Navegando por Autor "Franco, Octávio Luiz"
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Artigo Activity toward bruchid pest of a kunitz-type inhibitor from seeds of the algaroba tree (prosopis juliflora D.C.)(Pesticide Biochemistry and Physiology, 2002) Morais, Ana Heloneida de Araújo; Oliveira, Adeliana; Pereira, Railene; Lima, Liziane; Franco, Octávio Luiz; Bloch Júnior, Carlos; Sá, Maria Fátima Grossi de; Sales, MaurícioA proteinaceous inhibitor with high activity against papain was found in seeds of the xerophytic algaroba tree (Prosopis julifora). The proteinase inhibitor Pj was purified using Sephacryl S-200 gel filtration followed by reverse-phase high-performance liquid chromatography on a Vidac 18 TP. Inhibitor Pj showed a Mr of 20,000 on sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis and a Mr of 19.2K by mass spectrometry. The inhibition of papain by the Pj inhibitor was the noncompetitive type, with a Ki value of 0.59 3 1029 M. The gelatinase activity of papain was strongly inhibited by Pj too. The N-terminal amino acid sequence of the Pj inhibitor showed homology with the N-terminal amino acid sequence of the Kunitzproteinase inhibitor family. Pj was strongly effective against digestive proteinases from bean weevil Acanthoscelides obtectus and cowpea weevil Callosobruchus maculatus and was moderately active toward midgut proteinases from pod weevil Mimosestes mimosae and Mexican bean weevil Zabrotes subfasciatus. The data shown here suggest that the protein present in algaroba seeds is involved with defense responses to insects and may be an important tool to be used in engineering plants resistant to bean weevilDissertação Avaliação da ação bioinseticida de SBTI e vicilina de Erythrina velutina em enzimas digestivas e membrana peritrófica de larvas de Plodia interpunctella (Lepidoptera: Pyralidae)(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2007-09-28) Amorim, Ticiana Maria Lúcio de; Sales, Maurício Pereira de; ; http://lattes.cnpq.br/7890362793618911; ; http://lattes.cnpq.br/6216030147805627; Franco, Octávio Luiz; ; http://lattes.cnpq.br/8598274096498065; Uchoa, Adriana Ferreira; ; http://lattes.cnpq.br/6644671747055211Plodia interpunctella (traça-indiana-da-farinha) é uma praga cosmopolita que ataca não somente uma ampla gama de produtos armazenados, mas também outros produtos alimentícios. Devido a sua importância econômica várias pesquisas têm sido realizadas com o intuito de identificar um método capaz de controlar esta praga sem danos ao ambiente. O estudo de inibidores de enzimas digestivas, lectinas e proteínas que se ligam à quitina tem sido proposto como uma alternativa para controlar o dano causado por estes insetos. Neste estudo alvos específicos para inibidores de enzimas e proteínas ligantes à quitina foram identificados nas larvas desta praga. Para isso, durante o desenvolvimento de larvas de P. interpunctella as classes de enzimas digestivas alvos foram identificadas por ensaios de atividade in vitro e SDS-PAGE, pH e temperatura ótimos avaliados para a indicação de possíveis proteínas inibidoras para a principal classe de proteinase detectadas no intestino das larvas. Outro alvo para proteínas deletérias foi indicado pela identificação da membrana peritrófica por ensaios químicos de detecção de quitina e por microscopia de luz. Durante o período de desenvolvimento as larvas de P. interpunctella, alimentadas com uma dieta baseada em bagaço de cana, passaram por 5 ínstares e pelo estágio pré-pupal. A maior atividade proteolítica (UA/intestino) foi detectada no estágio pré-pupal, enquanto que a maior atividade proteolítica específica (UA/mg proteína) foi observada no terceiro ínstar, utilizando azocaseína como substrato a pH 9,5 e a 50°C. A inibição das proteinases presentes no homogenato intestinal de larvas de terceiro ínstar foi mais evidente quando inibidores de proteinases serínicas (SBTI, TLCK e PMSF, com 96%, 89% e 20% de inibição, respectivamente) foram utilizados nos ensaios. No estágio pré-pupal, a maior inibição observada foi com SBTI (96%), TLCK (81 %) e TPCK (20%), indicando a predominância de atividade enzimática de proteinases serínicas a pH 9,5 no intestino de Plodia interpunctella. Por zimograma foi observada inibição de bandas de menor massa molecular por TLCK e um atraso na corrida eletroforética dessas bandas causado por SBTI. Quando avaliado o efeito in vivo de SBTI no desenvolvimento larval, não foi observada mortalidade e nem efeito na massa das larvas sobreviventes. Estabelecido o segundo alvo de atuação, baseado na ligação à quitina, bioensaios usando a vicilina EvV foram realizados, onde um LD50 de 0,23% e um WD50 de 0,27% foram estabelecidos para esta proteína deletéria. O mecanismo de ação foi verificado por ensaios de digestibilidade de EvV durante a passagem pelo trato intestinal larval, sendo observado o envolvimento de um fragmento reativo, observado por imunodetecção, no efeito deletério da vicilina. A ligação de EvV à membrana peritrófica foi comprovada através de ensaios de imunohistoquímica. Estes resultados apontam para uma vicilina ligante à quitina que pode vir a ser utilizada como bioinseticida para Plodia interpunctellaDissertação Avaliação das atividades anti-inflamatória, anticoagulante e antiproliferativa do inibidor de quimotripsina das sementes de erythrina velutina (EvCI)(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2011-02-22) Monteiro, Norberto de Kássio Vieira; Uchoa, Adriana Ferreira; ; http://lattes.cnpq.br/6644671747055211; ; http://lattes.cnpq.br/8804303821523487; Souza, Giulianna Paiva Viana de Andrade; ; http://lattes.cnpq.br/9747224552107070; Franco, Octávio Luiz; ; http://lattes.cnpq.br/8598274096498065Estudos indicam que vários componentes medicinais foram isolados de vegetais, os quais apresentam atividades antibacterianas, antifúngicas, antitumorais e anti-inflamatórias. Sepse é caracterizada por uma inflamação sistêmica que tem como conseqüência a produção exarcebada de mediadores inflamatórios, pela excessiva ativação de células inflamatórias e coagulação intravascular disseminada (CIVD), na qual a elastase neutrofílica humana exerce um papel importante na sua patogênese. Diversos estudos epidemiológicos sugerem que componentes de vegetais, especialmente de leguminosas, podem desempenhar um papel benéfico na redução da incidência de diferentes tipos de câncer. Um inibidor de quimotripsina do tipo Kunitz (Varela, 2010) foi purificado de sementes de Erythrina velutina (Mulungu) por fracionamento com sulfato de amônio, cromatografias de afinidade em Tripsina-Sepharose e Quimotripsina-Sepharose e cromatografia de troca iônica em Resource Q 1 mL (GE Healthcare), em sistema FPLC/AKTA. O inibidor, denominado EvCI, apresentou uma massa molecular de 17 kDa, determinada por SDS-PAGE. A proteína purificada foi capaz de inibir a elastase de neutrófilos humanos (ENH), apresentando um IC50 de 3,12 nM. O EvCI foi capaz de inibir ambas as vias de liberação de ENH estimuladas por PAF e fMLP (75,6% e 65%, respectivamente). O inibidor também inibiu a migração leucocitária em camundongos sépticos em cerca de 87% e prolongou o tempo de coagulação com inibição do fator Xa. EvCI não apresentou atividade hemolítica nem citotóxica. EvCI apresentou um efeito antiproliferativo seletivo para linhagens de células HepG2 com IC50 de 0,5 μg /mL. Estes resultados sugerem o EvCI como uma molécula antagonista dos receptores PAF/fMLP e um potencial emprego no combate a distúrbios relacionados a inflamação, coagulação intravascular disseminada (CIVD) e cancerArtigo Characterization and pharmacological properties of a novel multifunctional kunitz inhibitor from erythrina velutina seeds(PloS One, 2013-05) Morais, Ana Heloneida de Araújo; Machado, Richele Janaína Araújo; Monteiro, Norberto de Kássio Vieira; Migliolo, Ludovico; Silva, Osmar Nascimento; Pinto, Michele Flaviane Soares; Oliveira, Adeliana; Franco, Octávio Luiz; Kiyota, Sumika; Bemquerer, Marcelo Porto; Uchôa, Adriana Ferreira; Santos, Elizeu Antunes dosInhibitors of peptidases isolated from leguminous seeds have been studied for their pharmacological properties. The present study focused on purification, biochemical characterization and anti-inflammatory and anticoagulant evaluation of a novel Kunitz trypsin inhibitor from Erythrina velutina seeds (EvTI). Trypsin inhibitors were purified by ammonium sulfate (30–60%), fractionation followed by Trypsin-Sepharose affinity chromatography and reversed-phase high performance liquid chromatography. The purified inhibitor showed molecular mass of 19,210.48 Da. Furthermore, a second isoform with 19,228.16 Da was also observed. The inhibitor that showed highest trypsin specificity and enhanced recovery yield was named EvTI (P2) and was selected for further analysis. The EvTI peptide fragments, generated by trypsin and pepsin digestion, were further analyzed by MALDI-ToF-ToF mass spectrometry, allowing a partial primary structure elucidation. EvTI exhibited inhibitory activity against trypsin with IC50 of 2.261028 mol.L21 and constant inhibition (Ki) of 1.061028 mol.L21 , by a non-competitive mechanism. In addition to inhibit the activity of trypsin, EvTI also inhibited factor Xa and neutrophil elastase, but do not inhibit thrombin, chymotrypsin or peptidase 3. EvTI was investigated for its anti-inflammatory and anticoagulant properties. Firstly, EvTI showed no cytotoxic effect on human peripheral blood cells. Nevertheless, the inhibitor was able to prolong the clotting time in a dose-dependent manner by using in vitro and in vivo models. Due to antiinflammatory and anticoagulant EvTI properties, two sepsis models were here challenged. EvTI inhibited leukocyte migration and specifically acted by inhibiting TNF-a release and stimulating IFN-a and IL-12 synthesis. The data presented clearly contribute to a better understanding of the use of Kunitz inhibitors in sepsis as a bioactive agent capable of interfering in blood coagulation and inflammationDissertação Construção de modelos de interação in silico e in vitro do inibidor do tipo Kunitz de Adenanthera pavonina L. para as enzimas cisteínicas e serínicas(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2008-07-02) Migliolo, Ludovico; Sales, Maurício Pereira de; ; http://lattes.cnpq.br/7890362793618911; ; http://lattes.cnpq.br/0805599101682606; Lima, João Paulo Matos Santos; ; http://lattes.cnpq.br/3289758851760692; Franco, Octávio Luiz; ; http://lattes.cnpq.br/8598274096498065Os inibidores de proteinases serínicas (IPs) estão extensamente distribuídos na natureza e inibem a atividade enzimática in vitro e in vivo. Estes IPs em sementes de leguminosas compreendem sete famílias, no entanto as famílias Bowman-Birk e do tipo Kunitz são as mais estudadas e representam um papel importante na primeira linha de defesa contra insetos pragas. Alguns inibidores do tipo Kunitz possuem atividades para proteinases serínicas e cisteínicas sendo denominados inibidores bifuncionais, como o inibidor ApTKI da semente de Adenanthera pavonina. O inibidor de A. pavonina por apresentar essa característica incomum aos inibidores dessa família foi utilizado para o estudo da interação entre as proteinases serínica (tripsina) e cisteínica (papaína). Para determinar a interação in vitro de ApTKI e as enzimas alvo foi realizada a purificação do inibidor a partir de técnicas cromatográficas e ensaios de inibição. O modelo 3D do inibidor bifuncional ApTKI foi construído pelo programa SWISS-MODEL através da metodologia de modelagem por homologia utilizando como molde o inibidor de tripsina de soja (STI, pdb:1ba7) que apresentou 40% de identidade com a proteína alvo. A qualidade do modelo foi avaliada pelo programa PROCHECK. Para a análise do complexo in silico entre as enzimas alvo e o inibidor foi utilizado o programa HEX 4.5. Estes resultados confirmaram os ensaios inibitórios in vitro, onde ApTKI apresentou a capacidade de inibir simultaneamente tripsina e papaína. Algumas das diferenças observadas nos resíduos do sitio reativo explicam a forte afinidade para tripsina e a fraca para papaínaDissertação Determinação de motivos de ligação à quitina em vicilinas de Canavalia ensiformis e Vigna unguiculata através de métodos in silico e relação com suas toxicidades para o bruquídeo Callosobruchus maculatus (Coleoptera:Bruchidae)(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2009-02-06) Aquino, Rodrigo Oliveira de; Sales, Maurício Pereira de; ; http://lattes.cnpq.br/7890362793618911; ; http://lattes.cnpq.br/4722621413633925; Santos, Elizeu Antunes dos; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782221T9&dataRevisao=null; Franco, Octávio Luiz; ; http://lattes.cnpq.br/8598274096498065A quitina (homopolímero linear contendo resíduos de β-1,4-N-acetil-D-glicosamina (GlcNac) é um importante componente estrutural da parede celular de fungos e exoesqueletos de muitos invertebrados pragas, tais como insetos e nematóides. Em sistemas digestórios de insetos forma uma matriz denominada de membrana peritrófica. Um dos mais estudados modelos de interação proteína-carboidrato é o modelo que envolve as proteínas ligantes à quitina. Dentre os motivos já caracterizados envolvidos nesta interação se destacam o motivo heveína (HD), obtida de Hevea brasiliensis (Seringueira), o motivo R&R consenso (R&R), encontrado em proteínas cuticulares de insetos, e o motivo denominado neste estudo como motivo conglicinina (CD), encontrado na estrutura cristalográfica da β-conglicinina complexada com GlcNac. Estes três motivos de ligação à quitina foram usados para determinar qual(is) deles poderia(m) estar envolvido(s) in silico na interação das vicilinas de Canavalia ensiformis e Vigna unguiculata com quitina, como também associar estes resultados com o WD50 destas vicilinas para larvas de Callosobruchus maculatus. A técnica de modelagem comparativa foi utilizada para construção do modelo 3D da vicilina de V. unguiculata, que não foi encontrada nos bancos de dados. Através do programa ClustalW obteve-se a localização destes domínios na estrutura primária das vicilinas. Os domínios R&R e CD foram encontrados com maior homologia nas seqüências primárias das vicilinas e foram alvos de estudos de interação. Através do programa GRAMM foram obtidos modelos de interação ( dockings ) das vicilinas com GlcNac. Os resultados mostraram que, através de análises in silico, o motivo HD não faz parte da estrutura das vicilinas, comprovando o resultado obtido com o alinhamento das seqüências primárias; o motivo R&R, apesar de não ter semelhança estrutural nas vicilinas, provavelmente tem uma participação na atividade de interação destas com GlcNac; enquanto que o motivo CD participa diretamente na interação das vicilinas com GlcNac. Estes resultados in silico mostram que o número de aminoácidos, os tipos e a quantidade de ligações feitas pelo motivo CD com GlcNac parecem estar diretamente associados ao poder deletério que essas vicilinas possuem para larvas de C. maculatus. Isso pode constutuir um passo inicial na elucidação de como as vicilinas interagem com quitina in vivo e exercem seu poder tóxico para insetos que possuem membrana peritróficaArtigo Dual insecticidal effects of Adenanthera Pavonina kunitz-type inhibitor on Plodia Interpunctella is mediated by digestive enzymes inhibition and chitin-binding properties(MDPI, 2019-11-28) Oliveira, Caio Fernando Ramalho de; Flores, Taylla Michelle de Oliveira; Cardoso, Marlon Henrique; Oshiro, Karen Garcia Nogueira; Russi, Raphael; França, Anderson Felipe Jácome de; Santos, Elizeu Antunes dos; Franco, Octávio Luiz; Oliveira, Adeliana Silva de; Migliolo, LudovicoThe Indianmeal moth, Plodia interpunctella, is one of the most damaging pests of stored products. We investigated the insecticidal properties of ApKTI, a Kunitz trypsin inhibitor from Adenanthera pavonina seeds, against P. interpunctella larvae through bioassays with artificial diet. ApKTI-fed larvae showed reduction of up to 88% on larval weight and 75% in survival. Trypsin enzymes extracted from P. interpunctella larvae were inhibited by ApKTI, which also demonstrated capacity to bind to chitin. Kinetic studies revealed a non-competitive inhibition mechanism of ApKTI for trypsin, which were further corroborated by molecular docking studies. Furthermore, we have demonstrated that ApKTI exhibits a hydrophobic pocket near the reactive site loop probably involved in chitin interactions. Taken together, these data suggested that the insecticidal activity of ApKTI for P. interpunctella larvae involves a dual and promiscuous mechanisms biding to two completely different targets. Both processes might impair the P. interpunctella larval digestive process, leading to larvae death before reaching the pupal stage. Further studies are encouraged using ApKTI as a biotechnological tool to control insect pests in field conditionsDissertação Lectina da esponja marinha Tedania ignis: purificação, caracterização e interação com leishmanias(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2006-08-18) Dias, Anne Shyrley Ferreira; Santos, Elizeu Antunes dos; Sales, Maurício Pereira de; ; http://lattes.cnpq.br/7890362793618911; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782221T9&dataRevisao=null; ; http://lattes.cnpq.br/0149103138701370; Franco, Octávio Luiz; ; http://lattes.cnpq.br/8598274096498065; Leite, Edda Lisboa; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783254U6&dataRevisao=nullUma lectina foi purificada e caracterizada da esponja marinha Tedania ignis. O procedimento de purificação foi conduzido a partir do extrato bruto obtido por solubilização em tampão Bórax 50mM, pH 7,5 e precipitação protéica com 30% de sulfato de amônio (FI). O precipitado foi dissolvido no tampão de extração e fracionado com 1,0 volume de acetona (F1,0). A lectina foi purificada desta fração por meio de cromatografia de afinidade em Sepharose 6B. A proteína apresentou uma massa molecular de 45 kDa, conforme determinada por eletroforese em poliacrilamida em SDS, e se mostrou estável até a temperatura de 40ºC, por 1 hora. Uma curva de pH foi conduzida entre os valores de pH 2,5 a 11,5, onde observou-se uma maior atividade em pH 7,5. Dentre os eritrócitos humanos testados ela aglutinou preferencialmente os do tipo B tratados com papaína. A atividade hemaglutinante da lectina foi dependente do cátion bivalente Mn+2 e foi inibida pelos carboidratos galactose, xilose e frutose. Formas promastigotas de Leishmania chagasi coradas com Coomassie blue R-250 foram aglutinadas por F1,0 e na presença de galactose essa interação não foi observada. Esses resultados indicam que essa lectina pode estar envolvida no processo de defesa e que pode vir a ser utilizada como ferramenta biológica nos estudos com esse protozoárioTese Lectina manganês-dependente da peçonha de bothrops moojeni com atividade bacteriostática: isolamento e caracterização(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2024-10-15) Nunes, Ellynes Amancio Correia; Migliolo, Ludovico; Luna, Karla Patrícia de Oliveira; https://orcid.org/0000-0002-6027-9109; http://lattes.cnpq.br/0781953872281542; Uchôa, Adriana Ferreira; https://orcid.org/0000-0002-3822-6502; http://lattes.cnpq.br/6644671747055211; Santos, Elizeu Antunes dos; Zuliani, Juliana Pavan; Franco, Octávio LuizA rica diversidade de moléculas bioativas presentes em peçonhas de animais oferece um vasto potencial para o desenvolvimento de novos fármacos. As peçonhas ofídicas são um complexo de molecular proteico, cuja diversidade de toxinas e seus mecanismos de ação explicam a variedade de manifestações clínicas observadas em envenenamentos por serpentes. O estudo das proteínas da peçonha ofídica permite explorar suas atividades biológicas. Nesse contexto, objetivou-se investigar o potencial biotecnológico de lectinas presentes na peçonha de Bothrops moojeni. A partir da revisão bibliográfica sobre lectinas ofídicas, foi formulada a hipótese de que essas proteínas podem apresentar atividades antibióticas. Para testar essa hipótese, foram realizados o isolamento, a caracterização bioquímica e a avaliação das atividades biológicas de uma lectina purificada da peçonha. O isolamento e identificação da lectina foi realizado por cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sephacryl S-100, equilibrada com tampão bicarbonato de amônio 50 mM e pH 7,8, com vazão de 680 µL.min-1. As frações com atividade hemaglutinante foram submetidas a cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa em coluna C18, utilizando um gradiente linear de acetonitrila e água em ácido trifluoroacético 0,1% como fase móvel. A pureza da proteína foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5%, sob condições redutoras. A presença de lectinas nas diferentes frações foi monitorada pela atividade hemaglutinante utilizando eritrócitos humanos a 2% (v/v) em PBS. A determinação de especificidade e dependência de íons foi investigada por hemaglutinação na presença de diferentes açúcares e íons, respectivamente. A influência do pH e temperatura na atividade hemaglutinante foi investigada em uma faixa de pH de 2 a 11, temperaturas de -4 a 100°C. A atividade hemolítica foi avaliada pela liberação de hemoglobina de eritrócitos de sangue humano tipo A, em uma concentração de 2% v:v, utilizando o método de espectrofotometria a 425 nm. A atividade antibacteriana contra Acinetobacter baumannii e Staphylococcus aureus foi determinada por ensaios modificados de inibição do crescimento por micro diluição em caldo. A formação de biofilme foi quantificada pelo método de cristal violeta. A cromatografia de exclusão molecular resultou em um perfil com seis frações proteicas distintas. A análise por ensaios de hemaglutinação revelou que as frações 5 e 6 apresentavam atividade hemaglutinante. A fração 5, com maior atividade, foi denominada BmoojL. A caracterização bioquímica da lectina BmoojL revelou que sua atividade é dependente de manganês e inibida por diversos monossacarídeos, como glicose, frutose e manose. Além disso, a proteína mostrou-se estável em uma ampla faixa de pH (5-9) e temperatura (até 80°C). BmoojL não foi hemolítica nas concentrações avaliadas (31,25-500 µg. mL-1), com porcentagem de hemólise abaixo de 10%. Os ensaios antibacterianos mostraram que apesar de não ter atingido a concentração inibitória mínima, BmoojL reduziu o crescimento bacteriano de A. baumannii a partir da concentração de 64 µg.mL-1 sendo, portanto, bacteriostática. O ensaio antibiofilme mostrou que para S. aureus, BmoojL foi efetivo, reduzindo consideravelmente o crescimento do biofilme em todas as concentrações testadas (16 - 512 µg.mL-1) em cerca de 50%. Dessa forma, o estudo permitiu isolar uma molécula com atividade lectínica manganês dependente com potencial para exercer atividade bacteriostática e antibiofilme, contribuindo para a pesquisa de moléculas bioativas derivadas de serpentes peçonhentas. Embora haja alguns estudos envolvendo tais moléculas e suas atividade heterólogas, quando comparado a outros grupos moleculares, o estudo envolvendo as lectinas de serpentes é uma área ainda pouco explorada, e esses achados mostram o que ainda há para se conhecer acerca destas moléculas e direcionar e propor novas atividades que venham somar as pesquisas biotecnológicas envolvendo esses grupos animais.Dissertação Um novo inibidor de tripsina multifuncional de sementes de Erythrina velutina: caracterizacao e propriedades farmacologicas(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2012-10-24) Machado, Richele Janaína de Araújo; Santos, Elizeu Antunes dos; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782221T9&dataRevisao=null; ; http://lattes.cnpq.br/1352905640097175; Pedrosa, Matheus de Freitas Fernandes; ; http://lattes.cnpq.br/2929963416385218; Franco, Octávio Luiz; ; http://lattes.cnpq.br/8598274096498065A sepse é uma doença complexa, de alta gravidade e durante o seu desenvolvimento pode ocorrer eventos inflamatórios graves, que podem levar o paciente ao óbito. Inibidores de peptidases isolados de sementes de leguminosas estão sendo estudados devido suas variadas atividades biomédicas ou farmacológicas. Nesse sentido, o presente estudo consistiu na avaliação das atividades multifuncionais do inibidor de tripsina presente nas sementes de Erythrina velutina (EvTIb). Dois inibidores de tripsina foram purificados por fracionamento com sulfato de amônio (30-60%), cromatografia de afinidade em tripsina-sepharose e cromatografia de fase reversa. Os inibidores purificados foram denominados de EvTIa e EvTIb e suas massas moleculares determinadas por espectrometria de massa por electrospray (ESI) foram: 19.228,16 Da e 19.210,48 Da, respectivamente. Dentre eles, o EvTIb apresentou maior atividade específica para tripsina e maior percentual de rendimento de extração, sendo, portanto, o escolhido para as análises adicionais. Os fragmentos desse inibidor gerados por tratamento enzimático com tripsina e pepsina foram analisados por espectrometria de massa MALDI-ToF-ToF, permitindo elucidar sua estrutura primária parcial. O EvTIb exibiu uma atividade de inibição do tipo não-competitiva para a tripsina com IC50 de 22 nmol.L-1 e constante de inibição (Ki) de 10 nmol.L-1. Além da atividade de inibição para tripsina, EvTIb também inibiu o fator Xa e a elastase neutrofílica, porém não inibiu trombina, quimotripsina ou peptidase 3. EvTIb se manteve estável a variação de pH e temperatura. EvTIb não foi citotóxico e não inibiu o crescimento bacteriano de Escherichia coli e Staphylococcus aureus. EvTIb foi capaz de prolongar o tempo de coagulação de maneira dose-dependente. Finalmente, observou-se que EvTIb foi capaz de restabelecer os níveis hemostáticos, inibir a migração leucocitária em camundongos sépticos e diminuir a secreção de TNF-α e não teve ação sobre a liberação de IL-6. Por outro lado, EvTIb promoveu um aumento na liberação de IFN- α e IL-12. Esses dados sugerem que EvTIb pode constituir em uma nova molécula com potencial de uso no tratamento da sepse e doenças relacionadas à coagulaçãoDissertação Purificação e caracterização parcial de uma B-D glicosidase de Artemia franciscana com ação sobre celobiose e lactose(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2008-02-27) Nascimento, Robério Medeiros do; Abreu, Luiz Roberto Diz de; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723470U6; ; http://lattes.cnpq.br/4591915204523482; Franco, Octávio Luiz; ; http://lattes.cnpq.br/8598274096498065; Sales, Maurício Pereira de; ; http://lattes.cnpq.br/7890362793618911-D-glicosidase (EC 3.2.1.21) é uma das mais interessantes glicosidases, especialmente por hidrolisar celobiose liberando glicose, último passo de degradação de celulose. Esta função faz com que a -D-glicosidase seja de grande interesse como um versátil biocatalizador industrial, sendo critica para vários processos de bio-tratamento / biorrefinaria, como produção de bioetanol. Neste trabalho, uma -D-glicosidase extraída de extratos protéicos do invertebrado marinho Artemia franciscana foi purificada e caracterizada com uma combinação de precipitação com sulfato de amônio (30; 50; 80%), a fração saturada na faixa de 50% (chamada F-II) foi aplicada em uma cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-200, as frações correspondentes ao primeiro pico de atividade da -D-glicosidase foram reunidas e aplicadas numa cromatografia de troca iônica em Mono Q; o terceiro pico protéico obtido nessa cromatografia, o qual coincide com o pico de atividade da -D-glicosidase, foi reunido e aplicado numa cromatografia gel filtração Superose 12 onde o primeiro pico protéico, o qual possui atividade da -D-glicosidase, foi recromatografado em Superose 12. Esta enzima provavelmente é multimerica, constituída por três subunidades, de massa molecular de 52,7 kDa (determinado por SDS-PAGE) e com massa molecular nativa de 157 kDa (determinado por cromatografia gel filtração em Superose 12 sob o sistema FPLC). A enzima foi purificada 44,09 vezes com uma recuperação de 1,01%. Utilizando-se -nitrofenil--D-glicopiranosídeo como substrato obtivemos uma Km aparente de 0,229 mM (12,7 M de produto/cm/hora) e Vmáx de 1,109 mM.60min-1.mL-1. O pH ótimo e a temperatura ótima de catálise do substrato sintético foram 5,0 e 45C, respectivamente. A atividade -D-glicosidásica foi fortemente inibida por nitrato de prata e N-etilmaleimida, esta inibição indica o envolvimento de radicais sulfidrila na hidrólise do substrato sintético. A -D-glicosidase de Artemia franciscana apresentou ação degradativa sobre celobiose, lactose e sobre o substrato sintético -nitrofenil--D-glicopiranosídeo, indicando potencial uso desta enzima na indústria principalmente para produção de bioetanol (produção de álcool a parti de celulose) e produção de leite hidrolisado (leite destituído de lactose)