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Título: Identificação e caracterização de componentes da via de excisão de bases (BER) em cana-de-açúcar (SACCHARUM spp.)
Título(s) alternativo(s): Identification and characterization from base excision repair pathway components (BER) in sugarcane (SACCHARUM spp.)
Autor(es): Medeiros, Nathalia Maíra Cabral de
Palavras-chave: Reparo de DNA;AP Endonuclease;Cana-de-açúcar;Caracterização bioquímica;Filogenia;Modelagem
Data do documento: 15-Ago-2018
Referência: MEDEIROS, Nathalia Maíra Cabral de. Identificação e caracterização de componentes da via de excisão de bases (BER) em cana-de-açúcar (SACCHARUM spp.). 2018. 216f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2018.
Abstract: The productivity of any cultivar is directly related to the preservation of its genetic code, since any change in the sequence can have consequences that directly affect the development/growth of the plant. The response to DNA damage occurs through its repair through different pathways, one of which is the base excision pathway (BER), whose studies on plants are still inferior in comparison to other eukaryotic organisms. One of the obstacles in the advancement of these researches is the complexity of the plant genome present in some cultivars of agroeconomic importance, so that many studies use diploid models organisms. This work proposes to fill the gap in the knowledge of the BER pathway in relation to non-models and polyploid plants, targeting the sugarcane. The first approach of the work was to identify components of the BER pathway in sugarcane and compare the results obtained with the sequences of other plant organisms to deepen the question of conservation of this pathway. The second approach was using a sequence homologous to the AP endonuclease of Arabidosis thaliana (AtARP) in sugarcane denominated ScARP1. This was the subject of an enzymatic characterization test. For the first approach, we considered the results of previous studies, where a duplication in sugarcane was verified for the AP endonuclease sequence (ScARP1 and ScARP3), in addition to recent work on the BER pathway review in plants. Thus, a search of the ESTs sequences databases for sugarcane (SUCEST-FUN) was done by sequences belonging to via BER. To verify the occurrence of duplications, the results of this search were submitted to phylogenetic analysis and Bayesian inferences. The sequences found were characterized as the presence of conserved domains, besides some of them were modeled, creating hypothetical 3D models. Some of the presumed proteins identified differed in their structure with the reference proteins of A. thalina. Furthermore, multiple copies sequences were observed in certain plant families over others. For the second approach, the ScARP1 protein was cloned, expressed and purified. With this, different assays were carried out to evaluate its enzymatic efficiency (considering temperature, enzymatic cofactors and salt concentration), as well as the substrates that would be recognized by ScARP1. It has been observed that the ScARP1 protein has only AP endonuclease activity. In addition, partial complementation of ScARP1 in protein extracts of the A. thalina arp-/- mutant was observed. With this work it was possible to identify members of the BER pathway in sugarcane, besides characterizing them structurally and phylogenetically, which made it possible to highlight differences between sequences of monocotyledons and dicotyledons. Furthermore, in relation to ScARP1, it was determined that this presents Ap endonuclease activity essential for his performance in BER. Thus, it amplified the knowledge this pathway in sugarcane and vegetables on organisms in general.
Resumo: A produtividade de qualquer cultivar está diretamente relacionada com a preservação de seu código genético, pois qualquer alteração na sequência pode acarretar consequências que afetam diretamente o desenvolvimento/crescimento do vegetal. A resposta ao dano ao DNA ocorre por meio de seu reparo que transcorre por intermédio de diferentes vias, sendo uma delas a via de excisão de bases (BER), cujos estudos em plantas ainda são inferiores em comparação a outros organismos eucariotos. Um dos obstáculos no avanço dessas pesquisas é a complexidade do genoma vegetal presente em alguns cultivares de importância agroeconômica, de modo que muitos estudos utilizam organismos modelos diploides. Este trabalho propõe preencher a lacuna existente no conhecimento da via BER em relação a plantas não-modelos e poliploides, tendo como alvo a cana-de-açúcar. A primeira abordagem do trabalho, foi a identificação de componentes da via BER em cana-de-açúcar e comparar os resultados obtidos com as sequências de outros organismos vegetais para o aprofundamento na questão da conservação desta via. A segunda abordagem se utilizou de uma sequência homóloga a AP endonuclease de Arabidosis thaliana (AtARP) em cana-de-açúcar denominada de ScARP1. Esta foi alvo de um ensaio de caracterização enzimática. Para primeira abordagem, considerou-se os resultados de trabalhos anteriores, onde foi verificado uma duplicação em cana-de-açúcar para a sequência AP endonuclease (ScARP1 e ScARP3), além de trabalho recente de revisão da via BER em plantas. Desta forma, foi efetuada uma busca nos bancos de dados de sequências ESTs para cana-de-açúcar (SUCEST-FUN) por sequências pertencentes a via BER. Para verificar a ocorrência de duplicações, os resultados dessa busca foram submetidos a analises filogenéticas e inferências Bayesianas. As sequências encontradas foram caracterizadas quanto a presença de domínios conservados, além de algumas delas foram modeladas, criando modelos 3D hipotéticos. Algumas das presumíveis proteínas identificadas diferiram em sua estrutura com as proteínas de referência de A. thalina. Ademais, múltiplas cópias de sequência foram observadas em certas famílias vegetais em detrimento de outras. Para a segunda abordagem, a proteína ScARP1 foi clonada, expressa e purificada. Com esta foram realizados diferentes ensaios que visaram avaliar a sua eficiência enzimática (considerando temperatura, cofatores enzimáticos e concentração de sais), assim como os substratos que seriam reconhecidos por ScARP1. Observou-se que a proteína ScARP1 possui apenas atividade AP endonuclease. Além disso, observou-se uma complementação parcial de ScARP1 em extratos proteicos do mutante arp- /- de A. thalina. Com esse trabalho foi possível identificar membros da via BER em cana-de-açúcar, além de caracteriza-los estruturalmente e filogeneticamente a qual possibilitou destacar diferenças entre sequências de monocotiledôneas e dicotiledôneas. Ademais, em relação a ScARP1, determinou-se que esta apresenta atividade Ap endonuclease essencial para a sua atuação em BER. Com isso, amplificou-se o conhecimento desta via em cana-de-açúcar, bem como em organismos vegetais de forma geral.
URI: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/26229
Aparece nas coleções:PPGB - Doutorado em Bioquímica

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