PPGB - Doutorado em Bioquímica

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Bioprospecção de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte: caracterização de uma heterofucana extraída da alga marron Sargassum filipendula que induz apoptose em células HeLa
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2012-03-08) Costa, Leandro Silva; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4799567J8&dataRevisao=null; ; http://lattes.cnpq.br/4991977240761750; Leite, Edda Lisboa; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783254U6&dataRevisao=null; Santos, Elizeu Antunes dos; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782221T9&dataRevisao=null; Toma, Leny; ; http://lattes.cnpq.br/3669434753963813
O litoral do Rio Grande do Norte apresenta mais de 100 espécies de macroalgas marinhas, a maioria delas ainda não explorada quanto ao seu potencial farmacológico. Os polissacarídeos sulfatados (PS) são de longe os compostos de macroalgas marinhas mais estudados, sendo atribuída a estes uma gama de propriedades biológicas, como: atividade anticoagulante, antiinflamatória, antitumoral e antioxidante. Neste trabalho, obteve-se extratos ricos em polissacarídeos de onze algas do litoral do Rio Grande do Norte (Dictyota cervicornis; Dictiopterys delicatula; Dictyota menstruallis; Dictyota mertensis; Sargassum filipendula; Spatoglossum schröederi; Gracilaria caudata; Caulerpa cupresoides; Caulerpa prolifera; Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum), e estas foram avaliadas quanto ao seu potencial anticoagulante, antioxidante e antiproliferativo frente à linhagem celular tumoral HeLa. Todos os extratos polissacarídicos apresentaram atividades anticoagulante, antioxidante e/ou antiproliferativa, com destaque para os das algas D. delicatula e S. filipendula, que apresentaram os maiores índices de potencial farmacológico, sendo, portanto, escolhidas para serem submetidos a passos posteriores de purificação de seus polissacarídeos sulfatados. Através do fracionamento com volumes crescentes de acetona foram obtidas seis frações ricas em polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula (DD-0,5v, DD-0,7v, DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v e DD-2,0v) e cinco frações da alga S. filipendula (SF-0,5v, SF- 0,7v, SF-1,0v, SF-1,5v e SF-2,0v). Análises físico-químicas mostraram que estas são ricas em heterofucanas sulfatadas. Apenas as frações da alga D. delicatula apresentaram atividade anticoagulante, com destaque para DD-1,5v que apresentou a atividade mais proeminente com razão de APTT semelhante à clexane®, fármaco anticoagulante comercial. Quando avaliadas com relação ao potencial antioxidante todas as frações apresentaram atividade em todos os testes realizados (Capacidade antioxidante total, sequestro de radicais superóxido e hidroxila, quelação férrica e atividade redutora), entretanto, a capacidade de quelação de íons ferro aparece como o principal mecanismo antioxidante dos polissacarídeos sulfatados dessas macroalgas marinhas. No ensaio antiproliferativo, todas as heterofucanas apresentaram atividades dose-dependente para a inibição da proliferação celular de HeLa, entretanto, as frações SF-0,7v, SF-1,0v e SF-1,5v apresentaram atividade específica para esta linhagem celular, não inibindo a proliferação da linhagem celular normal MC3T3, sendo a heterofucana SF-1,5v escolhida para ter seu mecanismo de ação antiproliferativo determinado. SF-1,5v induz a apoptose em células HeLa principalmente através de uma via independente da ativação das caspases, promovendo a liberação do Fator Indutor da Apoptose (AIF) no citosol, que por sua vez induz a condensação da cromatina e fragmentação do DNA em fragmentos de 50Kb. Este trabalho é o primeiro relato mostrando uma heterofucana cujo principal mecanismo antiproliferativo é a liberação de AIF mitocondrial para o citosol, o que torna SF-1,5v um promissor fármaco na terapia antitumoral, possibilitando uma alternativa aos quimioterápicos tradicionais.
Aspectos estruturais, farmacológicos e biológicos de fucanas da alga marrom sargassum vulgare
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2012-10-15) Dore, Celina Maria Pinto Guerra; Leite, Edda Lisboa; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783254U6&dataRevisao=null; ; http://lattes.cnpq.br/2279068301048550; Cruz, Ana Katarina Menezes da; ; http://lattes.cnpq.br/9810605697247961; Farias, Eduardo Henrique Cunha de; ; http://lattes.cnpq.br/0933304924768138; Filgueira, Luciana Guimarães Alves; ; http://lattes.cnpq.br/9951316929526841; Carvalho, Maria Goretti Freire de; ; http://lattes.cnpq.br/8934375314306198
O presente estudo analisa a composição química e seus efeitos sobre os radicais livres, inflamação, angiogênese, coagulação, VEGF e proliferação celular dos polissacarídeos de uma alga Sargassum vulgare. O polissacárido sulfatado foi extraído a partir de algas marrons por proteólise com a enzima maxataze. A presença de proteínas e açúcares foram observados no cru de polissacarideos. Fracionamento do o extrato bruto foi feito com concentrações crescente de acetona (0,3-1,5 v), produzindo quatro grupos de polissacarideos. Estes compostos aniônicos da alga S. vulgare, foram fracionados (SV1) e purificados (PSV1) exibindo com alta açúcares totais e sulfatecontent e nível muito baixo de proteínas.A fucana SV1 contém baixos níveis de proteína e de hidratos de carbono e alto teor de sulfato. Este polissacarídeos prolongou o tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) a 50 ug (>240 s). não foi observado qualquer efeito de SV1 sobre o tempo de protrombina (PT), que corresponde a via extrínseca da coagulação. SV1 exibiu alta ação antitrombótica in vivo, com uma concentração 10 vezes maior do que a heparina. SV1 promoveu a actividade de inibição enzimática direta da trombina e estimulou a atividade enzimática do FXa. Mostrou também, atividade inibidora optima de trombina (50,2 ± 0,28%) a uma concentração de 25 ug / mL. A sua acção anti-oxidante de radicais scavenging por DPPH foi de (22%), indicando que o polímero não tem qualquer ação citotóxica (hemolítica) em tipos de sangue ABO e Rh, em diferentes grupos de eritrócitos e exibindo alta ação anti-inflamatória em edema de pata de ratos Wistar em todas as concentrações testadas induzida por carragenina. Tal processo foi demonstrado por edema e infiltração celular. A angiogenese é um processo dinâmico de proliferação e diferenciação. Ele requer proliferação endotelial, migração, e a formação do tubo. Neste contexto, as células endoteliais são um alvo preferido para muitos estudos e terapias. A eficácia antiangiogenico de polissacarídeos foi examinada in vivo na membrana corioalantóica pinto (CAM) usando-se ovos fertilizados. Diminuições na densidade dos capilares foram avaliados e pontuados. Os resultados mostraram que SV1 e PSV1 tem um efeito inibidor da angiogenese. Estes resultados foram também confirmados por tubulogenesis inibição na célula endotelial da aorta de coelho (RAEC) em matrigel. Células RAEC quando foram incubadas com SV1and PSV1 demonstraram inibição da secreção de VEGF, a 25, 50 e 100 ug/mL. A secreção de VEGF com a linha de células RAEC durante 24 h, foi mais eficaz para PSV1 a 50 ug / mL (71,4%) do que SV1 100 ug / mL (75,9%). SV1 e PSV1 posuiram uma acção antiproliferativa (47%) contra as células tumorais tipo HeLa. Estes compostos foram avaliados também, no ensaio de apoptose (anexina V - FITC / PI) e a viabilidade celular pelo ensaio de MTT de RAEC. Estes polissacarídeos não afetaram a viabilidade e não tiveram ação apoptótica ou necrótica. Nossos resultados indicam que estes polissacarídeos sulfatados têm ações antiangiogênica e antitumoral e constituem um importante alvo biológico e farmacológico
Estado nutricional e efeito da vitamina A na resposta imune frente à infecção por Leishmania Infantum
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2013-12-20) Maciel, Bruna Leal Lima; Jerônimo, Selma Maria Bezerra; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785584A3&dataRevisao=null; ; http://lattes.cnpq.br/5790541670952158; Brandão Neto, José; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783031A0; Schwarzschild, Lúcia de Fátima Campos Pedrosa; ; http://lattes.cnpq.br/1863589790139155; Carvalho, Lucas Pedreira de; ; http://lattes.cnpq.br/7308383096084856; Passos, Sara Timóteo; ; http://lattes.cnpq.br/1834035455867904
O estado nutricional é importante determinante da resposta à infecção por Leishmania. No entanto, são poucos os trabalhos que caracterizem as bases moleculares das associações encontradas entre a desnutrição e a doença. A suplementação de vitamina A é utilizada em países em desenvolvimento para reduzir a mortalidade por diarreia e doenças respiratórias. Apesar disso, não existem estudos sobre o papel da vitamina A na infecção por Leishmania apesar de nosso grupo e outros terem demonstrando a deficiência de vitamina A durante a leishmaniose visceral (LV). As células T regulatórias são consideradas células supressoras durante a LV e são induzidas por metabólitos de vitamina A. Este trabalho teve como objetivo verificar a correlação do estado nutricional e o efeito da vitamina A na resposta frente à infecção por Leishmania infantum. Foram estudadas 179 crianças, sendo 31 casos de LV ativa, 33 com história pregressa de LV, 44 DTH+ e 71 DTH- e Anticorpo anti-Leishmania negativo (DTH-/Ac-). Células mononucleadas de sangue periférico foram isoladas em um subgrupo de 10 crianças com LV e 16 DTH-/Ac-, sendo cultivadas por 20h sob as seguintes condições: 1) Meio, 2) Antígenos solúveis de promastigotas de L. infantum (SLA), 3) Ácido all-trans retinóico (ATRA), 4) SLA + ATRA e 5) Concanavalina A. As células T CD4+CD25highFoxp3+, T CD4+CD25-Foxp3- e monócitos CD14+ foram marcadas e estudadas por citometria de fluxo quanto à produção de IL-10, TGF-β e IL-17. O estado nutricional apresentou-se comprometido nas crianças com LV, que apresentaram menor IMC/idade e baixas concentrações de retinol sérico quando comparadas aos controles sadios. Observou-se correlação negativa entre o estado nutricional (medido por Índice de Massa Corporal/Idade e retinol sérico) e anticorpos anti-Leishmania e proteínas de fase aguda. Não foi encontrada correlação entre o estado nutricional e a carga parasitária. O ATRA apresentou efeito distinto nas células Treg e monócitos: Em crianças saudáveis (DTH-/Ac-), induziu resposta regulatória, com aumento na produção de IL-10 e TGF-β; e, em crianças com LV, modulou a resposta imune, diminuindo a produção de IL-10 após o estímulo com SLA. Foi encontrada correlação positiva entre o IMC/Idade e a produção de IL-17 e correlação negativa entre o retinol sérico e a produção de IL-10 e TGF-β nas céluas T CD4+CD25highFoxp3+ após estímulo com SLA. Os dados deste estudo permitem concluir que o estado nutricional comprometido durante a LV é correlacionado com a resposta imune e inflamatória frente à Leishmania. Além disso, possivelmente, a vitamina A apresenta duplo efeito na resposta imune: em crianças sadias, promove resposta regulatória; durante a LV, reduz a produção de IL-10 em células Treg e monócitos. Dessa forma, o uso de vitamina A durante a LV pode promover a recuperação de pacientes em tratamento para a doença
Polimorfismos nos genes ERBB2 e PARK2/PACRG e sua associação com a hanseníase em populações do Rio Grande do Norte e Pará
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2013-12-20) Araújo, Sérgio Ricardo Fernandes de; Jerônimo, Selma Maria Bezerra; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785584A3&dataRevisao=null; ; http://lattes.cnpq.br/6893412829959508; Uchoa, Adriana Ferreira; ; http://lattes.cnpq.br/6644671747055211; Lima, João Paulo Matos Santos; ; http://lattes.cnpq.br/3289758851760692; Carvalho, Lucas Pedreira de; ; http://lattes.cnpq.br/7308383096084856; Passos, Sara Timóteo; ; http://lattes.cnpq.br/1834035455867904
O tropismo do M. leprae pela pele e nervos periféricos, confere à hanseníase características peculiares, tais como perda de sensibilidade e deformidades teciduais. Hipotetizamos que a susceptibilidade do hospedeiro é gerida por um complexo conjunto de fatores diferentes, como aumento da expressão dos genes ERBB2, PARK2 e PACRG e/ou o ganho de atividade dos seus produtos gênicos, em virtude de polimorfismos nesses genes. Outro fator que hipotetizamos estar contribuindo com a susceptibilidade à hanseníase, juntamente com os fatores genéticos, é a existência de elementos de risco entre pessoas susceptíveis, tais como, co-morbidades e exposição prolongada ao patógeno. Também hipotetizamos que a distribuição desigual da doença em algumas áreas populacionais, com formação de aglomerados, seja devido, a elevada densidade populacional de pessoas susceptíveis em áreas de risco por tempo prolongado. Portanto, para comprovar essas hipóteses tem-se os seguintes objetivos: 1) Testar o envolvimento de polimorfismos nos genes ERBB2, PARK2 e PACRG com a hanseníase em duas áreas endêmicas, mas com populações distintas; 2) Testar a relação de fatores de risco exposicionais e co-morbidades, dentre outros, com o aumento de susceptibilidade à hanseníase na população do Rio Grande do Norte e 3) Avaliar se fatores como densidade demográfica e padrão socioeconômico e sanitário estão contribuindo com a desigual distribuição da doença em área endêmica para a hanseníase no estado do Rio Grande do Norte. Este estudo foi desenvolvido em 3 etapas: Foram genotipados marcadores no gene ERBB2 na população de Belém/PA, usando uma abordagem familiar. Num segundo momento foram genotipados marcadores nos genes ERBB2, PARK2 e PACRG na população do Rio Grande do Norte, usando uma abordagem caso-controle. Num terceiro momento, foi avaliada a distribuição espacial da hanseníase em Nova Cruz/RN. Foram feitas análises in silico, que apontaram para uma mutação deletéria no gene ERBB2 (rs1058808) e outra no gene PARK2 (rs1801334). Através de análise de modelagem molecular também foi encontrada uma mutação potencialmente capaz de alterar a função da proteína ErbB2 (rs1801200). A genotipagem da população de Belém/PA mostrou como fatores de risco dentre as famílias analisadas os polimorfismos rs2517956 e rs1058808 no gene ERBB2. Na genotipagem da população do Rio Grande do Norte, encontramos como fatores de risco, os polimorfismos rs6915128 e rs1801334 para a hanseníase per se e suas formas clínicas e rs1333955 para o ENH. Encontramos dois fatores de risco que justificaram a distribuição desigual dos casos de hanseníase na cidade de Nova Cruz/RN, a elevada densidade demográfica e o maior tempo de moradia de pessoas susceptíveis em áreas de risco. Os genes PARK2, PACRG e ERBB2 participam da patogênese da hanseníase e, portanto são sérios candidatos a alvos para agentes terapêuticos. Nesse estudo foi encontrado um SNP que também já havia sido associado ao mal de Parkinson, e portanto, pode haver um compartilhamento funcional da parquina entre a hanseníase e o Parkinsonismo. Nesse estudo também foi encontrado pela primeira vez associação entre variantes genéticas de ERBB2 e a hanseníase
Papel da proteína de reparo XPC na regulação das proteínas de reparo APE1, OGG1 e PARP-1 em células humanas e de camundongos
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-02-26) Melo, Julliane Tamara Araújo de; Lima, Lucymara Fassarela Agnez; ; http://lattes.cnpq.br/1083882171718362; ; http://lattes.cnpq.br/3504274193684794; Menck, Carlos Frederico Martins; ; http://lattes.cnpq.br/8043136069525312; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4799567J8&dataRevisao=null; Souza-pinto, Nadja Cristhina de; ; http://lattes.cnpq.br/7088639503480810
A maior parte do nosso conhecimento sobre a via de Reparo de Excisão Nucleotídeos (NER) vem de estudos usando a luz ultravioleta (UV) como fonte de danos no DNA. Contudo, embora os danos no DNA causados pela luz UV sejam relacionados à ocorrência de mutagênese, morte celular e tumorigênese, eles não justificam fenótipos como neurodegeneração e tumorigênese observados em pacientes com síndromes como Xeroderma Pigmentosum (XP) e Síndrome de Cockayne (CS), as quais são associadas à deficiência na via NER. Adicionalmente, evidências mais recentes indicam o envolvimento da via NER no reparo de 8-oxodG, um substrato típico da via de Reparo por Excisão de Bases (BER). Uma vez que a deficiência na via BER resulta em instabilidade genômica, doenças neurodegenerativas e câncer, foi investigado neste trabalho o impacto da deficiência em XPC nas funções da via BER em células humanas. Foram realizadas análises da expressão e da localização celular de APE1, OGG1 e PARP-1, principais enzimas da via BER, em fibroblastos humanos deficientes na via NER. Os resultados demonstraram que os níveis endógenos de APE1, PARP-1 e OGG1 são reduzidos nos fibroblastos deficientes em XPC, os quais foram mais resistentes a diferentes tipos de agentes oxidantes e apresentaram níveis elevados de 8-oxodG quando comparados aos demais fibroblastos deficientes na via NER. Adicionalmente, alterações sutis na localização nuclear e mitocondrial de APE1 foram observadas nos fibroblastos deficientes em XPC. Para confirmar o impacto da deficiência de XPC na regulação da expressão e atividade de APE1 e OGG1, foi construída uma linhagem complementada com XPC. Embora a complementação tenha sido parcial, foi possível observar que os fibroblastos parcialmente complementados com XPC apresentaram níveis maiores de expressão de OGG1 quando comparados aos fibroblastos deficientes em XPC. Os extratos dos fibroblastos parcialmente complementados com XPC também apresentaram uma elevada atividade enzimática de OGG1. Contudo, não foram observadas mudanças na expressão e atividade de APE1 nos fibroblastos parcialmente complementados com XPC. Adicionalmente, foi possível verificar a presença da forma completa de APE1 (37 kDa) e de OGG1-α na mitocôndria dos fibroblastos deficientes em XPC e parcialmente complementados com XPC. Por outro lado, observou-se que a expressão de APE1 e PARP-1 não é alterada no cérebro e fígado de camundongos knockouts para XPC. Contudo, a deficiência em XPC resultou em mudanças na localização celular de APE1 no hipocampo e hipotálamo. Ainda, foi observada a ocorrência de uma interação física entre as proteínas XPC e APE1 em células humanas. Em conclusão, os dados sugerem que a proteína XPC possui um papel na regulação da expressão e da atividade de OGG1 em células humanas e está envolvida na regulação da localização celular de APE1 principalmente em camundongos. Adicionalmente, as respostas celulares dos fibroblastos deficientes na via NER ao estresse oxidativo podem não estar associadas à deficiência na via NER per se, mas podem incluir novas funções das enzimas da via NER na regulação da expressão e localização celular das proteínas da via BER
Efeito de glucanas do fungo Caripia montagnei em modelo de inflamação intestinal induzida por tnbs em ratos Wistar e em células de carcinoma de cólon humano HT-29
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-04-08) Santos, Marilia da Silva Nascimento; Leite, Edda Lisboa; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783254U6&dataRevisao=null; ; Oliveira, Adeliana Silva de; ; http://lattes.cnpq.br/3073846047255501; Cruz, Ana Katarina Menezes da; ; http://lattes.cnpq.br/9810605697247961
Compostos derivados de fungos tem sido alvo de muitos estudos a fim de desenvolver o conhecimento acerca de seu potencial bioativo. Polissacarídeos de Caripia montagnei já foram descritos por possuírem propriedades anti-inflamatória e antioxidante. Neste estudo, os polissacarídeos extraídos do fungo Caripia montagnei foram caracterizados quimicamente e seus efeitos sobre as lesões intestinais foram avaliados em diferentes intervalos de tratamento no modelo de colite induzida por ácido 2,4,6 - trinitrobenzenossulfónico (TNBS), verificou-se ainda sua ação sobre células do carcinoma de cólon humano, HT-29. Na análise realizada no extrato obtido de C. montagnei foi verificado que este é formado principalmente, por carboidratos (96%) apresentando um baixo teor de compostos fenólicos (1,5%) e baixa contaminação protéica (2,5%). As análises por espectroscopia de infra vermelho (FT-IR) e ressonância magnética nuclear (RMN) mostraram que os polissacarídeos desta espécie de fungo são α e β -glucanas. O dano colônico foi avaliado por análises macroscópicas, histológicas, bioquímicas e imunológicas. Os resultados mostraram a redução das lesões no cólon em todos os grupos tratados com as glucanas (GCM). GCM reduziram significativamente os níveis de IL-6 (50 e 75 mg/Kg, p < 0,05), uma importante citocina inflamatória. As análises bioquímicas mostraram que essas glucanas atuaram na redução dos níveis de fosfatase alcalina (75 mg/Kg, p < 0,01), óxido nítrico (p < 0,001) e mieloperoxidase (p < 0,001). Estes resultados foram confirmados pela redução da infiltração celular observado microscopicamente. O aumento da atividade da catalase, sugere um efeito protetor de GCM no tecido do cólon, o que confirma o seu potencial anti-inflamatório. GCM mostraram atividade citostática sobre as células HT-29, causando acúmulo de células na fase G1 e impedindo, assim, a progressão do ciclo celular. As glucanas deste estudo também mostraram habilidade em modular a adesão de células HT-29 ao Matrigel® e reduzir o estresse oxidativo nessas células. A atividade antiproliferativa contra células HT-29 exibida por GCM pode ser atribuída à sua ação citostática ou indução da apoptose por essas glucanas
Clonagem e expressão do gene que codifica o inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina WILLD. - caracterização e avaliação de seu potencial farmacológico
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-04-29) Amorim, Ticiana Maria Lúcio de; Santos, Elizeu Antunes dos; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782221T9&dataRevisao=null; ; http://lattes.cnpq.br/6216030147805627; Uchoa, Adriana Ferreira; ; http://lattes.cnpq.br/6644671747055211; Lima, João Paulo Matos Santos; ; http://lattes.cnpq.br/3289758851760692; Sá, Maria de Fátima Grossi de; ; http://lattes.cnpq.br/3058512809761818; Souto, Janeusa Trindade de; ; http://lattes.cnpq.br/6501426772186111; Dore, Celina Maria Pinto Guerra; ; http://lattes.cnpq.br/2279068301048550
Proteinases são enzimas amplamente distribuídas em diferentes organismos e que desempenham as mais diversas funções, desde a manutenção da homeostase até o agravamento de algumas doenças como câncer, doenças autoimunes e infecções. As proteínas responsáveis pelo controle e atuação destas enzimas são os inibidores, que são classificados de acordo com suas proteases alvo e são encontrados desde organismos mais simples, como bactérias, aos mais complexos, como plantas de grande porte e mamíferos. Inibidores de proteinases de plantas agem reduzindo ou inativando a atividade de enzimas alvo, dessa forma, estas proteínas vêm sendo estudadas como possíveis ferramentas no tratamento de doenças relacionadas às atividades proteásicas. Neste contexto, um inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina, denominado EvCI, foi previamente purificado e foi observado que esta proteína desempenha atividades anticoagulante in vitro a anti-inflamatória em modelo in vivo. Buscando reduzir o impacto ecológico causado pela purificação de EvCI em grandes quantidades e facilitar o processo de obtenção desta proteína, o inibidor de quimotripsina recombinante de Erythrina velutina foi produzido após clonagem e expressão em células de Escherichia coli. As bactérias foram crescidas em meio LB e após indução da expressão este material foi submetido a procedimentos de lise celular e o produto foi aplicado em uma coluna de afinidade de Níquel. As proteínas ligadas à coluna foram digeridas por trombina, aplicadas em uma coluna de afinidade de Quimotripsina-Sepharose obtendo-se o inibidor purificado, denominado recEvCI. Após eletroforese, o inibidor recombinante apresentou uma massa molecular de, aproximadamente, 17 kDA e reduziu a atividade de quimotripsina e elastase in vitro. O inibidor recombinante foi sequenciado e foi detectada a presença de aminoácidos iguais a outros inibidores depositados em banco de dados, com algumas modificações. recEvCI demonstrou alta estabilidade quando submetido a variações de pH e sob condições redutoras, mantendo sua atividade inibitória em torno de 80%. Esta proteína aumentou o tempo de coagulação sanguínea in vitro por atuação sobre a via intrínseca e não demostrou citotoxicidade contra as linhagens de fibroblasto de camundongo 3T3 e de macrófagos RAW 264.7. recEvCI apresentou atividade microbicida relacionada à liberação de óxido nítrico e consequente ativação de macrófagos, além de possuir efeito pró-inflamatório avaliado pelo aumento da liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que recEvCI pode ser utilizado biotecnologicamente como uma nova ferramenta no controle de doenças relacionadas à coagulação assim como pode vir a ser um agente ativador do sistema imune em indivíduos imunossuprimidos
Atividades biológicas de extratos salinos de sementes de plantas da caatinga contra Aedes Aegypti e investigação da participação de proteínas bioativas
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-06-09) Barbosa, Patricia Batista Barra Medeiros; Ximenes, Maria de Fátima Freire de Melo; Uchoa, Adriana Ferreira; ; http://lattes.cnpq.br/6644671747055211; ; http://lattes.cnpq.br/4231925509338101; ; http://lattes.cnpq.br/6945268593644384; Medeiros, Caroline Addison Carvalho Xavier de; ; http://lattes.cnpq.br/2982271986555450; Rocha, Hugo Alexandre De Oliveira; ; http://lattes.cnpq.br/4651814546820796; Dantas, Iron Macedo; ; http://lattes.cnpq.br/6446119209274157; Paiva, Patrícia Maria Guedes; ; http://lattes.cnpq.br/2885145995086459
A dengue é a mais importante arbovirose da atualidade, sendo transmitida pela picada do mosquito Aedes aegypti. A ausência de uma vacina profilática torna o controle da dengue pautado principalmente no controle do inseto vetor. Todavia os crescentes relatos de resistência e os danos ambientais causados pelos inseticidas químicos têm tornado urgente à busca por alternativas seguras. Foram preparados 21 extratos brutos (EB) de sementes de plantas da Caatinga. Como extrator foi utilizado o fosfato de sódio 50mM pH 8.0. Os extratos foram utilizados em bioensaios Aedes aegypti, ensaios de toxicidade e submetidos a uma caracterização parcial para identificar a presença de moléculas bioativas. As análises inseticidas foram realizadas por probit e as diferenças entre os grupos foram constatada por Student’s t-test e ANOVA. Todos os extratos apresentaram atividade larvicida para L1 e L4 e, com exceção do extrato de G. americana, levaram ao óbito 100% das larvas (48h). Os EB de M. urundeuva, P. viridiflora, E. velutina, A. cearenses e E. contortisiliquum apresentaram os melhores resultados larvicidas. Do mesmo modo, todos os EB foram repelentes para a postura das fêmeas grávidas. Os EB de D. grandiflora, E. contortisiliquum, A. cearenses, C. ferrea e C. retusa foram capazes de atrair as fêmeas para a posturas quando em baixas concentrações. Na concentração atrativa o EB de E. contortisiliquum foi capaz de levar a óbito 52% das larvas L1 em 48 h, enquanto que o EB de A. cearenses resultou na morte de 100% dessas larvas em 24h. Os extratos de A. cearenses, P. viridiflora, E. velutina, M. urundeuva e S. brasiliensis tiveram atividade pupicida, enquanto que os extratos de P. viridiflora, E. velutina, E. contortisiliquum, A. cearenses, A. colubrina, D. grandiflora, B. cheilantha, S. spectabilis, C. pyramidalis, M. regnelli e G. americana tiveram ação adulticidas. Todos os extratos apresentaram toxicidade para C. dubia e os EB de E. velutina e E. contortisiliquum não interferiram na viabilidade dos fibroblastos. Considerando todos os ensaios biológicos os extratos de A. cearenses, P. viridiflora, E. contortisiliquum, S. brasiliensis, E. velutina e M. urundeuva foram considerados os mais promissores. Em todos os extratos foram identificadas pelo menos duas proteínas com potencial. O EB de E. contortisiliquum foi selecionado para ser fracionando, já que não apresentou atividade pupicida, indicando que seu mecanismo de ação larvicida e adulticida resultou da ingestão de compostos ativos pelos insetos. Além disso, esse extrato apresentou o maior teor de proteína (22 mg/mL) e a maior atividade inibitória para as tripsinas das larvas de A. aegypti. Como observado para o EB, as frações proteicas de E. contortisiliquum, também apresentaram atividade larvicida, mas não foram pupicida, com destaque para F2 que apresentou maio atividade larvicida e menor toxicidade ambiental do que o EB de origem. A redução na atividade proteolítica das larvas alimentadas com o EB e as frações de E. contortisiliquum sugeriu que inibidores de tripsina seriam os responsável pela atividade larvicida. Embora o aumento na purificação de um inibidor de tripsina de E. contortisiliquum (ITEc) tenha resultado na perda da atividade larvicida, foi constatado que sua ausência reduziu a eficácia das frações, indicando que o ITEc contribui, mas não é suficiente para a atividade larvicida do EB de E. contortisiliquum. Também não foi verificada atividade larvicida e adulticida na fração rica em vicilina, e nem evidências da contribuição dessa molécula para a atividade inseticida desse extrato. Os resultados mostram o potencial dos extratos salinos de sementes de planta da Caatinga e, em especial do EB e da F2 de E. contortisiliquum, no controle da população de A. aegypti e indicam que a eficácia desses extratos deve resultar da ação conjunta de diferentes compostos ativos, inclusive de natureza proteica, que atuando em diferentes mecanismos são capazes de comprometer a viabilidade dos insetos e retardar o surgimento de resistências.
Os efeitos das queimadas na Amazônia em nível celular e molecular
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-08-28) Alves, Nilmara de Oliveira; Medeiros, Sílvia Regina Batistuzzo de; Vasconcellos, Pérola de Castro; ; http://lattes.cnpq.br/8971623116160175; ; http://lattes.cnpq.br/5882662534904226; ; http://lattes.cnpq.br/7763292684638407; Santos, Elizeu Antunes dos; ; http://lattes.cnpq.br/6762251930590306; Umbuzeiro, Gisela de Aragão; ; http://lattes.cnpq.br/9246879554920774; Hoelzemann, Judith Johanna; ; http://lattes.cnpq.br/6590472437235971; Hacon, Sandra de Souza; ; http://lattes.cnpq.br/7653379361147439
A Amazônia representa mais da metade das florestas tropicais remanescentes no planeta e compreende a maior biodiversidade do mundo, correspondendo aproximadamente a 60% do território brasileiro. Entretanto, o desmatamento e as queimadas que ocorrem na região têm causado sérios prejuízos para a população que está sendo exposta. Diante desta situação, o objetivo do presente estudo foi avaliar os compostos químicos assim como os efeitos celulares e moleculares após a exposição ao material orgânico extraído do material particulado menor que 10 µm (MP10) na região Amazônica. Com relação à composição química, a análise dos n-alcanos mostrou um predomínio da influência antrópica no período de queimadas na região. Além disso, observou-se um predomínio dos monossacarídeos marcadores da queima de biomassa. Também foram identificados os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA) e os seus derivados nas amostras coletadas na Amazônia. Os dados das concentrações dos HPA permitiram calcular o BaP-equivalente e observou-se que o dibenzo(a)antraceno contribui com 83% para o potencial risco carcinogênico. Já para o potencial risco mutagênico, o benzo(a)pireno é o HPA que apresenta uma maior contribuição nesta análise. Pode-se destacar que o reteno foi o HPA mais abundante. Este composto foi considerado genotóxico, além de causar morte por necrose nas células estudadas. Nas análises biológicas, os dados mostraram que o MP10 orgânico é capaz de causar alterações genéticas tanto em células vegetais como em células do pulmão humano. Estes danos levaram a uma parada na fase G1 no ciclo das células expostas, aumentando a expressão das proteínas p53 e p21. Além disso, o MP causou morte celular por apoptose, aumentando a marcação da histona -H2AX. Com resultados bem evidentes, o MP inalável também causou morte por necrose nas células do pulmão humano. Diante destes resultados, é importante enfatizar a importância da redução e um melhor controle da queima de biomassa na região Amazônica. Afinal, como descrito recentemente pela Organização Mundial de Saúde, pode-se afirmar que a redução da poluição do ar poderá salvar milhões de vidas.
Determinantes genéticos e ambientais das doenças hipertensivas da gravidez
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-10-06) Ferreira, Leonardo Capistrano; Jerônimo, Selma Maria Bezerra; ; http://lattes.cnpq.br/7120263570947836; ; Chies, José Artur Bogo; ; http://lattes.cnpq.br/9325091115265469; Scortecci, Katia Castanho; ; http://lattes.cnpq.br/4808910380593455; Andrade, Lara de Melo Barbosa; ; http://lattes.cnpq.br/0327817672623352; Carvalho, Maria Goretti Freire de; ; http://lattes.cnpq.br/8934375314306198
O desenvolvimento de doenças complexas, como a pré-eclâmpsia, é determinado por fatores ambientais e genéticos, além da possível interação entre esses fatores. As doenças hipertensivas da gravidez (DHGs) apresentam um amplo espectro clínico, que pode variar desde pré-eclâmpsia leve (hipertensão e proteinuria) até formas mais graves, como a eclâmpsia (convulsões) e síndrome HELLP (hemólise, elevação das enzimas hepáticas e plaquetopenia). O espectro clínico parece estar ligado a diferentes mecanismos patológicos. Este trabalho tem como objetivo identificar fatores (genéticos e ambientais) envolvidos no desenvolvimento das DHGs. Usando uma abordagem caso-controle, selecionamos um total de 1498 mulheres para os estudos epidemiológico e genético, abrangendo 755 grávidas normotensas (controle); 518 pré-eclâmpsia; 84 eclampsia e 141 HELLP. As mulheres foram genotipados para 18 marcadores distribuídos em cinco genes candidatos (FLT1, ACVR2A, ERAP1, ERAP2 e LNPEP). Como resultado das análises dos fatores ambientais, encontramos idade materna, paridade e o índice de massa corporal pré-gestacional como importantes fatores de risco associados às DHGs. As análises genéticas mostraram que os genes estão associados de maneira fenótipo-específica: ACVR2A com pré-eclâmpsia precoce (rs1424954, p=0,002); FLT1 com síndrome HELLP (rs9513095, p=0,003), e ERAP1 com eclâmpsia (rs30187, p=0,03). Nossos resultados sugerem que diferentes mecanismos genéticos, juntamente com fatores ambientais específicos, contribuem na determinação do espectro clínico das DHGs. Além disso, o refinamento fenotípico parece ser um passo essencial na busca por genes de doenças complexas
Perfil imunológico associado à susceptibilidade, resistência e cura na infecção por Leishmania ( Leishmania ) infantum
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-10-10) Galvão, Joanna Gardel Valverde; Jerônimo, Selma Maria Bezerra; ; http://lattes.cnpq.br/7120263570947836; ; http://lattes.cnpq.br/0166507910755600; Nascimento, Eliana Lucia Tomaz do; ; http://lattes.cnpq.br/3995803872021711; Sales, Valéria Soraya de Farias; ; http://lattes.cnpq.br/8525532896559374; Cruz, Alda Maria da; ; http://lattes.cnpq.br/2028714603825846; Bacellar, Maria Olivia Amado Ramos; ; http://lattes.cnpq.br/0199786420638506
A leishmaniose visceral (LV) é endêmica no Brasil, sendo a região nordeste a que apresenta maior incidência, apesar de nos últimos 30 anos ter aumentado o número de casos em outras regiões do país. A LV na América Latina é resultante da infecção por Leishmania infantum. No entanto, nem todas as pessoas infectadas desenvolvem doença; na verdade, a maioria apresenta resolução espontânea da infecção sem sintomas característicos de LV. Tradicionalmente a avaliação do perfil imunológico tem sido realizada utilizando a reestimulação de células mononucleares de sangue periférico em cultura. Esses estudos revelaram que pacientes com LV apresentavam inibição tanto da proliferação linfocitária quanto da resposta pró-inflamatória anti-Leishmania. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a resposta imune na LV sintomática, na cura pós-tratamento e assintomática. Para isso, analisamos características imunofenotípicas relacionadas à ativação, Treg e memória de linfócitos, por citometria de fluxo, assim como a produção de citocinas ex vivo ou em cultura de sangue total. Para os voluntários com LV, foi realizado um estudo longitudinal com reavaliação imunológicas aos 4 e 14 meses após a cura clínica. O grupo controle incluiu pessoas provenientes de região endêmica, sendo dividido em 2 grupos: Controle Positivo, formado por pessoas que apresentaram sorologia e∕ou PCR anti-Leishmania positivos e Controle Negativo formado por pessoas com sorologia e PCR anti-Leishmania negativos. Durante a LV os linfócitos CD4 apresentam um maior perfil de ativação e memória, além de serem maiores produtores de citocinas em cultura, quando comparado aos linfócitos CD8, contudo essa ativação não é Leishmania específica, visto que ocorreu tanto em ausência (CD4+CD25+:10,60%, CD8+CD25+:5,36%; p<0,0001) quanto em presença de antígenos solúveis de Leishmania (SLA), (CD4+CD25+: 10,20%, CD8+CD25+:3,28%; p=0,0003). Há ativação de linfócitos durante a LV (CD4+CD69+: 4,9%), quando comparado aos grupos Controle Positivo (CD4+CD69+: 1,96% p=0,0045) e Negativo (CD4+CD69+: 1,35% p=0,0062), mas esta ativação também não é Leishmania específica. O perfil de ativação linfocitária permanece elevado mesmo 14 meses após o fim do tratamento, porém após a cura a ativação é Leishmania específica (CD4+CD25+ em ausência de SLA: 8,44%, presença de SLA: 10,70% p=0,0279). Linfócitos CD8+CD25+ foram capazes de produzir IFN-γ em presença de antígeno tanto em Controles Positivos (ausência de SLA: 5,17%, presença de SLA: 9,52% p=0,0391) como em LV curados (Curado 4 meses: ausência de SLA: 3,90%, presença SLA: 10,70% p=0,0098). Células presentes no sangue total de pessoas com LV ativa são capazes de produzir IFN-γ em resposta ao SLA (IFN-γ em ausência de SLA: 3,61 pg∕mL e em presença de SLA: 44,26 pg∕mL; p=0,0020), assim como LV recuperado (IFN-γ em ausência de SLA: 2,29 pg∕mL e presença de SLA: 139,80 pg∕mL; p=0,0005). Contudo o elevado nível de IL-10 parece estar inibindo a atividade pro-inflamatória de IFN-γ e TNF-α em pacientes na fase sintomática. Contrariamente as demais citocinas pro-inflamatórias, a cultura de sangue total do grupo LV ativa não apresentou produção de IL-2 Leishmania específica (em ausência de SLA: 2,42 pg∕mL e em presença de SLA: 2,56 pg∕mL). Com base nesses dados nós concluímos que a restauração da ativação de linfócitos e a diminuição da produção de IL-10, Leishmania específica, estão relacionados à um perfil imunológico protetor.
Xilanas de sabugo de milho como agente antioxidante, citotóxico, anticoagulante e imunomodulador
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2014-10-20) Silveira, Raniere Fagundes de Melo; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; http://lattes.cnpq.br/4651814546820796; ; http://lattes.cnpq.br/4657447123848421; Barbosa, Carlos Augusto Galvão; ; http://lattes.cnpq.br/5004397230198722; Lanza, Daniel Carlos Ferreira; ; http://lattes.cnpq.br/6851351991421755; Albuquerque, Ivan Rui Lopes de; ; http://lattes.cnpq.br/2266021166245706; Bezerra, Ranilson de Souza; ; http://lattes.cnpq.br/2205151409139871
A prospecção de polissacarídeos farmacologicamente ativos provenientes de subprodutos agrícolas ainda é uma prática pouco explorada no meio científico. Dessa forma, este trabalho pretendeu ampliar o conhecimento relacionado às atividades farmacológicas de polissacarídeos extraídos do sabugo de milho. A partir da farinha de sabugo de milho, um extrato polissacarídico foi obtido ao combinar ondas de ultrassom em meio alcalino, e ao final do processo o produto foi denominado de EPSM. Esse extrato foi caracterizado fisico-quimicamente e, através de ensaios in vitro, foi avaliado como agente antioxidante, citotóxico, anticoagulante e imunomodulator. Os resultados indicaram que o EPSM apresentou significativa ação quelante de metal, além de não apresentar efeito tóxico para células de linhagem normal, mas evidenciar efeito citotóxico contra as células tumorais HeLa, quando causou a morte celular por apoptose. Em adição, outros efeitos farmacológicos foram observados, o EPSM diminuiu a produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos ativados, e estendeu o tempo de coagulação sanguínea quando avaliado pelo ensaio de APTT. Posteriormente, frações metanólicas, etanólicas e cetônicas foram obtidas a partir do fracionamento dos polissacarídeos presentes no EPSM. Foram obtidas cinco frações metanólicas, seis frações etanólicas e duas cetônicas; e todas avaliadas quanto às atividades antioxidante, citotóxica, anticoagulante e imunomodulatória. Dentre as frações, E1.4 exibiu significativo efeito qualante de metal, ação tóxica em células HeLa por indução da apoptose, reduziu a produção de NO por macrófagos ativados, e ampliou o tempo de coagulação sanguínea. Esses resultados sinalizaram que os polissacarídeos farmacologicamente ativos do EPSM estariam presentes na fração E1.4. A partir do fracionamento da E1.4 foram obtidas seis subfrações polissacarídicas com tamanhos distintos: -3; 3-10; 10-30; 30-50; 50-100 e +100 KDa. Cerca de 80% dos polissacarídeos de E1.4 apresentou tamanho inferior a 10 KDa, e todas as subfrações apresentaram mais de 61% de açúcar em suas composições químicas. Essas subfrações exibiram diferentes composições monossacarídicas, mas todas apresentaram xilose. As subfrações evidenciaram distintos efeitos nos ensaios farmacológicos in vitro. As subfrações de menor tamanho (< 30 KDa) demonstraram maior atividade quelante de metal e maior atividade citotóxica contra células tumorais. As intermediárias (entre 30 e 100 KDa) diminuíram mais a produção de NO por macrófagos ativados, mas a de maior tamanho (+100 KDa) modulou um maior número de citocinas inflamatórias, e demonstrou um maior efeito anticoagulante. Portanto, a análise conjunta dos resultados indica que os polissacarídeos farmacologicamente ativos do ESPM são heteroxilanas e foram concentrados nas subfrações de E1.4, além disso, os efeitos farmacológicos dessas heteroxilanas dependem do seu tamanho molecular.
Biofísica molecular: do transporte eletrônico em sistemas biológicos à descrição quântica da estabilidade do colágeno humano
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-02-26) Oliveira, Jonas Ivan Nobre; Fulco, Umberto Laino; Albuquerque, Eudenilson Lins de; ; http://lattes.cnpq.br/3594651355252245; ; http://lattes.cnpq.br/9579151361576173; ; http://lattes.cnpq.br/2461374517882321; Caetano, Ewerton Wagner Santos; ; http://lattes.cnpq.br/6647492142392254; Corso, Gilberto; ; http://lattes.cnpq.br/0274040885278760; Vieira, Vinícius Manzoni; ; http://lattes.cnpq.br/7335017320399198
Esta tese trata de duas pesquisas no campo da modelagem molecular, com diferentes naturezas conceituais, porém, baseadas em semelhantes princípios teóricos da física quântica e da química computacional. No primeiro estudo, com o intuito de esclarecer os aspectos estruturais e energéticos da estabilidade da tripla-hélice do colágeno humano, foram quantificadas as energias de interação entre os resíduos de aminoácidos que compõem o peptídeo homotrimérico T3-785, por intermédio de cálculos de Mecânica Quântica na luz da Teoria do Funcional da Densidade (DFT) e do método de Fracionamento Molecular com Capuzes Conjugados (MFCC). Assim, as forças de atração e repulsão de cada um dos 90 resíduos que compõem o sistema foram assinadas e as regiões com alta/baixa estabilidade identificadas e comparativamente analisadas. Os dados obtidos aprofundaram as discussões sobre a estabilidade conformacional do colágeno. Na segunda pesquisa, propriedades de transporte eletrônico de dois modelos biológicos foram exploradas. Nesse sentido, 27 miRNAs associados ao autismo e peptídeos formados pelas sequências (Thr-Ala)n e (Ala-Lys)n tiveram suas curvas de corrente-voltagem (I x V) calculadas. Os cálculos computacionais foram parcialmente executados pelo método quântico DFT e, fundamentalmente, dentro de um modelo tight-binding, em conjunto com a técnica de matriz de transferência. No caso dos miRNAs, os resultados sugerem que um tipo de biosensor pode ser desenvolvido para distinguir diferentes tipos de autismo. Já os peptídeos analisados, demonstraram-se como bons candidatos para a construção de um diodo molecular. Ambos os resultados podem fundamentar e estimular pesquisas experimentais com essas biomoléculas no campo da nanoeletrônica.
Análise fitoquímica e avaliação das atividades anti-inflamatória, antipeçonhenta e citotóxica de extratos aquosos de Aspidosperma pyrifolium e Ipomoea asarifolia
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-04-17) Lima, Maira Conceição Jerônimo de Souza; Pedrosa, Matheus de Freitas Fernandes; ; http://lattes.cnpq.br/2929963416385218; ; http://lattes.cnpq.br/2695792864798488; Blanco, Benito Soto; ; http://lattes.cnpq.br/5009042939501223; Guerra, Gerlane Coelho Bernardo; ; http://lattes.cnpq.br/5677318431530876; Scortecci, Kátia Castanho; ; http://lattes.cnpq.br/4808910380593455; Melo, Paulo de Assis; ; http://lattes.cnpq.br/6954875796234519
Envenenamentos causados por animais peçonhentos são um grave problema de saúde pública, enquadrando-se nesse cenário, principalmente, os escorpiões e as serpentes. Tityus serrulatus é considerado o escorpião mais venenoso da America do Sul, devido à alta toxicidade do seu veneno, responsável por causar acidentes graves, principalmente em crianças. A espécie Bothrops jararaca é uma serpente que possui no seu veneno uma mistura complexa de enzimas, peptídeos e outras moléculas. As toxinas do veneno de B. jararaca induzem respostas inflamatórias locais e sistêmicas. O tratamento de escolha para os casos graves de envenenamento é a administração intravenosa do antiveneno especifico. Porém, nem sempre esse tratamento está acessível para os moradores de zonas rurais, que fazem uso de extratos de plantas medicinais. Nesse contexto, extratos aquosos, frações e compostos isolados de Aspidosperma pyrifolium (pereiro) e Ipomoea asarifolia (salsa), usadas na medicina popular, foram objeto de estudo deste trabalho para avaliar a atividade anti-inflamatória nos modelos de peritonite induzida por carragenina e peritonite induzida pelo veneno de T. serrulatus (VTs), e nos no modelo de edema local e infiltrado inflamatório induzido pelo veneno de B. jararaca, administrados pela via intravenosa. Os resultados dos ensaios de citotoxidade utilizando o ensaio MTT demonstraram que os extratos aquosos das espécies vegetais apresentaram baixa toxicidade para células provenientes de fibroblasto de embrião de camundongo (3T3). A análise química dos extratos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência revelou a presença do flavonóide rutina, na A. pyrifolium, e rutina, ácido clorogênico e ácido caféico, na I. asarifolia. Quanto à avaliação farmacológica, os resultados demonstraram que o pré-tratamento com extratos aquosos e frações reduziram a migração de leucócitos totais para a cavidade abdominal no modelo de peritonite causada por carragenina e no modelo de peritonite induzida por veneno de T. serrulatus. Ainda, esses grupos apresentaram atividade antiedematogênica, no modelo de edema local causado pelo veneno de B. jararaca, e reduziram o infiltrado inflamatório para o músculo. Os soros (antiaracnídico e anti-botrópico) específicos para cada veneno atuaram inibindo a ação inflamatória dos venenos e foram utilizados como controles. Os compostos identificados nos extratos, rutina, ácido clorogênico e ácido caféico, também foram testados e, assim como os extratos das plantas, exibiram efeitos anti-inflamatórios significativos, nas doses testadas. Dessa forma, esses resultados dão evidências, às plantas estudadas, de potencial atividade anti-inflamatória. Esse é o primeiro estudo que avaliou os possíveis efeitos terapêuticos de A. pyrifolium e I. asarifolia, mostrando o potencial terapêutico que essas espécies possuem.
Variabilidade genética de Leishmania spp. circulantes entre seres humanos e cães e infecção de flebotomíneos em áreas endêmicas para as leishmanioses no Rio Grande do Norte
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-04-23) Silva, Virgínia Penéllope Macedo e; Ximenes, Maria de Fátima Freire de Melo; Salha, Daniella Regina Arantes Martins; ; ; http://lattes.cnpq.br/4231925509338101; ; http://lattes.cnpq.br/9809854013271379; Medeiros, Iara Marques de; ; http://lattes.cnpq.br/0702456215392682; Carvalho, Lucas Pedreira de; ; http://lattes.cnpq.br/7308383096084856; Moreira, Paula Viviane de Souza Queiroz;
Nas Américas, a infecção por Leishmania tem como principal agente etiológico Leishmania infantum. Nos últimos 30 anos o padrão de distribuição das leishmanioses tem mudado substancialmente e a doença tem apresentado um perfil emergente na periferia dos grandes centros urbanos. A infecção por Leishmania pode evoluir com um amplo espectro clínico desde o acometimento da pele, mucosas e vísceras. Dos indivíduos infectados por L. infantum apenas 10% desenvolvem a doença, sabe-se que 90% da infecção humana é assintomática e diversos fatores estão envolvidos no curso da infecção. Os principais fatores envolvidos no desenvolvimento da doença são a resposta imune do hospedeiro, a espécie e o conteúdo gênico do parasita. O sequenciamento dos isolados de Leishmania poderia aumentar a compreensão acerca da sintomatologia dos indivíduos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a diversidade genética de cepas de Leishmania circulantes entre humanos, sintomáticos e assintomáticos e cães de áreas endêmicas do Rio Grande do Norte. A variabilidade genética de um grupo de amostras de humanos e caninos com a doença visceral, doença cutânea e infecção assintomática foi avaliado com os marcadores moleculares hsp70 e ITS1. O genoma completo de 20 isolados de Leishmania oriundos de humanos, sintomáticos e assintomáticos, e cães foram sequenciados para avaliar a diversidade dessas amostras. Os fragmentos amplificados de hsp70 e ITS1 das amostras e foram analisados e montadas utilizando o pacote Phred/Phrap. Os dendogramas foram construídos aplicando o método neighbor joining com 500 bootstraps, seguido das inferências sobre as relações entre as variantes de Leishmania. As sequências dos 20 isolados brasileiros foram mapeadas com o genoma de referência Leishmania infantum JPCM5, usando o programa Bowtie2, com identificação de 36 contigs. As informações dos SNPs válidos foram utilizadas na PCA. Os SNPs foram visualizados pelo Geneious 7.1 e IGV. As anotações do genoma foram então transferidas para seus respectivos cromossomos e visualizadas utilizando o Geneious. As sequências consenso de todos os cromossomos (com mínimo de 75% das reads com a mesma base) foram alinhadas usando Mauve. As árvores filogenéticas foram calculadas de acordo com cálculos de máxima verossimilhança e modelos JTT. Como resultados obtivemos que hsp70 e ITS1 não foram capazes de definir variabilidade genética entre os isolados de humanos e cães; nem para os isolados de cultura e de sangue periférico, oriundos de um mesmo paciente.O sequenciamento genômico dos 20 isolados brasileiros revelou uma forte relação entre as cepas de Leishmania circulantes em no Rio Grande do Norte. Os isolados da Grande Natal de humanos e caninos permaneceram agrupados em todas as análises, sugerindo que existe proximidade genotípica e geográfica entre os isolados. As amostras isoladas na década de 1990 apresentaram uma maior diversidade genotípica quando comparadas as amostras recentemente isoladas. De forma geral, não encontramos correlação entre as formas clínicas sintomáticas e assintomáticas e o conteúdo gênico dos isolados brasileiros de Leishmania.
Moléculas coestimulatórias na leishmaniose visceral
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-04-27) Rodrigues Neto, João Firmino; Jerônimo, Selma Maria Bezerra; ; http://lattes.cnpq.br/7120263570947836; ; http://lattes.cnpq.br/6168035663769198; Salha, Daniella Regina Arantes Martins; ; http://lattes.cnpq.br/3695151190501921; Lacerda, Hênio Godeiro; ; http://lattes.cnpq.br/5385381875845273; Carvalho, Lucas Pedreira de; ; http://lattes.cnpq.br/7308383096084856; Moreira, Paula Viviane de Souza Queiroz;
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença endêmica em muitos países, incluindo o Brasil. O protozoário Leishmania infantum é o agente etiológico da LV, sendo transmitido pela picada das fêmeas dos flebotomíneos, durante o repasto sanguíneo. A maioria dos indivíduos quando expostos ao parasita não desenvolvem a doença, pois apresentam um predomínio da resposta celular Th1. Aqueles que desenvolvem doença, apresentam sinais como febre, perda de peso, hepatoesplenomegalia e um comprometimento da resposta imune celular, específica a antígenos de Leishmania. Nós avaliamos se essa anergia, observada durante a doença ativa, poderia estar associada com alterações nas moléculas coestimulatórias de linfócitos T ou em seus ligantes em monócitos CD14+. Há aumento na porcentagem de CTLA-4 em linfócitos T CD4+ (p=0,001) e ICOS em linfócitos T CD4+ e CD8+ (p=0,002 para CD4+ e p=0,003 para CD8+) após estímulo por antígeno solúvel de Leishmania (SLA) na LV sintomática, e que há maior porcentagem dessas moléculas ex vivo, quando comparados indivíduos sintomáticos aos recuperados (p=0,04 para CTLA-4 em CD4+, e p=0,001 para ICOS em CD4+ e p=0,026 para CD8+). Além disso, encontramos uma maior expressão dos genes CTLA-4, OX-40 e ICOS, durante a LV ativa. As moléculas CD40, CD80, CD86, HLA-DR e ICOSL, não sofrem alteração durante a doença. Há produção de IFN-γ por células de sangue periférico, após estímulo por SLA, em indivíduos sintomáticos; no entanto, há diminuição na razão entre IFN-γ/IL-10, com aumento desta após a cura. A observação do comprometimento de algumas vias de moléculas coestimulatórias poderia diminuir a capacidade microbicida dos fagócitos, durante a leishmaniose visceral sintomática, podendo facilitar a sobrevivência e a proliferação do parasita.
Avaliação da atividade antimicrobiana das defensinas recombinantes de ervilha (drr230a) e café (cd1) produzidas em Pichia pastoris
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-06-30) Lacerda, Ariane Ferreira; Grossi, Maria Fátima; Scortecci, Kátia Castanho; ; http://lattes.cnpq.br/4808910380593455; ; http://lattes.cnpq.br/3058512809761818; ; http://lattes.cnpq.br/0816835876517153; Santos, Elizeu Antunes dos; ; http://lattes.cnpq.br/6762251930590306; Vasconcelos, Ilka Maria; ; http://lattes.cnpq.br/0103197383336584; Pedrini, Márcia Regina da Silva; ; http://lattes.cnpq.br/0099275569766870; Silva, Marília Santos; ; http://lattes.cnpq.br/6395128945646125
A ineficácia de pesticidas químicos no controle de fungos fitopatogênicos na agricultura e a frequente incidência de doenças humanas causadas por bactérias resistentes a antibióticos levam à busca por compostos antimicrobianos alternativos. Neste contexto, defensinas vegetais constituem uma promissora ferramenta no controle de agentes patogênicos tanto de plantas quanto de humanos. Defensinas de plantas são peptídeos catiônicos com aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos, ricas em cisteínas e cuja estrutura tridimensional é bastante conservada entre as diferentes espécies vegetais. Estas moléculas de ação antimicrobiana representam um importante componente inato da resposta de defesa vegetal contra patógenos e são expressas em diversos tecidos da planta, como folhas, tubérculos, flores, vagens e sementes. O presente trabalho teve por finalidade a avaliação da atividade antimicrobiana de duas defensinas vegetais contra diferentes espécies de fungos fitopatogênicos e bactérias patogênicas ao homem. A defensina Drr230a, cujo gene foi isolado de ervilha (Pisum sativum) e a defensina CD1, cujo gene foi identificado no transcriptoma de café (Coffea arabica) foram subclonadas em vetor de expressão de levedura e expressas em Pichia pastoris. O gene cd1 foi subclonado em duas formas recombinantes: CD1tC, contendo uma sequência codificante para seis histidinas (6xHis) na região C-terminal do peptídeo e CD1tN, contendo sequência codificante para 6xHis na região N-terminal. No caso da defensina Drr230a, a sequência codificante para 6xHis foi inserida apenas na região N-terminal da proteína. Ensaios de atividade antimicrobiana das proteínas recombinantes purificadas rDrr230a e rCD1 contra Phakopsora pachyrhizi, agente causal da ferrugem asiática da soja, foram realizados para analisar a inibição da germinação de esporos in vitro e a severidade da doença causada pelo fungo in planta. As duas defensinas recombinantes testadas foram capazes de inibir a germinação de uredosporos de P. pachyrhizi, não havendo diferença entre a ação antimicrobiana de CD1tC e CD1tN. Ademais, rDrr230a e rCD1 reduziram drasticamente a severidade da ferrugem asiática da soja, conforme demonstrado em ensaios in planta. Apesar de rCD1 não ter sido capaz de inibir a proliferação das bactérias patogênicas humanas Staplylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae, rCD1 mostrou-se capaz de inibir o crescimento do fungo fitopatogênico Fusarium tucumaniae, causador da síndrome da morte súbita da soja. Os resultados obtidos mostram que tais defensinas vegetais são candidatas úteis para serem utilizadas em programas de engenharia genética de plantas para controlar doenças fúngicas impactantes na agricultura.
Purificação e caracterização de uma nova lectina com atividade imunomoduladora da esponja Aplysina fulva
(2015-07-10) Santos, Paula Ivani Medeiros dos; Santos, Elizeu Antunes dos; ; http://lattes.cnpq.br/6762251930590306; ; http://lattes.cnpq.br/1631947914918841; Queiroz, Alexandre Flávio Silva de; ; http://lattes.cnpq.br/4447420857221826; Souto, Janeusa Trindade de; ; http://lattes.cnpq.br/6501426772186111; Souza, Djair dos Santos de Lima e; ; http://lattes.cnpq.br/4456114894660929; Amorim, Ticiana Maria Lúcio de; ; http://lattes.cnpq.br/6216030147805627
As esponjas marinhas se apresentam como uma rica fonte de novos compostos bioativos de grande interesse biotecnológico, vimos, neste trabalho, relatar a purificação e caracterização de uma lectina da espécie Aplysina fulva, denominada AFL com atividade imunomoduladora, bem como avaliar se a mesma possue efeito citotóxico sobre células em cultura (normais, tumorais e leishmanias). As proteínas totais foram extraídas da esponja com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, e fracionadas por precipitação com acetona. A fração obtida com 1 volume de acetona possuía maior atividade hemaglutinante e foi submetida a uma cromatografia em matriz de goma guar com tampão tetraborato de sódio 20 mM, pH 7,5. Em seguida foi aplicada em uma coluna de Superdex 75 (FPLC-AKTA) contendo tampão Tris- HCl 20 mM, pH 7,5. A pureza da lectina foi atestada em uma coluna HILIC (HPLC). A sequência de 15 resíduos de aminoácidos do N-terminal da lectina foi determinada por degradação de Edman e não apresentou similaridade com nenhuma outra proteína dos bancos de dados mais conhecidos. A massa foi estabelecida em 62 kDa, por gel filtração em Superdex 75. Análise após tratamento com agentes redutores permitiu deduzir que AFL é uma proteína homotetramérica. Sua atividade hemaglutinante foi reduzida quando a lectina foi exposta em meio ácido (pH < 4) ou quando submetida a temperaturas acima de 60 ºC. AFL apresentou especificidade para lactose e parcial para D-glicose e D-galactose. A lectina purificada AFL não apresentou efeito citotóxico para as linhagens de células cancerígenas (PANC, HeLa, HT-29, Bf16F10, A549) e de fibroblastos (MRC5). AFL foi capaz de aglutinar formas promastigotas vivas de Leishmania amazonensis e Leishmania. braziliensis,e teve sua atividade revertida pela adição de lactose ao ensaio. AFL não diminuiu de forma significante a viabilidade de Leishmania amazonensis. A lectina AFL apresentou atividade mitogênica em concentrações a partir de 40 μg/mL para célula mononucleares do sangue periférico (monócitos e linfócitos). A lectina AFL foi capaz de induzir na linhagem de macrófagos (RAW264.7) de murinos a liberação de TNF- α, mas não de IL-6, na concentração de 10,0 μg/mL. Quando AFL foi incubada com células esplênicas de camundongos BALB/c, foi capaz de estimular a produção de IFN-γ e promover a diferenciação de células T para uma resposta imune celular do tipo Th1. A capacidade de modular a resposta imune do tipo Th1 jamais foi relatada em lectinas de esponjas marinhas. Todos os resultados corroboram com o alto potencial que a lectina AFL apresenta como uma nova molécula capaz de modular o sistema imune, podendo ser utilizada como adjuvante de vacinas contra microrganismos, dentre eles, os do gênero leishmania.
Extração, caracterização e prospecção de atividades farmacológicas de polissacarídeos sulfatados da macroalga verde Caulerpa prolifera
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-08-20) Câmara, Rafael Barros Gomes da; Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira; ; http://lattes.cnpq.br/4651814546820796; ; http://lattes.cnpq.br/9200036511632745; Teixeira, Dárlio Inácio Alves; ; http://lattes.cnpq.br/6835210577941969; Albuquerque, Ivan Rui Lopes de; ; http://lattes.cnpq.br/2266021166245706; Costa, Leandro Silva; ; http://lattes.cnpq.br/4991977240761750; Clemente, Tatjana Keesen de Souza Lima;
O presente estudo teve como objetivo extrair, caracterizar e realizar uma análise prospectiva de atividades farmacológicas de polissacarídeos sulfatados da macroalga verde Caulerpa prolifera. Sete frações (CP-0.3/CP-0.5/CP-0.7/CP-0.9/CP-1.1/CP-1.5/CP-2.0) foram obtidas de C. prolifera por proteólise alcalina seguida de precipitação sequencial em acetona. As análises físico-químicas indicaram que C. prolifera sintetiza diferentes populações de heteropolissacarídeos sulfatados. Na análise da atividade anticoagulante, todas as frações, exceto CP-0.3, apresentaram influência sobre a via intrínseca da coagulação. Todas as frações apresentaram atividade antioxidante em 6 ensaios diferentes, sendo mais pronunciadas no teste de sequestro de peróxido de hidrogênio, com destaque para CP-0.3, CP-0.7 e CP-0.9 (quando se obteve até 61% de sequestro), no teste de quelação férrica (com destaque para CP-0.9, com 56% de quelação) e no teste de quelação cúprica (com destaque para CP-2.0, com quelação de 78%). Com relação a ação imunomoduladora, a presença de CP-0.3, CP-0.7 e CP-0.9 promoveu aumento da produção de óxido nítrico (ON) em macrófagos em até 48, 142 e 163 vezes, respectivamente. De maneira oposta, a síntese de ON caiu em 73% quando macrófagos ativados por LPS foram incubados concomitantemente com CP-2. A atividade anti-adipogênica das frações também foi avaliada e o destaque ficou com CP-1.5, na presença desta fração (0,2 mg/mL) a diferenciação de pré-adipócitos (3T3-L1) em adipócitos foi reduzida em 60%. Vale salientar, que a viabilidade das células 3T3-L1 não foi afetada pela presença de CP-1.5. O que não ocorreu com células de câncer cervical humano (HeLa) e de adenocarcinoma renal humano (786-0), já que a viabilidade dessas células caiu quando elas foram expostas as frações, o destaque foi para a redução da viabilidade em torno de 55% quando as células HeLa foram incubadas com CP-0.3, CP-0.5 e CP-0.9. Já com 786-0, o melhor resultado encontrado foi com o uso da fração CP-1.5, quando se obteve uma redução de ~75% da viabilidade celular. Não se identificou atividade leishmanicida ou microbicida contra a Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) com ao se testar as frações contra estes organismos. No entanto, a proliferação de Staphylococcus epidermidis foi diminuída em 30% na presença de CP-1.5. Outro resultado relevante, foi a observação de que a formação de cristais de oxalato cálcio na presença das frações era alterada. Destaca-se CP-0.3, CP-0.5 e CP-1.1, já que na presença dessas frações identificou-se apenas a formação de cristais dihidratados e de tamanho médio 80% menor do que aquele verificado no grupo controle. Dados oriundos da avaliação do potencial zeta dos cristais formados na presença das frações e da avaliação de imagens de microscopia confocal de cristais formados na presença das frações marcadas fluorescentemente levaram a hipótese de que os polissacarídeos presentes nas frações interagem com o cálcio da rede cristalina e isso afeta o crescimento e a morfologia dos cristais formados. Os resultados aqui descritos levam a sugestão de os principais agentes responsáveis pelas atividades observadas com as frações seriam os polissacarídeos sulfatados, portanto passos posteriores de purificação desses polímeros, bem como a investigação de seus mecanismos de ação devem ser investigados. Por fim, os dados aqui obtidos levam a observação de que as frações ricas em polissacarídeos obtidas da alga C. prolifera apresentam um potencial multiterapêutico por serem anticoagulantes, antioxidantes, imunomoduladores, citotóxicas contra células tumorais, anti-adipogenicos, antibacterianas e alterarem a formação de cristais de oxalato de cálcio.
Caracterização de genes de reparo de DNA em cana-de-açúcar
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-10-16) Medeiros, Amanda Larissa Marques de; Scortecci, Katia Castanho; ; http://lattes.cnpq.br/4808910380593455; ; http://lattes.cnpq.br/3643904052914844; Dalmolin, Rodrigo Juliani Siqueira; ; http://lattes.cnpq.br/4065178015615979; Praxedes, Sidney Carlos; ; http://lattes.cnpq.br/6609231229691480; Calsa Júnior, Tercilio; ; http://lattes.cnpq.br/2775650529232362; Grangeiro, Thalles Barbosa; ; http://lattes.cnpq.br/3114375474778667
A cana-de-açúcar é uma importante cultura para nosso país, que contribui com quase metade de toda a produtividade mundial. Muitos desafios são enfrentados pelas plantas, que muitas vezes não atingem todo o seu potencial genético devido a presença de estresses bióticos e abióticos. Como consequência, esses estresses podem gerar espécies reativas de oxigênio, que podem danificar o material genético. Outra consequência do estresse é a floração precoce, que diminui também a produtividade da cana-de-açúcar. Neste contexto, este trabalho apresenta como objetivos caracterizar os genes scMUTM1 e scMUTM2, duas DNA glicosilases pertencentes à via de reparo por excisão de base (BER), além de identificar transcritos potencialmente relacionados com estresse e reparo de DNA, em duas variedades com fenótipo contrastante para floração. A caracterização das glicosilases incluiu a construção de cassetes de expressão de proteínas, para posterior purificação e uso em ensaios enzimáticos; construção de árvore filogenética e análise de promotor deste gene. Com a reconstrução filogenética de MUTM foi possível observar que há o agrupamento desta sequência em um ramo com monocotiledôneas e outro com dicotiledôneas. Isto sugere que a duplicação desta sequência pode ter ocorrido depois da divergência desses dois grupos. Com a análise do promotor deste gene, é sugerido que, provavelmente, o gene ScMUTM1 pode estar sofrendo subfuncionalização, uma vez que a região promotora do gene ScMUTM2 apresenta uma maior quantidade de sequências regulatórias relacionadas ao estresse. Por meio das análises de expressão gênica utilizando microarranjos, se observou a superexpressão de genes relacionados ao estresse de forma marcante em uma das condições de análise relacionadas com floração precoce.

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