Identificação da segurança e potencial aplicação clínica de nanopartículas contendo inibidor de tripsina isolado de sementes de tamarindo (Tamarindus indica L.)

Costa, Rafael Oliveira de Araújo

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Title:	Identificação da segurança e potencial aplicação clínica de nanopartículas contendo inibidor de tripsina isolado de sementes de tamarindo (Tamarindus indica L.)
Other Titles:	Identification of safety and potential clinical application of nanoparticles loaded with a trypsin inhibitor isolated from tamarind seeds (Tamarindus indica L.)
Authors:	Costa, Rafael Oliveira de Araújo
Advisor:	Morais, Ana Heloneida de Araujo
Keywords:	Encapsulação;Nanopartícula;Atividade antitríptica;CCD18- Co;Caco-2;Ratos Wistar
Issue Date:	29-Mar-2019
Citation:	COSTA, Rafael Oliveira de Araújo. Identificação da segurança e potencial aplicação clínica de nanopartículas contendo inibidor de tripsina isolado de sementes de tamarindo (Tamarindus indica L.). 2019. 74f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2019.
Portuguese Abstract:	Moléculas naturais com ação bioativa, tais como o inibidor de tripsina isolado de sementes de tamarindo (Tamarindus indica L.) (ITT), destaca-se entre os agentes sacietogênicos e anti-inflamatórios estudados na atualidade. Nessa perspectiva, visando manter o ITT intacto e protegido ao longo do trato gastrointestinal, foi realizada a encapsulação por nanoprecipitação em quitosana purificada e proteína de soro de leite isolada, e as partículas (EQPI) foram caracterizadas por diferentes técnicas. Para isso, porém, precisa ser avaliada a segurança, visando possíveis aplicações clínicas. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a citoxicidade e toxicidade sanguínea subaguda da dose bioativa do EQPI em ratos Wistar, alimentados com dieta de alto índice glicêmico. O ITT foi obtido com base no fracionamento proteico, utilizando sulfato de amônio. A fração com maior atividade inibitória contra tripsina, fracionamento de 30-60%, foi isolada por Cromatografia de Afinidade em Tripsina-Sepharose, e utilizada para síntese de nanopartículas. O EQPI foi sintetizado, respeitando a proporção de ITT, quitosana purificada e proteína isolada do soro do leite de 1:2:2 p/p/p, respectivamente, sendo posteriormente caracterizado por diferentes análises físicas e químicas. E avaliado quanto à interação entre o ITT e os agentes encapsulantes em pH neutro (água) e em pH ácido, por meio de diversas etapas de filtração em Amicon® 100 K, sendo monitorado pela atividade antitríptica. Adicionalmente, foi avaliado a citotoxicidade do EQPI em diferentes concentrações (0,5, 2,5 e 5 mg/mL) por meio do ensaio de resazurina, utilizando duas linhagens celulares, (Caco-2 e CCD-18Co), além da toxicidade sanguínea (hemograma, função hepática e renal) em ratos Wistar macho (n = 10), alimentados com dieta de alto índice glicêmico e, administrado com EQPI (12,5 mg/Kg) por 10 dias. O EQPI apresentou partículas esféricas com superfície lisa de acordo com a Microscopia Eletrônica de Varredura, diâmetro médio de 118 nm (17.27), índice de polidispersão de 0.373 (0.02), carga superficial de -38.26 mV (0.15) e, eficiência de encapsulação de 95.3% (0.31). Quanto à interação em água do ITT e dos agentes encapsulantes por meio da avaliação da atividade antitríptica, utilizando Amicon® 100 K, observou-se que, o EQPI protegeu o ITT e o manteve aprisionado. No entanto, em pH ácido ocorreu uma liberação gradual do ITT, sendo evidenciada pela forte interação entre o ITT e os agentes encapsulantes utilizados neste estudo. O ensaio de citotoxicidade apontou alta viabilidade celular (>70%) para Caco-2 e CCD-18Co, quando exposta ao EQPI avaliado em diferentes concentrações. Quanto à toxicidade sanguínea subaguda do EQPI, administrado em ratos Wistar, também não foram demonstrados efeitos tóxicos de acordo com os resultados obtidos para os parâmetros bioquímicos avaliados. Neste estudo, o EQPI se mostrou eficiente em proteger o ITT quando disperso em água e exposto ao pH ácido. As concentrações de EQPI, avaliadas em células e no modelo experimental, não demonstraram sinais de toxicidade, sugerindo a aplicação segura dessas partículas e provável efeito hepatoprotetor. Assim, assegurando a sua aplicação em estudos complementares para investigar a eficácia no tratamento da obesidade e suas complicações.
Abstract:	Natural molecules with bioactive action, such as the trypsin inhibitor isolated from tamarind (Tamarindus indica L.) (TTI) stands out among the satietogenic and anti-inflammatory agents currently studied. In this perspective, aiming to maintain TTI intact and protected throughout the gastrointestinal tract, encapsulation was performed by nanoprecipitation in purified chitosan and isolated whey protein, and the particles (ECW) were characterized by different techniques. However, for this, the safety needs to be evaluated, aiming at possible clinical applications. Thus, the objective of this study was to evaluate the cytotoxicity, and subacute blood toxicity of the bioactive dose of ECW in Wistar rats fed a high glycemic index diet. TTI was obtained from protein fractionation using ammonium sulfate. The fraction with the highest inhibitory activity against trypsin, fractionation of 30-60%, was isolated by Chromatography of Affinity in Trypsin-Sepharose and used for the synthesis of nanoparticles. ECW was synthesized respecting the ratio of TTI, purified chitosan and whey protein isolated of 1: 2: 2 w/w/w, respectively, being posteriorly characterized by different physical and chemical analyzes. And the interaction between TTI and the encapsulating agents in neutral pH (water) and acidic pH, through several filtration steps in Amicon® 100 K, being monitored antitrypsin activity. In addition, the cytotoxicity of the ECW at different concentrations (0.5, 2.5 and 5 mg / mL) was evaluated by resazurin assay (Caco-2 and CCD-18Co) and blood toxicity (blood count, hepatic and renal function) in male Wistar rats (n = 10) fed a high glycemic index diet and , administered with ECW (12.5 mg / kg) for days 10 days. The ECW presented spherical particles with a smooth surface according to Scanning Electron Microscopy, mean diameter of 118 nm (17.27), a polydispersity index of 0.373 (0.02), surface charge of -38.26 mV (0.15) and efficiency of encapsulation of 95.3% (0.31). Concerning the interaction in water of TTI and the encapsulating agents through the evaluation of the antitrypsin activity, using Amicon® 100 K, it was observed that in water the ECW protected the TTI and kept it entrapped. However, in acidic pH, there was a gradual release of TTI, evidenced by the strong interaction between TTI and the encapsulating agents used in this study. The cytotoxicity assay indicated high cell viability (> 70%) for Caco-2 and CCD18Co when exposed to the ECW evaluated at different concentrations. As for the subacute blood toxicity of the ECW administered in Wistar rats, no toxic effects were also demonstrated according to the results obtained for the biochemical parameters evaluated. In this study, ECW proved to be effective in protecting TTI when dispersed in water and exposed to acid pH. The concentrations of ECW evaluated in cells, and the experimental model did not show signs of toxicity, suggesting the safe application of these particles and, probably, hepatoprotective effect. Finally, ensuring its application in complementary studies to investigate the efficacy in the treatment of obesity and its complications.
URI:	https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/27159
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