Lectina manganês-dependente da peçonha de bothrops moojeni com atividade bacteriostática: isolamento e caracterização
dc.contributor.advisor | Migliolo, Ludovico | |
dc.contributor.advisor-co1 | Luna, Karla Patrícia de Oliveira | |
dc.contributor.author | Nunes, Ellynes Amancio Correia | |
dc.contributor.authorID | https://orcid.org/0000-0002-6027-9109 | pt_BR |
dc.contributor.authorLattes | http://lattes.cnpq.br/0781953872281542 | pt_BR |
dc.contributor.referees1 | Uchôa, Adriana Ferreira | |
dc.contributor.referees1ID | https://orcid.org/0000-0002-3822-6502 | pt_BR |
dc.contributor.referees1Lattes | http://lattes.cnpq.br/6644671747055211 | pt_BR |
dc.contributor.referees2 | Santos, Elizeu Antunes dos | |
dc.contributor.referees3 | Zuliani, Juliana Pavan | |
dc.contributor.referees4 | Franco, Octávio Luiz | |
dc.date.accessioned | 2024-12-26T20:00:16Z | |
dc.date.available | 2024-12-26T20:00:16Z | |
dc.date.issued | 2024-10-15 | |
dc.description.abstract | The rich diversity of bioactive molecules present in animal venoms offers vast potential for the development of new drugs. Snake venoms are a complex of molecular proteins, whose diversity of toxins and their mechanisms of action explain the variety of clinical manifestations observed in snake envenomations. The study of snake venom proteins allows us to explore their biological activities. In this context, the aim of this study was to investigate the biotechnological potential of lectins present in Bothrops moojeni venom. Based on a literature review on snake lectins, the hypothesis was formulated that these proteins may have antibiotic activities. To test these hypotheses, the isolation, biochemical characterization and evaluation of the biological activities of a purified lectin from the venom were performed. Lectin isolation and identification were performed by size exclusion chromatography on a Sephacryl S-100 column, equilibrated with 50 mM ammonium bicarbonate and pH 7.8, with a flow rate of 680 µL.min-1. The fractions with hemagglutinating activity were subjected to reversed-phase high-performance liquid chromatography on a C18 column, using a linear gradient of acetonitrile and water in 0.1% trifluoroacetic acid as the mobile phase. Protein purity was assessed by electrophoresis on a 12.5% SDS-PAGE polyacrylamide gel under reducing conditions. The presence of lectins in different fractions was monitored by hemagglutinating activity using 2% (v/v) human erythrocytes in PBS. The determination of specificity and ion dependence was investigated by hemagglutination in the presence of different sugars and ions, respectively. The influence of pH and temperature on hemagglutinating activity was investigated over a pH range of 2 to 11 and temperatures from -4 to 100°C. Hemolytic activity was assessed by the release of hemoglobin from human type A erythrocytes at a concentration of 2% v:v using the spectrophotometric method at 425 nm. Antibacterial activity against Acinetobacter baumannii and Staphylococcus aureus was determined by modified broth microdilution growth inhibition assays. Biofilm formation was quantified by the crystal violet method. Size exclusion chromatography investigated a profile with six distinct protein fractions. Analysis by hemagglutination assays revealed that fractions 5 and 6 exhibited hemagglutinating activity. Fraction 5, with the highest activity, was designated BmoojL. The biochemical characterization of the BmoojL lectin revealed that its activity is manganese-dependent and inhibited by several monosaccharides, such as glucose, fructose and mannose. Furthermore, the protein was stable over a wide range of pH (5-9) and temperature (up to 80°C). BmoojL was not hemolytic at the concentrations evaluated (31.25-500 µg. mL-1 ), with a hemolysis percentage below 10%. The antibacterial assays demonstrated that, despite not reaching the minimum inhibitory concentration, BmoojL impairs the bacterial growth of A. baumannii from the concentration of 64 µg. mL-1, being, therefore, bacteriostatic. The antibiofilm assay showed that for S. aureus, BmoojL was effective, considerably reducing biofilm growth at all concentrations tested (16 - 512 µg. mL-1) by approximately 50%. Thus, the study allowed the isolation of a molecule with manganese-dependent lectin activity with the potential to exert bacteriostatic and antibiofilm activity, contributing to the research of bioactive molecules derived from venomous snakes. Although there are some studies involving such molecules and their heterologous activity, when compared to other molecular groups, the study involving snake lectins is an area that is still little explored, and these findings show what there is still to know about these molecules and directions and propose new activities that may add to the biotechnological research related to these animal groups. | pt_BR |
dc.description.resumo | A rica diversidade de moléculas bioativas presentes em peçonhas de animais oferece um vasto potencial para o desenvolvimento de novos fármacos. As peçonhas ofídicas são um complexo de molecular proteico, cuja diversidade de toxinas e seus mecanismos de ação explicam a variedade de manifestações clínicas observadas em envenenamentos por serpentes. O estudo das proteínas da peçonha ofídica permite explorar suas atividades biológicas. Nesse contexto, objetivou-se investigar o potencial biotecnológico de lectinas presentes na peçonha de Bothrops moojeni. A partir da revisão bibliográfica sobre lectinas ofídicas, foi formulada a hipótese de que essas proteínas podem apresentar atividades antibióticas. Para testar essa hipótese, foram realizados o isolamento, a caracterização bioquímica e a avaliação das atividades biológicas de uma lectina purificada da peçonha. O isolamento e identificação da lectina foi realizado por cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sephacryl S-100, equilibrada com tampão bicarbonato de amônio 50 mM e pH 7,8, com vazão de 680 µL.min-1. As frações com atividade hemaglutinante foram submetidas a cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa em coluna C18, utilizando um gradiente linear de acetonitrila e água em ácido trifluoroacético 0,1% como fase móvel. A pureza da proteína foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5%, sob condições redutoras. A presença de lectinas nas diferentes frações foi monitorada pela atividade hemaglutinante utilizando eritrócitos humanos a 2% (v/v) em PBS. A determinação de especificidade e dependência de íons foi investigada por hemaglutinação na presença de diferentes açúcares e íons, respectivamente. A influência do pH e temperatura na atividade hemaglutinante foi investigada em uma faixa de pH de 2 a 11, temperaturas de -4 a 100°C. A atividade hemolítica foi avaliada pela liberação de hemoglobina de eritrócitos de sangue humano tipo A, em uma concentração de 2% v:v, utilizando o método de espectrofotometria a 425 nm. A atividade antibacteriana contra Acinetobacter baumannii e Staphylococcus aureus foi determinada por ensaios modificados de inibição do crescimento por micro diluição em caldo. A formação de biofilme foi quantificada pelo método de cristal violeta. A cromatografia de exclusão molecular resultou em um perfil com seis frações proteicas distintas. A análise por ensaios de hemaglutinação revelou que as frações 5 e 6 apresentavam atividade hemaglutinante. A fração 5, com maior atividade, foi denominada BmoojL. A caracterização bioquímica da lectina BmoojL revelou que sua atividade é dependente de manganês e inibida por diversos monossacarídeos, como glicose, frutose e manose. Além disso, a proteína mostrou-se estável em uma ampla faixa de pH (5-9) e temperatura (até 80°C). BmoojL não foi hemolítica nas concentrações avaliadas (31,25-500 µg. mL-1), com porcentagem de hemólise abaixo de 10%. Os ensaios antibacterianos mostraram que apesar de não ter atingido a concentração inibitória mínima, BmoojL reduziu o crescimento bacteriano de A. baumannii a partir da concentração de 64 µg.mL-1 sendo, portanto, bacteriostática. O ensaio antibiofilme mostrou que para S. aureus, BmoojL foi efetivo, reduzindo consideravelmente o crescimento do biofilme em todas as concentrações testadas (16 - 512 µg.mL-1) em cerca de 50%. Dessa forma, o estudo permitiu isolar uma molécula com atividade lectínica manganês dependente com potencial para exercer atividade bacteriostática e antibiofilme, contribuindo para a pesquisa de moléculas bioativas derivadas de serpentes peçonhentas. Embora haja alguns estudos envolvendo tais moléculas e suas atividade heterólogas, quando comparado a outros grupos moleculares, o estudo envolvendo as lectinas de serpentes é uma área ainda pouco explorada, e esses achados mostram o que ainda há para se conhecer acerca destas moléculas e direcionar e propor novas atividades que venham somar as pesquisas biotecnológicas envolvendo esses grupos animais. | pt_BR |
dc.description.sponsorship | Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES | pt_BR |
dc.identifier.citation | NUNES, Ellynes Amancio Correia. Lectina manganês-dependente da peçonha de bothrops moojeni com atividade bacteriostática: isolamento e caracterização. Orientador: Dr. Ludovico Migliolo. 2024. 96f. Tese (Doutorado em Bioquímica e Biologia Molecular) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2024. | pt_BR |
dc.identifier.uri | https://repositorio.ufrn.br/handle/123456789/60986 | |
dc.language | pt_BR | pt_BR |
dc.publisher | Universidade Federal do Rio Grande do Norte | pt_BR |
dc.publisher.country | Brasil | pt_BR |
dc.publisher.initials | UFRN | pt_BR |
dc.publisher.program | PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR | pt_BR |
dc.rights | Acesso Aberto | pt_BR |
dc.subject | Atividade biológica | pt_BR |
dc.subject | Peçonhas ofídicas | pt_BR |
dc.subject | Bioprospecção | pt_BR |
dc.subject.cnpq | CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS | pt_BR |
dc.title | Lectina manganês-dependente da peçonha de bothrops moojeni com atividade bacteriostática: isolamento e caracterização | pt_BR |
dc.title.alternative | Manganese-dependent lectin from: Bothrops moojeni venom with bacteriostatic activity: isolation and characterization | pt_BR |
dc.type | doctoralThesis | pt_BR |
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