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Título: Caracterização bioquímica do inibidor de tripsina purificado da semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) e avaliação do seu efeito na secreção de colecistocinina e leptina em modelo de obesidade experimental
Título(s) alternativo(s): Biochemical characterization of a Kunitz type inhibitor from Tamarindus indica L. seeds and its efficacy in reduces plasma leptin in a model of experimental obesity
Autor(es): Medeiros, Amanda Fernandes de
Palavras-chave: Atividade antitríptica;Kunitz;Ratos Wistar;CCK
Data do documento: 3-Nov-2017
Citação: MEDEIROS, Amanda Fernandes de. Caracterização bioquímica do inibidor de tripsina purificado da semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) e avaliação do seu efeito na secreção de colecistocinina e leptina em modelo de obesidade experimental. 2017. 82f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2017.
Resumo: Obesity is one of the non-communicable chronic diseases with a great impact on public health. The tamarind (Tamarindus indica L.) seed has been studied for its trypsin inhibitor and one of the attributes of this partially purified inhibitor (TTI) is its relationship with satiety, increasing cholecystokinin (CCK) in eutrophic and reducing leptin in obese animals. In this study the ITT was purified, characterized and evaluated for its properties against CCK and leptin in obese Wistar rats. For the purification and characterization of this inhibitor, the crude protein extract was fractionated with ammonium sulfate followed by trypsin-Sepharose affinity chromatography, two-dimensional electrophoresis (2-DE) and High Efficiency Liquid Chromatography (HPLC). TTIp molecular mass was determined by MS-ESI. Partial sequencing of TTIp was established by MALDI-ISD. Inhibitory specificity, stability to temperature and pH was characterized for TTIp. Plasma CCK and leptin was evaluated in rats submitted to oral gavage with TTIp (730 μg / kg) comparing them to untreated obese rats. TTI was purified by HPLC with a single protein peak (ITTp). After refinement of the methods, two protein fractions were observed: Fr 1 and Fr 2, with average mass of [M+H]+ = 19594.690 Da and [M+H]+ = 19578.266 Da, respectively. The presence of 4 cysteines was estimated after reduction and alkylation of Fr 1 e Fr 2. The protein fractions showed 54 and 53 amino acid residues with exactly the same sequence. TTIp presented resistance to temperature variations, reducing about 30% of its anti-tryptic activity at 100 ºC, and resistance to pH extremes. TTIp IC50 was 2.7 x 10-10 mol.L-1 and Ki was 2.9 x 10-11 mol.L-1. The 2-DE revealed spots with isoelectric points between pH 5 and 6, and a spot near pH 8. TTIp characteristics are compatible with trypsin inhibitors from the Kunitz family. In the in vivo experiment, ITTp action on leptin reduction was confirmed, but no effect on CCK was observed in animals with obesity, corroborating previous studies using unpurified TTI. Biochemical knowledge of this molecule and the in vivo experiments shown here are novel and provide essential information for a biomolecule of possible biotechnological application.
metadata.dc.description.resumo: A obesidade é uma das Doenças Crônicas Não Transmissíveis de maior impacto na saúde pública. A semente de tamarindo (Tamarindus indica L.) vem sendo estudada por possuir inibidor de tripsina, e, entre os atributos relacionados a esse inibidor parcialmente purificado (ITT), tem-se a sua relação com a saciedade, por aumentar colecistocinina (CCK) plasmática em animais eutróficos e seu efeito na redução da concentração circulante de leptina em animais com obesidade, entretanto sem aumento plasmático de CCK. Neste estudo, o ITT foi purificado, caracterizado e avaliado quanto às suas propriedades frente aos hormônios CCK e leptina em ratos Wistar com obesidade. Para purificação e caracterização desse inibidor, foram realizados: fracionamento do extrato bruto proteico com sulfato de amônio; cromatografia de afinidade Tripsina-Sepharose; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC); determinação da massa molecular por MS-ESI; sequenciamento parcial por MALDI-TOF com ISD; ensaio de estabilidade de temperatura e pH; estimativa dos parâmetros de especificidade; eletroforese bidimensional (2-DE) e dosagens de CCK e leptina plasmática, por ELISA, em ratos com obesidade, submetidos à gavagem oral (730 μg/kg) do inibidor de tripsina purificado (ITTp) comparando-os a ratos com obesidade sem tratamento. Desse modo, o ITT purificado por HPLC foi denominado ITTp. Com o refinamento do método, obtiveram-se, com base no ITTp, dois picos proteicos, as frações: Fr 1 e Fr 2. As massas moleculares médias dessas frações proteicas foram de [M+H]+ = 19594,690 Da e de [M+H]+ = 19578,266 Da, respectivamente. Após redução e alquilação, estimou-se a presença de 4 cisteínas para Fr 1 e Fr 2. As sequências parciais obtidas para Fr 1 e Fr 2 foram de 54 e 53 resíduos de aminoácidos identificados e exatamente com a mesma sequência para ambas, sugerindo-se tratar da mesma molécula. O ITTp se mostrou resistente à variação de temperatura até 80ºC, reduzindo cerca de 30% de sua atividade antitríptica quando em 100 ºC, e resistente aos extremos de pH. Para o ITTp estimou-se a IC50 de 2,7 x 10-10 mol.L-1 e a Ki de 2,9 x 10-11 mol.L-1. Na eletroforese bidimensional com ITTp foram revelados pontos isoelétricos entre pH 5 e 6, além de um spot próximo ao pH 8. Dessa forma, foi constatado que se trata de um inibidor de tripsina da família Kunitz. No experimento in vivo foi confirmada a ação de ITTp sobre a redução de leptina plasmática, mas sem efeito sobre CCK em animais com obesidade, como já atestado em estudos prévios com o ITT. A caracterização bioquímica desse inibidor e os seus efeitos sobre CCK e leptina, observados em experimentos in vivo, constituem relatos inéditos e promissores para uma provável aplicação biotecnológica.
URI: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/24460
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