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Título: Obtenção de polissacarídeos sulfatados da alga vermelha comestível Gracilaria birdiae e sua influência na formação e morfologia de cristais de oxalato de cálcio
Autor(es): Santos, Pablo de Castro
Palavras-chave: Algas vermelhas;Galactana sulfatada;Cálculo renal;Nefrolitíase
Data do documento: 30-Ago-2016
Citação: SANTOS, Pablo de Castro. Obtenção de polissacarídeos sulfatados da alga vermelha comestível Gracilaria birdiae e sua influência na formação e morfologia de cristais de oxalato de cálcio. 2016. 107f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2016.
Resumo: The urolithiasis disease affects approximately 10% of the world's population and is strongly associated calcium oxalate crystals (CaOx). Until now, there is not an efficient compound that can be used to prevent this disease. However, some sulfated polysaccharides (SP) from brown seaweeds exhibited an ability to inhibit the formation of CaOx crystals and change the morphology in vitro. SP from the red seaweed Gracilaria birdiae has important biological activities, but they have not been evaluated as inhibitor of CaOx crystals formation. This study aimed to obtain SP from this seaweed and evaluate their effect on CaOx crystals formation. Thus, sulfated polysaccharide-rich extract (EC) was obtained using alkaline extraction, sonication, proteolytic digestion followed by ethanol precipitation. This extract was fractionated into five fractions (F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0; F-1.25) by DEAE-cellulose ion-exchange chromatography. Agarose gel electrophoresis, infrared and chemical analysis showed that these fractions contain the same pool of sulfated galactose-rich polysaccharides. F-0.25; F-0.5; F, 0.75; F-1.0 were able to inhibit important formation steps of the CaOx crystals, as nucleation and aggregation, we highlight F-0.25 that promoted the highest inhibition of nucleation in 76.92% and aggregation in 68.57%. The F-0.25 and F-0.5 fractions were able to reduce approximately 6 and 7 times, respectively, the number of these CaOx monohydrated crystals (COM) formed in vitro, whereas F-0.75 and F-1.0 fractions reduced this number only 1.5 times. The morphology of CaOX crystals was mainly affected by the samples EC, F-0.25; F-0.5 and F-0.75, they promoted the most discordant variations in the control. The analysis of the zeta potential (ζ) of the crystals formed in the presence of the samples was found an increase of negative charges on their surfaces. Through the images obtained by fluorescence microscopy revealed that the PS are distributed homogeneously in the dehydrated crystals (COD) and peripherally in COM. The data obtained by scanning electron microscopy (SEM) and energy dispersive spectroscopy (EDS) revealed wide variations in the distribution of oxygen and calcium atoms on the surface of the crystals in the presence of F-0.25 and F-0.5. The kidney cells HEK-293, MDCK and 786-0 showed low toxicity in the presence of EC and fractions F-0.25; F-0.5; F, 0.75. These samples protected kidney MDCK cells against damage caused by H2O2 and CaOx. Finally, the MDCK cells treated beforehand and concomitant with both F-0.25 and F-0.5 in the presence of H2O2 and CaOx, reduced the activity of superoxide dismutase and catalase enzymes. Overall, the data showed that PS G. birdiae may be potential pharmacological targets for preventive, therapeutic and repairing damage caused by urolithiasis. However, it is important that to make set in vivo experiments, as well as, experiments to elucidate the precise mechanism of action by which these PS protect the H2O2 damage on cells.
metadata.dc.description.resumo: A urolitíase afeta aproximadamente 10% da população mundial e está associada fortemente a presença de cristais de oxalato de cálcio (OxCa). Atualmente não existe nenhum composto eficiente que pode ser utilizado para prevenir esta doença. No entanto, alguns polissacarídeos sulfatados (PS) de algas marinhas marrons demonstraram capacidade de inibir a formação de cristais de OxCa e alterar a morfologia destes in vitro. Os PS da alga vermelha Gracilaria birdiae têm atividades biológicas importantes, mas até o presente momento não foi avaliada como inibidora da formação de cristais de OxCa. O presente estudo teve como objetivo obter PS e verificar seu efeito na formação do OxCa. Para tal, extratos ricos em polissacarídeos foram obtidos utilizando extração alcalina, sonicação, digestão proteolítica, seguida por precipitação com etanol. Esses extratos ricos em PS (EB) foram separados em 5 frações (F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0 e F-1.25) através de cromatografia de troca iônica DEAE-celulose. A eletroforese em gel de agarose, infra vermelho e análises químicas mostraram que essas frações contêm o mesmo pool de polissacarídeos sulfatados ricos em galactose. F-0.25; F-0.5; F-0.75; F-1.0 foram capazes de inibir etapas importantes da formação dos cristais de OxCa, como a nucleação e agregação, no entanto a F-0.25 promoveu a maior inibição da nucleação em 76,92% e da agregação em 68,57%. As frações F-0.25 e F-0.5 foram capazes de inibir em 6 e 7 vezes, respectivamente, o número de cristais OxCa monohidratados (COM) formados in vitro, enquanto que as frações F-0.75 e F-1.0, reduziram apenas em 1,5 vezes. A morfologia dos cristais de OxCa foi afetada principalmente pelas amostras, EB, F-0.25; F-0.5 e F-0.75, pois promoveram as variações mais destoantes em relação ao controle. A análise do potencial zeta (ζ) dos cristais formados na presença das amostras, constatou um aumento de cargas negativas em suas superfícies. Através das imagens obtidas por microscopia de fluorescência, foi constatado que os PS estão distribuídos de forma homogênea nos cristais dihidratados (COD) e de forma periférica nos COM. Os dados obtidos através da microscopia eletrônica de varredura(MEV) e espectroscopia de energia dispersiva (EDS) revelaram grandes variações na distribuição de átomos de oxigênio e cálcio na superfície dos cristais na presença das F-0.25 e F-0.5. A células renais HEK-293, MDCK e 786-0 tiveram baixa toxicidade na presença do extrato bruto e das frações F-0.25; F-0.5; F-0.75. Estas amostras protegeram células renais MDCK e verificou-se um efeito reparador contra danos causados pelo H2O2 e OxCa. Por fim, as células MDCK submetidas ao tratamento prévio e simultâneo com a F-0.25 e a F-0.5 na presença de H2O2 e OxCa, reduziram a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Com isto, verifica-se que PS da G. birdiae podem ser potenciais alvos farmacológicos do ponto de vista preventivo, terapêutico e reparador de danos causados pela urolitíase, porém é importante que outros estudos sejam realizados in vivo, bem como, sejam realizados experimentos para elucidar os mecanismos precisos de ação, pelos quais estes PS protegem as células contra danos por H2O2.
URI: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/22223
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