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Title: Recuperação e purificação parcial do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi em E. coli M15 recombinante e remoção simultânea de lipopolissacarídeos em sistemas aquosos bifásicos
Other Titles: Recuperation and partial purification of antigen 503 of Leishmania i. chagasi from recombinant E. coli M15 and simultaneous LPS removal using Aqueous Two-Phase Systems
Authors: Oliveira Filho, Marcos Antonio
Keywords: Leishmaniose;SDFA;Endotoxina;Sugaring-out
Issue Date: 21-Feb-2018
Citation: OLIVEIRA FILHO, Marcos Antonio. Recuperação e purificação parcial do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi em E. coli M15 recombinante e remoção simultânea de lipopolissacarídeos em sistemas aquosos bifásicos. 2018. 79f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2018.
Portuguese Abstract: O antígeno 503, uma proteína encontrada na forma amastigota de Leishmania i. chagasi, possui potencial para utilização em vacinas e testes para diagnóstico específico da leishmaniose visceral. No entanto, um problema intrínseco à purificação de proteínas expressas em E. coli é a presença de endotoxinas (LPS), componente da parede celular de bactérias gram-negativas, que provoca resposta imune quando em contato com células de defesa humana. Os sistemas aquosos bifásicos (SABs) vêm sendo utilizados na purificação de biomoléculas por apresentar vantagens como eliminar a etapa de clarificação, concentrar e purificar a molécula alvo e, no presente estudo, efetuar a remoção parcial do LPS, durante o protocolo de purificação. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os SABs baseados em polietilenoglicol (PEG 1500) e etanol com sais (fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) e sulfato de amônio ((NH4)2SO4)) e acetonitrila com glicose na recuperação e purificação parcial do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli M15 com remoção simultânea de LPS. Inicialmente, foram obtidas as curvas binodais, pelo método de titulação por ponto de nuvem a temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) a fim de determinar as concentrações de trabalho dos componentes dos sistemas avaliados. Esses dados experimentais também foram usados para os cálculos dos parâmetros da equação proposta por Merchuk, e obtenção do comprimento das linhas de amarração – tie lines length (TTL). Definindo-se a composição dos sistemas, aplicou-se 20% de homogeneizado celular de E. coli nos SABs, observou-se que o sistema que mais favoreceu a recuperação e concentração do antígeno 503 foi o constituído por PEG 1500 e K2HPO4, atingindo um fator de purificação de 1,55 e percentual de recuperação de 116,96% na fase de topo, nas condições de 30% de PEG 1500 e 10% de sal (m/m). A remoção de LPS foi promissora para todos os sistemas avaliados, se mantendo acima de 90,0%. O ensaio que apresentou melhor purificação também se destacou na remoção desse contaminante, atingindo 99,90% de LPS removido. Deste modo, os SABs podem ser empregados como etapa precedente à cromatografia para remoção de elevadas concentrações de LPS e aumentar o grau de pureza de proteínas recombinantes expressas em E. coli.
Abstract: The antigen 503, a protein found in the amastigote phase of Leishmania i. chagasi, can integrate vaccines and specific diagnosis assays for visceral leishmaniasis (VL). However, a problem on the purification of proteins expressed in E. coli is the presence of endotoxins (LPS), natural compound of gram-negative bacterial expression systems, which triggers immune response in human body and interacts with the proteins impairing possible chromatography steps. To solve this problem, Aqueous Two-phase Systems (ATPS) can be employed with the advantages of eliminate clarification steps on the whole process, indeed it also concentrates the molecule of interest and reduces the concentration of LPS, preparing the product for a more efficient adsorption in the following steps. Thus, the present work aimed evaluate ATPS based on Polyethylene glycol (PEG 1500) /Salt, Ethanol/Salt (K2HPO4 and (NH4)2SO4) and Acetonitrile/Dextrose on the partial purification of antigen 503 expressed in recombinant E. coli M15 and simultaneous removal of LPS. For that, firstly, binodal curves of these systems were constructed by cloud point titration method at room temperature (25 ± 2 ºC) in order to determine the concentrations of each evaluated system. The parameters of the equation purposed by Merchuk were calculated by these experimental data and the Tie-Line Lengths (TLL) were obtained. When 20% of cell homogenate from E. coli was applied, the system which exhibited the best results was 30% PEG 1500 and 10% K2HPO4 (m/m) achieving 116,96% of recuperation and 1,55 of purification factor (assay P3). The removal of endotoxins was promising for all the systems evaluated, as it was kept above 90,0%. The assay P3 also stood out for the LPS removal, being able to remove 99,90%. Thus, ATPS can be a precedent step to the chromatography for the removal of high LPS concentration and grow the purity of recombinant proteins from E. coli.
URI: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/25111
Appears in Collections:PPGEQ - Mestrado em Engenharia Química

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