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Atividade imunomoduladora de diferentes extratos obtidos da espécie Plukenetia volubilis Linneo (Euphorbiaceae stricto sensu)
(2017-12-21) Nascimento, Ana Karina de Lima; Scortecci, Katia Castanho; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; ; ; Golbert, Daiane Cristina Ferreira; ; Lima, Jailma Almeida de; ; Silveira, Raniere Fagundes de Melo; ; Giordani, Raquel Brandt;
A inflamação é um mecanismo de resposta do hospedeiro contra agressões e injúrias e que deve ser finamente regulada para evitar o desequilíbrio homeostático do organismo, prevenindo também o surgimento de doenças. Em virtude da ocorrência de efeitos adversos associados aos imunomoduladores sintéticos, tais como problemas cardiovasculares e gastrointestinais, a busca por imunomoduladores de fontes naturais, especificamente de origem vegetal, tem se tornado uma boa alternativa no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. Dentro desse contexto, a espécie Plukenetia volubilis L., pertencente à família Euphorbiaceae stricto sensu (ss), se enquadra como uma representante do reino vegetal de alto valor biológico. Há ocorrência de relatos etnobotânicos de sua utilização no tratamento de lesões de pele, sendo necessária uma comprovação científica destes dados. Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade imunomoduladora in vitro e in vivo de extratos de folhas da espécie Plukenetia volubilis Linneo. Para isto, foram realizados testes in vitro utilizando macrófagos da linhagem RAW 264.7 e in vivo utilizando camundongos BALB/C. Os resultados do presente trabalho mostram que os extratos de P. volubilis estimularam a atividade de redução do composto MTT pelas desidrogenases mitocondriais dos macrófagos com ausência de citotoxicidade nas concentrações utilizadas (100, 250 e 500 μg/mL). Macrófagos estimulados com LPS e tratados com os diferentes extratos apresentaram redução significativa na produção de óxido nítrico (NO), em comparação com o controle. As porcentagens de produção de NO para os extratos metanólico (EM), aquoso (EA), hexânico (EH), etanólico (EE) e clorofórmico (EC) foram de 56%, 64%, 64,1%, 65% e 72%, respectivamente. Com relação à dosagem de citocinas e à quantificação da expressão relativa de seus genes, verificou-se que para a maioria houve uma redução da expressão, com exceção de TNF-α que apresentou expressão relativa acima do controle após tratamento com os extratos EH, EC e EA. Os extratos EH, EC e EA, provavelmente, agem inibindo COX-2 e iNOS via inibição do fator de transcrição NfΚB, enquanto que para TNF-α seu mecanismo de ação supostamente ocorre por outra via independente. No ensaio in vivo os extratos EA e EE inibiram a migração de leucócitos para cavidade peritoneal de camundongos induzidos a peritonite. Desta forma, conclui-se que os compostos presentes nos extratos de folhas de P. volubilis são agentes promissores no desenvolvimento de novas formas alternativas para o tratamento de doenças inflamatórias, uma vez que agem modulando a resposta inflamatória por meio da modulação na síntese das citocinas.
Atividades biológicas de xilana de sabugo de milho
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2010-02-25) Silveira, Raniere Fagundes de Melo; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4799567J8&dataRevisao=null; ; http://lattes.cnpq.br/4657447123848421; Santos, Everaldo Silvino dos; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4799564Y2; Silva, Ana Maria da; ; SILVA, Ana Maria da
O sabugo de milho é um subproduto agrícola ainda pouco utilizado, isto se deve em parte ao baixo conhecimento do potencial biotecnológico de suas biomoléculas. Xilana de sabugo de milho (XSM) é um polissacarídeo presente em maior quantidade na estrutura do vegetal e seu potencial biotecnológico é pouco conhecido. Este trabalho teve como objetivo a extração, caracterização química e avaliação de atividades biológicas de XSM. Sabugos de milho foram limpos, cortados, desidratados e triturados, dando origem a uma farinha. Esta foi submetida a uma metodologia que combina o uso de meio alcalino com ondas de ultra-som. Após precipitação metanólica, centrifugação e secagem obteve-se um rendimento de 40% (g/g de farinha). Análises químicas indicaram um alto percentual de polissacarídeos na amostra (60%) e baixa contaminação por proteínas (0.4%) e compostos fenólicos (>0.01%). Análises da composição monossacarídica por cromatografia em papel e por cromatografia líquida de alta performance (CLAE) indicaram a presença de xilose:glicose:arabinose:galactose:manose:ácido glucurônico em uma proporção molar de 50:20:15:10:2,5:2,5. A presença de xilana na amostra foi confirmada por ressonância magnética nuclear (13C e 1H) e por espectroscopia de infravermelho (IR). Testes foram realizados para avaliação do potencial antioxidante de XSM. Esta mostrou uma capacidade antioxidante total de 48.45 EAA/g de amostra. Contudo, a mesma não mostrou atividade sequestradora de superóxido, radical hidroxila bem como poder redutor. Em contra partida, apresentou 70% de atividade quelante de íons de ferro na concentração de 2 mg/mL. A capacidade de XSM em influenciar a proliferação celular em cultura também foi avaliada. Este polissacarídeo não influenciou a proliferação de células fibroblásticas normais (3T3), entretanto, diminuiu a taxa de proliferação de células tumorais (HeLa) de maneira dose-dependente, chegando a uma inibição de aproximadamente 50% com concentração em torno de 2 mg/mL. Analisando proteínas relacionadas à morte celular, através de immunoblotting, XSM aumenta a quantidade de Bax, citocromo c e AIF e diminui Bcl-2 e procaspase- 3, indicando a indução de morte celular por apoptose dependente e independente de caspase. XSM não apresentou atividade anticoagulante pelo teste de PT. Todavia, no teste de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), XSM aumentou o tempo de coagulação em cerca de 5 vezes utilizando 600 μg de amostra, quando comparadas com o controle negativo. A presença de sulfato ligado a XSM foi descartada por eletroforese em gel de agarose e por IR. Após carboxirredução de XSM a atividade anticoagulante diminuiu drasticamente. Os dados deste trabalho demonstram que XSM apresenta potencial como composto antioxidante, antiproliferativo e anticoagulante. Estudos futuros de caracterização dessas atividades do XSM contribuirão para aumentar o conhecimento sobre esta molécula extraída de milho e permitirão a sua utilização em alimentos funcionais, produtos farmacêuticos e indústrias químicas.
Caracterização de frações ricas em polissacarídeos sulfatados da alga marrom Dictyopteris delicatula e avaliação do seu potencial antiurolítico, a partir da determinação de suas atividades antioxidante e moduladora da cristalização de oxalato de cálcio
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2020-03-27) Batista, Lucas Alighieri Neves Costa; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; ; Scortecci, Kátia Castanho; ; Silveira, Raniere Fagundes de Melo;
Fucanas e fucoidans são polissacarídeos que contêm alfa-L-fucose sulfatada em sua constituição e são encontrados quase que exclusivamente em algas marrons, atribui-se a essas moléculas diversas atividades farmacológicas como: anticoagulante, antitrombótica, antiproliferativa, antinociceptiva osteogênica. A ampla presença de grupamentos sulfato, e as vezes carboxila, nas fucanas e fucoidans confere a essas moléculas uma elevada carga negativa, o que é uma característica comum nos inibidores da formação de cálculos renais de oxalato de cálcio (CaOx), por isso, considera-se que as fucanas e fucoidans têm elevado potencial como agentes antiurolíticos. Outro ponto positivo para as fucanas e fucoidans com relação sua atividade antiurolítica é as suas propriedades antioxidantes, pois como o estresse oxidativo participa do processo de formação de cálculos renais, a ação antioxidante é considerada como preventora da urolitíase. Contudo, poucas fucanas e fucoidans, menos de dez, foram avaliados nesse sentido. Tendo isso em mente, assim como, a questão da carga negativa e a atividade antioxidante como fatores chave para atividade antiurolítica, no presente estudo teve-se como objetivo avaliar o potencial antiurolítico de polissacarídeos extraídos da macroalga Dictyopteris delicatula, uma macroalga amplamente encontrada em todo o litoral nordeste do Brasil, por meio da análise da influência desses polissacarídeos na cristalização do CaOx in vitro e da capacidade deles em prevenir o estresse oxidativo em células proveniente do epitélio renal (MDCK). Polissacarídeos de D. delicatula foram extraídos por proteólise a quente e fracionados por meio de precipitação com volumes crescente de acetona em cinco diferentes frações: F0,5v, F0,7v, F1,0v, F1,5v e F2,0v. Análise da composição dessas frações mostrou que se tratavam de frações ricas em polissacarídeos sulfatados (FRPS) contendo fucose. Na presença das FRPS os cristais CaOx foram menores, mais numerosos e com carga superficial altamente negativa. Destacou-se a atividade modulatória da F0,5v (0,1 mg/mL), cuja presença na cristalização aumentou 1721 vezes o número de cristais formados; reduziu em mais de 90% o tamanho dos cristais; aumentou a carga negativa da superfície de -7 mV para -35 mV e impediu completamente a formação de cristais CaOx monoidratados. Muitos destes efeitos ainda foram visualizados quando F0,5v foi avaliada em concentrações menores (0,02 – 0,01 mg/mL). Quando avaliada em condições de cultivo celular, F0,5v (0,5 mg/mL) inibiu por completo o efeito do peróxido de hidrogênio em diminuir a viabilidade de células MDCK. Portanto, esta foi escolhida para ser melhor caracterizada. Assim, a F0,5v foi submetida a cromatografia de troca iônica e foram obtidas cinco subfrações: 0.2 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M e 1.0 M. A caracterização química da F0,5v e das suas subfrações revelaram que essas são constituídas principalmente por fucose, glucose, ácido urônico e sulfato. As atividades antioxidante e moduladora da cristalização de CaOx de nenhuma das subfrações foi superior às atividades da F0,5v, indicando que a F0,5v é mais potente quando não está fracionada. Em suma, F0,5v foi capaz de sequestrar 79% dos radicais hidroxila, 10% dos radicais superóxido, 22% do óxido nítrico e teve atividade antioxidante equivalente a 31 mg de ácido ascórbico. E com relação a modulação dos cristalização, na presença das subfrações foi observado redução no número e aumento no tamanho dos cristais CaOx, exceto quando utilizou-se 0.2 M e 0.6 M. Considerando a atividade antioxidante e modulatória da cristalização do CaOx promovida pela F0,5v, concluise que essa fração tem potencial em prevenir a formação de cálculos renais de CaOx mais promissor que as suas subfrações.
Conjugação verde de ácido gálico a Polissacarídeos (quitosana e dextranas): avaliação química e potencialização de atividades antioxidantes
(2019-07-29) Queiroz Neto, Moacir Fernandes de; Costa, Leandro Silva; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; ; ; Câmara, Rafael Barros Gomes da; ; Sabry, Diego de Araújo; ; Silveira, Raniere Fagundes de Melo; ; Medeiros, Valquiria Pereira de;
Estresse oxidativo nas células ocorre quando há um desequilíbrio entre a quantidade de antioxidantes e oxidantes a favor destes últimos, o que, por conseguinte, pode ser causa de mais de 100 doenças. A fim de se combater esta situação pode-se utilizar antioxidantes exógenos adquiridos principalmente através da alimentação. Por isso, há uma busca por diferentes fontes de compostos com ação antioxidantes, inclusive de compostos semissintéticos ou sintéticos. Polissacarídeos são moléculas naturais cuja capacidade antioxidante varia de acordo com o seu tipo de polissacarídeo e de possíveis conjugações com diferentes grupos ou moléculas como ácido gálico (AG). Quitosanas e dextranas são duas das famílias de polissacarídeos mais abundantes na natureza e que têm diversas aplicações. Todavia, possuem baixo potencial antioxidante, o que restringe o seu uso. Nesse trabalho, a partir do método de conjugação verde foi possível conjugar AG à quitosana e dextrana e a conjugação foi confirmada através das análises de dosagem de compostos fenólicos, infravermelho e ressonância magnética nuclear. Foi possível incorporar 10,2 ± 1,5 mg AG/g de quitosana, o que provocou um aumento de 2 vezes na capacidade antioxidante total (CAT), 5 vezes no poder redutor e houve o surgimento de uma atividade de quelação férrica (cerca de 60%) não observada com a quitosana nativa. Além disso o conjugado também foi capaz de impedir a formação exacerbada de cristais de oxalato de cálcio in vitro, o que foi observado com a quitosana nativa. No tocante a dextrana, vale salientar que este é o primeiro relato de conjugação desse polissacarídeo a AG, que no caso foi 36,8 ± 1,4 mg de AG/g de dextrana. A dextrana nativa não apresentou atividade antioxidante em nenhum teste, porém a dextrana conjugada apresentou atividades nos testes de CAT (14 mg ácido ascóbico (AA)/g), sequestro de radical superóxido (60%) e poder redutor (90%). Devido ao seu ineditismo o processo de conjugação da dextrana com AG foi submetido a um planejamento fatorial com intuito de entender como as variáveis (quantidade de peróxido e quantidade de AG) influenciavam na síntese da dextrana conjugada; em suas atividades antioxidantes; e de obter uma condição ideal de conjugação de AG à dextrana. Verificou-se que a quantidade de AG no processo de conjugação é inversamente proporcional as atividades antioxidantes, e que a condição ideal para produção de uma molécula com potencial antioxidante máximo é aquela produzida com peróxido de concentração 1,2M e proporção de AG para dextrana de 1:1. A molécula ideal teve CAT de 60 mg de AA/g de amostra, quelação de cobre próxima de 50%, e um poder redutor próximo de 90%. Em suma, o método verde de conjugação de AG foi eficiente tanto para quitosana quanto para dextrana e em ambos os casos, foi possível aumentar o potencial antioxidante desses polissacarídeos, indicando um potencialpara uso esses derivados como substituintes das suas moléculas nativas aplicações chave.
Controle de qualidade no laboratório clínico: hora de mudar?
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2020-11-27) Gomes, Cícero Sena Moreira; Ferreira, Leonarco Capistrano; Silveira, Raniere Fagundes de Melo; Rodrigues Neto, João Firmino
O controle de qualidade nas análises clínicas é um ponto crucial para garantir que os laudos e resultados expedidos representam a condição clínica dos pacientes. Envolve uma série de requisitos e está baseado principalmente na realização de testes de controle diários. Os elevados custos no controle de qualidade nos laboratórios clínicos associado a probabilidade de liberação de resultados com vieses levam a uma preocupação constante. Os desvios observados no controle promovem um efeito cascata sobre a rotina do laboratório introduzindo retrabalho e aumento no consumo dos produtos químicos utilizados. Um ponto adicional a ser observado recai sobre o uso de substâncias comerciais para efetuar o controle onde podem ocorrer efeitos matriz e o risco de não comutabilidade, o que introduz vieses nem sempre mensuráveis. Apresenta-se então uma metodologia para controle de qualidade baseada no próprio paciente e realizada em tempo real: o Controle de Qualidade em Tempo Real Baseado no Paciente (CQTRBP), que propõe o uso de dados existentes dos próprios pacientes para minimizar vieses associados ao efeito matriz e não comutabilidade, antecipar desvios promovendo ações rápidas de correção e minimizando retrabalho, além de promover uma redução de custos estimada em até 85% nos insumos para o controle de qualidade.
Efeito da fotobiomodulação na proliferação e viabilidade de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)
(2019-08-30) Albuquerque, Diego Filgueira; Barboza, Carlos Augusto Galvão; ; ; Santos, Pedro Paulo de Andrade; ; Silveira, Raniere Fagundes de Melo;
O objetivo do presente estudo foi avaliar, através de experimentos in vitro, o efeito da fotobiomodulação com laser de baixa intensidade na proliferação e viabilidade de células endoteliais humanas. Células endoteliais da veia do cordão umbilical humano (HUVEC) foram cultivadas e divididas em quatro grupos: C - controle (sem irradiação) e grupos L1, L4 e L7.5 – células irradiadas com doses de 1; 4; e 7,5 J/cm², respectivamente, de laser diodo (InGaAlP; comprimento de onda de 660 nm; potência de 30 Mw, em dose única). A atividade metabólica das células foi avaliada nos intervalos de 24, 48 e 72 horas após a irradiação, através do ensaio do Alamar Blue. A viabilidade e a proliferação celular também foram avaliadas no intervalo de 72h, através dos ensaios de Live/Dead, Annexin V/PI, análise das fases do ciclo celular e imunomarcação da proteína Ki67. Os dados do ensaio do Alamar Blue mostraram que no intervalo de 72h todos os grupos irradiados exibiram percentuais de redução significativamente maiores do que o grupo controle não irradiado (p<0,01), sendo a diferença ainda mais evidente em L4 e L7.5 (p<0,001). A análise da viabilidade celular por Live/Dead demonstrou um grande número de células viáveis em todos os grupos, o que também foi observado através da imunomarcação por Annexin V/PI, que mostrou alta porcentagem de viabilidade celular nos grupos estudados (C: 95,2%; L1: 96,1%; L4: 96,1%; L7.5: 96,9%). A avaliação das fases do ciclo celular mostrou que os grupos irradiados exibiram aumento gradativo do percentual de células nas fases proliferativas do ciclo (S e G2/M), de modo dose-dependente (C: 36,9%; L1: 38,0%; L4: 38,3%; L7.5: 40.4%). A irradiação promoveu um aumento significativo na expressão da proteína nuclear Ki67, com resultado mais acentuado quando comparado o grupo G7.5 com os demais grupos. Em conjunto, os resultados do presente estudo demonstraram que a fotobiomodulação, principalmente na dose de 7,5 J/cm², promoveu aumento da proliferação e viabilidade de células HUVEC, o que pode sugerir o uso potencial do laser nos parâmetros estudados como estimulo à endotelização nas técnicas de engenharia tecidual vascular.
Efeito da laserterapia em células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 cultivadas sobre arcabouços de quitosana
(2019-06-27) Dionizio, Silvano da Cunha; Barboza, Carlos Augusto Galvão; ; ; Farias, Naisandra Bezerra da Silva; ; Silveira, Raniere Fagundes de Melo;
A quitosana é um biopolímero que apresenta uso potencial como arcabouço na engenharia tecidual devido às suas propriedades mecânicas e biológicas, tais como biodegradabilidade não toxicidade, efeito antibacteriano e biocompatibilidade. A laserterapia tem sido estudada como uma ferramenta auxiliar nas técnicas de engenharia tecidual pelo seu efeito bioestimulatório in vitro em diversos tipos celulares, contudo seu efeito sobre células cultivadas em arcabouços de quitosana ainda é desconhecido. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da laserterapia em células pré-osteoblásticas cultivadas sobre arcabouços de quitosana. A quitosana e as membranas produzidas foram submetidas a caracterização físico-química e de superfície. As células da linhagem MC3T3-E1 foram expandidas e cultivadas em quatro grupos, de acordo com a superfícies de cultivo e a aplicação ou não de irradiação: P – plástico da placa de cultivo, sem irradiação, como controle positivo do crescimento celular; L0 – arcabouços de quitosana, sem irradiação; L1 – arcabouços de quitosana, com células irradiadas com dose de 1 J/cm²; e L4 - arcabouços de quitosana, com células irradiadas com dose de 4 J/cm². A laserterapia foi realizada com laser diodo de InGaAlP, com comprimento de onda de 660 nm, potência de 30 mW, em dose única. A proliferação celular foi analisada nos intervalos de 24, 48 e 72 horas após a irradiação, através do ensaio de redução metabólica do Alamar Blue, enquanto a viabilidade celular foi avaliada através dos ensaios de Live/Dead e da Anexina/PI. A morfologia celular e a integração célula/biomaterial foram avaliados no intervalo de 72 horas por MEV. Os dados do ensaio de proliferação mostraram que o grupo L4 apresentou maior proliferação em comparação com grupos P e L0 no intervalo de 24 h (p<0,01) e exibiu uma tendência proliferativa em relação a L0 e L1 no intervalo de 72 h. A avalição da viabilidade por Live/Dead revelou um grande número de células viáveis em todos os grupos, o que foi confirmado pela análise por Anexina/PI, que mostrou alta porcentagem de viabilidade celular nos grupos estudados (P: 89,2%; L0: 82,1%; L1: 82%; e L4: 85,2%). A análise por MEV revelou que no grupo não irradiado (L0) as células apresentaram-se mais isoladas e com formato arredondado, enquanto nos grupos irradiados (L1 e L4) as células exibiram projeções mais evidentes e formaram grupamentos celulares. Em conjunto, os dados do presente estudo mostraram que o arcabouço de quitosana produzido não influenciou a proliferação das células MC3T3-E1, no entanto também não prejudicou a viabilidade celular. A fotobiomodulação, principalmente na dose de 4 J/cm², promoveu aumento da proliferação celular e permitiu que as células superassem eventuais condições desfavoráveis da superfície do biomaterial. Estes resultados sugerem que a laserterapia pode ser uma ferramenta eficaz para promover a proliferação celular nas técnicas de engenharia tecidual com arcabouços de quitosana.
Efeitos do laser de baixa intensidade na proliferação e viabilidade de células pré-osteoblásticas na superfície de filmes de ácido polilático
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2020-07-17) Sabino, Vladimir Galdino; Barboza, Carlos Augusto Galvão; Miguel, Márcia Cristina da Costa; Silveira, Raniere Fagundes de Melo
O ácido polilático (PLA) é um biomaterial usado em muitas aplicações biomédicas e mostra-se promissor na produção de arcabouços para engenharia de tecidos. A irradiação com laser de baixa intensidade (LBI) tem sido sugerida como uma ferramenta para promover a bioestimulação in vitro de vários tipos celulares. Nesse contexto, o estudo teve como objetivo verificar a eficácia do LBI na proliferação de pré-osteoblastos MC3T3-E1 cultivados em filmes de PLA. Os filmes produzidos foram caracterizados em termos de hidrofilicidade por testes de ângulo de contato, morfologia da superfície por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e nanotopografia por microscopia de força atômica (AFM). As células MC3T3-E1 foram cultivadas em três grupos: Controle - superfície plástica de poliestireno; PLA - filme de PLA; e PLA + Laser - filme de PLA, com posterior irradiação das células com laser de diodo (InGaAIP; comprimento de onda 660 nm; potência 30 mW; densidade energética 4 J/cm²). A proliferação celular foi avaliada pelo ensaio Alamar Blue nos intervalos de 24, 48 e 72 h após a irradiação. No intervalo de 72 h, a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio Live/Dead, os eventos relacionados à apoptose por marcação com Anexina-V/PI e os eventos do ciclo celular por citometria de fluxo, enquanto a morfologia celular na superfície de cada filme foi avaliada por MEV. Os filmes produzidos apresentaram superfície lisa e regular, com rugosidade superficial média (Ra) de 21,43 nm. Os resultados do ensaio bioquímico do Alamar Blue indicaram que o grupo PLA + Laser exibiu maior proliferação (p<0,01) quando comparado aos grupos Controle e PLA. Os ensaios Live/Dead e Annexina/PI indicaram aumento da viabilidade celular no grupo PLA + Laser, que também apresentou maior porcentagem de células (p<0.05) nas fases proliferativas do ciclo celular (S e G2/M). Esses achados foram confirmados pela maior densidade celular observada no grupo PLA + Laser através da análise por MEV. As evidências deste estudo corroboram a ideia de que o LBI aumenta a proliferação de células MC3T3-E1 nas superfícies do PLA, sugerindo que ele pode ser potencialmente aplicado na engenharia de tecidos ósseos.
Estudo dos genomas dos principais vírus que acometem a carcinicultura no Brasil
(2019-03-15) Dantas, Márcia Danielle de Araújo; Lanza, Daniel Carlos Ferreira; Lima, João Paulo Matos Santos; ; ; ; Silva, Marcelo de Sousa da; ; Amaral, Viviane Souza do; ; Silveira, Raniere Fagundes de Melo; ; Feijó, Rubens Galdino;
A região Nordeste é uma das maiores produtoras de camarão no Brasil, com destaque para os estados do Rio Grande do Norte e Ceará. Um dos maiores problemas que a indústria da carcinicultura vem enfrentando nas últimas décadas é o aumento da incidência de doenças infecciosas, as quais causam grandes perdas econômicas para o setor. Dentre essas doenças destacam-se aquelas causadas pelo vírus da síndrome da mancha branca (WSSV), o Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) e o vírus da mionecrose infecciosa (IMNV). O estudo dos genomas desses vírus é de fundamental importância para entender mecanismos essenciais à sobrevivência dos mesmos e, assim, desenvolver ferramentas eficazes para detecção e controle. Nesse contexto, o objetivo geral deste trabalho foi caracterizar os genomas de variantes do IMNV, WSSV e PstDNV, contribuindo com novas informações sobre as características do genoma e taxonomia desses patógenos. O capítulo 1 descreve o estudo de sequências de membros da família Totiviridae. Os resultados mostram que o IMNV e outros vírus da família que infectam artrópodes apresentam características que os classificam em um novo grupo denominado preliminarmente como Artivirus. O alinhamento de aminoácidos da ORF1 indica que os artivírus são os únicos membros da família Totiviridae que apresentam os sítios de clivagem 2A-like e duas proteínas previamente preditas para o IMNV. Um possível sítio de clivagem upstream à proteína do capsídeo também foi identificado nesses genomas. Modelos proteicos revelaram estruturas conservadas para as duas proteínas, indicando que, provavelmente, elas estão envolvidas na formação das protrusões virais e empacotamento do RNA. O capítulo 2 aborda o sequenciamento e análise do genoma de um isolado brasileiro do WSSV (WSSV-BR). O genoma foi sequenciado utilizando a plataforma Ion Torrent e montado usando um pipeline alternativo no qual um genoma quimera do WSSV foi utilizado como sequência referência. O genoma do WSSV-BR apresentou um tamanho de 292.912 pb, 184 possíveis ORFs e nove regiões homólogas. Análises de identidade e de filogenia mostraram que o WSSV-BR é mais próximo aos isolados da Tailândia e México e que, provavelmente, esses três vírus compartilham uma origem evolutiva comum. Além disso, foi observado que a história evolutiva do WSSV pode estar relacionada a eventos de recombinação e que esses eventos, de algum modo, podem ser traçados analisando as regiões homólogas do WSSV. O capítulo 3 traz o sequenciamento e análise do genoma de um novo isolado brasileiro do PstDNV (PstDNV-BR17). A comparação de identidade e a filogenia mostraram que o novo isolado faz parte de uma linhagem infecciosa do PstDNV. Análises de variabilidade genética mostraram que existem poucos sítios polimórficos entre os isolados brasileiros e que essas alterações não afetam a estrutura das proteínas. A investigação da região 5’UTR revelou a presença de uma deleção no PstDNV-BR17 que altera estruturas secundárias presentes nessa região, as quais são importantes para a replicação viral. As informações obtidas a partir do estudo dos genomas poderão ser utilizadas para subsidiar a orientação de medidas de manejo e controle eficazes no combate aos problemas causados por vírus que afetam a carcinicultura.
Nanopartículas de prata contendo polissacarídeos sulfatados de algas: caracterização química, morfológica e identificação de suas atividades antioxidante, bactericida, antiproliferativa e imunomodulatória
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-08-07) Negreiros, Marília Medeiros Fernandes de; Costa, Leandro Silva; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; http://lattes.cnpq.br/4651814546820796; ; http://lattes.cnpq.br/4991977240761750; ; http://lattes.cnpq.br/8484266004921053; Sassaki, Guilherme Lanzi; ; http://lattes.cnpq.br/6433828746058651; Silveira, Raniere Fagundes de Melo; ; http://lattes.cnpq.br/4657447123848421
A produção de nanoparticulas de prata com extratos naturais tem sido apontada como uma excelente alternativa para potencializar ou fornecer novas aplicabilidades aos extratos. Extratos de polissacarídeos sulfatados de algas (ASP) apresentam propriedades farmacológicas, porém há poucos relatos da produção de nanopartículas de prata com extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (SPN). Assim, neste trabalho sintetizou-se SPN de algas encontradas no Brasil: Spatoglossum schröederi, Dictyopteris justii, Sargassum filipendula e Dictyota mertensii. A obtenção dos extratos ricos em polissacarídeos ocorreu por proteólise seguida por precipitação com metanol. A síntese das diferentes nanopartículas ocorreu com a adição de soluções de prata 1 mM em soluções dos diferentes polissacarídeos e mantidos em repouso. Posteriormente as amostras foram centrifugadas e liofilizadas. A formação SPN foi confirmada por espectroscopia UV/visível, microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica. O tamanho das SPN foi de 108 ± 2 nm; 82 ± 1nm; 288 ± 52 nm; 104 ± 2 nm para S. schröederi; D. justii; S. filipendula; D. mertensii, respectivamente e se manteve estável por catorze meses, os potenciais zeta foram negativos e as formas das SPN foram esféricas. Os resultados de diversos testes in vitro mostraram que as SPN potencializam as atividades antioxidantes de ASP. As SPN também foram biocompatíveis com células normais 3T3 (fibroblastos murinicos). Por outro lado, SPN de S schröederi e de D. mertensii tiveram atividade citotóxica (~60%) frente as células de melanoma murínico (B16F10) e acredita-se que a maior atividade citotóxica destas SPN ocorram devido aos seus pequenos tamanhos. SPN também tiveram grande capacidade antibacteriana. Nanopartículas de D. justii e S. filipendula tiveram os melhores resultados, sendo necessário somente 50 µg/mL para a morte da bactéria E. coli e 100 µg/mL para a morte de S. aureus. Hipotetíza-se que esta atividade ocorra por liberação de prata pelas SPN. SPN também foram capazes de induzir a produção de óxido nítrico e citocinas com perfil semelhante a os seus respectivos ASP, com exceção para SPN de S. schröederi. Em geral, os resultados revelaram que a síntese de SPN a partir das ASP potencializa efeitos antioxidantes, citotóxico e antibacteriano dos ASP, além de apresentar o mesmo efeito imunomodulador de seus respectivos ASP. Os dados obtidos levam a propor que a síntese de SPN constituiu-se como um possível mecanismo potencializador de atividades biológicas.
Nanopartículas de prata contendo xilanas: síntese, caracterização e avaliação do seu efeito imunomodulador e antibacteriano
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2022-05-06) Viana, Rony Lucas da Silva; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; https://orcid.org/0000-0003-2252-1221; http://lattes.cnpq.br/4651814546820796; http://lattes.cnpq.br/2739053256443663; Alves, Monique Gabriela das Chagas Faustino; https://orcid.org/0000-0002-9122-1073; http://lattes.cnpq.br/9570307530482830; Melo, Karoline Rachel Teodosio de; Silveira, Raniere Fagundes de Melo; Medeiros, Valquiria Pereira de
Nas últimas décadas o aumento da resistência bacteriana aos tratamentos convencionais fez com que houvesse uma busca incessante para novas alternativas de tratamento contra enfermidades causadas por esses microrganismos. Dentro desse contexto, progressos significativos foram alcançados no desenvolvimento de medicamentos baseados em nanotecnologia, a fim de combater/atenuar a resistência bacteriana. As nanopartículas, constituídas de prata (NANO) são apontadas como uma opção promissora nesse sentido, inclusive já vem sendo aplicadas em diferentes usos. Porém, seu uso na clínica médica tem uma menor dimensão, e isso vem impulsionando desenvolvimento de diferentes NANO mistas, que contêm, além da prata, uma porção orgânica na sua constituição, já que essa pode potencializar ou fornecer novas aplicabilidades as NANO. Isto vem estimulando, inclusive, a utilização de técnicas menos agressivas ao meio ambiente (síntese verde) para a síntese de NANO e os polissacarídeos são uma das moléculas orgânicas utilizadas com esse propósito. Xilana é uma hemi-celulose encontrada em diferentes vegetais e, por isso, muito abundante na natureza. Porém, há menos de uma dezena de trabalhos com NANO contendo xilanas, e nenhum avaliou seu efeito antimicrobiano. Diante deste cenário, neste trabalho foram sintetizadas NANO com diferentes xilanas extraídas do sabugo do milho (Zea mays). Para tal, a farinha do sabugo do milho solubilizado em NaOH 1,8M, foi submetido a ondas de ultrassom para se obter um extrato bruto rico em xilana (EBX), que posteriormente foi fracionado com adição de volumes crescentes de etanol PA. Foram obtidas seis frações etanólicas (FE’s), que após caracterização (teor de açúcar, proteínas, compostos fenólicos e composição monossacarídica), foram utilizadas para síntese verde de NANO (NANO EBX; NANO E0,3; NANO E0,4; NANO E0,8; NANO E1,4 e NANO E2,2). As NANO foram caraterizadas por espectroscopia UV-visível, microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia por dispersão de energia, dispersão de luz dinâmica e espectroscopia de infravermelho. Todas as NANO foram compostas essencialmente de prata e xilanas, apresentaram formato arredondado, tamanho médio entre 79,7 e 105,0 nm e estabilidade de 24 meses. Estas NANO não foram citotóxicas frente a fibroblastos (3T3) e macrófagos (RAW). Além disso, promoveram a redução da produção de óxido nítrico (ON) em macrófagos ativados por lipopolissacarídeo bacteriano. As diferentes NANO, aqui sintetizadas, também apresentaram atividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas (Escherichia coli – E. coli; Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase – KPPC) com destaques para NANO EBX e NANO E1,4 que apresentaram concentração inibitória mínima (CIM) de 62,5 µg/mL frente a E. coli. Já para KPPC destaca-se NANO EBX, NANO E0,4; NANO E1,4 e NANO E2,2 que apresentaram o CIM de 250 µg/mL. Os dados aqui apresentados mostram o potencial biotecnológico das diferentes xilanas sob forma de nanopartícula com ação antibacteriana e imunomoduladora na produção de ON, futuros ensaios inclusive in vivo devem ser feitos para confirmar o potencial antibacteriano das diferentes NANO sintetizadas com EBX e as FE’s.
Prospecção de polissacarídeos bioativos da alga Lobophora variegata e elucidação estrutural de uma de suas β-glucanas
(2016-07-29) Paiva, Almino Afonso de Oliveira; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; ; Dore, Celina Maria Pinto Guerra; ; Albuquerque, Ivan Rui Lopes de; ; Costa, Leandro Silva; ; Nobre, Leonardo Thiago Duarte Barreto; ; Silveira, Raniere Fagundes de Melo;
Macroalgas marinhas são importantes fontes de polissacarídeos neutros e negativos com importante potencial industrial e farmacológico. A macroalga marrom Lobophora variegata é conhecida por apresentar polissacarídeos sulfatados (heterofucanas) e neutros (laminarinas). Neste trabalho, mostra-se a obtenção de 6 frações polissacarídicas (F0.3; F0.5; F0.8; F1; F1.5 e F2). A partir dos dados de caracterização físico-química das frações, escolheu-se a F1 para purificação de seus componentes polissacarídicos. Análises de cromatografia líquida de exclusão molecular levaram a observação que F1 apresenta polissacarídicos de baixa (~ 5 kDa) até alta (> 100 kDa) massa molecular. Estes componentes foram separados de acordo com sua massa molecular, utilizando-se dispositivos de separação por tamanho molecular. Com isso, obteve-se subfrações polissacarídicas com tamanhos médios de 5, 20, 40, 75 e acima 100 kDa, denominadas de F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 e F1>100 kDa, respectivamente. Estas subfrações foram analisadas físico-químicamente por eletroforese em gel de agarose, cromatografia líquida de alta eficiência, assim como, por análises de suas propriedades antioxidantes, imunoestimulantes e citotóxicas/antiproliferativas. Como resultados, detectou-se um teor de açúcares totais acima de 55% em todas as subfrações, já proteínas e compostos fenólicos não foram observados. As frações F1-5, F1-20 e F1-40 apresentaram somente glucose (glucanas), já F1-75 e F1>100 apresentam glucose, galactose e fucose (heterofucanas). Todas as subfrações apresentaram atividade quelante de metais, mas somente F1-75 e F1>100 foram mais efetivas em sequestrar radicais. A produção/liberação de óxido nítrico (NO) por células RAW 264.7 ficou aumentada apenas na presença F1-5 (10 μM, p<0,05), F1-75 (10 μM, p<0,001) e, com destaque, F1>100 (10 μM, p<0,001) cuja presença aumentou em cerca de 12 vezes a quantidade de NO. Entretanto, quando estas células foram ativadas com LPS, somente F1-20 e F1>100 (10 μM) (p<0,001) proporcionaram produção/liberação de ON. As demais frações não interferiram na ação do LPS. Somente F1-5 e F1>100 estimularam a produção/liberação de citocinas. Somente F1>100 (10 μM) foi citotóxica para a linhagem 3T3 (fibroblastos) (p<0,01). Nenhuma das subfrações apresentaram efeito citotóxico para linhagem de células RAW 264.7 (macrófagos) ou para linhagem de células tumorais Hep-G2 (carcinoma hepático). Já com a linhagen de células 786-0 (adenocarcinoma renal) somente a glucana F1-40 não apresentou atividade citotóxica (p>0,05). Os maiores valores de citotoxidade foram obtidos com a subfração F1-20, no caso contra células B16F10 (melanoma). Dados de citometria de fluxo indicaram que esta subfração promove uma parada das células na fase G1 do ciclo celular (10 μM, p<0,01). Análises de ressonância magnética nuclear levaram a proposta de que F1-20 é uma β-glucana formada por β-(13) glucoses com ramificações, compostas por um resíduo de glicose, na posição 6. A proporção é de nove resíduos de glucose 13 ligados para cada ponto de ramificação. Os dados apontam F1-20, por ser antioxidante, imunomoduladora e citotóxico, como um composto pluripotente cujo potencial deva ser melhor investigado.
Uma proteína de sementes de Lachesiodendron viridiflorum: uma alternativa para combate de agentes microbianos e células tumoriais
(2018-08-31) França, Anderson Felipe Jácome de; Santos, Elizeu Antunes dos; Migliolo, Ludovico; ; ; ; Uchoa, Adriana Ferreira; ; Soares, Ana Katarina Menezes da Cruz; ; Lima, Jailma Almeida de; ; Silveira, Raniere Fagundes de Melo;
Sementes são reservatórios de moléculas com grande potencial para a obtenção de bioprodutos e por este motivo uma especial atenção tem sido direcionada na busca de proteínas bioativas com ação antimetabólica e outras propriedades farmacológicas. Algumas sementes apresentam proteínas e peptídeos que, sozinhos, desempenham múltiplas funções tais como interações com membranas de bactérias causando disrupção, atividade fungicida e antitumoral, recrutamento de macrófagos e neutrófilos (uma ação definida como imunomodulação) e atividade hemolítica. Neste trabalho, uma prospecção de proteínas com atividade multifuncional foi realizada em extratos de sementes de quatro espécies da família Fabaceae: Senna spectabilis (Cássia-do-nordeste), Anadenanthera colubrina (Angico), Adenanthera pavonina (Carolina) e Lachesiodendron viridiflorum (Jurema-Juquiri). Os extratos foram testados com relação à presença de atividades antitríptica, antipapaínica, hemaglutinante, hemolítica e citotoxicidade sobre linhagem de célula não tumoral e, dentre eles, se destacou o extrato de L. viridiflorum, cuja proteína denominada LvP foi purificada e escolhida para os estudos posteriores. Quando analisada por SDS-PAGE, LvP apresentou uma massa molecular de aproximadamente 17 kDa, com atividades hemolítica e citotóxica para células mononucleares. Não apresentou atividade tóxica para a linhagem celular 3T3, entretanto, em baixas concentrações, LvP foi capaz de afetar a viabilidade celular das linhagens tumorais HeLa, Hep G2, HT29, B16, A-375 e A2058. LvP também foi deletéria para os fungos Candida albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. glabrata e C. parapsilosis. Todavia, quando testada contra as bactérias patogênicas Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Staphylococcus aureus resistente à meticilina - MRSA, nenhuma atividade bactericida foi detectada. Quando a LvP foi associada aos antibióticos de referência, e testada novamente contra as bactérias, ela foi capaz de reduzir o CIM do antibiótico em até uma diluição para todas as três espécies, caracterizando assim uma atividade sinérgica da proteína. Baseado nos dados obtidos, a LvP isolada corresponde a uma estrutura proteica multifuncional, e suas propriedades antitumoral, antimicrobiana, fungicida e bactericida precisam ser investigadas com mais detalhes para que seu potencial biotecnológico seja melhor avaliado.
Síntese verde de nanopartículas contendo prata e xilana do sabugo de milho: caracterização físico-química e avaliação das atividades antioxidante e antimicrobiana frente a protozoário e a fungos
(2017-10-30) Viana, Rony Lucas da Silva; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; Silveira, Raniere Fagundes de Melo; ; ; ; Souza, Giulianna Paiva Viana de Andrade; ; Lima, Jailma Almeida de;
O sabugo de milho é um subproduto do cultivo do milho que é pouco utilizado economicamente o que leva ao desperdício de milhões de toneladas desse material anualmente. Do sabugo pode-se extrair moléculas, inclusive um polissacarídeo bioativo, rico em xilose, denominado de xilana. Neste trabalho, foram produzidas, por um método sustentável ao meio ambiente (síntese verde), nanopartículas de prata contendo xilanas de sabugo de milho (nanoxilanas). Para tal, a xilana de sabugo de milho foi extraída com o auxílio de ondas de ultrassom. Análises químicas mostraram que esta não estava contaminada por proteínas nem por compostos fenólicos. A xilana foi hidrolisada e seus componentes monossacarídicos foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Na análise monossacarídica identificou-se os componentes sendo eles, xilose: glucose: galactose: manose: ácido glucurônico nas seguintes proporções 50: 21: 14: 9: 2,5: 2,5, respectivamente. A formação das nanoxilanas foi acompanhada por espectroscopia UV-visível com kmax = 469 nm. Análises de espectroscopia de infravermelho confirmaram a presença da prata e xilana na nanopartícula. Já as análises de dispersão dinâmica de luz e microscopia (DLS) e de força atômica (MFA) mostraram que o tamanho das partículas foi em média de 102 nm e que essas tinham um formato arredondado. Os dados de DLS também mostraram que as nanoxilanas permaneceram estáveis por 12 meses quando armazenadas a 4 °C e protegidas da luz. Dados de espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado (ICP OES) mostraram que o percentual de prata na nanoxilana foi de 19%. A nanoxilana reduziu a viabilidade das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (L. amazonensis) (IC50 25 μg/mL), enquanto a xilana não foi efetiva nessa concentração. Além disso, a nanoxilana apresentou um valor de 7,5 μg/mL correspondente a concentração mínima inibitória para três diferentes fungos Candida albicans, Candida parapsilosis, e Cryptococcus neorformans. Adicionalmente, a nanoxilana não alterou de forma negativa a redução de MTT a formazan por células normais (3T3). Os dados aqui apresentados mostram o potencial biotecnológico da nanoxilana e futuros ensaios, inclusive in vivo, devem ser feitos para confirmar o potencial antimicrobiano da nanoxilana.
Xilanas de sabugo de milho como agente antioxidante, citotóxico, anticoagulante e imunomodulador
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-10-20) Silveira, Raniere Fagundes de Melo; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; http://lattes.cnpq.br/4651814546820796; ; http://lattes.cnpq.br/4657447123848421; Barbosa, Carlos Augusto Galvão; ; http://lattes.cnpq.br/5004397230198722; Lanza, Daniel Carlos Ferreira; ; http://lattes.cnpq.br/6851351991421755; Albuquerque, Ivan Rui Lopes de; ; http://lattes.cnpq.br/2266021166245706; Bezerra, Ranilson de Souza; ; http://lattes.cnpq.br/2205151409139871
A prospecção de polissacarídeos farmacologicamente ativos provenientes de subprodutos agrícolas ainda é uma prática pouco explorada no meio científico. Dessa forma, este trabalho pretendeu ampliar o conhecimento relacionado às atividades farmacológicas de polissacarídeos extraídos do sabugo de milho. A partir da farinha de sabugo de milho, um extrato polissacarídico foi obtido ao combinar ondas de ultrassom em meio alcalino, e ao final do processo o produto foi denominado de EPSM. Esse extrato foi caracterizado fisico-quimicamente e, através de ensaios in vitro, foi avaliado como agente antioxidante, citotóxico, anticoagulante e imunomodulator. Os resultados indicaram que o EPSM apresentou significativa ação quelante de metal, além de não apresentar efeito tóxico para células de linhagem normal, mas evidenciar efeito citotóxico contra as células tumorais HeLa, quando causou a morte celular por apoptose. Em adição, outros efeitos farmacológicos foram observados, o EPSM diminuiu a produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos ativados, e estendeu o tempo de coagulação sanguínea quando avaliado pelo ensaio de APTT. Posteriormente, frações metanólicas, etanólicas e cetônicas foram obtidas a partir do fracionamento dos polissacarídeos presentes no EPSM. Foram obtidas cinco frações metanólicas, seis frações etanólicas e duas cetônicas; e todas avaliadas quanto às atividades antioxidante, citotóxica, anticoagulante e imunomodulatória. Dentre as frações, E1.4 exibiu significativo efeito qualante de metal, ação tóxica em células HeLa por indução da apoptose, reduziu a produção de NO por macrófagos ativados, e ampliou o tempo de coagulação sanguínea. Esses resultados sinalizaram que os polissacarídeos farmacologicamente ativos do EPSM estariam presentes na fração E1.4. A partir do fracionamento da E1.4 foram obtidas seis subfrações polissacarídicas com tamanhos distintos: -3; 3-10; 10-30; 30-50; 50-100 e +100 KDa. Cerca de 80% dos polissacarídeos de E1.4 apresentou tamanho inferior a 10 KDa, e todas as subfrações apresentaram mais de 61% de açúcar em suas composições químicas. Essas subfrações exibiram diferentes composições monossacarídicas, mas todas apresentaram xilose. As subfrações evidenciaram distintos efeitos nos ensaios farmacológicos in vitro. As subfrações de menor tamanho (< 30 KDa) demonstraram maior atividade quelante de metal e maior atividade citotóxica contra células tumorais. As intermediárias (entre 30 e 100 KDa) diminuíram mais a produção de NO por macrófagos ativados, mas a de maior tamanho (+100 KDa) modulou um maior número de citocinas inflamatórias, e demonstrou um maior efeito anticoagulante. Portanto, a análise conjunta dos resultados indica que os polissacarídeos farmacologicamente ativos do ESPM são heteroxilanas e foram concentrados nas subfrações de E1.4, além disso, os efeitos farmacológicos dessas heteroxilanas dependem do seu tamanho molecular.

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