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Título: Efeitos de um inibidor do tipo Kunitz de sementes de Mimosa regnellii Benth sobre eventos celulares da linhagem tumoral B16-F10
Autor(es): Rabêlo, Luciana Maria Araújo
Palavras-chave: Mimosa regnellii Benth;Inibidor de tripsina;Melanoma;Apoptose;Angiogênese;Migração celular;Potencial de membrana mitocondrial
Data do documento: 25-Out-2016
Citação: RABÊLO, Luciana Maria Araújo. Efeitos de um inibidor do tipo Kunitz de sementes de Mimosa regnellii Benth sobre eventos celulares da linhagem tumoral B16-F10. 2016. 132f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2016.
Resumo: Cancer is a term used to represent a set of more than 200 diseases, including malignant tumors of different localizations. There are several mechanisms that contribute to carcinogenesis: sustained proliferative signals, deregulation of cellular energy, evasion of apoptosis, angiogenesis induction and unlimited replication, among others. Among the main types of cancer, skin cancer stands out: arises in melanocytes and is the most common in Brazil, accounting for 30% of all malignant tumors registered in the country melanomas at an early stage can, in most cases,. It is treated with surgery, but the most advanced cancers require other treatments. In this work a Kunitz-type trypsin inhibitor was purified from Mimosa regnellii Benth (ITJ) legume seeds, partially characterized and evaluated for their toxicity front tumor cell lines, specifically acting with an IC50 of 0.65 μM in B16-F10 cell line, showing no toxicity compared to non-transformed cell lines. Its ability to induce cell death by apoptosis pathway in mouse B16-F10 melanoma cells was evaluated by flow cytometry with Annexin V-FITC / PI markers, inducing about 45% apoptosis of cells. In addition, the inhibitor was also evaluated for their ability to: change the mitochondrial membrane potential, visualized by flow cytometry experiments using Rhodamine123 probe and confocal microscopy with Mitotracker Red marker, which was able to significantly change the ΔΨm; Release of ROS and RNs through specific probes visualized by microscopy techniques, causing release of ROS in the concentration of IC50, but not influencing release RNS; Liberation of cytosolic calcium, an event that influences the apoptosis activation, with significant effect on B16-F10 cells; Inhibition of angiogenic activity on rabbit endothelial cells through experiments of inhibition of new vessel formation in Matrigel, analysis of VEGF expression by western blotting techniques and reduction of IL-6 expression analyzed by confocal microscopy; Inhibition of cell migration process in wound induction assay and microscopy analysis and, finally, to alter the cellular morphology of B16-F10 analyzed by incubation with specific antibodies to extracellular matrix components and intermediate filaments of melanoma cells, conducted in fluorescence microscopy. All these combined results favor the proposal of a possible ITJ action mechanism in the induction of cell death by apoptosis in B16-F10 cells, where the inhibitor initially act by altering the p53 expression in 36h of incubation, increasing calcium cytosolic levels and ROS, which would act changing the mitochondrial metabolism, activating dependent apoptosis pathways of caspase participation; ITJ also act by inhibiting migration processes up to 18 hours of exposure, as well as influence belatedly in inhibiting the angiogenic process in vitro. These results suggest that ITJ has the potential to be used as a drug adjuvant treatment for melanomas, due to their specificity and low-dose when compared to other bioactive molecules.
metadata.dc.description.resumo: O câncer é um termo utilizado para representar um conjunto de mais de 200 patologias, incluindo tumores malignos de diferentes localizações. Vários são os mecanismos que contribuem para a carcinogênese: sinal proliferativo sustentado, desregulação da energia celular, evasão a apoptose, indução a angiogênese, replicação ilimitada, entre outros. Dentre os principais tipos de câncer existentes, o câncer de pele se destaca: surge nos melanócitos e é o mais frequente no Brasil, correspondendo a 30% de todos os tumores malignos registrados no País. Melanomas em estágio inicial podem, na maioria das vezes, ser tratados apenas com cirurgia, porém os cânceres mais avançados requerem outros tratamentos. Neste trabalho, um inibidor de tripsina do tipo Kunitz foi purificado de sementes da leguminosa Mimosa regnellii Benth (ITJ), parcialmente caracterizado e avaliado quanto sua toxicidade frente a linhagens de células tumorais, atuando especificamente com um IC50 de 0,65 μM em linhagem celular B16-F10, não apresentando toxicidade frente a linhagens de células não transformadas. Sua capacidade de induzir morte celular pela via de apoptose em células de melanoma de camundongo B16-F10 também foi avaliada, através de citometria de fluxo com os marcadores Anexina V-FITC/PI, induzindo cerca de 45% das células a apoptose. Além disso, o inibidor também foi avaliado quanto a sua capacidade de: alterar o potencial de membrana mitocondrial, visualizado por experimentos em citometria de fluxo utilizando a sonda Rodamina123 e microscopia confocal com o marcador Mitotracker Red, onde foi capaz de alterar de forma significativa o ΔΨm; Liberar espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, através de sondas específicas visualizadas por técnicas de microscopia, causando liberação de ROS na concentração de IC50, porém não influenciando liberação de ERNs; Liberar cálcio citosólico, evento que influencia na ativação de apoptose, com efeito significativo em células B16-f10; Inibir atividade angiogênica de células endoteliais de coelho, através de experimentos de inibição de formação de novos vasos em matrigel, análise da expressão de VEGF por técnicas de western Blotting e redução da expressão de IL-6 analisado por microscopia confocal; Inibir o processo de migração celular em ensaio de indução de ferimento e análise em microscopia e, por fim, a alterar a morfologia celular de B16-F10, analisada por incubação com anticorpos específicos para componentes da matriz extracelular e filamentos intermediários das células de melanoma, realizados em microscopia de fluorescência. Todos esses resultados reunidos favorecem a proposição de um possível mecanismo de ação de ITJ na indução de morte celular por apoptose em células B16-F10, onde o inibidor atuaria inicialmente aumentando os níveis de cálcio citosólico e ROS, alterando posteriormente a expressão de p53 em 36h de incubação, que agiriam alterando o metabolismo mitocondrial, ativando vias de apoptose dependentes da participação de caspases; ITJ também atuaria inibindo processos migratórios até 18 horas de exposição, além de influenciar de forma tardia na inibição do processo angiogênico in vitro. Estes resultados sugerem que ITJ apresenta potencial para ser utilizado como fármaco em tratamento adjuvante contra melanomas, devido a sua especificidade e baixa dosagem quando comparado a outras moléculas bioativas.
URI: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/22059
Aparece nas coleções:PPGB - Doutorado em Bioquímica

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