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Título: Inibição da função redox de APE1/REF-1 e sua influência na regulação transcricional em um modelo de estimulação inflamatória
Autor(es): Fontes, Fabricia Lima
Palavras-chave: APE1/REF-1;Função redox;RNA-Seq;RelA(p65);c-Myc e biogênese ribossomal
Data do documento: 9-Dez-2016
Citação: FONTES, Fabricia Lima. Inibição da função redox de APE1/REF-1 e sua influência na regulação transcricional em um modelo de estimulação inflamatória. 2016. 172f. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2016.
Resumo: The human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1/REF-1) is a multifunctional enzyme that plays a role in both DNA repair and transcription pathways, being considered a hub protein, controlling key pathways in cell homeostasis and survival. This study aimed to investigate the mechanism behind the inhibition of APE1/REF-1 redox activity using an inflammation model. As the experimental model, U937 cells were incubated with LPS at 1 μg/ml and submitted to two different treatments with 100 μM of E3330, which inhibits specifically the APE1/REF-1 redox function. Inflammation stimulation kinetics was performed with LPS for 1 hour, followed by treatment with E3330 for 2, 4, 6, 24 and 48 hours. In the second model the cells were stimulated with LPS for 24 hours and a subsequent treatment with E3330 for 4 hours. After the treatments, parameters such as cell viability; the expression patterns of inflammatory markers; apoptosis and mitochondrial membrane potential were assessed. The transcriptome analysis was performed using the 454 GS-FLX Titanium platform, followed by functional enrichment and protein-protein interaction networks (PPI) design based on the differentially expressed genes list. In parallel, to validate the transcriptome data and the cellular mechanisms proposed, qPCR, western blotting, rRNA degradation and AP site incision assays were carried out. In addition, searching for putative transcription factors (TFs) binding sites in target genes, the iRegulon tool was used. Our results showed that after stimulation with LPS for 24 hours, the treatment with E3330 for 4 hours did not cause significant variations in cell viability and apoptosis ratio. However, the results obtained using the inflammatory kinetics model showed that cell viability was reduced after treatment with E3330 for 48 hours. Regarding to PPI networks, it was noticed that the most enriched functional categories in the downregulated network were associated to gene expression, immune response, rRNA processing and ribosome biogenesis. On the other hand, biological processes such as signal transduction, stress response, chromatin modification, DNA damage response and positive regulation of apoptosis were the most representative pathways in the network unique to upregulated genes. The protein quantification showed that E3330 lead to the decrease of c-Myc and NF- κB(p65) levels, concomitantly to the increase in MDM2 60 kDa isoform levels. The rRNA integrity assay indicated a decrease of 12 and 20% in the 28S/18S ratio in samples treated with E3330 or LPS respectively. It is noteworthy that all of this finds resulted from the specific inhibition of APE/REF-1 redox activity, since the AP site incision assay confirmed that E3330 at the concentration tested was not able to inhibit APE/REF-1 repair function. In general, regarding to downregulated genes, the TFs are modulated by redox regulation and inhibition of this function by E3330 might alter the activity of these factors, leading to the noticed decrease in the expression of key genes. In this work, it was possible to determine which cellular events are regulated by APE1/REF-1 redox function and it was suggested that inhibition of this function by E3330 reduces the inflammatory response as well as promotes the inhibition of pathways associated to ribosome biogenesis and rRNA processing, without causing any disturbance in its APendonucleases function.
metadata.dc.description.resumo: A endonuclease apurínica/apirimidínica 1 (APE1/REF-1) humana é uma enzima multifuncional que possui atividade de reparo de DNA e regulação transcricional, atuando como proteína reguladora de várias vias importantes para a homeostase e sobrevivência da célula. Este trabalho teve como objetivo caracterizar os efeitos da inibição da função redox de APE1/REF-1 em um modelo de inflamação. Como modelo experimental células U937 foram estimuladas com 1 μg/ml de LPS e submetidas a dois diferentes tratamentos com 100 μM de E3330, um inibidor seletivo da função redox de APE1/REF-1. Foi realizada uma cinética de estimulação com um pré-tratamento de 1 hora com LPS e subsequente tratamento com E3330 por 2, 4, 6, 24 e 48 horas. No segundo modelo as células foram estimuladas com LPS por 24 horas e em seguida foi adicionado o E3330 por mais 4 horas. Após os tratamentos foram realizados ensaios de viabilidade celular, expressão de moduladores inflamatórios, avaliação da apoptose e potencial de membrana. Foi realizado também uma análise de transcriptoma utilizando a plataforma 454 GS-FLX Titanium seguida de sua caracterização e categorização e analise de interação proteína-proteína a partir de ferramentas de bioinformática. Para a validação da expressão diferencial e dos modelos propostos foi realizado experimentos de qPCR, western blotting, ensaio de degradação do rRNA, ensaio de incisão do sítio AP utilizando oligos marcados. E por fim foi utilizada a ferramenta iRegulon para localizar os sítios putativos de ligação à fatores de transcrição (FT) nos genes alvo identificados. Os nossos resultados mostram que após 24 horas de estimulação de células U937 com LPS e tratamento subsequente com E3330 durante mais quatro horas não afeta significativamente a viabilidade das células e a razão de apoptose. No entanto, no modelo de cinética inflamatória, foi possível observar uma redução das células viáveis como consequência do tratamento após 48 horas. Verificou-se também uma diminuição significativa de moduladores inflamatórios em presença de E3330. Em relação análise de interação proteína-proteína foi possível observar que as categorias funcionais mais enriquecidas na rede regulada negativamente estão relacionadas com expressão gênica, resposta imune, tradução, processamento de rRNA e biogênese ribossomal. Já na rede regulada positivamente foi observado um enriquecimento para transdução de sinal, resposta ao estresse, modificação da cromatina, resposta ao dano de DNA e regulação positiva da apoptose. Na quantificação de níveis proteicos foi possível observar uma diminuição estatisticamente significante após o tratamento com E3330 para c-Myc, NF- κB(p65), e um aumento da MDM2 de 60 kDa. No ensaio de integridade de rRNA foi observado uma diminuição da razão 28S/18S nas amostras tratadas com E3330 em torno de 12% e 20% em relação ao controle e LPS respectivamente. Todos esses achados são associados a inibição seletiva da função redox de APE1/REF-1, visto que no ensaio de incisão de sítio AP, a concentração de E3330 utilizada não foi capaz de inibir a função de reparo de DNA da proteína. De uma forma geral, para os genes da lista regulada negativamente, os FTs identificados com a ferramenta iRegulon são modulados por regulação redox, e a inibição com E3330 da APE1/REF-1 pode estar alterando a função dos mesmos e por isso diminuindo a expressão dos genes em questão. Assim, nesse trabalho é proposto que o bloqueio seletivo da atividade redox de APE1/REF-1 por E3330 leva a uma redução da resposta inflamatória, bem como uma diminuição nos mecanismos que promovem a biogênese ribossomal e processamento do rRNA sem alterar a sua função de APendonuclease.
URI: http://hdl.handle.net/123456789/23304
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