PPGB - Mestrado em Bioquímica

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Análise do perfil epigenético de crianças com fendas labiopalatinas não sindrômicas
(2019-08-14) Rêgo, Amanda Jussara Figueirêdo; Amaral, Viviane Souza do; ; ; Navoni, Julio Alejandro; ; Medeiros, Silvia Regina Batistuzzo de;
As fendas labiopalatinas não sindrômicas (FL/PNS) são defeitos congênitos advindos de causas ambientais e genéticas. Estudos recentes têm associado os fatores epigenéticos, como a metilação do DNA, à hereditabilidade dessa malformação complexa, assim como a nutrição vem sendo considerada um gatilho ambiental das FL/PNS atuando diretamente no perfil de metilação. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi analisar o padrão epigenético do DNA de crianças com FL/PNS. Também foi investigado o padrão dietético dos fissurados e o perfil de exposição durante a gestação de suas mães. Foram coletadas células da mucosa oral de todas as crianças para a extração do DNA e determinação da metilação global e específica. Para isso, aplicou-se a técnica de análise de restrição combinada por bissulfito (COBRA) às 5-metilcitosinas (5-mC) das regiões LINE-1 e Alu, pois compreendem cerca de 30 % do genoma humano, e, adicionalmente, foi feita a reação em cadeia da polimerase para análise da metilação específica do promotor do BRCA1. A escolha desse gene foi baseada no seu papel na estabilidade do genoma. Além disso, as mães colaboraram com a pesquisa respondendo um questionário sobre informações dietéticas sobre seus filhos e fatores de exposição na gestação. Como resultado, em relação aos scores do perfil dietético analisados, foi observado que o grupo controle apresentou um maior consumo de “ultraprocessados”, “trigo refinado”, “gorduras vegetais processadas”, “carboidratos simples” e “embutidos” (p<0,05), porém, quanto às demais categorias de alimentos, não houve diferença estatística entre os grupos. Com relação aos dados da gestação, foi visto uma baixa taxa de programação gestacional e consequente atraso no início do uso dos suplementos nutricionais que favorecem o adequado desenvolvimento do embrião. Além disso, o tempo de uso de anticoncepcionais antes da gestação foi significativamente maior para as mães do grupo de fendas e associado ao aumento do risco em quase duas vezes de seus filhos nascerem com fendas (p=0,036; IC 95%, 0,639 – 4,134). Sobre os dados de metilação global, foi encontrado uma porcentagem média de 5-mC apenas para o LINE-1, respectivamente, de 48% e 45,3%, controle e fenda, com diferença estatística significante (p=0,047). E o promotor do BRCA1 mostrou-se metilado em 30.4% e 56.5%, controle e fenda, respectivamente, sem diferença estatística entre os grupos. Em geral, foi visto que o perfil alimentar dos participantes da pesquisa é de baixa qualidade, e mesmo a alimentação sendo discretamente melhor entre os indivíduos do grupo fenda, houve tendência maior à hipometilação global e hipermetilação no BRCA1 nas crianças com fendas, corroborando com as especulações recentes de que marcas epigenéticas da metilação do DNA podem ser fruto de uma herança epigenética transgeracional e ter efeitos na etiologia dessa malformação. Porém, são necessários mais estudos para a confirmação desses achados e compreensão de outros mecanismos epigenéticos que estejam atuando conjuntamente com as variantes de susceptibilidade genética e em consequência aos fatores ambientais responsáveis pela caracterização desse fenótipo.
Avaliação da instabilidade do genoma em crianças com fendas labiopalatinas não-sindrômicas
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-07-31) Xavier, Luíza Araújo da Costa; Amaral, Viviane Souza do; ; http://lattes.cnpq.br/4440806451383783; ; http://lattes.cnpq.br/0250196372811610; Sinigaglia, Marialva; ; http://lattes.cnpq.br/5450809564180533; Medeiros, Silvia Regina Batistuzzo de; ; http://lattes.cnpq.br/5882662534904226
As fendas labiopalatinas não-sindrômicas (FL/PNS) são defeitos congênitos comuns em humanos, caracterizadas pelo desenvolvimento incompleto de estruturas que separam a cavidade nasal da cavidade oral, e são causadas devido a uma interação entre fatores genéticos e ambientais. Dados obtidos de estudos de caso-controle e intervenção dietética indicam que a suplementação materna com multivitaminas contendo ácido fólico previne o surgimento das fissuras orais. É conhecido que o ácido fólico participa de funções celulares essenciais, como a síntese de nucleotídeos para o reparo do DNA, as quais contribuem para a proteção da integridade do genoma contra eventos de danos gerados por fatores endógenos e/ou exógenos. Inclusive, estudos revelam que a deficiência desta vitamina aumenta a formação de micronúcleos, estruturas citogenéticas indicadoras de danos no DNA. Além disso, esta deficiência é modulada pelos polimorfismos genéticos associados ao metabolismo do ácido fólico, comprometendo o desempenho das funções de estabilidade do genoma e, portanto, estão sendo associados com o desenvolvimento de vários distúrbios, dentre eles as fissuras orais. A partir deste contexto, foi conduzido um estudo transversal do tipo caso-controle não pareado com o objetivo de avaliar a frequência de biomarcadores de instabilidade genômica, sua relação com polimorfismos genéticos do metabolismo do folato, e se essas variáveis estão associadas com o desenvolvimento das FL/PNS em crianças do Rio Grande do Norte, Brasil. Foram recrutados 48 pacientes fissurados e 18 crianças controles, respectivamente, no Hospital de Pediatria Professor Heriberto Ferreira Bezerra (HOSPED)/UFRN e em escolas estaduais da cidade de Natal, RN. Com o devido consentimento dos participantes, realizou-se uma entrevista com os responsáveis para obtenção de dados epidemiológicos, como também procedeu-se a coleta sanguínea das crianças para a realização dos testes. Foi executado o ensaio do micronúcleo com bloqueio da citocinese para calcular a frequência de micronúcleos (MN), pontes nucleoplasmáticas (PN) e brotos nucleares (BN). A partir da extração do DNA genômico, avaliou-se os polimorfismos da metilenotetrahidrofolato redutase C677T e A1298C, metionina sintase A2756G, metionina sintase redutase A66G e do receptor de folato reduzido A80G pela técnica de reação em cadeia da polimerase associada ao polimorfismo de tamanho do fragmento de restrição (PCR-RFLP). As crianças com FL/PNS apresentaram maior frequência basal de MN, PN e BN que o grupo de crianças controle (p < 0,001), e nenhum dos polimorfismos avaliados modificaram significativamente a frequência destes biomarcadores. Além disso, crianças com FL/PNS apresentaram 2,3 vezes mais risco de exibir altas frequências de MN (p = 0,043) segundo modelo de regressão logística binária. A alta instabilidade do genoma nas crianças com fissuras orais sugere que os eventos genotóxicos, em particular os que promovem quebras na dupla fita do DNA e não são devidamente reparados formando micronúcleos, representam fatores relevantes no desenvolvimento das fendas labiopalatinas não-sindrômicas.
Descrição bioquímica quântica do bolsão de interação do ÍON Zn2+ na enzima ALAD humana
(2016-07-29) Barbosa, Emmanuel Duarte; Amaral, Viviane Souza do; ; ; Fulco, Umberto Laino; ; Sinigaglia, Marialva;
A enzima Delta Aminolevulínico Desidratase (ALAD) é uma metaloproteína citosólica essencial em vários processos biológicos, uma vez que é responsável pelo segundo passo da catálise enzimática na formação de porfobilinogênio, um precursor dos tetrapirrólicos (heme, clorofila). Esta enzima é bastante sensível a metais pesados e tem sido classicamente usada como um marcador na intoxicação por chumbo. Sua inibição se dá pela substituição desses metais pesados no sítio de ligação a metais. Na ALAD humana, o Zinco (Zn2+) ocupa funcionalmente este sítio sendo essencial para a coordenação das cadeias de ácido aminolevulínico durante a catálise enzimática. Embora muitos ensaios in vitro, in vivo e in sílico já tenham demonstrado a importância do Zn2+ nesse sítio, não se tinha conhecimento de nenhum estudo baseado em abordagem quântica com o intuito de elucidar esta interação de forma mais detalhada. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo analisar as mutações missense que acometem o sítio de ligação ao zinco e descrever através de métodos quânticos a energia de interação entre a enzima e o zinco com maior acurácia utilizando o método do Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas (MFCC), quantificando energeticamente os resíduos de aminoácidos posicionados até uma distância de 8,5 Å do centroide do ligante. Foi identificado as alterações bioquímicas na estrutura monomérica dos mutantes, as quais resultam na diminuição da atividade enzimática. Foram identificados um total de 30 resíduos com valores energéticos variados que interagem com o zinco no bolsão de ligação. Aqueles que apresentaram valores significativos (de atração ou repulsão) e estão relacionados funcionalmente à atividade enzimática foram: Lis199, Lis252, Arg 209, Arg 174, Cis122, Cis124 e Cis132; e aqueles que demonstraram relevância para a permanência do íon no sítio de ligação foram: Asp169, Gli130, Gli133, Asp120 e Ser168. A partir disso, pôde-se concluir que além dos grupos nucleófilos (grupos tiolatos) dos resíduos Cis122, Cis124 e Cis132, os resíduos Asp169, Asp120 e Ser168 são fundamentais na composição do bolsão, uma vez que demonstraram grande quantidade de energia de interação atrativa com o íon Zn2+.
Desenvolvimento de ferramentas moleculares para identificação de variantes genotípicas do vírus causador da Síndrome da Mancha Branca em camarões
(2018-06-29) Pereira, Jéssica Marina de Paiva; Lanza, Daniel Carlos Ferreira; ; ; Amaral, Viviane Souza do; ; Vieira, Patricia Raquel Nogueira;
A região nordeste é responsável por mais de 90% do camarão produzido no Brasil compreendendo os dois maiores produtores, os estados do Ceará e do Rio Grande do Norte. O vírus causador da síndrome da mancha branca (WSSV) tem sido considerado um dos principais desafios enfrentados pela carcinicultura global nas últimas décadas. Apesar de ser o maior problema enfretando pela carcinicultura brasileira na atualidade, o status epidemiológico e a variabilidade genética do WSSV foram pouco estudados no Brasil até o momento. A variabilidade genética do WSSV tem sido investigada em diferentes regiões do mundo, principalmente em estudos de dispersão viral e em tentativas de correlacionar genótipo e virulência. Essa variabilidade é acessada principalmente por meio de regiões variáveis presentes nas inserções entre as ORFs 23/24 e 14/15, e de repetições em tandem de número variável (VNTRs) que ocorrem nas ORFs 75, 94 e 125. Os primers usados para genotipar o WSSV com base nessas regiões foram descritos há pelo menos dez anos, e alguns não funcionam eficientemente para genotipar novas variantes do WSSV incluindo as que ocorrem no Brasil. No presente trabalho, foi desenvolvido um novo set de primers para amplificação das regiões variáveis no genoma do WSSV por PCR, baseados em alinhamentos de todas as sequências disponíveis até o momento nos bancos de dados públicos. Os novos primers foram sintetizados, e novas reações de PCR foram padronizadas, tendo sua eficiência comparada com protocolos e primers anteriormente descritos. Os novos primers foram utilizados em um estudo epidemiológico piloto, em que amostras de camarão foram coletadas em fazendas localizadas ao longo da costa do Rio Grande do Norte. A prevalência do WSSV foi de 58%, 100% e 60% nas fazendas investigadas nas regiões sul, central e norte do estado respectivamente. As amostras com maior carga viral foram genotipadas. O novo conjunto de primers se mostrou mais eficiente em comparação com os primers já descritos, permitindo genotipar maior número de amostras. Os resultados indicam que a prevalência do WSSV no estado do Rio Grande do Norte estava alta no período em que foram coletadas as amostras, e que a variabilidade genética do WSSV no estado é baixa, tendo sido obsevada principalmente no marcador ORF94. Os resultados permitiram ainda observar algumas evidências de que eventos de recombinação genética podem ter originado os isolados Brasileiros do WSSV.
A infecção por Leishmania infantum chagasi altera o metabolismo lipídico do hospedeiro
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2012-12-03) Ottoni, Cristina Iglesias; Jerônimo, Selma Maria Bezerra; ; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785584A3&dataRevisao=null; ; http://lattes.cnpq.br/6522050045198506; Carvalho, Lucas Pedreira de; ; http://lattes.cnpq.br/7308383096084856; Amaral, Viviane Souza do; ; http://lattes.cnpq.br/4440806451383783
A leishmaniose visceral americana (LVA), causada pela Leishmania infantum chagasi (L.i.chagasi) permanece como um problema de saúde pública no Brasil. A LVA cursa com alterações bioquímicas e hematológicas que podem resultar em caquexia e predisposição a infecções secundárias. O metabolismo lipídico pode ser alterado em resposta à infecção, sendo que alguns microorganismos podem induzir estas alterações.. Estudos experimentais mostram que o colesterol é necessário para a internalização e replicação de L.i.chagasi em macrófagos. Este trabalho teve como objetivo avaliar se o metabolismo lipídico sofre alterações em diversos status pós-infecção por L.i.chagasi. Os níveis de colesterol, triglicerídeos, HDL, proteína C reativa foram quantificados. A expressão de genes relacionados ao metabolismo lipídico, como LXR-a, LXR-b, PPAR-a, PPAR-d, PPAR-g e APOE foi determinada por PCR em tempo real. Indivíduos com LVA quando comparados com indivíduos com infecção assintomática apresentaram baixos níveis de coleste rol total (128 ± 6,180 mg/dL vs. 158 ±5,733 mg/dL, p=0,0001), HDL (29 ± 1,746 mg/dL vs. 37 ± 1,647 mg/dL, p=0,001); elevação nos níveis de triglicerídeos (149,5 mg/dL ± 12,72 vs. 78,00 ± 10,43 mg/dL, p=0,0095) e de proteína C reativa (1,750± 0,4939 mg/dL vs. 0,40 ± 0,1707 mg/dL; p=0,0001). A expressão de genes envolvidos no metabolismo de lipídos apresentou diminuições de 3,5 vezes em pacientes com LVA, no caso de PPAR-g. Para outros genes, como PPAR-a, esta diminuição de expressão chegou a 27,70 vezes para pacientes com LVA em relação ao grupo controle. Estes achados podem explicar os níveis séricos alterados de lipídios para os indivíduos com LVA. Estes resultados sugerem que a cronicidade da infecção por Leishmania resulta em uma modulação do metabolismo de lipídios, com inibição da síntese de colesterol. Isso pode facilitar a sobrevivência da leishmania, por potencialmente resultar em redução da habilidade dos macrófagos em apresentar antígenos eficientemente para células T frente à redução de colesterol disponível, e isso resulta em uma subversão da imunidade do hospedeiro.
Investigação da toxicidade genética de produtos naturais através de bioensaios de curta duração
(Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2015-07-30) Cruz, Marina Sampaio de Menezes; Amaral, Viviane Souza do; ; http://lattes.cnpq.br/4440806451383783; ; http://lattes.cnpq.br/6681979238632936; Sinigaglia, Marialva; ; http://lattes.cnpq.br/5450809564180533; Pedrosa, Matheus de Freitas Fernandes; ; http://lattes.cnpq.br/2929963416385218
Os produtos naturais derivados de plantas servem de matéria-prima para a síntese de fitoterápicos, sendo amplamente utilizados por várias populações em todo o mundo. Dentre estes compostos, destacam-se as saponinas e seus metabólitos. Seu intenso uso é decorrente de suas propriedades bioativas, somado a sua similaridade estrutural a hormônios. As saponinas derivam-se em sapogeninas, como, por exemplo, a Diosgenina e a Hecogenina. Além de serem utilizadas na indústria farmacêutica para a produção de hormônios e anti-inflamatórios esteroidais, estas duas sapogeninas também são empregadas como fitoterápicos, estando presentes também em vegetais que compõem a dieta de muitas populações. Apesar da vasta utilização destes compostos, existe uma falta de informações sobre a toxicidade genética, o que torna o consumo destas sapogeninas um risco para as populações. Diante deste contexto, o presente trabalho apresentou como objetivo investigar as potencialidades tóxicas, em nível celular e de DNA, da Diosgenina e da Hecogenina. Ensaios em células HepG2 para a avaliação da citotoxicidade, genotoxicidade, e mutagenicidade foram realizados. Considerando os resultados obtidos com a Diosgenina, esta sapogenina revelou efeito citotóxico em concentrações acima de 30 M, assim como induziu significativamente incrementos na frequência de danos no DNA e de micronúcleos. Por outro lado, a Hecogenina somente se revelou citotóxica acima de 150 M, porém em concentrações abaixo deste valor, foi capaz de induzir danos ao material genético sem promover um aumento na frequência de micronúcleos. A análise do conjunto destes dados sugere que o consumo de alimentos, fitoterápicos ou de medicamentos que contenham a Diosgenina na sua composição apresenta um risco maior de toxicidade, quando comparados com as formulações a base de Hecogenina, uma vez que a Diosgenina apresenta um potencial mutagênico demonstrado por meio de um aumento significativo na frequência de micronúcleos que são biomarcadores de instabilidade genômica.

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