Navegando por Autor "Vieira, Hermany Munguba"
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Dissertação Indicadores de cálcio e de voltagem codificados geneticamente na detecção de potenciais de ação e inputs sinápticos em cultura de neurônios hipocampais(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2013-03-04) Vieira, Hermany Munguba; Leão, Richardson Naves; ; http://lattes.cnpq.br/0683942077872227; ; http://lattes.cnpq.br/6762407295457000; Leão, Emelie Katarina Svahn; ; http://lattes.cnpq.br/1279823352935722; Amaral, Olavo Bohrer; ; http://lattes.cnpq.br/4987439782337345Neurônios se comunicam por meio de sinapses, trocando mensagens capazes de modificar o potencial de membrana de outros neurônios. Demonstrar o papel desses sinais e decodificar essa linguagem elétrica representa o grande objetivo da neurociência moderna. Atualmente, a eletrofisiologia é o ramo da neurociência capaz de investigar esses recursos elétricos de neurônios - que vão desde registros de condutância e comportamento cinético de canais iônicos individuais até a demonstração de neurônios individuais implicados em comportamentos complexos. Nesse sentido, diferentes estados cerebrais e comportamentos implicam o recrutamento de grandes conjuntos de neurônios se comunicando em um estado coerente, dinâmico. Além disso, essas grandes populações são formadas por diversos subtipos neuronais cuja análise requer ténicas que possibilitem uma resolução temporal e espacial de células individuais e, prefencialmente, de subtipos específicos. Apenas recentemente, indicadores ópticos geneticamente codificados surgiram como ferramentas não invasivas de alta resolução espacial e temporal utilizados para monitorar a atividade de neurônios individuais e populações neuronais específicas. O número crescente de novos indicadores optogenéticos, juntamente com a ausência de comparações em condições idênticas, gerou dificuldade em escolher a mais adequada das proteínas, dependendo do desenho experimental. Portanto, o objetivo deste estudo foi comparar três proteínas repórter recentemente desenvolvidas: os indicadores de cálcio GCaMP3 e R-GECO1, e o indicador de voltagem VSFP butterfly1.2. Foram expressos em neurônios do hipocampo em cultura, os quais foram submetidos a registros de patch-clamp e de imageamento óptico. Os três grupos (cada um expressando uma proteína) exibiram valores semelhantes de potencial de membrana (em mV, GCaMP3: -56 ± 8,0; R-GECO1: -57 ± 2,5; VSFP: -60 ± 3,9; p = 0,86), no entanto, o grupo de neurônios que expressam VSFP mostrou uma média mais baixa de resistência de entrada do que os outros grupos (em Mohms, GCaMP3: 161 ± 18,3; GECO1-R: 128 ± 15,3; VSFP: 94 ± 14,0; p = 0,02). Cada neurônio foi submetido a injeções de correntes com frequências diferentes (10 Hz, 5 Hz, 3 Hz, 1,5 Hz, e 0,7 Hz) e as suas respostas de fluorescência foram registradas. Em nosso estudo, apenas 26,7% (4/15) dos neurônios que expressam VSFP mostraram sinal de fluorescência detectável em resposta a potenciais de ação. O valor médio de sinal-para-ruído (SNR), obtido em resposta a cinco potenciais de aҫão (a 10 Hz) foi pequeno (1,3 ± 0,21), no entanto a cinética rápida do VSFP permite a discriminação de disparos, como picos individuais, com detecção de 53% dos APs evocados. Freqüências abaixo de 5 Hz, assim como variaҫões no potencial de membrana subliminares, foram indetectáveis devido ao alto ruído do sinal de fluorescência. Por outro lado, os indicadores de cálcio mostraram maior alteração na fluorescência, seguindo o mesmo protocolo (cinco potenciais de aҫão a 10 Hz). Entre os neurônios expressando GCaMP3, 80% (8/10) exibiram sinal, com um valor médio de SNR de 21 ± 6,69 (soma), enquanto que para os neurônios expressando R-GECO1, 50% (2/4) dos neurônios demonstraram sinal com um valor médio SNR de 52 ± 19,7 (soma). Para protocolos de 10 Hz, 54% dos disparos foram detectados com evocado GCaMP3 e 85% com o R-GECO1. Disparos foram detectados em todas as frequências e os sinais de fluorescência foram também detectados a partir de despolarizações subliminares. Sendo GCaMP3 o indicador mais provável de produzir sinal de fluorescência e com alto SNR, alguns experimentos foram realizados somente com essa proteína. Observamos que GCaMP3 é eficaz na detecção de inputs sinápticas (envolvendo influxo de Ca2+), com alta resolução espacial e temporal. Também foram observadas diferenças entre os valores de SNR resultantes dos disparos evocados, em comparação com os disparos espontâneos. Em registros de grupos de células, GCaMP3 mostrou clara discriminação entre células ativadas e silêncio, revelando-se como uma ferramenta potencial em estudos de sincronização neuronal. Assim, nossos resultados sugerem que os indicadores de cálcio disponíveis atualmente permitem estudos detalhados sobre a comunicação neuronal, que vão desde dendritos individuais até a investigação de eventos de sincronia em redes neuronais geneticamente definidas. Em contraste, VSFPs representam uma tecnologia promissora para monitorar a atividade neural e, apesar de ainda requererem melhoramentos, podem se tornar mais apropriados do que os indicadores de cálcio, uma vez que os neurônios trabalham em uma escala de tempo mais rápida do que eventos de cálcio podem prever