 4.307.161.350 ras-related GTP-binding protein A SAP30L 0.4992 0.1159 4.307.161.350 histone deacetylase complex subunit SAP30L SAT2 0.4992 0.1159 4.307.161.350 diamine N-acetyltransferase 2 SDCCAG8 0.4992 0.1159 4.307.161.350 serologically defined colon cancer antigen 8 SGSM3 0.4992 0.1159 4.307.161.350 small G protein signaling modulator 3 SLC25A25 0.4992 0.1159 4.307.161.350 calcium-binding mitochondrial carrier protein SCaMC-2 SLC35F2 0.4992 0.1159 4.307.161.350 solute carrier family 35, member F2 SOCS5 0.4992 0.1159 4.307.161.350 suppressor of cytokine signaling 5 SP2 0.4992 0.1159 4.307.161.350 sp2 protein precursor TDRD7 0.4992 0.1159 4.307.161.350 tudor domain-containing protein 7A isoform 2 TMCC1 0.4992 0.1159 4.307.161.350 transmembrane and coiled-coil domain family 1 TMEM242 0.4992 0.1159 4.307.161.350 transmembrane protein 242 TMEM39B 0.4992 0.1159 4.307.161.350 transmembrane protein 39B TRIOBP 0.4992 0.1159 4.307.161.350 uncharacterized protein LOC790927 VWA8 0.4992 0.1159 4.307.161.350 von Willebrand factor A domain-containing protein 8 ZNF133 0.4992 0.1159 4.307.161.350 zinc finger protein 133 ZNF274 0.4992 0.1159 4.307.161.350 neurotrophin receptor-interacting factor homolog isoform a ZNF7 0.4992 0.1159 4.307.161.350 zinc finger protein 7 BMP2K 24.959 0.5796 4.306.245.690 BMP-2-inducible protein kinase isoform 2 132 MRGBP 14.975 0.3478 4.305.635.420 MRG/MORF4L binding protein SARS 14.975 0.3478 4.305.635.420 seryl-tRNA synthetase, cytoplasmic TGM5 14.975 0.3478 4.305.635.420 protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 5 isoform 1 WDR37 14.975 0.3478 4.305.635.420 WD repeat-containing protein 37 ARHGEF1 0 21.964 0.5217 4.210.082.420 rho guanine nucleotide exchange factor 10 AQR 38.936 0.9274 4.198.404.140 intron-binding protein aquarius BTF3L4 11.980 0.2898 4.133.885.440 transcription factor BTF3 homolog 4 CCZ1B 11.980 0.2898 4.133.885.440 vacuolar fusion protein CCZ1 homolog TRMT1L 11.980 0.2898 4.133.885.440 tRNA methyltransferase 1 homolog (S. cerevisiae)-like CYTH2 18.969 0.4637 4.090.791.460 cytohesin 2 SRGAP2 18.969 0.4637 4.090.791.460 SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 2 MSL2 32.946 0.8115 4.059.889.090 Male-specific lethal 2-like 1 IGF2BP3 39.935 0.9854 4.052.668.970 insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3 AKAP17A 0.6989 0.1739 4.018.976.420 splicing factor, arginine/serine-rich 17A CCNYL1 0.6989 0.1739 4.018.976.420 cyclin-Y-like protein 1 CDK14 0.6989 0.1739 4.018.976.420 cyclin-dependent kinase 14 CYB5R4 0.6989 0.1739 4.018.976.420 cytochrome b5 reductase 4 EXOSC9 0.6989 0.1739 4.018.976.420 exosome complex exonuclease RRP45 GSAP 0.6989 0.1739 4.018.976.420 gamma-secretase-activating protein LOC15077 6 0.6989 0.1739 4.018.976.420 PDLIM2 0.6989 0.1739 4.018.976.420 PDZ and LIM domain protein 2 RNPEPL1 0.6989 0.1739 4.018.976.420 arginyl aminopeptidase-like 1 SNX13 0.6989 0.1739 4.018.976.420 sorting nexin-13 ZXDB 0.6989 0.1739 4.018.976.420 zinc finger X-linked protein ZXDB PPDPF 13.977 0.3478 4.018.688.900 pancreatic progenitor cell differentiation and proliferation factor TRIM33 13.977 0.3478 4.018.688.900 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM33 USP31 13.977 0.3478 4.018.688.900 ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 31 VPS26B 13.977 0.3478 4.018.688.900 vacuolar protein sorting-associated protein 26B C1orf109 0.8985 0.2318 3.876.186.370 uncharacterized protein C1orf109 homolog CRAT 0.8985 0.2318 3.876.186.370 carnitine O-acetyltransferase isoform 1 precursor CUEDC2 0.8985 0.2318 3.876.186.370 CUE domain-containing protein 2 DNAJC16 0.8985 0.2318 3.876.186.370 dnaJ homolog subfamily C member 16 precursor KIAA0226 0.8985 0.2318 3.876.186.370 run domain Beclin-1 interacting and cysteine-rich containing protein isoform 1 MICALL1 0.8985 0.2318 3.876.186.370 MICAL-like protein 1 RHOT2 0.8985 0.2318 3.876.186.370 mitochondrial Rho GTPase 2 SPTSSA 0.8985 0.2318 3.876.186.370 serine palmitoyltransferase small subunit A STX10 0.8985 0.2318 3.876.186.370 Syntaxin-10 TBP 0.8985 0.2318 3.876.186.370 TATA binding protein TINF2 0.8985 0.2318 3.876.186.370 TERF1 (TRF1)-interacting nuclear factor 2 ZNF689 0.8985 0.2318 3.876.186.370 zinc finger protein 689 MAD2L2 19.967 0.5217 3.827.295.380 mitotic spindle assembly checkpoint protein MAD2B RBM5 19.967 0.5217 3.827.295.380 RNA-binding protein 5 CLTB 10.982 0.2898 3.789.510.010 clathrin, light polypeptide (Lcb) CSF2RB 21.964 0.5796 3.789.510.010 colony stimulating factor 2 receptor, beta, low-affinity (granulocyte-macrophage) precursor 133 ITPR2 10.982 0.2898 3.789.510.010 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 2 MAP1LC3 B 10.982 0.2898 3.789.510.010 microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B RBM28 10.982 0.2898 3.789.510.010 RNA-binding protein 28 UNC119B 10.982 0.2898 3.789.510.010 unc-119 homolog b isoform 1 WIZ 10.982 0.2898 3.789.510.010 protein Wiz XRN1 10.982 0.2898 3.789.510.010 5'-3' exoribonuclease 1 ZNF469 10.982 0.2898 3.789.510.010 zinc finger protein 469 UBE2H 25.957 0.6955 3.732.135.150 ubiquitin-conjugating enzyme E2 H NUMB 12.979 0.3478 3.731.742.380 Numb protein TICRR 12.979 0.3478 3.731.742.380 treslin SLC25A13 22.962 0.6376 3.601.317.440 solute carrier family 25 (aspartate/glutamate carrier), member 13 SDHA 44.926 12.752 3.523.055.210 succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp) CBFA2T2 0.7987 0.2318 3.445.642.800 protein CBFA2T2 DYNLT3 0.7987 0.2318 3.445.642.800 dynein light chain Tctex-type 3 FAM76B 0.7987 0.2318 3.445.642.800 protein FAM76B GPSM3 0.7987 0.2318 3.445.642.800 G-protein-signaling modulator 3 ITFG3 0.7987 0.2318 3.445.642.800 ITFG3 protein LUC7L2 0.7987 0.2318 3.445.642.800 LUC7-like 2 MARCH5 0.7987 0.2318 3.445.642.800 E3 ubiquitin-protein ligase MARCH5 NAAA 0.7987 0.2318 3.445.642.800 N-acylethanolamine acid amidase precursor NKIRAS2 0.7987 0.2318 3.445.642.800 NF-kappa-B inhibitor-interacting Ras-like protein 2 PPHLN1 0.7987 0.2318 3.445.642.800 periphilin-1 ZNF526 0.7987 0.2318 3.445.642.800 zinc finger protein 526 AKT1S1 0.3993 0.1159 3.445.211.390 AKT1 substrate 1 (proline-rich) ANAPC15 0.3993 0.1159 3.445.211.390 anaphase-promoting complex subunit 15 ASPSCR1 0.3993 0.1159 3.445.211.390 uncharacterized protein LOC495145 C22orf29 0.3993 0.1159 3.445.211.390 protein Bop C5AR2 0.3993 0.1159 3.445.211.390 C5a anaphylatoxin chemotactic receptor 2 C9orf91 0.3993 0.1159 3.445.211.390 transmembrane protein C9orf91 CCDC134 0.3993 0.1159 3.445.211.390 coiled-coil domain-containing protein 134 precursor CDK8 0.3993 0.1159 3.445.211.390 cyclin-dependent kinase 8 CYTH1 0.3993 0.1159 3.445.211.390 cytohesin 2 DAB2 0.3993 0.1159 3.445.211.390 disabled homolog 2 DOCK9 0.3993 0.1159 3.445.211.390 dedicator of cytokinesis protein 9 DTD2 0.3993 0.1159 3.445.211.390 probable D-tyrosyl-tRNA(Tyr) deacylase 2 DUSP16 0.3993 0.1159 3.445.211.390 dual specificity protein phosphatase 16 EIF5AL1 0.3993 0.1159 3.445.211.390 eukaryotic translation initiation factor 5A-1-like FAM195B 0.3993 0.1159 3.445.211.390 protein FAM195B FAM72C 0.3993 0.1159 3.445.211.390 protein FAM72C FBXO21 0.3993 0.1159 3.445.211.390 F-box protein 21 GAL 0.3993 0.1159 3.445.211.390 galanin isoform 2 precursor GPR137 0.3993 0.1159 3.445.211.390 integral membrane protein GPR137 isoform 1 GTPBP3 0.3993 0.1159 3.445.211.390 tRNA modification GTPase GTPBP3, mitochondrial precursor HERC4 0.3993 0.1159 3.445.211.390 probable E3 ubiquitin-protein ligase HERC4 KDM3A 0.3993 0.1159 3.445.211.390 lysine-specific demethylase 3A 134 LANCL2 0.3993 0.1159 3.445.211.390 lanC-like protein 2 LYRM7 0.3993 0.1159 3.445.211.390 complex III assembly factor LYRM7 MRPL23 0.3993 0.1159 3.445.211.390 39S ribosomal protein L23, mitochondrial NIFK-AS1 0.3993 0.1159 3.445.211.390 OARD1 0.3993 0.1159 3.445.211.390 O-acyl-ADP-ribose deacylase 1 OSER1 0.3993 0.1159 3.445.211.390 oxidative stress responsive 1 OTUD7B 0.3993 0.1159 3.445.211.390 OTU domain-containing protein 7B PHLDA1 0.3993 0.1159 3.445.211.390 pleckstrin homology-like domain family A member 1 POGLUT1 0.3993 0.1159 3.445.211.390 KTEL motif-containing protein 1 precursor PPP1R16 A 0.3993 0.1159 3.445.211.390 protein phosphatase 1, regulatory subunit 16A PRMT7 0.3993 0.1159 3.445.211.390 protein arginine N-methyltransferase 7 PUS7L 0.3993 0.1159 3.445.211.390 pseudouridylate synthase 7 homolog-like protein RPS27L 0.3993 0.1159 3.445.211.390 ribosomal protein S27-like RWDD4 0.3993 0.1159 3.445.211.390 RWD domain-containing protein 4A SERINC2 0.3993 0.1159 3.445.211.390 serine incorporator 2 precursor SLC15A4 0.3993 0.1159 3.445.211.390 solute carrier family 15 member 4 SLC7A5P2 0.3993 0.1159 3.445.211.390 SNRNP27 0.3993 0.1159 3.445.211.390 U4/U6.U5 small nuclear ribonucleoprotein 27 kDa protein TMEM63C 0.3993 0.1159 3.445.211.390 transmembrane protein 63C TRIP10 0.3993 0.1159 3.445.211.390 cdc42-interacting protein 4 UCK1 0.3993 0.1159 3.445.211.390 uridine-cytidine kinase 1 ZNF777 0.3993 0.1159 3.445.211.390 zinc finger protein 777 CIZ1 13.977 0.4057 3.445.156.520 cip1-interacting zinc finger protein isoform 1 BRI3 0.9984 0.2898 3.445.134.580 brain protein I3 CD109 0.9984 0.2898 3.445.134.580 CD109 antigen isoform 1 precursor EXOSC3 0.9984 0.2898 3.445.134.580 exosome complex exonuclease RRP40 FOXP1 0.9984 0.2898 3.445.134.580 forkhead box P1 PBXIP1 0.9984 0.2898 3.445.134.580 pre-B-cell leukemia transcription factor-interacting protein 1 SIRPB1 0.9984 0.2898 3.445.134.580 signal-regulatory protein beta-1 isoform 1 precursor TBC1D8 0.9984 0.2898 3.445.134.580 TBC1 domain family member 8 PRPF38A 19.967 0.5796 3.444.962.040 pre-mRNA-splicing factor 38A LAMP5 15.974 0.4637 3.444.899.720 lysosome-associated membrane glycoprotein 5 precursor TM9SF4 15.974 0.4637 3.444.899.720 transmembrane 9 superfamily protein member 4 precursor ALDH6A1 0.5990 0.1739 3.444.508.340 methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase [acylating], mitochondrial APBA2 0.5990 0.1739 3.444.508.340 amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family A, member 2 C16orf62 0.5990 0.1739 3.444.508.340 uncharacterized protein LOC100145160 C2orf69 0.5990 0.1739 3.444.508.340 uncharacterized protein LOC549281 CABLES1 0.5990 0.1739 3.444.508.340 CDK5 and ABL1 enzyme substrate 1 CBX1 0.5990 0.1739 3.444.508.340 Chromobox protein homolog 1 DCAF10 0.5990 0.1739 3.444.508.340 DDB1- and CUL4-associated factor 10 DNAJC27 0.5990 0.1739 3.444.508.340 dnaJ homolog subfamily C member 27 DNPEP 0.5990 0.1739 3.444.508.340 aspartyl aminopeptidase DPY19L4 0.5990 0.1739 3.444.508.340 probable C-mannosyltransferase DPY19L4 135 FAM160B 2 0.5990 0.1739 3.444.508.340 protein FAM160B2 GGPS1 0.5990 0.1739 3.444.508.340 geranylgeranyl pyrophosphate synthase 1 HIST1H1D 0.5990 0.1739 3.444.508.340 histone cluster 1, H1d KDM7A 0.5990 0.1739 3.444.508.340 lysine-specific demethylase 7 LCORL 0.5990 0.1739 3.444.508.340 ligand-dependent nuclear receptor corepressor-like protein LRBA 0.5990 0.1739 3.444.508.340 lipopolysaccharide-responsive and beige-like anchor protein isoform 1 PINX1 0.5990 0.1739 3.444.508.340 pin2-interacting protein X1 PLCB1 0.5990 0.1739 3.444.508.340 phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) RAB40C 0.5990 0.1739 3.444.508.340 ras-related protein Rab-40C RAB5B 0.5990 0.1739 3.444.508.340 ras-related protein Rab-5B RBM7 0.5990 0.1739 3.444.508.340 RNA binding motif protein 7 SLC25A35 0.5990 0.1739 3.444.508.340 solute carrier family 25 member 35 SMDT1 0.5990 0.1739 3.444.508.340 single-pass membrane protein with aspartate-rich tail 1, mitochondrial precursor SRD5A1 0.5990 0.1739 3.444.508.340 3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 1 SYNC 0.5990 0.1739 3.444.508.340 syncoilin TECPR2 0.5990 0.1739 3.444.508.340 tectonin beta-propeller repeat-containing protein 2 TOB2 0.5990 0.1739 3.444.508.340 Tob VPS45 0.5990 0.1739 3.444.508.340 vacuolar protein sorting 45 ZNF324 0.5990 0.1739 3.444.508.340 zinc finger protein 324A ACOX2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 acyl-CoA oxidase 2, branched chain ADAM8 0.1997 0.0580 3.443.103.450 a disintegrin and metalloproteinase domain 8 precursor AGPAT4 0.1997 0.0580 3.443.103.450 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase delta ALG10B 0.1997 0.0580 3.443.103.450 putative Dol-P-Glc:Glc(2)Man(9)GlcNAc(2)-PP-Dol alpha-1,2-glucosyltransferase AMDHD2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 amidohydrolase domain containing 2 ANKMY2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 ankyrin repeat and MYND domain-containing protein 2 ARMC7 0.1997 0.0580 3.443.103.450 armadillo repeat containing 7 ATF3 0.1997 0.0580 3.443.103.450 transcription factor protein ATG4C 0.1997 0.0580 3.443.103.450 cysteine protease ATG4C BBS4 0.1997 0.0580 3.443.103.450 Bardet-Biedl syndrome 4 BMS1P4 0.1997 0.0580 3.443.103.450 BTN3A2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 butyrophilin subfamily 3 member A2 isoform a precursor C17orf53 0.1997 0.0580 3.443.103.450 uncharacterized protein C17orf53 isoform 2 C17orf59 0.1997 0.0580 3.443.103.450 uncharacterized protein C17orf59 C19orf24 0.1997 0.0580 3.443.103.450 uncharacterized protein LOC733527 precursor C4orf33 0.1997 0.0580 3.443.103.450 UPF0462 protein C4orf33 homolog C5orf66 0.1997 0.0580 3.443.103.450 uncharacterized protein LOC100996485 CCDC109 B 0.1997 0.0580 3.443.103.450 coiled-coil domain containing 109B CCDC41 0.1997 0.0580 3.443.103.450 coiled-coil domain containing 41 CCDC61 0.1997 0.0580 3.443.103.450 coiled-coil domain-containing protein 61 CDKN2AI PNL 0.1997 0.0580 3.443.103.450 CDKN2AIP N-terminal-like protein CHIC2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 cysteine-rich hydrophobic domain 2 protein CLHC1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 clathrin heavy chain linker domain containing 1 COG6 0.1997 0.0580 3.443.103.450 component of oligomeric golgi complex 6 COMMD10 0.1997 0.0580 3.443.103.450 COMM domain containing 10 136 CPNE8 0.1997 0.0580 3.443.103.450 copine-8 CREB3 0.1997 0.0580 3.443.103.450 cAMP responsive element binding protein 3 CRLF2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 cytokine receptor-like factor 2 isoform 1 precursor CTBP1- AS2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 CTNS 0.1997 0.0580 3.443.103.450 cystinosin precursor CTU1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 1 CYB5RL 0.1997 0.0580 3.443.103.450 NADH-cytochrome b5 reductase-like DBP 0.1997 0.0580 3.443.103.450 D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein DCAF4 0.1997 0.0580 3.443.103.450 DDB1- and CUL4-associated factor 4 isoform 1 DCAKD 0.1997 0.0580 3.443.103.450 dephospho-CoA kinase domain-containing protein DCP1B 0.1997 0.0580 3.443.103.450 mRNA-decapping enzyme 1B DDX26B 0.1997 0.0580 3.443.103.450 integrator complex subunit 6 DLG4 0.1997 0.0580 3.443.103.450 lethal(2) giant larvae protein homolog 1 DNMT3B 0.1997 0.0580 3.443.103.450 DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3 beta DYRK3 0.1997 0.0580 3.443.103.450 dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 3 DYRK4 0.1997 0.0580 3.443.103.450 dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 4 isoform 1 EDF1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 endothelial differentiation-related factor 1 homolog ENDOG 0.1997 0.0580 3.443.103.450 endonuclease G, mitochondrial ERCC6L2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 uncharacterized protein LOC100127871 ERCC8 0.1997 0.0580 3.443.103.450 DNA excision repair protein ERCC-8 FAM200B 0.1997 0.0580 3.443.103.450 putative protein FAM200B FAM220A 0.1997 0.0580 3.443.103.450 protein FAM220A FAM83G 0.1997 0.0580 3.443.103.450 protein FAM83G FBN1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 fibrillin-1 precursor FBXO46 0.1997 0.0580 3.443.103.450 F-box protein 46 FKRP 0.1997 0.0580 3.443.103.450 fukutin-related protein isoform 1 FLJ10038 0.1997 0.0580 3.443.103.450 FPGT 0.1997 0.0580 3.443.103.450 fucose-1-phosphate guanylyltransferase FRA10AC 1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 FRA10AC1 protein FSCN1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 fascin FSD1L 0.1997 0.0580 3.443.103.450 FSD1-like protein isoform 2 GAS2L1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 GAS2-like protein 1 isoform a GGCX 0.1997 0.0580 3.443.103.450 gamma-glutamyl carboxylase GIMAP2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 GTPase IMAP family member 2 GTDC1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 glycosyltransferase-like domain-containing protein 1 HAUS8 0.1997 0.0580 3.443.103.450 HAUS augmin-like complex subunit 8 HIST1H2A I 0.1997 0.0580 3.443.103.450 histone H2A type 1 HSF2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 heat shock factor protein 2 isoform c IFT46 0.1997 0.0580 3.443.103.450 intraflagellar transport 46 homolog IL22RA2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 interleukin-22 receptor subunit alpha-2 isoform 2 precursor INO80C 0.1997 0.0580 3.443.103.450 INO80 complex subunit C-like ITGA3 0.1997 0.0580 3.443.103.450 integrin alpha-3 precursor lCORL 0.1997 0.0580 3.443.103.450 junction plakoglobin KAT5 0.1997 0.0580 3.443.103.450 K(lysine) acetyltransferase 5 137 KHK 0.1997 0.0580 3.443.103.450 ketohexokinase KIF16B 0.1997 0.0580 3.443.103.450 kinesin-like protein KIF16B isoform 1 KLF9 0.1997 0.0580 3.443.103.450 Kruppel-like factor 9 KLHDC2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 kelch domain containing 2 KNOP1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 lysine-rich nucleolar protein 1 LILRA5 0.1997 0.0580 3.443.103.450 leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 5 isoform 1 precursor LINGO3 0.1997 0.0580 3.443.103.450 leucine-rich repeat and immunoglobulin-like domain- containing nogo receptor-interacting protein 3 precursor LOC10013 2352 0.1997 0.0580 3.443.103.450 LOC10050 7577 0.1997 0.0580 3.443.103.450 LOC81691 0.1997 0.0580 3.443.103.450 putative RNA exonuclease NEF-sp isoform 2 LY75 0.1997 0.0580 3.443.103.450 lymphocyte antigen 75 precursor LZTFL1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 leucine zipper transcription factor-like protein 1 LZTS1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 leucine zipper, putative tumor suppressor 1 METTL3 0.1997 0.0580 3.443.103.450 N6-adenosine-methyltransferase 70 kDa subunit MIEN1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 uncharacterized protein LOC100049740 MITF 0.1997 0.0580 3.443.103.450 transcription factor protein MMP14 0.1997 0.0580 3.443.103.450 matrix metalloproteinase 14 precursor MON1A 0.1997 0.0580 3.443.103.450 vacuolar fusion protein MON1 homolog A MT1F 0.1997 0.0580 3.443.103.450 metallothionein-1F MTRNR2L 1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 humanin-like protein 1 NAT1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 eIF4G-related protein NAT1 NCBP2- AS2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 NDUFA2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 2 NIPAL2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 NIPA-like protein 2 NTMT1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 N-terminal Xaa-Pro-Lys N-methyltransferase 1 OMA1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 metalloendopeptidase OMA1, mitochondrial precursor ORMDL2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 ORM1-like protein 2 PAFAH2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 platelet-activating factor acetylhydrolase 2, cytoplasmic PALD1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 paladin PALM 0.1997 0.0580 3.443.103.450 paralemmin PAX5 0.1997 0.0580 3.443.103.450 paired box protein Pax-5 PCYT1A 0.1997 0.0580 3.443.103.450 phosphate cytidylyltransferase 1, choline, alpha PDE9A 0.1997 0.0580 3.443.103.450 phosphodiesterase 9A PFDN4 0.1997 0.0580 3.443.103.450 prefoldin subunit 4 PHLDB3 0.1997 0.0580 3.443.103.450 pleckstrin homology-like domain family B member 3 PHLPP2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase 2 PIWIL4 0.1997 0.0580 3.443.103.450 piwi-like protein 4 PLA2G6 0.1997 0.0580 3.443.103.450 85 kDa calcium-independent phospholipase A2 PMF1- BGLAP 0.1997 0.0580 3.443.103.450 PMF1-BGLAP protein isoform 1 PPP1R35 0.1997 0.0580 3.443.103.450 protein phosphatase 1 regulatory subunit 35 PRAF2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 PRA1 family protein 2 PRKCQ- AS1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 138 PRPSAP1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 phosphoribosyl pyrophosphate synthetase-associated protein 1 PSEN2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 presenilin-2 PTPRG 0.1997 0.0580 3.443.103.450 receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma precursor RAB28 0.1997 0.0580 3.443.103.450 responsive to abscisic acid 28 RBM41 0.1997 0.0580 3.443.103.450 RNA-binding protein 41 RBM45 0.1997 0.0580 3.443.103.450 RNA-binding protein 45 RC3H2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 roquin-2 isoform 1 RGS1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 putative membrane receptor protein RGS1 RMND5B 0.1997 0.0580 3.443.103.450 protein RMD5 homolog B RRN3P3 0.1997 0.0580 3.443.103.450 RTN2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 reticulon 2 RTN4RL2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 reticulon-4 receptor-like 2 precursor RUNDC1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 RUN domain-containing protein 1 SCHIP1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 schwannomin-interacting protein 1 SCYL3 0.1997 0.0580 3.443.103.450 protein-associating with the carboxyl-terminal domain of ezrin SDSL 0.1997 0.0580 3.443.103.450 serine dehydratase-like SH2D3C 0.1997 0.0580 3.443.103.450 SH2 domain-containing protein 3C SIPA1L1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 signal-induced proliferation-associated 1-like protein 1 SLC16A5 0.1997 0.0580 3.443.103.450 monocarboxylate transporter 6 SLC37A2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 sugar phosphate exchanger 2 SLC38A9 0.1997 0.0580 3.443.103.450 putative sodium-coupled neutral amino acid transporter 9 SLC41A2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 solute carrier family 41 member 2 SLC41A3 0.1997 0.0580 3.443.103.450 solute carrier family 41, member 3 SMCO4 0.1997 0.0580 3.443.103.450 single-pass membrane and coiled-coil domain- containing protein 4 SNRK- AS1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 SNRNP35 0.1997 0.0580 3.443.103.450 U11/U12 small nuclear ribonucleoprotein 35 kDa protein SPOCD1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 SPOC domain-containing protein 1 isoform 1 STOML1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 stomatin-like protein 1 TAF1A 0.1997 0.0580 3.443.103.450 TATA box-binding protein-associated factor RNA polymerase I subunit A TDRKH 0.1997 0.0580 3.443.103.450 tudor and KH domain-containing protein TK2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 thymidine kinase 2, mitochondrial TLR7 0.1997 0.0580 3.443.103.450 toll-like receptor 7 TMEM64 0.1997 0.0580 3.443.103.450 transmembrane protein 64 TNFRSF14 0.1997 0.0580 3.443.103.450 tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 precursor TPM3P9 0.1997 0.0580 3.443.103.450 TRIM71 0.1997 0.0580 3.443.103.450 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM71 TRMT5 0.1997 0.0580 3.443.103.450 tRNA (guanine(37)-N1)-methyltransferase TTC33 0.1997 0.0580 3.443.103.450 tetratricopeptide repeat protein 33 TUT1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 speckle targeted PIP5K1A-regulated poly(A) polymerase TVP23B 0.1997 0.0580 3.443.103.450 Golgi apparatus membrane protein TVP23 homolog B UBXN2A 0.1997 0.0580 3.443.103.450 UBX domain protein 2A UNC13A 0.1997 0.0580 3.443.103.450 protein unc-13 homolog A UROS 0.1997 0.0580 3.443.103.450 uroporphyrinogen-III synthase 139 USP30 0.1997 0.0580 3.443.103.450 ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 30 VPS9D1- AS1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 XRCC2 0.1997 0.0580 3.443.103.450 DNA repair protein XRCC2-like protein XRRA1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 X-ray radiation resistance-associated protein 1 isoform 1 ZFPL1 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc finger protein-like 1 ZGPAT 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc finger CCCH-type with G patch domain-containing protein ZHX1- C8ORF76 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc fingers and homeoboxes protein 1, isoform 2 ZMYM5 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc finger MYM-type protein 5 ZNF226 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc finger protein 226 ZNF25 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc finger protein 25 ZNF271 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc finger protein 271 ZNF302 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc finger protein 302 ZNF414 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc finger protein 414 isoform 2 ZNF616 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc finger protein 616 ZNF669 0.1997 0.0580 3.443.103.450 zinc finger protein 669 NCOA3 30.949 0.9274 3.337.179.210 nuclear receptor coactivator 3 PSAT1 20.966 0.6376 3.288.268.510 phospholipid sterol acyl transferase 1 RPL30 81.866 24.924 3.284.625.260 60S ribosomal protein L30 NXF1 18.969 0.5796 3.272.774.330 Nuclear RNA export factor 1 PI4K2A 16.972 0.5217 3.253.210.660 phosphatidylinositol 4-kinase type 2-alpha TRIM44 29.951 0.9274 3.229.566.530 tripartite motif-containing 44 PBDC1 14.975 0.4637 3.229.458.700 uncharacterized protein LOC436977 SHC1 14.975 0.4637 3.229.458.700 SHC-transforming protein 1 ESRRA 27.954 0.8694 3.215.320.910 steroid hormone receptor ERR1 RERE 27.954 0.8694 3.215.320.910 arginine-glutamic acid dipeptide (RE) repeats ASNA1 12.979 0.4057 3.199.161.940 ATPase asna1 BRWD3 12.979 0.4057 3.199.161.940 bromodomain and WD repeat-containing protein 3 FOPNL 12.979 0.4057 3.199.161.940 lisH domain-containing protein FOPNL MICB 12.979 0.4057 3.199.161.940 MHC class I polypeptide-related sequence B precursor PLCG2 12.979 0.4057 3.199.161.940 1-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-2 MICAL1 10.982 0.3478 3.157.561.820 NEDD9-interacting protein with calponin homology and LIM domains TIMM44 10.982 0.3478 3.157.561.820 mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM44 ZBTB48 10.982 0.3478 3.157.561.820 zinc finger and BTB domain containing 48 ANAPC11 0.8985 0.2898 3.100.414.080 anaphase-promoting complex subunit 11 CPVL 0.8985 0.2898 3.100.414.080 probable serine carboxypeptidase CPVL precursor DCAF15 0.8985 0.2898 3.100.414.080 DDB1- and CUL4-associated factor 15 DGKQ 0.8985 0.2898 3.100.414.080 diacylglycerol kinase theta MVP 0.8985 0.2898 3.100.414.080 major vault protein PRKD2 0.8985 0.2898 3.100.414.080 serine/threonine-protein kinase D2 isoform A RBM15 0.8985 0.2898 3.100.414.080 RNA binding motif protein 15 RNF138 0.8985 0.2898 3.100.414.080 E3 ubiquitin-protein ligase RNF138 TAF11 0.8985 0.2898 3.100.414.080 transcription initiation factor TFIID subunit 11 TBC1D22 B 0.8985 0.2898 3.100.414.080 TBC1 domain family member 22B 140 UPF3A 0.8985 0.2898 3.100.414.080 regulator of nonsense transcripts 3A ACAD8 0.8985 0.2898 3.100.414.080 isobutyryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial ZNF182 0.8985 0.2898 3.100.414.080 zinc finger protein 182 CLPB 15.974 0.5217 3.061.912.980 caseinolytic peptidase B protein homolog AMZ2 0.6989 0.2318 3.015.099.220 archaemetzincin-2 ATF1 0.6989 0.2318 3.015.099.220 cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-1 BCL2L2 0.6989 0.2318 3.015.099.220 BCL2-like 2 CCNDBP1 0.6989 0.2318 3.015.099.220 cyclin-D1-binding protein 1 CCR1 0.6989 0.2318 3.015.099.220 serine/threonine-protein kinase-like protein CCR1 CRIPT 0.6989 0.2318 3.015.099.220 cysteine-rich PDZ-binding protein FAM102B 0.6989 0.2318 3.015.099.220 uncharacterized protein LOC549525 FAM206A 0.6989 0.2318 3.015.099.220 protein FAM206A GFPT1 0.6989 0.2318 3.015.099.220 glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase [isomerizing] 1 IL6ST 0.6989 0.2318 3.015.099.220 interleukin-6 receptor subunit beta precursor KTI12 0.6989 0.2318 3.015.099.220 protein KTI12 homolog MRPL28 0.6989 0.2318 3.015.099.220 39S ribosomal protein L28, mitochondrial MTHFR 0.6989 0.2318 3.015.099.220 methylenetetrahydrofolate reductase NR1D2 0.6989 0.2318 3.015.099.220 nuclear receptor subfamily 1, group D, member 2 PODXL 0.6989 0.2318 3.015.099.220 podocalyxin precursor POP7 0.6989 0.2318 3.015.099.220 ribonuclease P protein subunit p20 PPIL2 0.6989 0.2318 3.015.099.220 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase-like 2 RHBDF2 0.6989 0.2318 3.015.099.220 inactive rhomboid protein 2 RHOC 0.6989 0.2318 3.015.099.220 RhoA protein SCAMP5 0.6989 0.2318 3.015.099.220 secretory carrier-associated membrane protein 5 SMYD3 0.6989 0.2318 3.015.099.220 SET and MYND domain-containing protein 3 SNX20 0.6989 0.2318 3.015.099.220 sorting nexin-20 isoform 1 TEAD3 0.6989 0.2318 3.015.099.220 transcriptional enhancer factor TEF-5 isoform 1 TMED3 27.954 0.9274 3.014.233.340 transmembrane emp24 domain-containing protein 3 precursor 141 Tabela A7. Lista completa dos genes cujos transcritos foram down-regulados após o tratamento LPS/MX Gene LPS/MX LPS Fold change Descrição AHDC1 0.0998 13.331 -13.357.715.430 AT-hook DNA-binding motif-containing protein 1 KIAA0232 0.0998 12.752 -12.777.555.110 KIAA0232 CUL3 0.0998 12.172 -12.196.392.790 cullin-3 PANK2 0.0998 12.172 -12.196.392.790 pantothenate kinase 2 EYA3 0.0998 11.592 -11.615.230.460 eyes absent homolog 3 AKAP1 0.0998 11.013 -11.035.070.140 A-kinase anchor protein 1, mitochondrial precursor GTSF1 0.0998 11.013 -11.035.070.140 gametocyte specific factor 1 ANKRD22 0.0998 10.433 -10.453.907.820 ankyrin repeat domain-containing protein 22 POLR1B 0.0998 10.433 -10.453.907.820 polymerase (RNA) I polypeptide B, 128kDa ARPC5L 0.0998 0.9854 -9.873.747.490 actin related protein 2/3 complex, subunit 5-like WDR55 0.0998 0.9854 -9.873.747.490 WD repeat-containing protein 55 URGCP 0.0998 0.9274 -9.292.585.170 upregulator of cell proliferation HSPA8 34.943 322.268 -9.222.676.930 heat shock cognate 71 kDa protein TDG 0.0998 0.8694 -8.711.422.850 G/T mismatch-specific thymine DNA glycosylase AKT3 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 RAC-gamma serine/threonine-protein kinase isoform 2 ALG12 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 Dol-P-Man:Man(7)GlcNAc(2)-PP-Dol alpha-1,6- mannosyltransferase CCNA1 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 cyclin-A1 COQ2 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 para-hydroxybenzoate--polyprenyltransferase, mitochondrial DHCR7 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 7-dehydrocholesterol reductase DNAJB14 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 dnaJ homolog subfamily B member 14 FSTL3 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 follistatin-related protein 3 precursor PIP4K2C 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase type-2 gamma PPME1 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 pectinesterase PPME1 S1PR3 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 sphingosine 1-phosphate receptor 3 SHPRH 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 E3 ubiquitin-protein ligase SHPRH isoform a STAM2 0.0998 0.8115 -8.131.262.530 signal transducing adapter molecule 2 OLIG1 0.1997 15.650 -7.836.755.130 oligodendrocyte transcription factor 1 CD47 0.2995 23.185 -7.741.235.390 leukocyte surface antigen CD47 precursor CD101 0.0998 0.7535 -7.550.100.200 immunoglobulin superfamily member 2 isoform 1 precursor FAM156B 0.0998 0.7535 -7.550.100.200 protein FAM156A/FAM156B LOC100129361 0.0998 0.7535 -7.550.100.200 uncharacterized protein LOC100129361 OTUD4 0.0998 0.7535 -7.550.100.200 OTU domain containing 4 RTCA 0.0998 0.7535 -7.550.100.200 RNA 3'-terminal phosphate cyclase SATB2 0.0998 0.7535 -7.550.100.200 DNA-binding protein SATB2 TARS2 0.0998 0.7535 -7.550.100.200 threonine--tRNA ligase, mitochondrial isoform a RNF4 0.1997 15.070 -7.546.319.480 ring finger protein 4 PM20D2 0.1997 14.490 -7.255.883.830 peptidase M20 domain-containing protein 2 USP3 0.1997 14.490 -7.255.883.830 ubiquitin specific peptidase 3 COPG2 0.0998 0.6955 -6.968.937.880 coatomer subunit gamma-2 GGA3 0.0998 0.6955 -6.968.937.880 golgi associated, gamma adaptin ear containing, ARF binding protein 3 GLOD4 0.0998 0.6955 -6.968.937.880 glyoxalase domain-containing protein 4 NAA10 0.0998 0.6955 -6.968.937.880 N-alpha-acetyltransferase 10, NatA catalytic subunit NAIP 0.0998 0.6955 -6.968.937.880 NLR family, apoptosis inhibitory protein PELO 0.0998 0.6955 -6.968.937.880 protein pelota homolog SDK1 0.0998 0.6955 -6.968.937.880 protein sidekick-1 precursor SYNE3 0.0998 0.6955 -6.968.937.880 nesprin-3 TLR2 0.0998 0.6955 -6.968.937.880 toll-like receptor 2 precursor YTHDC2 0.0998 0.6955 -6.968.937.880 YTH domain-containing protein 2 NSL1 0.1997 13.911 -6.965.948.920 MAC/Perforin domain-containing protein TMX3 0.1997 13.331 -6.675.513.270 protein disulfide-isomerase TMX3 precursor C12orf4 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 uncharacterized protein LOC379131 CAMSAP1 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 calmodulin-regulated spectrin-associated protein 1 CASP3 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 caspase-3 DMXL1 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 dmX-like protein 1 142 EPM2AIP1 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 EPM2A-interacting protein 1 METTL23 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 methyltransferase-like protein 23 isoform 1 SGOL2 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 shugoshin-like 2 isoform 3 TSPYL1 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 testis-specific Y-encoded-like protein 1 YES1 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 tyrosine-protein kinase yes ZFYVE16 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 zinc finger FYVE domain-containing protein 16 isoform a ZNF652 0.0998 0.6376 -6.388.777.560 zinc finger protein 652-A GLS 0.4992 31.299 -6.269.831.730 glutaminase kidney isoform, mitochondrial precursor GIT2 0.1997 12.172 -6.095.142.710 G protein-coupled receptor kinase interacting ArfGAP 2 ARL1 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 ADP-ribosylation factor-like protein 1 ASNSD1 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 asparagine synthetase domain-containing protein 1 CAAP1 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 uncharacterized protein LOC734409 CNTNAP4 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 contactin-associated protein-like 4 isoform 1 precursor CSF3R 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 granulocyte colony-stimulating factor receptor precursor DPH3 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 DPH3 homolog FASTKD5 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 FAST kinase domain-containing protein 5 FOXO4 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 forkhead box O4 GOLGA8R 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 golgin subfamily A member 8R IDI1 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase 1 IFIT2 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 INSIG2 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 insulin-induced gene 2 protein KANK1 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 KN motif and ankyrin repeat domains 1 KIAA0586 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 TALPID3 protein LMAN2L 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 lectin, mannose-binding 2-like MLKL 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 Mixed lineage kinase domain-like protein MRPS5 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 28S ribosomal protein S5, mitochondrial precursor NGDN 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 neuroguidin PINK1-AS 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 PNMA1 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 paraneoplastic antigen Ma1 RPS6KB1 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 ribosomal protein S6 kinase, 70kDa, polypeptide 1 SLC25A22 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 solute carrier family 25 (mitochondrial carrier: glutamate), member 22 STYXL1 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 serine/threonine/tyrosine-interacting-like protein 1 XRCC3 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 DNA repair protein XRCC3 ZNF276 0.0998 0.5796 -5.807.615.230 zinc finger protein 276 LOC284889 0.1997 11.592 -5.804.707.060 NMI 0.1997 11.592 -5.804.707.060 N-myc (and STAT) interactor RNF216 0.1997 11.592 -5.804.707.060 ring finger protein 216 WSB1 0.1997 11.592 -5.804.707.060 WD repeat and SOCS box-containing protein 1 CDK11A 0.1997 11.013 -5.514.772.160 cyclin-dependent kinase 11A isoform 1 RRM2B 0.1997 11.013 -5.514.772.160 ribonucleoside-diphosphate reductase subunit M2 B ZNF655 0.1997 11.013 -5.514.772.160 zinc finger protein 655 isoform f BIN2 0.2995 16.229 -5.418.697.830 Shaggy-related protein kinase eta ARNTL 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1 isoform 2 ERGIC1 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein 1 FAM13B 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 uncharacterized protein LOC568603 FAM213B 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 prostamide/prostaglandin F synthase GMPPA 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 mannose-1-phosphate guanyltransferase alpha HIBADH 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase ITSN1 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 intersectin-1 KCTD13 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 BTB/POZ domain-containing protein KCTD13 PAK1IP1 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 p21-activated protein kinase-interacting protein 1- like PSPC1 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 paraspeckle component 1 RDH14 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 Retinol dehydrogenase 14 RNASE3 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 eosinophil cationic protein precursor SEPT8 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 Septin-8 143 YEATS4 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 YEATS domain-containing protein 4 ZNF337 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 zinc finger protein 337 ZNF407 0.0998 0.5217 -5.227.454.910 zinc finger protein 407 isoform 3 DOK1 0.1997 10.433 -5.224.336.500 docking protein 1, 62kDa (downstream of tyrosine kinase 1) NDUFA13 0.1997 10.433 -5.224.336.500 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 13 DNAJB1 0.2995 15.070 -5.031.719.530 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 1 ARGLU1 0.4992 24.924 -4.992.788.460 arginine and glutamate-rich protein 1 EIF1AD 0.1997 0.9854 -4.934.401.600 probable RNA-binding protein EIF1AD KCTD5 0.1997 0.9854 -4.934.401.600 BTB/POZ domain-containing protein KCTD5 MZT2B 0.1997 0.9854 -4.934.401.600 mitotic-spindle organizing protein 2 PLSCR1 0.1997 0.9854 -4.934.401.600 phospholipid scramblase 1 TUBG1 0.1997 0.9854 -4.934.401.600 tubulin gamma-1 chain CACNA2D4 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 voltage-dependent calcium channel subunit alpha- 2/delta-4 CD180 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 CD180 antigen precursor CD33 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 myeloid cell surface antigen CD33 isoform 2 precursor CDC7 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 cell division cycle 7-related protein kinase CSTF2T 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 cleavage stimulation factor subunit 2 tau variant EIF2B2 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 translation initiation factor eIF-2B subunit beta FPR2 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 N-formyl peptide receptor 2 GBA2 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 non-lysosomal glucosylceramidase GPR125 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 probable G-protein coupled receptor 125 precursor GSTCD 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 glutathione S-transferase C-terminal domain- containing protein HBP1 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 HMG box-containing protein 1 HEIH 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 KYNU 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 kynureninase isoform a LINC00094 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 MED18 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 mediator of RNA polymerase II transcription subunit 18 MPHOSPH8 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 M-phase phosphoprotein 8 MRPL10 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 39S ribosomal protein L10, mitochondrial precursor PATZ1 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 POZ-, AT hook-, and zinc finger-containing protein 1 long A isoform RAP1GAP2 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 rap1 GTPase-activating protein 2 RASA1 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 ras GTPase-activating protein 1 RBAK 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 RB-associated KRAB zinc finger protein RIOK1 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 serine/threonine-protein kinase RIO1 RPUSD4 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 RNA pseudouridylate synthase domain-containing protein 4 SEC24B 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 protein transport protein Sec24B SLC25A33 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 solute carrier family 25 member 33 SLC30A1 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 solute carrier family 30 (zinc transporter), member 1 SNRPG 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 small nuclear ribonucleoprotein polypeptide G SUPV3L1 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 ATP-dependent RNA helicase SUPV3L1, mitochondrial precursor TAF9 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 transcription initiation factor TFIID subunit 9 TEP1 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 telomerase protein component 1 TRAF5 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 TNF receptor-associated factor 5 XXYLT1 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 xyloside xylosyltransferase 1 ZBTB11 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 zinc finger and BTB domain containing 11 ZMYM6 0.0998 0.4637 -4.646.292.590 zinc finger MYM-type protein 6 BRAT1 0.2995 13.911 -4.644.741.240 BRCA1-associated ATM activator 1 FOXN2 0.1997 0.9274 -4.643.965.950 forkhead box protein N2 HSPA1A 0.1997 0.9274 -4.643.965.950 heat shock 70kDa protein 1A IKBIP 0.1997 0.9274 -4.643.965.950 IKBKB interacting protein KIAA1467 0.1997 0.9274 -4.643.965.950 uncharacterized protein KIAA1467 homolog LOC283788 0.1997 0.9274 -4.643.965.950 TRIM13 0.1997 0.9274 -4.643.965.950 tripartite motif-containing 13 ZC3HAV1 0.5990 27.242 -4.547.913.190 zinc finger CCCH-type antiviral protein 1 CBX2 0.2995 13.331 -4.451.085.140 chromobox protein homolog 2 144 CHPF2 0.2995 13.331 -4.451.085.140 chondroitin sulfate glucuronyltransferase NDUFA9 0.2995 13.331 -4.451.085.140 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 9, 39kDa CEBPA 10.982 48.108 -4.380.622.840 CCAAT/enhancer-binding protein alpha ABCB8 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 ATP-binding cassette sub-family B member 8, mitochondrial ANKS1A 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 ankyrin repeat and sterile alpha motif domain containing 1A CITED4 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 cbp/p300-interacting transactivator 3 MOSPD2 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 motile sperm domain containing 2 MPZL1 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 myelin protein zero-like protein 1 isoform a precursor NEMF 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 nuclear export mediator factor NEMF NREP 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 neuronal regeneration-related protein NT5DC3 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 5'-nucleotidase domain-containing protein 3 PHF13 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 PHD finger protein 19 RPL35A 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 60S ribosomal protein L35a WEE1 0.1997 0.8694 -4.353.530.300 Wee1-like protein kinase GOLGA8N 0.2995 12.752 -4.257.762.940 golgin A8 family, member N KLC1 0.2995 12.752 -4.257.762.940 kinesin light chain 4 LPCAT2 0.2995 12.752 -4.257.762.940 lysophosphatidylcholine acyltransferase 2 BRCC3 0.3993 16.809 -4.209.616.830 lys-63-specific deubiquitinase BRCC36 SH3GL1 0.3993 16.809 -4.209.616.830 SH3-domain GRB2-like 1 ABR 0.4992 20.866 -4.179.887.820 active breakpoint cluster region-related protein ABHD3 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 abhydrolase domain-containing protein 3 ACSS2 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic ACTR5 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 actin-related protein 5 AGAP6 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 arf-GAP with GTPase, ANK repeat and PH domain- containing protein 6 ARHGAP18 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 Rho GTPase activating protein 18 ATE1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 ATPase E1 ATP5D 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 ATP synthase subunit delta, mitochondrial BIN3 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 bridging integrator 3 BTBD9 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 BTB/POZ domain-containing protein 9 C1orf159 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 uncharacterized protein LOC733821 C1orf27 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 protein odr-4 homolog CERK 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 ceramide kinase CKS2 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 cyclin-dependent kinases regulatory subunit 2 COX7B 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 cytochrome c oxidase subunit VIIb DCLRE1A 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 DNA cross-link repair 1A (PSO2 homolog, S. DPM1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 dolichol-phosphate mannosyltransferase ELK3 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 ETS domain-containing protein Elk-3 FAM126B 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 protein FAM126B FCER2 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor isoform a FCHO1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 FCH domain only 1 GCLM 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 glutamate--cysteine ligase regulatory subunit GNAQ 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 guanine nucleotide-binding protein G(q) alpha subunit HEATR5A 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 HEAT repeat-containing protein 5A HEATR6 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 HEAT repeat-containing protein 6 HP 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 haptoglobin precursor HSD17B11 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 11 INO80E 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 INO80 complex subunit E KRBA1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 protein KRBA1 LYSMD2 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 lysM and putative peptidoglycan-binding domain- containing protein 2 MED30 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 mediator of RNA polymerase II transcription subunit 30 METAP1D 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 methionine aminopeptidase 1D, mitochondrial precursor MFSD5 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 molybdate-anion transporter precursor MPDU1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 MRM1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 rRNA methyltransferase 1, mitochondrial precursor 145 MRPL45 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 39S ribosomal protein L45, mitochondrial MT2A 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 metallothionein-2 MUC1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 mucin-1 isoform 1 precursor NCKIPSD 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 NCK interacting protein with SH3 domain NDE1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 nuclear distribution protein nudE homolog 1 NEU3 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 sialidase 3 (membrane sialidase) NME2 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 nucleoside diphosphate kinase B NSMCE2 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 E3 SUMO-protein ligase NSE2 NUDT16L1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 protein syndesmos precursor PABPN1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 polyadenylate-binding protein nuclear 1 isoform 2 PANK1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 Pantothenate kinase 1 PANK3 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 pantothenate kinase 3 PAPD5 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 PAP-associated domain-containing protein 5 isoform b PHLPP1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 PH domain leucine-rich repeat-containing protein phosphatase 1 PIK3R3 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 (p55, gamma) POLR3D 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 DNA-directed RNA polymerase III subunit RPC4 PPARA 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 peroxisome proliferator-activated receptor alpha RABEPK 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 rab9 effector protein with kelch motifs RELL1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 RELT-like 1 RPL23AP82 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 SCAND1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 SCAN domain-containing protein 1 SCFD2 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 sec1 family domain-containing protein 2 SUPT4H1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 transcription elongation factor SPT4 THAP5 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 THAP domain-containing protein 5 TICAM1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 TIR domain-containing adapter molecule 1 TMEM126B 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 transmembrane protein 126B isoform b TMEM69 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 transmembrane protein 69 TWF1 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 twinfilin-1 UTP15 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 U3 small nucleolar RNA-associated protein 15 homolog VAMP2 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 vesicle-associated membrane protein 2 WASH2P 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 YEATS2 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 YEATS domain containing 2 YRDC 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 yrdC domain-containing protein, mitochondrial ZNF37BP 0.0998 0.4057 -4.065.130.260 SLC17A5 0.2995 12.172 -4.064.106.840 sialin TPRG1L 0.2995 12.172 -4.064.106.840 tumor protein p63 regulated 1-like TTC7A 0.2995 12.172 -4.064.106.840 tetratricopeptide repeat protein 7A BCKDHA 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 2-oxoisovalerate dehydrogenase subunit alpha, mitochondrial C19orf54 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 UPF0692 protein C19orf54 homolog C9orf69 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 protein C9orf69 DCXR 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 L-xylulose reductase GRPEL1 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 grpE protein homolog 1, mitochondrial HDAC7 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 histone deacetylase 7 MYO7A 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 unconventional myosin-VIIa isoform 1 NANS 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 sialic acid synthase NAPG 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein, gamma NFRKB 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 nuclear factor related to kappa-B-binding protein PSME1 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 proteasome activator complex subunit 1 RCN2 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 reticulocalbin-2 SLC35C1 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 GDP-fucose transporter 1 SLCO4A1 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 solute carrier organic anion transporter family, member 4A1 TBCC 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 tubulin-specific chaperone C TEX10 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 testis-expressed sequence 10 protein homolog TMC6 0.1997 0.8115 -4.063.595.390 transmembrane channel-like 6 NAA15 0.6989 27.242 -3.897.839.460 N(alpha)-acetyltransferase 15, NatA auxiliary subunit ATL2 0.2995 11.592 -3.870.450.750 atlastin-2 146 C19orf43 0.2995 11.592 -3.870.450.750 uncharacterized protein LOC734591 CD3EAP 0.2995 11.592 -3.870.450.750 DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA34 DUSP7 0.2995 11.592 -3.870.450.750 dual specificity protein phosphatase 7 FAM46A 0.2995 11.592 -3.870.450.750 uncharacterized protein LOC100158383 SRXN1 0.2995 11.592 -3.870.450.750 sulfiredoxin-1 UXT 0.2995 11.592 -3.870.450.750 protein UXT MFNG 0.9984 38.255 -3.831.630.610 beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase manic fringe MYC 0.4992 19.127 -3.831.530.450 transcription factor protein AUP1 0.3993 15.070 -3.774.104.680 ancient ubiquitous protein 1 IDH3G 0.3993 15.070 -3.774.104.680 isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) gamma TLR4 0.3993 15.070 -3.774.104.680 toll-like receptor 4 precursor ANKRD36 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 ankyrin repeat domain-containing protein 36A ARMC8 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 armadillo repeat-containing protein 8 ATP11C 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 ATPase, class VI, type 11C BRD3 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 bromodomain containing 3 CCDC136 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 coiled-coil domain-containing protein 136 isoform 1 EHD4 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 EH domain-containing protein 4 GIT1 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 ARF GTPase-activating protein GIT1 HMGCS1 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 hydroxymethylglutaryl-CoA synthase 1 MINA 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 MYC induced nuclear antigen N4BP1 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 NEDD4-binding protein 1 NEIL3 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 endonuclease VIII-like 3 PDE8A 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 high affinity cAMP-specific and IBMX-insensitive 3',5'-cyclic phosphodiesterase 8A PPARGC1B 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta isoform 1 RARG 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 retinoic acid receptor gamma SLC11A2 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 natural resistance-associated macrophage protein 2 SNUPN 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 snurportin-1 USP47 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 47 VPS18 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 vacuolar protein sorting-associated protein 18 homolog ZNF12 0.1997 0.7535 -3.773.159.740 zinc finger protein 12 isoform a ASH1L 0.6989 26.083 -3.732.007.440 probable histone-lysine N-methyltransferase ASH1L EDC3 0.4992 18.548 -3.715.544.870 enhancer of mRNA-decapping protein 3 EIF2S1 0.9984 37.096 -3.715.544.870 eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 1 ACAA2 0.2995 11.013 -3.677.128.550 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial AFTPH 0.2995 11.013 -3.677.128.550 aftiphilin CHTF8 0.2995 11.013 -3.677.128.550 chromosome transmission fidelity protein 8 homolog CIPC 0.2995 11.013 -3.677.128.550 uncharacterized protein KIAA1737 FAM78A 0.2995 11.013 -3.677.128.550 uncharacterized protein LOC100145734 FUNDC2 0.2995 11.013 -3.677.128.550 FUN14 domain-containing protein 2 GLIPR1 0.2995 11.013 -3.677.128.550 glioma pathogenesis-related protein 1 precursor KRR1 0.2995 11.013 -3.677.128.550 KRR1, small subunit (SSU) processome component, homolog RBM12B 0.2995 11.013 -3.677.128.550 RNA binding motif protein 12B RSF1 0.2995 11.013 -3.677.128.550 remodeling and spacing factor 1 SKP1 0.2995 11.013 -3.677.128.550 S-phase kinase-associated protein 1 ANXA1 0.3993 14.490 -3.628.850.490 Annexin A1 DEGS1 0.3993 14.490 -3.628.850.490 sphingolipid delta(4)-desaturase DES1 RALGAPB 0.3993 14.490 -3.628.850.490 ral GTPase-activating protein subunit beta TRIM14 0.4992 17.968 -3.599.358.970 tripartite motif-containing protein 14 MCFD2 0.6989 24.924 -3.566.175.420 multiple coagulation factor deficiency 2 precursor ACTR6 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 actin-related protein 6 AMH 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 muellerian-inhibiting factor precursor APC2 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 anaphase-promoting complex subunit 2 ARV1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 protein ARV1 ASB7 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 ankyrin repeat and SOCS box protein 7 ATP5H 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 ATP synthase subunit d, mitochondrial BCL2A1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 bcl-2-related protein A1 C11orf30 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 protein EMSY C19orf44 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 uncharacterized protein LOC100093620 C1GALT1C1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 C1GALT1-specific chaperone 1 147 C22orf46 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 uncharacterized protein C22orf46 precursor C8orf59 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 uncharacterized protein C8orf59 CD320 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 CD320 molecule precursor CEP97 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 centrosomal protein of 97 kDa CHKB 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 choline/ethanolamine kinase CHRAC1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 CPT2 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 carnitine O-palmitoyltransferase 2, mitochondrial DCUN1D3 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 DCN1-like protein 3 DTWD1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 DTW domain-containing protein 1 DTYMK 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 thymidylate kinase EFCAB4B 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 EF-hand calcium-binding domain-containing protein 4B isoform a FAM162A 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 protein FAM162B FBXO31 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 F-box only protein 31 GAB3 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 GRB2-associated-binding protein 3 isoform 2 GID4 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 uncharacterized protein LOC100145021 GMEB2 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 glucocorticoid modulatory element binding protein 2 GTF2H2D 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 general transcription factor IIH subunit 2-like protein HIST1H2AM 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 histone cluster 1, H2am IKZF5 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 zinc finger protein Pegasus IL21R 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 interleukin-21 receptor precursor IMPACT 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 protein IMPACT LILRA1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 1 precursor LOC100294145 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 LZTS2 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 leucine zipper putative tumor suppressor 2 homolog MED26 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 mediator of RNA polymerase II transcription subunit 26 MICU2 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 EF-hand domain-containing family member A1 MKL2 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 myocardin-related transcription factor B MMP24-AS1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 MRPL16 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 39S ribosomal protein L16, mitochondrial MTRF1L 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 peptide chain release factor 1-like, mitochondrial isoform a MTX3 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 metaxin-3 MYO10 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 myosin 10 NAV2 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 neuron navigator 2 NCK1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1 NDUFB7 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 7 NTPCR 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 nucleoside-triphosphatase, cancer-related NUBP2 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 cytosolic Fe-S cluster assembly factor nubp2 ORC3 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 origin recognition complex subunit 3 PAM 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase isoform 1 precursor PARL 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 presenilin associated, rhomboid-like PHF1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 SEC12-like protein 1 PHF11 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 PHD finger protein 11 isoform b PIGB 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 GPI mannosyltransferase 3 PLEKHA8 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 pleckstrin homology domain-containing family A member 8 POLR3F 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 DNA-directed RNA polymerase III subunit RPC6 RAB11FIP2 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 RAB11 family interacting protein 2 (class I) RAD9A 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 RAD9 homolog A RCAN3 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 calcipressin-3 RIN1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 RPM1-interacting protein TIP49a SEC11C 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 SEC11 homolog C SPAST 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 spastin SPSB1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 SPRY domain-containing SOCS box protein 1 TMEM241 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 transmembrane protein 241 TNFAIP8L1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 tumor necrosis factor alpha-induced protein 8-like protein 1 TRANK1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 TPR and ankyrin repeat-containing protein 1 148 UPP1 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 uridine phosphorylase 1 USMG5 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 up-regulated during skeletal muscle growth protein 5 VPS25 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 vacuolar protein sorting-associated protein 25 XPC 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 xeroderma pigmentosum, complementation group C ZFP36 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 ZFP36 ring finger protein ZNF101 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 zinc finger protein 101 ZNF107 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 zinc finger protein 107 isoform a ZNF33B 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 zinc finger protein 33B ZNF584 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 zinc finger protein 584 ZNF587 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 zinc finger protein 587 isoform 1 ZNF670 0.0998 0.3478 -3.484.969.940 zinc finger protein 670 isoform 1 ADH5 0.3993 13.911 -3.483.846.730 alcohol dehydrogenase class-3 HNRNPH2 0.5990 20.866 -3.483.472.450 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2 NCAPH 0.2995 10.433 -3.483.472.450 condensin complex subunit 2 PPM1F 0.2995 10.433 -3.483.472.450 protein phosphatase 1F USP33 0.5990 20.866 -3.483.472.450 ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 33 ACACA 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 acetyl-CoA carboxylase ASL 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 argininosuccinate lyase BICD2 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 bicaudal D homolog 2 CAPN15 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 calpain 15 CCDC127 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 coiled-coil domain containing 127 CCDC69 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 coiled-coil domain-containing protein 69 FAM46C 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 protein FAM46C FUT8 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 fucosyltransferase 8 IER5 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 immediate early response gene 5 protein IL16 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 pro-interleukin-16 LDOC1L 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 protein LDOC1L NBPF20 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 neuroblastoma breakpoint family member 20 NSA2 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 ribosome biogenesis protein NSA2 homolog OGFRL1 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 opioid growth factor receptor-like protein 1 RAB32 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 RAB32, member RAS oncogene family RRS1 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 disease resistance protein RRS1 SIVA1 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 SIVA1, apoptosis-inducing factor SLC12A9 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 solute carrier family 12 member 9 SLC25A44 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 solute carrier family 25, member 44 SLC37A1 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 glycerol-3-phosphate transporter VPS33A 0.1997 0.6955 -3.482.724.090 vacuolar protein sorting 33A U2AF2 15.974 55.064 -3.447.101.540 Splicing factor U2AF 65 kDa subunit SETD7 0.5990 20.287 -3.386.811.350 histone-lysine N-methyltransferase SETD7 EBP 0.3993 13.331 -3.338.592.540 ethylene-responsive transcription factor RAP2-3 C19orf59 0.9984 33.038 -3.309.094.550 mast cell-expressed membrane protein 1 CMIP 0.2995 0.9854 -3.290.150.250 C-Maf-inducing protein GMFB 0.2995 0.9854 -3.290.150.250 glia maturation factor beta KIAA1468 0.2995 0.9854 -3.290.150.250 lisH domain and HEAT repeat-containing protein KIAA1468 homolog MLXIP 0.2995 0.9854 -3.290.150.250 MLX interacting protein SCRIB 0.2995 0.9854 -3.290.150.250 protein scribble homolog SMARCD2 0.2995 0.9854 -3.290.150.250 SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily d, member 2 WBP2 0.2995 0.9854 -3.290.150.250 WW domain-binding protein 2 AP1G1 0.7987 26.083 -3.265.681.730 AP-1 complex subunit gamma-1 COMMD4 0.4992 16.229 -3.251.001.600 COMM domain-containing protein 4 ISG15 0.4992 16.229 -3.251.001.600 si:rp71-1c23.2 TMEM173 0.4992 16.229 -3.251.001.600 stimulator of interferon genes protein ARL5A 0.3993 12.752 -3.193.588.780 ADP-ribosylation factor-like protein 5A CPSF7 0.3993 12.752 -3.193.588.780 Cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 7 SLC2A1 0.3993 12.752 -3.193.588.780 solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 1 SS18L1 0.3993 12.752 -3.193.588.780 calcium-responsive transactivator STX3 0.3993 12.752 -3.193.588.780 Syntaxin-3 149 ABCC10 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 multidrug resistance-associated protein 7 isoform MRP7A ACAA1 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 3-ketoacyl-CoA thiolase B, peroxisomal AHCYL2 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 adenosylhomocysteinase-like 2 ATP10D 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 probable phospholipid-transporting ATPase VD CDC34 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 cell division cycle 34 COX19 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 cytochrome c oxidase assembly protein COX19 DDX11 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 probable ATP-dependent RNA helicase DDX11 ESF1 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 ESF1, nucleolar pre-rRNA processing protein, homolog FTO 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase FTO GNB5 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 guanine nucleotide-binding protein subunit beta-5 HIBCH 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 3-hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase, mitochondrial ILVBL 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 acetolactate synthase-like protein INO80D 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 INO80 complex subunit D KIAA1715 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 protein lunapark KLHL8 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 kelch-like protein 8 LMO2 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 rhombotin-2 PCCA 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 propionyl-CoA carboxylase alpha chain, mitochondrial PCCB 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 propionyl-CoA carboxylase beta chain, mitochondrial PHTF1 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 putative homeodomain transcription factor 1 PIAS3 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 protein inhibitor of activated STAT, 3 PPP2CB 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 protein phosphatase 2, catalytic subunit, beta isozyme PRCP 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 lysosomal Pro-X carboxypeptidase precursor RAD51AP1 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 RAD51-associated protein 1 RIPK1 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 receptor (TNFRSF)-interacting serine-threonine kinase 1 RNF115 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 RING finger protein 115 RNF20 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 ring finger protein 20, E3 ubiquitin protein ligase RRP1 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 ribosomal RNA processing protein 1 homolog A SETD3 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 histone-lysine N-methyltransferase setd3 SMAD5 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 mothers against decapentaplegic homolog 5 TADA1 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 transcriptional adapter 1 TPCN2 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 two pore segment channel 2 VPS13A 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 vacuolar protein sorting 13 homolog A YAF2 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 YY1-associated factor 2 ZNF385A 0.1997 0.6376 -3.192.789.180 zinc finger protein 385A isoform a RASAL3 0.6989 22.026 -3.151.523.820 RAS protein activator like-3 TFRC 14.975 46.949 -3.135.158.600 transferrin receptor protein 1 CTSS 0.4992 15.650 -3.135.016.030 cathepsin S precursor PPIL1 0.7987 24.924 -3.120.570.930 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase-like 1 C16orf58 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 UPF0420 protein C16orf58 CCL2 11.980 37.096 -3.096.494.160 C-C motif chemokine 2 precursor CHUK 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit alpha EIF3G 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 eukaryotic translation initiation factor 3 subunit G HINT1 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 histidine triad nucleotide binding protein 1 KLHL21 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 kelch-like protein 21 ONECUT2 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 one cut domain family member 2 PTCD3 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 pentatricopeptide repeat domain-containing protein 3, mitochondrial precursor RAB20 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 ras-related protein Rab-20 RBM23 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 RNA binding motif protein 23 RPA2 0.5990 18.548 -3.096.494.160 replicon protein A2 SLC31A1 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 high affinity copper uptake protein 1 TECPR1 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 tectonin beta-propeller repeat-containing protein 1 TIMELESS 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 protein timeless homolog ZNF706 0.2995 0.9274 -3.096.494.160 zinc finger protein 706 CTBP1 0.6989 21.446 -3.068.536.270 C-terminal binding protein 1 ADSS 0.3993 12.172 -3.048.334.590 adenylosuccinate synthetase AGFG1 0.3993 12.172 -3.048.334.590 ArfGAP with FG repeats 1 150 SLC35E1 0.3993 12.172 -3.048.334.590 solute carrier family 35 member E1 SMS 12.979 39.414 -3.036.751.680 spermine synthase