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Título: Prospecção do gene da Calmodulina em plantas
Autor(es): Barreto, Kellya Francisca Mendonça
Palavras-chave: Saccharum spp;Florescimento precoce;Anatomia;Rede de interação proteica
Data do documento: 25-Jul-2018
Referência: BARRETO, Kellya Francisca Mendonça. Prospecção do gene da Calmodulina em plantas . 2018. 99f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2018.
Abstract: Sugarcane is one of the most important producing monocultures in Brazil as a source of first and second-generation renewable biofuel, as well as sugar and other derivatives. The conditions of abiotic and water stress and high salinity of the soil for a region of the Northeast are unfavorable to the cultivation of plants and vegetables early.. This has a negative impact for sugarcane culture as it may reduce the production of alcohol and sugar. Molecular studies for the flowering pathway has an important impact for this culture. In this work, the aim of this work was to understand the possible role for ScCAM sequence (Calmodulin sequence in sugarcane). This sequence was previously identified related to flowering process. In order to understand the possible association of this sequence to flowering process in sugarcane it was used different approaches for this work. It was used bioinformatics, protein-protein interaction (two-hybrid assays), analysis of transgenic plants Nicotiana tabacum with the overexpression cassette in antisense orientation and histological analysis from apical meristem from sugarcane plants. First, bioinformatics analyzes allowed us to verify the conservation of the nucleotide sequence by comparing the ScCAM sequence with the sequences of AtCAM (Arabidospis thaliana), which presented 99% identity. A phylogenetic tree was done using the coding nucleotide sequences (CDS). It was observed a high conservation of calmodulin in plants. Based on these results, a 3D modeling from the ScCAM sequence was done. This model was overlapped to the AtCAM 3D model for the 4AQR crystal. This overlapped showed the EF-hands motifs and the entire protein structure. This data allowed us to propose that ScCAM may be a functional protein. After that, an interaction network was done using the AtCAM7 sequence (from Arabidopsis thaliana) using Cytoscape. The Clusters obtained were enriched and it showed proteins that may be interacting as flowering induction as well as it had a role in the oxidation/reduction homeostasis. The two hybrids assays identified some clones and tow of these clones had homology to A. thaliana ribosomal proteins L31-1 and L19-1 (Uniprot access: Q9SLL7). These results suggest that the ScCAM protein may interact with ribosomal proteins. The transgenic plants having the overexpression cassete in antisense (ScCAMAS) orientation showed an increase in the germinated potential of the transgenic seeds ScCAM-AS, an increase of inflorescence branches number and fruit. Furthermore, it was observed an increase of root hair when compared to transgenic plants having the empty vector (control) or wild-type plants. For leaves, it was not observed any changes at morphometric parameters. The only modification that was observed for these plants were the height, inflorescence and fruits. In parallel, it was also analyzed the shoot apical meristem from sugarcane plant at production field using early and late-flowering cultivar. This analysis showed that the flowering induction may be happen 30-60 days before for early flowering cultivar. Similar results were observed for the transgenic plants. In this way, the results obtained here reinforce the hypothesis that the ScCAM sequence may be associated to the flowering process as well as stress signaling pathway by modification from physiological processes, then it may be remodeling apical and root meristems. The proteins identified in the interaction network indicated that AtCAM may act in pathways of stress signaling by altering physiological processes in the remodeling of meristematic tissues and roots by interactions between Ca+2 + CAM and actin modulating time of growth, development and flowering. The results obtained with transgenics plants and the data with the double hybrid suggest that ScCAM may act together with the ribosomal 60S protein as a floral inducer through the activation or inhibition from genes belonging to the flowering pathway. As well, it may potentiating the increase of biomass.
Resumo: A cana-de-açúcar é uma das mais importantes monoculturas produtoras no Brasil como fonte geradora de biocombustível renovável de primeira e segunda geração, assim como de açúcar e outros derivados. As condições de estresse abiótico como o déficit hídrico e alta salinidade do solo para a região Nordeste podem desfavorecer o seu cultivo afetando os vegetais a florescerem precocemente. Este apresenta um impacto negativo na cultura de cana-de-açúcar podendo promover uma redução na produção de álcool e açúcar. Neste sentido estudos moleculares utilizando genes envolvidos na via de florescimento são de extrema importância econômica. Neste estudo, foi avaliado o papel da sequência ScCAM (sequência da Calmodulina encontrada em cana-de-açúcar) identificada anteriormente, pelo nosso grupo, como potencial associado ao processo de florescimento. Assim, foram utilizadas as abordagens de bioinformática, interação proteína-proteína (ensaios de dois híbridos), análise de plantas transgênicas Nicotiana tabacum contendo o cassete de super-expressão em orientação anti-senso bem como análise histológica de material de cana-de-açúcar obtido em campo de produção. Primeiramente, as análises de bioinformática realizadas por meio de comparação da sequência nucleotídica apresentou 99% de identidade entre a sequência ScCAM com as sequências de AtCAM (Arabidospis thaliana), o qual, utilizando as sequências codantes (CDS) foi construída uma árvore filogenética que permitiu observar a alta conservação da calmodulina em plantas. Com base nestes resultados foi realizada, então, a modelagem em 3D da sequência ScCAM, e esta foi sobreposta ao modelo 3D da AtCAM referente ao cristal 4AQR, possibilitando a observação dos motivos EF-hands e toda a estrutura proteica. Este modelo permitiu propor uma possível funcionalidade para a sequência ScCAM. Em seguida, foi construída uma rede de interação de proteínas utilizando a sequência de AtCAM7 (homóloga a ScCAM em Arabidopsis thaliana) gerada por via do programa Cytoscape. Por meio do programa Gene Ontology (GO), os Clusters da rede foram enriquecidos, revelando algumas proteínas que possivelmente estejam atuando como indutoras da floração, bem como, no controle da homeostase durante o processo de oxidação/redução. Esses dados também sugerem que a AtCAM7 possa estar envolvida na sinalização em resposta ao estresse. Por meio da metodologia de dois híbridos utilizando leveduras foram obtidos dois clones que tiveram uma identidade de 77,6% para as proteínas ribossomais L31-1 e L19-1 de A. thaliana (acesso Uniprot: Q9SLL7). Estes resultados sugerem que a proteína ScCAM possa interagir com as proteínas ribossomais. Na abordagem utilizando plantas transgênicas de Nicotiana tabacum contendo o cassete de superexpressão em anti-senso foram observadas um aumento no potencial germinativo destas sementes; o aumento no número dos ramos da inflorescência e frutos, além das alterações estruturais nos tecidos das raízes com grande aumento dos pelos radiculares quando comparado com as linhagens denominadas de controle e as plantas não transformadas (selvagens). Nos tecidos foliares não foram observadas alterações morformétricas. No entanto, houve alteração na altura, inflorescência e frutos das plantas. Paralelamente, foi realizada uma análise histológica para o tecido meristemático apical de plantas de cana-de-açúcar coletadas em campo de produção para as variedades de florescimento precoce e tardio. As análises histológicas permitiram observar que na variedade precoce houve indução floral entre 30-60 dias de antecedência quando comparada a variedade tardia, semelhante com as características das plantas transgênicas cultivadas em ambiente controlado. Os resultados obtidos por meio das análises de bioinformática, plantas transgênicas de N. tabacum in vivo, permitem propor que a sequência CAM em plantas possa estar associada ao florescimento. As proteínas identificadas na rede de interações indicaram que a AtCAM pode atuar em vias de sinalização de estresse por meio de alteração de processos fisiológicos, na remodelação dos tecidos meristemáticos e raízes, por interações entre Ca+2 + CAM e actinas modulando o tempo de crescimento, desenvolvimento e florescimento. Os resultados obtidos das plantas transgênicas junto com os dados obtidos com o duplo híbrido, sugerem que a ScCAM possa atuar junto a proteína 60S ribossomal como indutora floral através da ativação ou inibição de genes pertencentes a via de floração. Bem como, possíveis potencializadores quanto ao aumento da biomassa.
URI: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/26085
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