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Title: Prospecção de microrganismos e genes envolvidos na biodegradação de petróleo e derivados
Authors: Carlos, Aline Cardoso
Keywords: Bibliotecas metagenômicas;Biorremediação;Degradação de hidrocarbonetos
Issue Date: 31-Jan-2019
Citation: CARLOS, Aline Cardoso. Prospecção de microrganismos e genes envolvidos na biodegradação de petróleo e derivados. 2019. 101f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2019.
Portuguese Abstract: Atividades industriais realizadas pela exploração de petróleo tem gerado uma grande quantidade de resíduos. Os resíduos formados representam um passivo ambiental de grandes proporções, os quais carecem de tratamento adequado. Desta forma, tem sido crescente nos últimos anos o desenvolvimento de estratégias de biorremediação ambiental. Nesse contexto, a abordagem metagenômica foi utilizada no presente trabalho com objetivo de identificar microrganismos e genes associados à biodegradação de hidrocarbonetos e síntese de biossurfactantes, a partir da triagem funcional de biblioteca metagenômica e do isolamento de bactérias. Uma biblioteca metagenômica utilizando DNA ambiental do resíduo de fluido de perfuração de poço de petróleo, foi construída e os clones obtidos em plasmídeo (pBC) e expressos em E. coli (DH10B). Os clones foram selecionados funcionalmente. Para isto, foram utilizados testes qualitativos e quantitativos, como o teste colorimétrico baseado na redução do DCPIP (2,6- diclorofenol indofenol), que permite detectar degradação de hidrocarbonetos. O teste DCPIP revelou 60 clones positivos para atividade de degradação, dos quais 25 foram sequenciados. A predição de ORFs permitiu a identificação de genes envolvidos nas vias de degradação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos. Além disso, o crescimento dos clones na presença de petróleo, corroboraram com os resultados obtidos no teste DCPIP, revelando habilidade de degradação pelos clones. Seis clones apresentaram estimativa de degradação entre 50 a 80% quando comparado a E.coli DH10BØ (cepa hospedeira com o vetor vazio). Estes seis clones foram selecionados para montagem de dois consórcios (consórcio C e consórcio C + I) os quais foram utilizados para biorremediação do resíduo de fluido de perfuração. No ensaio que avaliou a atividade desidrogenásica foi observada elevada atividade metabólica durante o período de 28 dias. As taxas de degradação foram de 14 e 42% de n-alcanos para os consórcios C e C+ I, respectivamente, sugerindo potencial de aplicação dos consórcios em processos de biorremediação. O sequenciamento dos clones formadores do consórcio, mostrou a presença de genes envolvidos em diferentes vias, além de genes chaves envolvidos na degradação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos. Bactérias isoladas a partir do resíduo, foram identificadas por meio do sequenciamento do RNAr 16S e apresentaram elevada identidade com representantes dos gêneros Brevibacillus e Bacillus. A abordagem funcional de bibliotecas metagenômicas utilizada no presente trabalho, se mostrou uma excelente estratégia para a prospecção de enzimas atuantes na degradação de hidrocarbonetos do petróleo.
Abstract: Industrial activities carried out by oil exploration have generated a lot of waste. The waste generated represents a major environmental liability, which requires adequate treatment. In this way, the development of environmental bioremediation strategies has been increasing in recent years. In this context, the metagenomic approach was used in the present work to identify microorganisms and genes associated with hydrocarbon biodegradation and biosurfactant synthesis, from the functional screening of the metagenomic library and the isolation of bacteria. A metagenomic library using environmental DNA from the oil well drilling fluid residue was constructed and the clones obtained in plasmid (pBC) and expressed in E. coli (DH10B). The clones were functionally selected. For this, qualitative and quantitative tests were used, such as the colorimetric test based on the reduction of DCPIP (2,6-dichlorophenol indophenol), which allows the detection of hydrocarbon degradation. The DCPIP test revealed 60 clones positive for degradation activity, of which 25 were sequenced. The prediction of ORFs allowed the identification of genes involved in the degradation pathways of aliphatic and aromatic hydrocarbons. In addition, the growth of the clones in the presence of petroleum, corroborated with the results obtained in the DCPIP test, revealing ability of degradation by the clones. Six clones showed degradation estimates between 50 and 80% when compared to E.coli DH10BØ (host strain with empty vector). These six clones were selected for assembly of two consortia (C consortium and C + I consortium) which were used for bioremediation of the drilling fluid residue. In the assay that evaluated the dehydrogenase activity was observed a high metabolic activity during the period of 28 days. The degradation rates were 14 and 42% of n-alkanes for the consortia C and C + I, respectively, suggesting potential of application of the consortia in bioremediation processes. Sequencing of the consortium forming clones showed the presence of genes involved in different pathways as well as key genes involved in the degradation of aliphatic and aromatic hydrocarbons. Bacteria isolated from the residue were identified by sequencing the 16S rRNA and showed high identity with representatives of the genus Brevibacillus and Bacillus. The functional approach of metagenomic libraries used in the present work has proved to be an excellent strategy for the prospection of enzymes active in the degradation of petroleum hydrocarbons.
URI: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/27078
Embargoed until: 2020-02-18
Appears in Collections:PPGB - Doutorado em Bioquímica

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