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Título: Desenvolvimento e validação de testes de fluxo lateral para a detecção de cultivares geneticamente modificados e de aflatoxinas em produtos agrícolas
Autor(es): Evangelista, Vanessa Olinto dos Santos
Palavras-chave: Testes de fluxo lateral;Proteínas Cry;Testes rápidos;Detecção de cultivares GM;Aflatoxinas;Segurança alimentar
Data do documento: 3-Dez-2015
Editor: Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Citação: EVANGELISTA, Vanessa Olinto dos Santos. Desenvolvimento e validação de testes de fluxo lateral para a detecção de cultivares geneticamente modificados e de aflatoxinas em produtos agrícolas. 2015. 124f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2015.
Resumo: The expansion of cultivated areas with genetically modified crops (GM) is a worldwide phenomenon, stimulating regulatory authorities to implement strict procedures to monitor and verify the presence of GM varieties in agricultural crops. With the constant growing of plant cultivating areas all over the world, consumption of aflatoxin-contaminated food also increased. Aflatoxins correspond to a class of highly toxic contaminants found in agricultural products that can have harmful effects on human and animal health. Therefore, the safety and quality evaluation of agricultural products are important issues for consumers. Lateral flow tests (strip tests) is a promising method for the detection both proteins expressed in GM crops and aflatoxins-contaminated food samples. The advantages of this technique include its simplicity, rapidity and cost-effective when compared to the conventional methods. In this study, two novel and sensitive strip tests assay were developed for the identification of: (i) Cry1Ac and Cry8Ka5 proteins expressed in GM cotton crops and; (ii) aflatoxins from agricultural products. The first strip test was developed using a sandwhich format, while the second one was developed using a competitive format. Gold colloidal nanoparticles were used as detector reagent when coated with monoclonal antibodies. An anti-species specific antibody was sprayed at the nitrocellulose membrane to be used as a control line. To validate the first strip test, GM (Bollgard I® e Planta 50- EMBRAPA) and non-GM cotton leaf (Cooker 312) were used. The results showed that the strip containing antibodies for the identification of Cry1Ac and Cry8Ka5 proteins was capable of correctly distinguishing between GM samples (positive result) and non-GM samples (negative result), in a high sensitivity manner. To validate the second strip test, artificially contaminated soybean with Aspergillus flavus (aflatoxin-producing fungus) was employed. Food samples, such as milk and soybean, were also evaluated for the presence of aflatoxins. The strip test was capable to distinguish between samples with and without aflatoxins samples, at a sensitivity concentration of 0,5 μg/Kg. Therefore, these results suggest that the strip tests developed in this study can be a potential tool as a rapid and cost-effective method for detection of insect resistant GM crops expressing Cry1Ac and Cry8Ka5 and aflatoxins from food samples.
metadata.dc.description.resumo: A expansão agrícola utilizando cultivares geneticamente modificados (GM) é fenômeno mundial. Esse fato tem impulsionado a implementação de legislações regulatórias para monitorar à presença de variedades GM em culturas agrícolas. Outra importante demanda mundial está relacionada ao consumo de alimentos contaminados por aflatoxinas. Essas moléculas constituem um classe de compostos extremamente tóxicos que causam efeitos danosos para a saúde humana e animal. Por isso, a segurança e qualidade dos produtos agrícolas são essenciais para os consumidores. Os testes de fluxo lateral são métodos alternativos promissores que podem ser utilizados tanto para a detecção de proteínas transgênicas expressas em culturas GM quanto para a detecção de compostos tóxicos em alimentos. Essa técnica apresenta vantagens adicionais quando comparado aos métodos convencionais, como: simplicidade, rapidez e baixo custo. Nesse estudo foram desenvolvidos dois testes de fluxo lateral, um para a identificação das proteínas Cry1Ac e Cry8 Ka5 expressas em cultivares de algodão GM e o outro, para a detecção de aflatoxinas em produtos agrícolas. O teste, para a detecção dos cultivares transgênicos, foi desenvolvido no formato sandwhich. Esse teste foi desenvolvido utilizando os anticorpos monoclonais 1B1 e 5H4, produzidos contra a proteína Cry1Ac, mas que apresentaram reação cruzada para a proteína Cry8Ka5. O monoclonal anti-Cry1B1 foi conjugado com nanopartículas de ouro coloidal (40 nm) e utilizados como reagente de detecção. O monoclonal 5H4 foi adsorvido na membrana de nitrocelulose, na região denominada de linha teste e utilizado como reagente de captura do teste. Na linha controle, foi adsorvido o anticorpo anti-mouse IgG. Esses testes foram validados utilizando amostras de folhas de plantas de algodão GM ( Bollgard I ® e Planta 50- produzida em nosso laboratório) e folhas provenientes de cultivares não GM ( Cooker 312). Os resultados demonstraram que esse teste foi capaz de distinguir eficientemente amostras GM de não GM. Além disso, também apresentou elevada sensibilidade, sendo capaz de detectar 0,06 μg das proteínas respectivas nos cultivares transgênicos. O teste para a detecção de aflatoxinas foi desenvolvido no formato competitivo. O anticorpo α-AFLA 3B6, produzido contra AFB1, apresentou reatividade cruzada contra as aflatoxinas AFB2, AFG1, AFG2 e AFM1 e por isso, foi utilizado para o desenvolvimento das fitas-testes. Nesse teste o anticorpo 3B6 foi conjugado com ouro coloidal (40 nm) e utilizado como reagente de detecção. O antígeno AFB1 foi adsorvido na linha teste e utilizado como reagente de captura e o anti-mouse IgG foi imobilizado na linha controle do teste. Para a validação, grãos de soja contaminados com o fungo Aspergillus flavus, foram utilizados. Esses testes também foram avaliados quanto à habilidade de detecção de aflatoxinas em amostras alimentares, incluindo leite e proteína texturizada de soja. Os resultados demonstraram que a fita eficientemente identificou amostras contendo aflatoxinas. Além disso, apresentou sensibilidade de 0,5 ng/mL ou 0,5 μg/Kg. Os resultados obtidos sugerem que as fitas testes desenvolvidas podem ser utilizadas como método rápido e de baixo custo para o screening de cultivares GM, expressando as proteínas Cry1Ac e Cry8Ka5, quanto para a detecção de aflatoxinas em amostras alimentares.
URI: http://repositorio.ufrn.br/handle/123456789/20879
Aparece nas coleções:PPGB - Doutorado em Bioquímica

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