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Título: Oligonucleotídeos: desenho, produção e aplicações
Autor(es): Nunes, Allan Roberto Dias
Palavras-chave: Oligodeoxiribonucleotídeo;Síntese enzimática;Desenho de primers;Flavivírus;Vírus Zika;Vírus Dengue
Data do documento: 23-Fev-2017
Citação: NUNES, Allan Roberto Dias. Oligonucleotídeos: desenho, produção e aplicações. 2017. 93f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2017.
Resumo: Oligonucleotides are small molecules of nucleic acids with great biotechnological potential for application in several areas of biology and medicine. The pathogen identification by PCR and the production of aptamers with bioactive or pharmacological effect can be cited among its main applications. In this context, the production and design of oligonucleotides are critical points for their application. The most widely used technique for the production of DNA oligonucleotides is chemical synthesis. Despite its effectiveness, this technique cannot be performed in house, making the user totally dependent on a supplier. This work aimed to design new oligonucleotides with potential for different applications, to develop a method for produce them, and to validate their application in a new protocol for the Flavivirus detection using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). In the first stage of the work, a set of universal primers for Flavivirus identification was developed. For this, 1442 complete genomes of different representatives of the genus Flavivirus were aligned for selection of conserved regions (CRs). Twenty-six CRs were selected, allowing the design of 76 universal primers. Among them, it was chosen the primer pairs with the better characteristics related todegeneration and annealing temperature. These primers were used for the standardization of the in vitro RT-PCR protocol, which potentially amplifies an fragment of 800-806 bp in size from the coding region of NS5 protein. This fragment has sufficient variability to discriminate any species of the genus Flavivirus by sequencing. Once the flavivirus detection system was complete, a new step was taken for the design of specific primers. For this, the amplicon generated by the universal primers was defined as a target, in order to produce five new primers for specific identification of Zika virus and the four serotypes of the Dengue virus. Thus, a semi-nested RT-PCR system was developed. In the first step, some species of the genus Flavivirus are detected and in the second step, with the addition of a set of specific primers, are generated fragments of different sizes for discrimination between Zika virus and four dengue virus serotypes by agarose electrophoresis. In the second stage of the work, an enzymatic method for the production of DNA oligonucleotides was developed. The proposed method is based on rolling circle amplification (RCA) and involves four enzymatic steps: (1) phosphorylation of the 5 'end of the target sequence, (2) circularization of the target sequence, (3) polymerization of a new single strand of DNA containing the oligonucleotides of interest and, finally, (4) a restriction assay to release the oligonucleotides. All steps were performed in a single tube, adding the enzymes with their respective buffer solutions. The oligonucleotides produced were resolved using 8% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and visualized by silver staining. Potentially, any oligonucleotide that has no degenerate bases can be produced by the proposed enzymatic method in a single tube. To illustrate, the production of three variations of aptamer 31-TBA, a single chain oligonucleotide having anticoagulant action, was presented.
metadata.dc.description.resumo: Oligonucleotídeos são pequenas moléculas de ácidos nucleicos com grande potencial biotecnológico para aplicação em diversas áreas da biologia e da medicina. Entre suas principais aplicações está a identificação genética de patógenos por meio da técnica de PCR e a produção de aptâmeros com efeito bioativo ou farmacológico. Nesse contexto, a produção e o desenho de oligonucleotídeos são pontos críticos para sua aplicação. A técnica mais utilizada para a produção de oligonucleotídeos de DNA é a síntese química. Apesar de sua eficácia, esta técnica não pode ser realizada in house, tornando o usuário totalmente dependente de um fornecedor. Este trabalho teve como objetivo desenhar novos oligonucleotídeos com potencial para diferentes aplicações, desenvolver um método para produzi-los, e validar a sua aplicação em um protocolo para detecção de Flavivírus por meio da técnica de reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Na primeira etapa do trabalho, um conjunto de primers universais para identificação de Flavivírus foi desenvolvido. Para isso, 1442 genomas completos de diferentes representantes do gênero Flavivirus foram alinhados para seleção de regiões conservadas (CRs). Foram selecionadas 26 CRs, as quais permitiram o desenho de 76 primers universais. Entre eles, foi escolhido o par de primers com a melhor condição de degeneração e temperatura de anelamento para validação do protocolo de RT-PCR in vitro, o qual tem o potencial de amplificar um fragmento da proteína NS5 de 800-806 pb de tamanho. O fragmento gerado é suficientemente variável para discriminar potencialmente qualquer espécie do gênero Flavivirus por sequenciamento. Uma vez determinado o fragmento que seria amplificado para detecção universal de Flavivírus, procedeu-se uma nova etapa para desenho de primers específicos. Desta vez, o produto de amplificação gerado pelos primers universais foi definido como alvo, no intuito de produzir cinco novos primers específicos para identificação do vírus Zika e dos quatro sorotipos do vírus Dengue. Dessa forma, foi desenvolvido um sistema de semi-nested RT-PCR no qual, em um primeiro passo, é detectada a presença de qualquer espécie do gênero Flavivirus e, em um segundo passo, pela adição de um conjunto de primers específicos, é permitida à amplificação de fragmentos de tamanhos diferentes para discriminação do vírus Zika e dos quatro sorotipos de dengue em gel de agarose. Na segunda etapa do trabalho, foi desenvolvido um método enzimático para produção de oligonucleotídeos de DNA. O método proposto é baseado na rolling circle amplification (RCA) e envolve quatro etapas enzimáticas: (1) fosforilação da extremidade 5’ da sequência alvo, (2) circularização da sequência alvo, (3) polimerização de uma nova fita simples de DNA contendo os oligonucleotídeos de interesse e, por fim, (4) um ensaio de restrição para liberar os oligonucleotídeos. Todas as etapas foram realizadas em um único tubo, adicionando as enzimas com suas respectivas soluções-tampão. Os oligonucleotídeos gerados foram separados utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida 8% (PAGE) e visualizados por coloração em prata. Potencialmente, qualquer oligonucleotídeo que não tenha bases degeneradas pode ser produzido pelo método enzimático proposto em um único tubo de reação. Para ilustrar, foi apresentada a produção de três variações do aptâmero 31-TBA, um oligonucleotídeo de cadeia simples que tem ação anticoagulante.
URI: http://hdl.handle.net/123456789/23160
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